JPH08301781A - Ｈｓｐ４７合成抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 分子量４７キロダルトンの熱ショックタンパ
ク質の合成抑制剤を提供する。 【構成】 麦芽抽出物を有効成分として含有する。 【効果】 コラーゲン合成を抑制するので、細胞外マト
リックス産生の亢進の病態を示す病気を治療することが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、麦芽抽出物を有効成分
として含有する、分子量４７キロダルトンの熱ショック
タンパク質（以下、ＨＳＰ４７と称する）の合成抑制剤
に関する。本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤は、特に、臓
器内のコラーゲンの合成を抑制することにより肝硬変、
間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾
患）、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じ
るケロイドや肥厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節
リウマチなどの細胞外マトリックス（細胞外基質）産生
亢進の病態を示す病気の患者の生理学的状態を有効に改
善させ、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性
腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、交通
事故等の後に生じるケロイドや肥厚性瘢痕、強皮症、動
脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞外マトリックス産
生亢進の病態を示す病気を効果的に治療することができ
る。

【０００２】

【従来の技術】近年、コラーゲンなどの細胞外マトリッ
クスの産生の亢進の病態を示す病気が大きな問題となっ
ている。ここでいう細胞外マトリックス産生の亢進の病
態を示す病気とは、例えば、肝硬変、間質性肺疾患、慢
性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕
や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚
性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどを含
む。

【０００３】例えば、死亡者がわが国だけでも年間約２
万人にものぼるといわれている肝硬変は、肝臓が結合組
織の増殖のため固くなる病気の総称で、種々の慢性肝疾
患の終末像であるといわれ、肝全体にわたるびまん性の
肝線維症である。すなわち、肝炎などの肝傷害が長期に
及ぶ慢性肝炎においては、線維芽細胞や伊東細胞などの
細胞外マトリックス（とくにＩ型コラーゲン）産生の著
しい亢進を伴い肝臓は線維化する。肝の線維化が慢性的
に進行すると、ますます正常な肝再生は妨害され、肝細
胞に置き換わり、線維芽細胞とＩ型コラーゲンを主体と
する細胞外マトリックスが肝組織のかなりの部分を占
め、多くの凝小葉からなる肝硬変に至る。肝硬変の進行
に伴い、線維隔壁が肝全体に進展し、その結果生じる血
流の異常は、肝実質細胞の変性をさらに押し進める一因
にもなり、肝硬変における悪循環が続くことになり、さ
らにはアルコール、ウイルス、自己免疫等種々の原因に
よって、肝臓中に多量の膠質線維が生成され、肝細胞の
壊死と機能消失とが生じ、肝硬変患者は遂には死に至
る。Ｉ型コラーゲンは正常肝では全タンパク質量の約２
％を占めるが、肝硬変となると１０〜３０％を占めるよ
うになる。

【０００４】また、間質性肺疾患は、肺胞及び肺胞管の
みならず、しばしば呼吸細気管支や終末気管支も巻き込
む下部気道の慢性炎症（肺胞炎 alveolitis ）とその結
果である間質の線維化と肺胞内線維化を特徴とする疾患
群である。ここでいう間質性肺疾患とは、例えば、間質
性肺炎、肺線維症などのびまん性間質性肺疾患、特発性
肺線維症、透過性肺水腫、膠原病肺、サルコイドーシス
等を含む。間質性肺疾患においては、線維化組織では細
胞外マトリックスの過剰な産生と蓄積が認められてい
る。すなわち、間質性肺疾患の肺線維化組織では、肥大
した間質に著明なＩ型及びIII 型コラーゲンの集積がみ
られており、とくにIII 型コラーゲンは、線維化の早期
に肥厚した肺胞中隔に集積し、病期が進行し、後期には
Ｉ型コラーゲンが増加し、主要なコラーゲンとなる。基
底膜は早期に破壊されており、肺胞腔側へのコラーゲン
線維の侵入が観察される。

【０００５】また、慢性腎不全とは慢性腎炎症候群の結
果、腎機能の荒廃により体内の恒常性が維持できなくな
った状態である。慢性腎不全の進行を病理学的にみると
糸球体硬化と間質線維化の進行である。糸球体硬化症
は、メサンギウム領域を中心とした細胞外マトリックス
の増生である。メサンギウム硬化症の成分は正常と比較
し、著明にIV型コラーゲンなどの糸球体基底膜の成分が
増加し、また間質成分であるＩ型コラーゲンも硬化症部
位に一致して増生している。すなわち、慢性に経過する
糸球体硬化に対しては、細胞外マトリックスの産生亢進
が大きな要因である。ここで慢性腎不全に陥いる疾患と
は、例えばＩｇＡ腎症、巣状糸球体硬化症、膜性増殖性
腎炎、糖尿病性腎症、慢性間質性腎炎、慢性糸球体腎炎
などを含む。その他、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、強皮
症、動脈硬化等の細胞外マトリックス産生亢進の病態を
示す病気は、何らかの原因によりコラーゲン合成の異常
亢進が起こり、線維化が進んで組織の硬化変化を生ずる
ことが主要な成因と考えられている。

