JP3003978B2 - ペオニフロリン含有ｈｓｐ４７合成抑制剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ペオニフロリン又はそ
の誘導体を有効成分として含有する、分子量４７キロダ
ルトンの熱ショックタンパク質（以下、ＨＳＰ４７と称
する）の合成抑制剤に関する。本発明のＨＳＰ４７合成
抑制剤は、特に、臓器内のコラーゲンの合成を抑制する
ことにより肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢
性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、交
通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性瘢痕、強皮症、
動脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞外マトリックス
（細胞外基質）産生亢進の病態を示す病気の患者の生理
学的状態を有効に改善させ、肝硬変、間質性肺疾患、慢
性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕
や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚
性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの細
胞外マトリックス産生亢進の病態を示す病気を効果的に
治療することができる。

【０００２】

【従来の技術】近年、コラーゲンなどの細胞外マトリッ
クスの産生の亢進の病態を示す病気が大きな問題となっ
ている。ここでいう細胞外マトリックス産生の亢進の病
態を示す病気とは、例えば肝硬変、間質性肺疾患、慢性
腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕や
熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性
瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどを含
む。

【０００３】例えば、死亡者がわが国だけでも年間約２
万人にものぼるといわれている肝硬変は、肝臓が結合組
織の増殖のため固くなる病気の総称で、種々の慢性肝疾
患の終末像であるといわれ、肝全体にわたるびまん性の
肝線維症である。すなわち、肝炎などの肝傷害が長期に
及ぶ慢性肝炎においては、線維芽細胞や伊東細胞などの
細胞外マトリックス（特にＩ型コラーゲン）産生の著し
い亢進を伴い肝臓は線維化する。肝の線維化が慢性的に
進行すると、ますます正常な肝再生は妨害され、肝細胞
に置き換わり、線維芽細胞とＩ型コラーゲンを主体とす
る細胞外マトリックスが肝組織のかなりの部分を占め、
多くの凝小葉からなる肝硬変に至る。肝硬変の進行に伴
い、線維隔壁が肝全体に進展し、その結果生じる血流の
異常は、肝実質細胞の変性を更に押し進める一因にもな
り、肝硬変における悪循環が続くことになり、更にはア
ルコール、ウイルス、自己免疫等種々の原因によって、
肝臓中に多量の膠質線維が生成され、肝細胞の壊死と機
能消失とが生じ、肝硬変患者は遂には死に至る。Ｉ型コ
ラーゲンは正常肝では全タンパク質量の約２％を占める
が、肝硬変となると１０〜３０％を占めるようになる。

【０００４】また、間質性肺疾患は、肺胞及び肺胞管の
みならず、しばしば呼吸細気管支や終末気管支も巻き込
む下部気道の慢性炎症（肺胞炎 alveolitis)とその結果
である間質の線維化と肺胞内線維化を特徴とする疾患群
である。ここでいう間質性肺疾患とは、例えば、間質性
肺炎、肺線維症などのびまん性間質性肺疾患、特発性肺
線維症、透過性肺水腫、膠原病肺、サルコイドーシスな
どを含む。間質性肺疾患においては、線維化組織では細
胞外マトリックスの過剰な産生と蓄積が認められてい
る。すなわち、間質性肺疾患の肺線維化組織では、肥大
した間質に著明なＩ型及び III型コラーゲンの集積がみ
られており、特に III型コラーゲンは、線維化の早期に
肥厚した肺胞中隔に集積し、病期が進行し、後期にはＩ
型コラーゲンが増加し、主要なコラーゲンとなる。基底
膜は早期に破壊されており、肺胞腔側へのコラーゲン線
維の侵入が観察される。