【０００６】また、血管新生においても基底膜及び基底
膜中のコラーゲン合成が、重要な役割をはたすことが指
摘されている（Maragoudakis, E., Sarmonika, M., and
Panoutsacopoulous, M., "J. Pharmacol. Exp. The
r.", 244: 729, 1988; Ingber,D. E., Madri, J. A., a
nd Folkman, J., "Endocrinology", 119: 1768, 1986
）。血管新生による疾患としては、例えば、糖尿病性
網膜症、後水晶体線維増殖症、角膜移植に伴う血管新
生、緑内症、眼腫瘍、トラコーマ、幹せん、化膿性肉芽
腫、血管腫、線維性血管腫、肥大性はん痕、肉芽、リュ
ーマチ性関節炎、浮腫性硬化症、アテローム性動脈硬化
症、各種腫瘍などが知られている。このようにコラーゲ
ンなどの細胞外マトリックスの産生の亢進の病態を示す
病気が大きな問題となっているにもかかわらず、従来で
は副作用や薬理効果等の種々の面で満足すべき細胞外マ
トリックス合成抑制剤（例えば、コラーゲン合成抑制
剤）は未だ開発されていなかったのである。

【０００７】一方、熱ショックタンパク質（heat shock
protein；ＨＳＰ、ストレスタンパク質ともいう）は、
細胞に何らかのストレス、例えば熱、薬剤、放射線等を
加えることにより細胞に発現されるタンパク質である。
ＨＳＰは、その種類は多種多様であるが、分子量の大き
さから９０ファミリー、７０ファミリー、６０ファミリ
ー、低分子ファミリーの４ファミリーに大別することが
できる。ストレスへの応答に加えて、これらのタンパク
質のいくつかは構成的に合成され、正常な環境のもと、
タンパク質のフォールディング、アンフォールディン
グ、タンパク質サブユニットの会合、タンパク質の膜輸
送のような、必須の生理的な役割を演じていることが示
されている。熱ショックタンパク質としてのこれらの機
能は、分子シャペロンと称される。

【０００８】ＨＳＰ４７は、永田等によって１９８６年
に発見されたタンパク質で、分子量４７キロダルトンの
塩基性タンパク質（ｐＩ＝９．０）である。ＨＳＰ４７
の発現が増大するにつれて、コラーゲンの合成も増加す
ることが様々な細胞で示されている（"J. Biol. Che
m.", 261: 7531, 1986; "Eur. J. Biochem.", 206: 32
3,1992; "J. Biol. Chem.", 265: 992, 1990; "J. Cli
n. Invest.", 94: 2481, 1994)。すなわち、ＨＳＰ４７
は、細胞内で小胞体内でのプロコラーゲンのプロセシン
グ、三重鎖ヘリックス形成、あるいは小胞体からゴルジ
装置へのプロコラーゲン輸送・分泌という局面で、コラ
ーゲンの特異的分子シャペロンとして機能しているとさ
れているので、増大したＨＳＰ４７発現は、細胞外マト
リックスにおけるコラーゲン分子の蓄積を刺激する。こ
のようにコラーゲン結合熱ショックタンパク質であるＨ
ＳＰ４７は、発現と同様に機能においても、細胞外マト
リックスタンパク質であるコラーゲンに密接に関連した
熱ショックタンパク質である。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記事
情に鑑み、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢
性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、交
通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性瘢痕、強皮症、
動脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞外マトリックス
産生亢進の病態を示す病気の患者の生理学的状態を有効
に改善させ、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は
慢性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、
交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性瘢痕、強皮
症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞外マトリッ
クス産生亢進の病態を示す病気を効果的に治療すること
のできる、細胞外マトリックス合成抑制剤を提供するた
めに、種々検討を重ねてきた。

【００１０】上記したように、肝硬変、間質性肺疾患、
慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢
痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥
厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの
線維症は臓器内の細胞外マトリックスの著しく増加した
病態が主病変と理解されている。肝硬変、間質性肺疾
患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後
の瘢痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイド
や肥厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチな
どの細胞外マトリックス産生亢進の病態を示す病気に伴
う線維化は、コラーゲン生合成増加やコラーゲン分解能
の低下により生ずると考えられている。例えば、肝の線
維化において、Ｉ型、III 型、IV型コラーゲンの合成活
性化が起こるが、特に主要成分であるＩ型コラーゲンの
合成活性化が重要な意味をもつ。

【００１１】こうした状況下で、本発明者らは、意外に
も、麦芽抽出物が、病態を示す組織の細胞におけるＨＳ
Ｐ４７の合成を特異的に抑制することを見出した。すな
わち、麦芽抽出物を投与することにより、細胞内でのＨ
ＳＰ４７合成を抑制し、臓器内でのコラーゲン合成を抑
制し、ひいては肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又
は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕や熱傷性瘢
痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性瘢痕、強
皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞外マトリ
ックス産生亢進の病態を示す病気の治療が可能であるこ
とを見出したのである。本発明はこうした知見に基づく
ものであり、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は
慢性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、
交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性瘢痕、強皮
症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞外マトリッ
クス産生の亢進の病態を示す病気を効果的に治療するこ
とができるＨＳＰ４７の合成抑制剤であって、細胞内で
のコラーゲンの成熟及び輸送過程に重要な役割を果たし
ているコラーゲン特異的な分子シャペロンであるＨＳＰ
４７の合成抑制剤を提供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、麦芽
抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、Ｈ
ＳＰ４７の合成抑制剤に関する。

【００１３】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明のＨＳＰ４７合成抑制剤の有効成分として含有され
る麦芽抽出物は、特に限定されず、例えば、市販の麦芽
抽出物（ＭＡＬＴ ＥＸＴＲＡＣＴ）をそのまま、ある
いは好ましくは市販の麦芽抽出物（ＭＡＬＴ ＥＸＴＲ
ＡＣＴ）を透析等の手段により低分子画分を除去したも
のを用いることができる。

【００１４】また、麦芽を糖化した後、濾別し、濾過残
渣を水又は親水性溶媒で抽出し、抽出液から低分子画分
を除去して得られる麦芽抽出物を用いることが好まし
い。この場合、水又は親水性溶媒がアルカリ水溶液又は
アルカリ性親水性溶媒であり、そのアルカリ水溶液又は
アルカリ性親水性溶媒によって抽出して得られた抽出液
を中和して沈殿する物質を除去し、得られる上清から低
分子画分を除去して得られる麦芽抽出物を用いることが
より好ましい。また、水又は親水性溶媒で抽出した後、
得られた抽出液をｐＨ３〜５に調整し、沈澱するタンパ
ク質を除去し、得られた上清を中和して沈殿する物質を
さらに除去し、得られる上清から低分子画分を除去して
得られる麦芽抽出物を用いることが更に好ましい。ま
た、アルカリ水溶液又はアルカリ性親水性溶媒によって
抽出した後、得られた抽出液をｐＨ３〜５に調整し、沈
澱するタンパク質を除去し、得られた上清を中和して沈
殿する物質をさらに除去し、得られる上清から低分子画
分を除去して得られる麦芽抽出物を用いることが特に好
ましい。

【００１５】特には、麦芽を糖化した後に濾過し、麦芽
糖化物濾過残渣を水又は親水性溶媒で抽出し、抽出液か
ら低分子画分を除去して得られる麦芽由来の生理活性物
質であって、（ｉ）分子量約１００００以上であり、
（ii）赤外線吸収スペクトルで３６００〜３２００ｃｍ
^-1及び１７００〜１６００ｃｍ^-1に吸収があり、（ii
i）プロトン核磁気共鳴スペクトルで、０．５〜６．０
ｐｐｍ及び６．０〜８．５ｐｐｍにピークがあり、（i
v）紫外線吸収スペクトルで、２００〜２５０ｎｍ及び
２５０〜３５０ｎｍに吸収があり、（ｖ）フェノール硫
酸呈色反応が陽性であり、（vi）銅フォーリン呈色反応
が陽性である、麦芽由来の生理活性物質（以下、麦芽由
来生理活性物質と称する）を用いることが好ましい。

【００１６】本発明では、前記の麦芽抽出物を調製する
ための麦芽（ｍａｌｔ）として、例えば、イネ科の穀類
種子を発芽させてつくったものを用いることができ、こ
れらの種子には、例えば、大麦、小麦、ライ麦、エン
麦、ハダカ麦、トウモロコシ等がある。これらの麦芽を
そのまま、あるいは粉砕し、さらに必要な場合には澱粉
を加え、温水を加え、糖化を行う。こうして得られた麦
芽糖化物を濾過する。ここで得られる麦芽糖化物濾液
は、一般に麦汁としてビール原料に利用されている。ま
た、もう一方の麦芽糖化物濾過残渣は、従来から家畜飼
料として用いられていたが、本発明ではこの麦芽糖化物
濾過残渣を、麦芽抽出物の原料として用いることができ
る。

【００１７】続いて、前記の麦芽糖化物濾過残渣を、常
温若しくは加熱された水、又は常温若しくは加熱された
親水性溶媒で抽出し、抽出物を得ることができる。抽出
用の親水性溶媒としては、親水性有機溶媒、例えば、低
級アルコール（例えば、メチルアルコール若しくはエチ
ルアルコール）又はケトン類（例えば、アセトン）を用
いることができ、更に前記の親水性有機溶媒と水との混
合液を用いてもよい。抽出は、例えば、乾燥又は湿潤の
麦芽糖化物濾過残渣１００重量部に対し、水、温熱アル
カリ水溶液又は親水性溶媒１０〜１，０００，０００重
量部を加え、数時間〜１昼夜程度実施するのが好まし
い。この際、攪拌処理又は超音波処理を行ったり、ある
いは界面活性剤を添加して、抽出効果を高めることがで
きる。

【００１８】また、前記の抽出用の水又は親水性溶媒が
ｐＨ１０〜１４のアルカリ水溶液であり、前記の抽出液
を中和（例えば、ｐＨ６．５〜７．５）して、生ずる沈
殿を除くことが好ましい。例えば、０．４５〜０．５５
Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で抽出すると、麦芽糖化物濾
過残渣の品質を変えることなく、抽出効率を高め、しか
も得られる抽出物の水に対する溶解性を高めることがで
きる。また、水又は親水性溶媒で抽出した後に、得られ
る抽出液を、無機酸（例えば、塩酸）又は有機酸（例え
ば、シュウ酸）によって酸性（例えば、ｐＨ３〜５）に
してタンパク質を沈殿させて除去してから、得られる上
清を前記と同様に中和して生じる沈殿物をさらに除去し
てもよい。