【０００５】また、慢性腎不全とは慢性腎炎症候群の結
果、腎機能の荒廃により体内の恒常性が維持できなくな
った状態である。慢性腎不全の進行を病理学的にみると
糸球体硬化と間質線維化の進行である。糸球体硬化症
は、メサンギウム領域を中心とした細胞外マトリックス
の増生である。メサンギウム硬化症の成分は正常と比較
し、著明にIV型コラーゲンなどの糸球体基底膜の成分が
増加し、また間質成分であるＩ型コラーゲンも硬化症部
位に一致して増生している。すなわち、慢性に経過する
糸球体硬化に対しては、細胞外マトリックスの産生亢進
が大きな要因である。ここで慢性腎不全に陥いる疾患と
は、例えばＩｇＡ腎症、巣状糸球体硬化症、膜性増殖性
腎炎、糖尿病性腎症、慢性間質性腎炎、慢性糸球体腎炎
などを含む。その他、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、あるい
は強皮症、動脈硬化等の細胞外マトリックス産生亢進の
病態を示す病気は、何らかの原因によりコラーゲン合成
の異常亢進が起こり、線維化が進んで組織の硬化変化を
生ずることが主要な成因と考えられている。

【０００６】また、血管新生においても基底膜及び基底
膜中のコラーゲン合成が、重要な役割をはたすことが指
摘されている（Maragoudakis, E., Sarmonika, M., and
Panoutsacopoulous, M., "J. Pharmacol. Exp. The
r.", 244 : 729, 1988; Ingber,D. E., Madri, J. A.,
and Folkman, J., "Endocrinology", 119 : 1768, 198
6）。血管新生による疾患としては、例えば、糖尿病性
網膜症、後水晶体線維増殖症、角膜移植に伴う血管新
生、緑内症、眼腫瘍、トラコーマ、幹せん、化膿性肉芽
腫、血管腫、線維性血管腫、肥大性はん痕、肉芽、リュ
ーマチ性関節炎、浮腫性硬化症、アテローム性動脈硬化
症、各種腫瘍などが知られている。このようにコラーゲ
ンなどの細胞外マトリックスの産生の亢進の病態を示す
病気が大きな問題となっているにもかかわらず、従来で
は副作用や薬理効果等の種々の面で満足すべき細胞外マ
トリックス合成抑制剤（例えば、コラーゲン合成抑制
剤）は未だ開発されていなかったのである。

【０００７】一方、熱ショックタンパク質（heat shock
protein；ＨＳＰ、ストレスタンパク質ともいう）は、
細胞に何らかのストレス、例えば熱、薬剤、放射線等を
加えることにより細胞に発現されるタンパク質である。
ＨＳＰは、その種類は多種多様であるが、分子量の大き
さから９０ファミリー、７０ファミリー、６０ファミリ
ー、低分子ファミリーの４ファミリーに大別することが
できる。ストレスへの応答に加えて、これらのタンパク
質のいくつかは構成的に合成され、正常な環境のもと、
タンパク質のフォールディング、アンフォールディン
グ、タンパク質サブユニットの会合、タンパク質の膜輸
送のような、必須の生理的な役割を演じていることが示
されている。熱ショックタンパク質としてのこれらの機
能は、分子シャペロンと称される。

【０００８】ＨＳＰ４７は、永田等によって１９８６年
に発見されたタンパク質で、分子量４７キロダルトンの
塩基性タンパク質（ｐＩ＝９．０）である。ＨＳＰ４７
の発現が増大するにつれて、コラーゲンの合成も増加す
ることが様々な細胞で示されている（"J. Biol. Che
m.", 261 : 7531, 1986; "Eur. J. Biochem.", 206 : 3
23, 1992; "J. Biol. Chem.", 265 : 992, 1990; "J.
Clin. Invest.", 94 : 2481, 1994)。すなわち、ＨＳ
Ｐ４７は、細胞内で小胞体内でのプロコラーゲンのプロ
セシング、三重鎖ヘリックス形成、あるいは小胞体から
ゴルジ装置へのプロコラーゲン輸送・分泌という局面
で、コラーゲンの特異的分子シャペロンとして機能して
いるとされているので、増大したＨＳＰ４７発現は、細
胞外マトリックスにおけるコラーゲン分子の蓄積を刺激
する。このようにコラーゲン結合熱ショックタンパク質
であるＨＳＰ４７は、発現と同様に機能においても、細
胞外マトリックスタンパク質であるコラーゲンに密接に
関連した熱ショックタンパク質である。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記事
情に鑑み、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢
性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、交
通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性瘢痕、強皮症、
動脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞外マトリックス
産生亢進の病態を示す病気の患者の生理学的状態を有効
に改善させ、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は
慢性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、
交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性瘢痕、強皮
症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞外マトリッ
クス産生亢進の病態を示す病気を効果的に治療すること
のできる、細胞外マトリックス合成抑制剤を提供するた
めに、種々検討を重ねてきた。

【００１０】上記したように、肝硬変、間質性肺疾患、
慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢
痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥
厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの
線維症は臓器内の細胞外マトリックスの著しく増加した
病態が主病変と理解されている。肝硬変、間質性肺疾
患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後
の瘢痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイド
や肥厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチな
どの細胞外マトリックス産生亢進の病態を示す病気に伴
う線維化は、コラーゲン生合成増加やコラーゲン分解能
の低下により生ずると考えられている。例えば、肝の線
維化において、Ｉ型、 III型、IV型コラーゲンの合成活
性化が起こるが、特に主要成分であるＩ型コラーゲンの
合成活性化が重要な意味をもつ。

【００１１】こうした状況下で、本発明者らは、意外に
も、芍薬（Ｐａｅｏｎｉａｅ Ｒａｄｉｘ）の成分であ
るペオニフロリン（Ｐａｅｏｎｉｆｌｏｒｉｎ）、又は
その誘導体が、病態を示す組織の細胞におけるＨＳＰ４
７の合成を特異的に抑制することを見出した。すなわ
ち、ペオニフロリン又はその誘導体を投与することによ
り、細胞内でのＨＳＰ４７の合成を抑制し、臓器内での
コラーゲン合成を抑制し、ひいては肝硬変、間質性肺疾
患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後
の瘢痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイド
や肥厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチな
どの細胞外マトリックス産生亢進の病態を示す病気の治
療が可能であることを見出したのである。本発明はこう
した知見に基づくものであり、肝硬変、間質性肺疾患、
慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢
痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥
厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの
細胞外マトリックス産生の亢進の病態を示す病気を効果
的に治療することのできるＨＳＰ４７合成抑制剤であっ
て、細胞内でのコラーゲンの成熟及び輸送過程に重要な
役割を果たしているコラーゲン特異的な分子シャペロン
であるＨＳＰ４７の合成抑制剤を提供することを目的と
する。

【００１２】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、ペオ
ニフロリン、あるいは、オキシペオニフロリン、ベンゾ
イルペオニフロリン、ベンゾイルオキシペオニフロリ
ン、アルビフロリン、ガロイルペオニフロリン、ペオニ
フロリンテトラアセテート、ペオニフロリンペンタアセ
テート、デスベンゾイルペオニフロリン、ペオニフロリ
ンテトラアセテートトシレート、ペオニフロリンモノベ
ンゾエートトリアセテート、及びペオニフロリンモノベ
ンゾエートからなる群から選んだペオニフロリン誘導体
を有効成分として含有することを特徴とする、ＨＳＰ４
７合成抑制剤に関する。

【００１３】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明のＨＳＰ４７合成抑制剤に有効成分として含まれる
ペオニフロリン（Ｐａｅｏｎｉｆｌｏｒｉｎ；Ｃ₂₃Ｈ₂₈
Ｏ₁₁＝４８０．４７）は、式

【化１】 （式中、Ｇｌｃはグルコース残基である）で表される配
糖体であり、例えば、芍薬等の生薬に含まれている。な
お、前記のペオニフロリンには、多種の立体異性体が存
在するが、本発明では、それらの任意の純粋な立体異性
体又はそれらの混合物を用いることができる。

【００１４】本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤に含有され
るペオニフロリンは、化学合成によって、又は天然物か
ら抽出して精製することによって、調製することができ
る。あるいは、市販品を用いてもよい。また、本発明の
ＨＳＰ４７合成抑制剤において有効成分として用いるペ
オニフロリンを、天然物から抽出する場合には、ペオニ
フロリンを含有する植物の全体又は一部分（例えば、全
草、葉、根、根茎、茎、根皮、若しくは花）をそのまま
用いて、又は簡単に加工処理（例えば、乾燥、切断、若
しくは粉末化）したもの（例えば、生薬）を用いて抽出
する。抽出条件は一般的に植物抽出に用いられる条件な
らば特に制限はない。