【００１９】前記の抽出工程により、あるいは場合によ
り、更に前記の中和処理及び／又は前記の酸性化・中和
処理（酸性化処理に続く中和処理）を行った後に、得ら
れる抽出物をそのまま本発明による合成抑制剤の有効成
分として用いることもできるが、得られた抽出物から、
例えば、透析、塩析、限外濾過、逆浸透処理、ゲル濾
過、有機溶媒による沈殿処理等の手段により、低分子画
分を除去して得られた生成物を用いることが好ましい。
特に、分子量１０，０００未満の画分を除去することが
好ましい。得られた麦芽抽出物は、そのまま使用しても
よいし、さらに濃縮して使用してもよい。また、これを
凍結乾燥、又は噴霧乾燥等粉末化して使用してもよい。

【００２０】本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤は、前記の
麦芽抽出物を、それ単独で、又は好ましくは製剤学的に
許容することのできる通常の担体と共に投与することが
できる。投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、
散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エ
マルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等
の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所
投与のクリーム若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げる
ことができる。

【００２１】これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、ア
ルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳
糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロー
ス、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロ
ース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タル
ク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコー
ル、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸などの賦形剤、結
合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希
釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿
剤、防腐剤、酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造
することができる。例えば、麦芽抽出物（特には前記の
麦芽由来生理活性物質）１重量部と乳糖９９重量部とを
混合して充填したカプセル剤などである。

【００２２】非経口投与方法としては、注射（皮下、静
脈内等）、直腸投与等が例示される。これらのなかで、
注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の調製
においては、有効成分としての麦芽抽出物の他に、例え
ば、生理食塩水、滅菌水リンゲル液等の水溶性溶剤、植
物油、脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖、塩
化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防
腐剤、懸濁化剤、乳化剤等を任意に用いることができ
る。具体的に一例を示すと、麦芽抽出物（特には前記の
麦芽由来生理活性物質）１０ｍｇとマンニトール５０ｍ
ｇとを蒸留水に溶解して１０ｍｌとし、常法で除菌した
後、２ｍｌづつを注射用小瓶に分注し、又はそのまま凍
結乾燥して注射剤とする。使用に際して、生理食塩水で
希釈して注射液とする。また、本発明のＨＳＰ４７合成
抑制剤は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手
法を用いて投与してもよい。例えば、本発明のＨＳＰ４
７合成抑制剤をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレット
に取り込ませて、このペレットを治療すべき組織中に外
科的に移植することができる。

【００２３】本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤は、これに
限定されるものではないが、麦芽抽出物（特には前記の
麦芽由来生理活性物質）を０．０１〜９９重量％、好ま
しくは０．１〜８０重量％の量で含有することができ
る。本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤を用いる場合の投与
量は、病気の種類、患者の年齢、症状の程度、投与方法
などにより異なり、特に制限はないが、麦芽抽出物（特
には前記の麦芽由来生理活性物質）量として通常成人１
人当り１mg〜１０ｇ程度を、１日１〜４回程度にわけ
て、経口的に又は非経口的に投与する。さらに、用途も
医薬品に限定されるものではなく、種々の用途、例え
ば、機能性食品や健康食品として飲食物等の形で与える
ことも可能である。本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤は、
マウスを用いる経口投与法によって急性毒性試験を行な
ったが、毒性は全く認められなかった。

【００２４】

【作用】上記したように、本発明のＨＳＰ４７合成抑制
剤に含有される麦芽抽出物は、細胞内のＨＳＰ４７合成
を特異的に抑制する作用があるので、前記麦芽抽出物を
投与すると細胞内でのＨＳＰ４７生合成が特異的に減少
し、コラーゲンの生合成が抑制される。その結果、細胞
外マトリックス産生も抑制されることになる。従って、
前記麦芽抽出物は、コラーゲンの増加を伴う細胞外マト
リックス産生亢進の病態を示す病気、例えば肝硬変、間
質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾
患）、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又
は関節リウマチなどの予防及び治療に使用することがで
きる。すなわち、本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤は、コ
ラーゲン特異的シャペロンであるＨＳＰ４７の合成を抑
制することによりコラーゲンの合成を抑制する。

【００２５】また、前記のように、血管新生において
も、基底膜及び基底膜中のコラーゲン合成が重要な役割
をはたすことが指摘されているので、本発明のＨＳＰ４
７合成抑制剤は、血管新生の異常増殖に基づく多くの疾
患の予防治療薬として極めて有用であり、先に述べたよ
うな各疾患、すなわち糖尿病性網膜症、後水晶体線維増
殖症、角膜移植に伴う血管新生、緑内症、眼腫瘍、トラ
コーマ、乾せん、化膿性肉芽腫、血管腫、線維性血管
腫、肥大性はん痕、肉芽、リューマチ性関節炎、浮腫性
硬化症、アテローム性動脈硬化症及び各種腫瘍などに用
いることができる。さらに、Ｉ型コラーゲンとフィブロ
ネクチンを基本骨格とする間質（interstitial stroma
）が癌の転移において、離脱した癌細胞が近傍の脈管
に侵入するまでのガイド役を果たすことが、明らかとな
っているので〔"BIOTHERAPY", 7 (8): 1181, 1993 〕、
本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤を投与することにより、
癌の転移を抑制することも可能である。