【００１５】本発明におけるペオニフロリンは、生薬か
ら抽出する場合、これに限定するものではないが、例え
ば芍薬から抽出することが好ましい。本明細書において
は、植物としての「シャクヤク」（Ｐａｅｏｎｉａ ｌ
ａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ）と、生薬としての
「芍薬」（Ｐｅｏｎｙ Ｒｏｏｔ；ＰＡＥＯＮＩＡＥＲ
ＡＤＩＸ）とを、カタカナと漢字とで区別して表記す
る。すなわち、芍薬とは、シャクヤク又はその近縁植物
（Ｐａｅｏｎｉａｃｅａｅ）の根の生又は乾燥物を意味
し、それらの部分を単独であるいは任意に組み合わせて
使用することができる。

【００１６】本発明によるＨＳＰ４７合成抑制剤におい
て有効成分として用いる芍薬抽出物は、前記のペオニフ
ロリンを含有していればよく、従って、芍薬の粗抽出物
を用いることができる。本発明で用いる芍薬抽出物の製
造方法としては、芍薬を、例えば、水（例えば、温水、
好ましくは熱湯）によって抽出するか、又は有機溶媒を
用いて抽出する。有機溶媒としては、例えば、メチルア
ルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコー
ル、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、酢酸
メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、アセ
トン、メチルイソブチルケトン、石油エーテル、シクロ
ヘキサン、四塩化炭素、トルエン、ベンゼン、ジクロロ
メタン、クロロホルム、エーテル、ピリジン、ポリエチ
レングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリ
コール、又はアセトニトリルなどを用いることができ、
これらの有機溶媒を単独、又は適宜組み合わせ、一定の
比率で混合し、更には無水又は含水状態で用いることが
できる。好ましくは、エチルアルコール、メチルアルコ
ール、水、ブチレングリコール、含水アルコール、又は
アセトニトリル−水混合溶媒等が望ましい。

【００１７】水抽出又は有機溶媒抽出の方法としては、
通常の生薬抽出に用いられる方法を用いることができ、
例えば（乾燥）芍薬１重量部に対し、水又は有機溶媒５
〜３００重量部を用いて、攪拌しながら、その沸点以下
の温度で加熱還流することが望ましい。抽出工程は、通
常は５分〜７日間、好ましくは１０分〜２４時間実施
し、必要に応じて、攪拌等の補助的手段を加えることに
より、抽出時間を短縮することができる。

【００１８】抽出工程終了後、濾過又は遠心分離等の適
当な方法により、水又は有機溶媒抽出液から、不溶物を
分離して粗抽出物を得ることができる。なお、本発明の
ＨＳＰ４７合成抑制剤において、天然物より抽出、分画
したペオニフロリンを用いる場合には、前記の粗抽出物
を特に精製することなく、そのまま使用してもよい。常
法による熱水抽出物又は有機溶媒抽出物の他に、前記の
粗抽出物を各種有機溶媒又は吸着剤等により、更に処理
した精製抽出物も、本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤の有
効成分として用いることができる。これらの粗抽出物及
び各種の精製処理を終えた精製抽出物を含む芍薬抽出物
は、抽出したままの溶液を用いても、溶媒を濃縮したエ
キスを用いても良いし、溶媒を留去し乾燥した粉末、更
には結晶化して精製したもの、あるいは粘性のある物質
を用いても良く、またそれらの希釈液を用いることもで
きる。こうして得られた芍薬抽出物は、芍薬に含まれる
ペオニフロリンを含み、同時に原料の芍薬に由来する不
純物を含んでいる。

【００１９】また、ペオニフロリン誘導体としては、生
薬中に本来含有されているペオニフロリン誘導体〔例え
ば、オキシペオニフロリン（Ｏｘｙｐａｅｏｎｉｆｌｏ
ｒｉｎ）、ベンゾイルペオニフロリン（Ｂｅｎｚｏｙｌ
ｐａｅｏｎｉｆｌｏｒｉｎ）、ベンゾイルオキシペオニ
フロリン（Ｂｅｎｚｏｙｌｏｘｙｐａｅｏｎｉｆｌｏｒ
ｉｎ）、アルビフロリン（Ａｌｂｉｆｌｏｒｉｎ）、ガ
ロイルペオニフロリン（Ｇａｌｌｏｙｌｐａｅｏｎｉｆ
ｌｏｒｉｎ）など〕；抽出、分画の際の化学的処理によ
って変換した誘導体；及び化学的修飾を行った誘導体
〔例えば、ペオニフロリンテトラアセテート（Ｐａｅｏ
ｎｉｆｌｏｒｉｎ ｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ）、ペオ
ニフロリンペンタアセテート（Ｐａｅｏｎｉｆｌｏｒｉ
ｎ ｐｅｎｔａａｃｅｔａｔｅ）、デスベンゾイルペオ
ニフロリン（Ｄｅｓｂｅｎｚｏｙｌｐａｅｏｎｉｆｌｏ
ｒｉｎ）、ペオニフロリンテトラアセテートトシレート
（Ｐａｅｏｎｉｆｌｏｒｉｎ ｔｅｔｒａａｃｅｔａｔ
ｅ ｔｏｓｙｌａｔｅ）、ペオニフロリンモノベンゾエ
ートトリアセテート（Ｐａｅｏｎｉｆｌｏｒｉｎ ｍｏ
ｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ ｔｒｉａｃｅｔａｔｅ）、ペオ
ニフロリンモノベンゾエート（Ｐａｅｏｎｉｆｌｏｒｉ
ｎ ｍｏｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ）など〕等が含まれる。

【００２０】本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤は、ペオニ
フロリン若しくはその誘導体、又はペオニフロリン含有
植物、例えば、ペオニフロリン含有生薬（特には、芍
薬）より抽出、分画したペオニフロリン含有抽出物を、
それ単独で、又は好ましくは製剤学的に許容することの
できる通常の担体と共に投与することができる。投与剤
型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、
顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、
シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は
注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリー
ム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができ
る。

【００２１】これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、ア
ルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳
糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロー
ス、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロ
ース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タル
ク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコー
ル、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸
アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性
剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、
香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防
止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
例えば、ペオニフロリン１重量部と乳糖９９重量部とを
混合して充填したカプセル剤などである。

【００２２】非経口投与方法としては、注射（皮下、静
脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなか
で、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の
調製においては、有効成分としてのペオニフロリン若し
くはその誘導体、又はペオニフロリン含有植物抽出物、
例えば、ペオニフロリン含有生薬抽出物（特には、芍薬
抽出物）の他に、例えば、生理食塩水、滅菌水リンゲル
液等の水溶性溶剤、植物油、脂肪酸エステル等の非水溶
性溶剤、ブドウ糖、塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解
補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤等を
任意に用いることができる。具体的に一例を示すと、ペ
オニフロリン１０ｍｇとマンニトール５０ｍｇとを蒸留
水に溶解して１０ｍｌとし、常法で除菌した後、２ｍｌ
ずつを注射用小瓶に分注し、又はそのまま凍結乾燥して
注射剤とする。使用に際して、生理食塩水で希釈して注
射液とする。また、本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤は、
徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて
投与してもよい。例えば、本発明のＨＳＰ４７合成抑制
剤をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ま
せて、このペレットを治療すべき組織中に外科的に移植
することができる。

【００２３】本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤は、これに
限定されるものではないが、ペオニフロリン、その誘導
体、又はその医薬上許容される塩を、０．０１〜９９重
量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有するこ
とができる。また、ペオニフロリン含有植物抽出物、例
えば、ペオニフロリン含有生薬抽出物（特には、芍薬抽
出物）を有効成分として含有する本発明のＨＳＰ４７合
成抑制剤は、その中に含まれるペオニフロリンが前記の
量範囲になるように適宜調整して、調製することができ
る。なお、ペオニフロリン含有植物抽出物、例えば、ペ
オニフロリン含有生薬抽出物（特には、芍薬抽出物）を
有効成分として含有するＨＳＰ４７合成抑制剤を、経口
投与用製剤とする場合には、製剤学的に許容することの
できる担体を用いて、製剤化することが好ましい。本発
明のＨＳＰ４７合成抑制剤を用いる場合の投与量は、病
気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は
投与方法などにより異なり、特に制限はないが、ペオニ
フロリン量として通常成人１人当り１ｍｇ〜１０ｇ程度
を、１日１〜４回程度にわけて、経口的に又は非経口的
に投与する。更に、用途も医薬品に限定されるものでは
なく、種々の用途、例えば、機能性食品や健康食品とし
て飲食物等の形で与えることも可能である。なお、本発
明に用いられるペオニフロリンはマウスを用いた急性毒
性試験における経口投与ではほとんど死亡例を見ない程
毒性が極めて弱かった。