【００２６】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：麦芽抽出物の調製 本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤の有効成分として含有さ
れる麦芽抽出物は、特公平７−２０９８８号公報の実施
例１に記載されている方法に従って調製した。すなわ
ち、大麦１０ｋｇを発芽させ、でんぷんを加え、糖化
し、濾過後乾燥した。得られた糖化残渣の一部１００ｇ
を、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液４リットルに入
れ、沸騰水溶液中で３時間抽出し、１Ｎ塩酸でｐＨ４．
０にし、２４時間静置した後、６，０００ｒｐｍで３０
分間遠心分離を行い、沈殿を除去した。得られた上清を
１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に中和し、再
び６，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行い、得られ
た上清を減圧濃縮した後、透析用セルロースチューブ
（三光純薬、カタログ番号ＵＣ３６−３２−１０００）
を用いて流水透析を行なったところ、分子量１０，００
０未満の低分子化合物が除去されていた。得られた濃縮
溶液を凍結乾燥し、麦芽抽出物の乾燥物２３ｇを得た。

【００２７】前記の麦芽抽出物の乾燥物の、ＧＰＣ−Ｌ
ａｌｌｓ法により測定した重量平均分子量は、２０９，
０００であった。この麦芽抽出物の乾燥物のゲルクロマ
トグラフ〔充填剤：セルロファインＧＬＣ−２０００−
Ｃカラム：直径２．５ｃｍ×高さ４５ｃｍ、分取３ｍｌ
／１フラクション、検出方法：フェノール硫酸呈色（４
９０ｎｍ）、試料：３０ｍｇ／３ｍｌで注入〕を図１に
示す。このグラフから、分子量１０，０００以下のもの
が除去されていることが確認された。また、ＫＢｒ錠剤
法により、日本分光Ａ２０２型で前記麦芽抽出物の乾燥
物の赤外線スペクトルを測定した結果を図２に示す。３
６００〜３２００ｃｍ^-1及び１７００〜１６００ｃｍ^-1
に吸収が確認された。更に、３−（トリメチルシリル）
−１−プロパンスルホン酸ナトリウム（ＤＳＳ）を内部
標準物質として、ＪＥＯＬ ＪＭＮ−ＧＳＸ５００型ス
ペクトロメーターを用いて、５００ＭＨｚで前記麦芽抽
出物の乾燥物のプロトン核磁気共鳴スペクトルを測定し
た結果を、図３に示す。０．５〜６．０ｐｐｍと６．０
〜８．５ｐｐｍとにピークが確認された。更に、前記麦
芽抽出物の乾燥物の水溶液を、多目的記録用スペクトロ
メーター（島津Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ Ｒｅｃｏｒ
ｄｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰ
Ｓ−２０００）を用いて、紫外線可視吸光スペクトルを
測定した結果を、図４に示す。２００〜２５０ｎｍ及び
２５０〜３５０ｎｍに吸収が認められた。また、前記麦
芽抽出物の乾燥物のフェノール硫酸呈色反応は、陽性で
あって、糖の存在を示した。更に、前記麦芽抽出物の乾
燥物の銅フォーリン呈色反応も、陽性であって、タンパ
ク質の存在を示した。

【００２８】実施例２：抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗
体の作製 （１）抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体の調製 ヒトＨＳＰ４７のＮ末端から２〜１６番目のアミノ酸配
列に対応するアミノ酸１５個からなるペプチド〔以下、
ヒトＨＳＰ４７ペプチド（２−１６）と称する；ラット
のＨＳＰ４７の相当する部分と共通アミノ酸配列を示
す〕を自動ペプチド合成装置（ＰＳＳＭ−８システム，
島津制作所）を用いて作製し、スクシニミジル４−（ｐ
−マレイミドフェニル）ブチレート〔ＳＭＰＢ：Succin
imidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate〕を架橋剤とし
て用い、常法（"Biochemistry", 18: 690, 1979 ）によ
りラクトグロブリンと結合させ、感作抗原を作製した。
この感作抗原１５０μｇを含むリン酸緩衝生理食塩水
〔組成：ＫＣｌ＝０．２ｇ／ｌ，ＫＨ₂ ＰＯ₄ ＝０．２
ｇ／ｌ，ＮａＣｌ＝８ｇ／ｌ，Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ （無水）
＝１．１５ｇ／ｌ：以下ＰＢＳ（−）と称する：コスモ
バイオ，カタログ番号320-01〕０．２ｍｌと、等量のフ
ロイント完全アジュバント（ヤトロン，カタログ番号RM
606-1 ）とを混和し、得られた混合液０．２ｍｌを、ル
ーラット（６週齢，雌性：日本クレア）の皮下に投与
し、免疫した。同様の方法で第２次及び第３次免疫を繰
り返した後、アジュバント（Hunter's TiterMax ；CytR
x Corporation ，米国ジョージア州）を用いて６回免疫
感作を行った。感作動物より採血し、常法により血清を
分離して採取し、以下に示す酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ
法）及びウェスタンブロット法によって血清中の抗体価
を測定した。