【００２４】

【作用】上記したように、本発明のＨＳＰ４７合成抑制
剤に含有されるペオニフロリン又はその誘導体は、細胞
内のＨＳＰ４７合成を特異的に抑制する作用があるの
で、ペオニフロリン又はその誘導体を投与すると細胞内
でのＨＳＰ４７生合成が特異的に減少し、コラーゲンの
生合成が抑制される。その結果、細胞外マトリックス産
生も抑制されることになる。従って、ペオニフロリン又
はその誘導体は、コラーゲンの増加を伴う細胞外マトリ
ックス産生亢進の病態を示す病気、例えば肝硬変、間質
性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾
患）、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じ
るケロイドや肥厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節
リウマチなどの予防及び治療に使用することができる。
すなわち、本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤は、コラーゲ
ン特異的シャペロンであるＨＳＰ４７の合成を抑制する
ことによりコラーゲンの合成を抑制する。

【００２５】また、前記のように、血管新生において
も、基底膜及び基底膜中のコラーゲン合成が重要な役割
をはたすことが指摘されているので、本発明のＨＳＰ４
７合成抑制剤は、血管新生の異常増殖に基づく多くの疾
患の予防治療薬として極めて有用であり、先に述べたよ
うな各疾患、すなわち糖尿病性網膜症、後水晶体線維増
殖症、角膜移植に伴う血管新生、緑内症、眼腫瘍、トラ
コーマ、乾せん、化膿性肉芽腫、血管腫、線維性血管
腫、肥大性はん痕、肉芽、リューマチ性関節炎、浮腫性
硬化症、アテローム性動脈硬化症及び各種腫瘍などに用
いることができる。更に、Ｉ型コラーゲンとフィブロネ
クチンを基本骨格とする間質（interstitialstroma)が
癌の転移において、離脱した癌細胞が近傍の脈管に侵入
するまでのガイド役を果たすことが、明らかとなってい
るので（"BIOTHERAPY", 7 (8): 1181,1993)、本発明の
ＨＳＰ４７合成抑制剤を投与することにより、癌の転移
を抑制することも可能である。

【００２６】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体の作製 （１）抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体の調製 ヒトＨＳＰ４７のＮ末端から２〜１６番目のアミノ酸配
列に対応するアミノ酸１５個からなるペプチド〔以下、
ヒトＨＳＰ４７ペプチド（２−１６）と称する〕を自動
ペプチド合成装置（ＰＳＳＭ−８システム，島津製作
所）を用いて作製し、スクシニミジル４−（ｐ−マレイ
ミドフェニル）ブチレート〔ＳＭＰＢ：Ｓｕｃｃｉｎｉ
ｍｉｄｙｌ ４−（ｐ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙ
ｌ）ｂｕｔｙｒａｔｅ〕を架橋剤として用い、常法
（“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，１８：６９０，１９
７９）によりラクトグロブリンと結合させ、感作抗原を
作製した。この感作抗原１５０μｇを含むリン酸緩衝生
理食塩水〔組成：ＫＣｌ＝０．２ｇ／ｌ，ＫＨ_２ＰＯ_４
＝０．２ｇ／ｌ，ＮａＣｌ＝８ｇ／ｌ，Ｎａ_２ＨＰＯ_４
（無水）＝１．１５ｇ／ｌ：以下ＰＢＳ（−）と称す
る：コスモバイオ，カタログ番号３２０−０１〕０．２
ｍｌと、等量のフロイント完全アジュバント（ヤトロ
ン，カタログ番号ＲＭ６０６−１）とを混和し、得られ
た混合液０．２ｍｌを、ルーラット（６週齢，雌性：日
本クレア）の皮下に投与し、免疫した。同様の方法で第
２次及び第３次免疫を繰り返した後、アジュバント（Ｈ
ｕｎｔｅｒ’ｓＴｉｔｅｒＭａｘ；ＣｙｔＲｘ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ，米国ジョージア州）を用いて６回免
疫感作を行った。感作動物より採血し、常法により血清
を分離して採取し、以下に示す酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ
法）及びウェスタンブロット法によって血清中の抗体価
を測定した。