【００２９】（２）酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）による
抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体特性の評価 前項（１）で調製したヒトＨＳＰ４７ペプチド（２−１
６）をＰＢＳ（−）に溶解し、１０μｇ／ｍｌの濃度の
ペプチド溶液を調製し、リジットアセイプレート（ファ
ルコン，カタログ番号3910）の各ウェルに前記ペプチド
溶液を５０μｌずつ滴下した。最も外側のウェルにはＰ
ＢＳ（−）５０μｌのみを入れ、湿潤下で４℃にて一晩
放置した後、前記ペプチド溶液を捨て、ＰＢＳ（−）を
用いて各ウェルを洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン
（以下、ＢＳＡと略称する）を含むＰＢＳ（−）１００
μｌを各ウェルに入れ、室温下で１時間放置した。ＰＢ
Ｓ（−）で３回洗浄した後、前項（１）で取得したルー
ラット血清５０μｌを各ウェルに入れ、１時間室温にて
放置した。ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、各ウェルに
２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ５
０μｌを入れ、室温下で１時間放置した。ＰＢＳ（−）
で２回洗浄した後、過酸化水素水４μｌを加えた０．１
Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ４．５）１０ｍｌにｏ−フ
ェニレンジアミン（ＯＰＤ）タブレット（シグマ，カタ
ログ番号P8287 ）１個（１０ｍｇ）を溶解して調製した
基質液１００μｌずつを各ウェルに滴下し、室温にて遮
光下で３０分間放置した後、各ウェルの４９２ｎｍの吸
光度をマイクロプレートリーダー（東ソー，ＭＰＲ−Ａ
４ｉ型）にて測定した。抗体価の上昇が確認された血清
を抗ヒトＨＳＰ４７ポリクローナル抗体として以下の実
施例に用いた。

【００３０】（３）ウェスタンブロット法による抗ＨＳ
Ｐ４７ポリクローナル抗体特性の評価 Ｌａｅｍｍｌｉのバッファー系（Laemmli, N. K., "Nat
ure", 283 : pp.249-256, 1970）を用いて、ＨｅＬａ細
胞のライセートのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を、以下の方法に従って
行った。濃縮ゲルの調製は次のように行った。蒸留水
６．１ｍｌ、０．５Ｍトリス（バイオ・ラッド，カタロ
グ番号161-0716）−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）２．５ｍｌ、
１０％ＳＤＳ（バイオ・ラッド，カタログ番号161-030
1）１００μｌ、及び３０％アクリルアミド（バイオ・
ラッド，カタログ番号161-0101）／Ｎ，Ｎ’−メチレン
ビスアクリルアミド（バイオ・ラッド，カタログ番号16
1-0201）１．３ｍｌを混合して、１５分間脱気し、１０
％過硫酸アンモニウム（バイオ・ラッド，カタログ番号
161-0700）５０μｌ及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメ
チルエチレンジアミン（以下、ＴＥＭＥＤと略称する）
（バイオ・ラッド，カタログ番号161-0800）１０μｌを
加えて、濃縮ゲルを調製した。

【００３１】また、分離ゲルの調製は次のように行っ
た。蒸留水４．０４５ｍｌ、１．５Ｍトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８．８）２．５ｍｌ、１０％ＳＤＳ１００μｌ、
及び３０％アクリルアミド／Ｎ，Ｎ’−メチレンビスア
クリルアミド３．３ｍｌをゆっくり混合して、１５分間
アスピレータで脱気し、１０％過硫酸アンモニウム５０
μｌ、及びＴＥＭＥＤ５μｌを加えた。

【００３２】泳動バッファーとしては、トリス９．０
ｇ、グリシン（バイオ・ラッド，カタログ番号161-071
7）４３．２ｇ、及びＳＤＳ３．０ｇに蒸留水を加えて
６００ｍｌにし、この溶液を蒸留水で５倍希釈したもの
を用いた。サンプルバッファーは、蒸留水２ｍｌ、２Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）５００μｌ、ＳＤＳ０．
３２ｇ、β−メルカプトエタノール８００μｌ、及び
０．０５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー（バイオ
・ラッド，カタログ番号161-0404）４００μｌを混合し
たものを用いた。

【００３３】後述する実施例３に示す方法に基づいてＨ
ｅＬａ細胞を培養し、そのライセートを調製した。得ら
れたＨｅＬａ細胞ライセートのＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行った後、０．４５μｍニトロセル
ロース膜（Schleicher & Schuell，カタログ番号40119
6）にゲルを密着させ、タンパク質転写装置（Trans-Blo
t Electrophoretic Transfer Cell：バイオ・ラッド）
を用いて、室温にて１００Ｖで、３時間ブロッティング
を行った。ブロッティングバッファーとしては０．０２
５Ｍトリス及び０．１９２ＭグリシンよりなりｐＨ８．
５に調整されたトリスグリシンバッファー（Tris Gly R
unning and Blotting Buffer；Enprotech，米国マサチ
ューセッツ州，カタログ番号SA100034）にメタノールを
２０％になるように加えて調製したバッファーを用い
た。

【００３４】ブロッティング後、５％スキムミルク（雪
印乳業）を含むＰＢＳ（−）溶液にニトロセルロース膜
を室温にて３０分間浸し、ブロッキングを行った。ブロ
ッキング後、スクリーナーブロッター（サンプラテッ
ク）を用いて、前項（１）で取得したルーラット血清を
１次抗体として、１次抗体反応を行った。１次抗体反応
は、２％スキムミルク（雪印乳業）を含むＰＢＳ（−）
にて１０倍希釈した前記ルーラット血清２００μｌで、
室温にて１２０分間行った。１次抗体反応終了後、スロ
ー・ロッキング・シェイカーを用いて、ＰＢＳ（−）で
５分間の振盪を２回、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（バイオ
・ラッド，カタログ番号170-6531）を含むＰＢＳ（−）
溶液で１５分間の振盪を４回、更にＰＢＳ（−）で５分
間の振盪を２回行うことにより、ニトロセルロース膜を
洗浄した。

【００３５】洗浄終了後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
ラットＩｇＧ抗体（Southern Biotechnology，カタログ
番号3030-05 ）を、２％スキムミルクを含むＰＢＳ
（−）溶液で５０００倍に希釈した溶液５ｍｌを用い
て、２次抗体反応を２時間行った。反応終了後、ＰＢＳ
（−）溶液、及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
（−）溶液で、１次抗体反応後の洗浄と同じ条件下にて
ニトロセルロース膜の洗浄を行った。余分なＰＢＳ
（−）溶液を除去した後、ウェスタンブロッティング検
出試薬（ECL Western blotting detection reagent；ア
マーシャム，カタログ番号RPN2106 ）をニトロセルロー
ス膜上に振りかけ、１分間室温にて静置した後、余分な
検出試薬を除去し、ニトロセルロース膜をラップに包
み、反応面をＸ線フィルム（コダック X-OMAT, AR カタ
ログ番号165 1454）に密着させて露光させた。現像後、
ＨＳＰ４７に相当する分子量４７キロダルトン付近のバ
ンドを測定することによって、抗ＨＳＰ４７ポリクロー
ナル抗体の反応性の検討を行った。抗体価の上昇が確認
された血清を、抗ヒトＨＳＰ４７ポリクローナル抗体と
して、以下の実施例に用いた。

【００３６】実施例３：ヒト培養癌細胞のＨＳＰ発現量
の測定 （１）ヒト培養癌細胞の培養 以下の各種ヒト培養癌細胞を、５％二酸化炭素条件下
で、熱ショック処理時以外は、３７℃で培養した。肺癌
細胞株Ｈ６９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ １１９）及び胃癌細
胞株ＫＡＴＯ III （ＡＴＣＣ ＨＴＢ １０３）は、
１０％非働化ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略称する）
を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。腎癌細胞株
ＡＣＨＮ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１１）及び子宮癌細
胞株ＨｅＬａ Ｓ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２．２）は、
１０％非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて培養した。神
経腫瘍細胞株（神経芽細胞腫）ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣ
Ｃ ＨＴＢ １０）は、非必須アミノ酸（Ｌ−アラニン
８．９ｍｇ／ｌ、Ｌ−アスパラギン・Ｈ₂ Ｏ１５ｍｇ／
ｌ、Ｌ−アスパラギン酸１３．３ｍｇ／ｌ、Ｌ−グルタ
ミン酸１４．７ｍｇ／ｌ、グリシン７．５ｍｇ／ｌ、Ｌ
−プロリン１１．５ｍｇ／ｌ及びＬ−セリン１０．５ｍ
ｇ／ｌ）及び１０％非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて
培養した。

【００３７】（２）麦芽抽出物処理及び熱ショック処理 播種２日後の前記各種ヒト培養癌細胞の培地中に、実施
例１で得られた麦芽抽出物を、最終濃度１ｍｇ／ｍｌと
なるように添加し、２４時間培養した。その後、４５℃
にて１５分間熱ショック処理をしてから、３７℃にて終
夜培養した。対照試験は、実施例１で得られた麦芽抽出
物を添加しないこと以外は前記と同様に実施した。

【００３８】（３）ヒト培養癌細胞でのＨＳＰ発現量の
測定 前項（２）で処理した各細胞を、以下に示す方法により
ホモジナイズし、ＨＳＰ発現量をウェスタンブロット法
にて測定した。すなわち、前項（２）で処理した細胞を
ＰＢＳ（−）で洗浄した後、ライシスバッファー（ｌｙ
ｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）［１．０％ＮＰ−４０、０．１
５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、２ｍＭ−Ｎ−エチルマレ
イミド、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、
２μｇ／ｍｌロイペプチン及び２μｇ／ｍｌペプスタチ
ン］１ｍｌを加え、氷上で２０分間静置した。その後、
４℃で１２０００ｒｐｍにて、２０分間、遠心を行っ
た。遠心後の上清１０μｌをＰＢＳ（−）７９０μｌに
加え、更にプロテインアッセイ染色液（Dye Reagent Co
ncentrate ：バイオラッド，カタログ番号500-0006）２
００μｌを加えた。５分間、室温にて静置した後、５９
５ｎｍで吸光度を測定してタンパク質定量を行った。

【００３９】タンパク質定量を行った試料を用いて、Ｌ
ａｅｍｍｌｉのバッファー系にて、等量のタンパク質を
含むライセートのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行った。電気泳動後、実施例２で述べた方法に従っ
て、ブロッティング及びそれに続くブロッキングを行っ
た。すなわち、タンパク質転写装置（Trans-Blot Elect
rophoretic Transfer Cell：バイオ・ラッド）を用い
て、室温にて１００Ｖにて、０．４５μｍニトロセルロ
ース膜（Schleicher & Schuell，カタログ番号401196）
にゲルを密着させ、３時間ブロッティングを行った。ブ
ロッティングバッファーとしては、前記実施例２（３）
で用いたバッファーと同じものを用いた。ブロッティン
グ後、ニトロセルロース膜を１０％スキムミルク（雪印
乳業）−ＰＢＳ（−）溶液に室温にて３０分間、インキ
ュベートし非特異的結合をブロックした。

【００４０】ブロッキング後、スクリーナーブロッター
（サンプラテック）を用いて、ニトロセルロース膜の上
で、実施例２にて製造した抗ヒトＨＳＰ４７ラットポリ
クローナル抗体により、１次抗体反応を行った。その
後、ＰＢＳ（−）で５分間づつ、溶液を取り替えて２回
の洗浄をスロー・ロッキング・シェイカーによって行
い、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（バイ
オ・ラッド，カタログ番号170-6531）溶液で１５分間づ
つ、溶液を取り替えて４回の洗浄を行った。最終的に、
ＰＢＳ（−）で５分間づつ、２回の洗浄を行った。

【００４１】洗浄終了後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
ラットＩｇＧ抗体（Southern Biotechnology，カタログ
番号3030-05 ）を、２％スキムミルクを含むＰＢＳ
（−）溶液で５０００倍に希釈して調製した抗体溶液５
ｍｌを用いて、２時間、２次抗体反応を行った。反応終
了後、ニトロセルロース膜に関して、ＰＢＳ（−）溶液
で５分間づつ溶液を変えて２回、更にＰＢＳ（−）−
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で１５分間づつ溶液を変え
て５回の洗浄をスロー・ロッキング・シェイカーにより
行った。最後にＰＢＳ（−）溶液で５分間づつ２回の洗
浄を行った。余分なＰＢＳ（−）溶液を除去した後、ウ
ェスタンブロッティング検出試薬（ECL Western blotti
ng detection reagent；Amersham，カタログ番号RPN210
6 ）をニトロセルロース膜上に振りかけ、１分間インキ
ュベートした後、余分な検出試薬を除去し、ニトロセル
ロース膜をラップに包み、反応面をＸ線フィルム（コダ
ック X-OMAT, AR ，カタログ番号165 1454）に密着させ
て露光し、現像してＨＳＰ４７の有無の検討を行った。
結果を表１に示す。表中、「↓」は、対照に比べて、Ｈ
ＳＰ４７発現量が減少したことを意味する。

【００４２】

【表１】 癌種 癌細胞 ＨＳＰ４７発現量変化 肺 Ｈ６９ ↓ 子宮 ＨｅＬａ Ｓ３ ↓ 胃 ＫＡＴＯ III ↓ 腎臓 ＡＣＨＮ ↓ 神経 ＳＫ−Ｎ−ＭＣ ↓

【００４３】表１に示すとおり、麦芽抽出物は、肺癌細
胞株Ｈ６９、子宮癌細胞株ＨｅＬａＳ３、胃癌細胞株Ｋ
ＡＴＯ III 、腎臓癌細胞株ＡＣＨＮ、及び神経腫瘍細
胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣにおいてＨＳＰ４７の発現を抑制し
た。従って、麦芽抽出物は、ＨＳＰ４７の発現を抑制す
る活性を有し、ＨＳＰ４７合成抑制剤として有用である
ものと結論することができ、このことは、麦芽抽出物が
細胞外マトリックス産生の亢進に抑制的に働くことを示
している。

【００４４】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明のＨＳＰ４
７合成抑制剤は、例えば、肝硬変、間質性肺疾患、慢性
腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕や
熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性
瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞
外マトリックス産生の亢進の病態を示す病気に罹患した
細胞にみられるコラーゲン合成亢進を改善する作用を有
する。従って、本発明によるＨＳＰ４７合成抑制剤を投
与することにより、臓器、組織の線維化、硬化が阻止さ
れ、その結果、前記病気の患者の生理学的状態を有効に
改善させ、前記病気を効果的に治療することができる。
また、本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤は、血管新生の異
常増殖を伴う各種疾患の予防治療にも有用である。さら
に、Ｉ型コラーゲンとフィブロネクチンを基本骨格とす
る間質が、癌の転移において離脱した癌細胞が近傍の脈
管に侵入するまでのガイド役を果たすことが、明らかと
なっているので、本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤を投与
することにより、癌の転移を抑制することも可能であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた麦芽抽出物の乾燥物のクロ
マトグラフを例示したものである。

【図２】実施例１で得られた麦芽抽出物の乾燥物の赤外
吸収スペクトルを例示したものである。

【図３】実施例１で得られた麦芽抽出物の乾燥物の核磁
気共鳴スペクトルを例示したものである。

【図４】実施例１で得られた麦芽抽出物の乾燥物の紫外
可視吸光スペクトルを例示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 35/78 ＡＣＶ Ａ６１Ｋ 35/78 ＡＣＶ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 麦芽抽出物を有効成分として含有するこ
   とを特徴とする、分子量４７キロダルトンの熱ショック
   タンパク質の合成抑制剤。
2. 【請求項２】 麦芽抽出物が、麦芽を糖化し、得られた
   麦芽糖化物を濾過し、得られた麦芽糖化物濾過残渣を水
   又は親水性溶媒で抽出し、得られた抽出液から分子量１
   ０，０００未満の低分子化合物画分を除去して得られる
   生成物である、請求項１に記載の分子量４７キロダルト
   ンの熱ショックタンパク質の合成抑制剤。
3. 【請求項３】 前記の水又は親水性溶媒がアルカリ性で
   あり、そのアルカリ性の水又は親水性溶媒による抽出に
   よって得られた抽出液を中和して沈殿する物質を除去す
   る、請求項２に記載の分子量４７キロダルトンの熱ショ
   ックタンパク質の合成抑制剤。
4. 【請求項４】 水又は親水性溶媒で抽出した後、得られ
   た抽出液をｐＨ３〜５に調整し、沈澱するタンパク質を
   除去し、得られた上清を中和して沈殿する物質をさらに
   除去する、請求項２又は３に記載の分子量４７キロダル
   トンの熱ショックタンパク質の合成抑制剤。