【００２７】（２）酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）による
抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体特性の評価 前項（１）で調製したヒトＨＳＰ４７ペプチド（２−１
６）をＰＢＳ（−）に溶解し、１０μｇ／ｍｌの濃度の
ペプチド溶液を調製し、リジットアセイプレート（ファ
ルコン，カタログ番号3910）の各ウェルに前記ペプチド
溶液を５０μｌずつ滴下した。最も外側のウェルにはＰ
ＢＳ（−）５０μｌのみを入れ、湿潤下で４℃にて一晩
放置した後、前記ペプチド溶液を捨て、ＰＢＳ（−）を
用いて各ウェルを洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン
（以下、ＢＳＡと略称する）を含むＰＢＳ（−）１００
μｌを各ウェルに入れ、室温下で１時間放置した。ＰＢ
Ｓ（−）で３回洗浄した後、前項（１）で取得したルー
ラット血清５０μｌを各ウェルに入れ、１時間室温にて
放置した。ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、各ウェルに
２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ５
０μｌを入れ、室温下で１時間放置した。ＰＢＳ（−）
で２回洗浄した後、過酸化水素水４μｌを加えた０．１
Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ４．５）１０ｍｌにｏ−フ
ェニレンジアミン（ＯＰＤ）タブレット（シグマ，カタ
ログ番号P8287)１個（１０ｍｇ）を溶解して調製した基
質液１００μｌずつを各ウェルに滴下し、室温にて遮光
下で３０分間放置した後、各ウェルの４９２ｎｍの吸光
度をマイクロプレートリーダー（東ソー，ＭＰＲ−Ａ４
ｉ型）にて測定した。抗体価の上昇が確認された血清を
抗ヒトＨＳＰ４７ポリクローナル抗体として以下の実施
例に用いた。

【００２８】（３）ウェスタンブロット法による抗ＨＳ
Ｐ４７ポリクローナル抗体特性の評価Ｌａｅｍｍｌｉの
バッファー系（Laemmli, N. K., "Nature", 283 : pp.2
49-256, 1970）を用いて、ＨｅＬａ細胞のライセートの
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を、以下の方法に従って行った。濃縮ゲル
の調製は次のように行った。蒸留水６．１ｍｌ、０．５
Ｍトリス（バイオ・ラッド，カタログ番号161-0716）−
ＨＣｌ（ｐＨ６．８）２．５ｍｌ、１０％ＳＤＳ（バイ
オ・ラッド，カタログ番号161-0301）１００μｌ、及び
３０％アクリルアミド（バイオ・ラッド，カタログ番号
161-0101）／Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド
（バイオ・ラッド，カタログ番号161-0201）１．３ｍｌ
を混合して、１５分間脱気し、１０％過硫酸アンモニウ
ム（バイオ・ラッド，カタログ番号161-0700）５０μｌ
及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミ
ン（以下、ＴＥＭＥＤと略称する）（バイオ・ラッド，
カタログ番号161-0800）１０μｌを加えて、濃縮ゲルを
調製した。また、分離ゲルの調製は次のように行った。
蒸留水４．０４５ｍｌ、１．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
８．８）２．５ｍｌ、１０％ＳＤＳ１００μｌ、及び３
０％アクリルアミド／Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリル
アミド３．３ｍｌをゆっくり混合して、１５分間アスピ
レータで脱気し、１０％過硫酸アンモニウム５０μｌ、
及びＴＥＭＥＤ５μｌを加えた。泳動バッファーとして
は、トリス９．０ｇ、グリシン（バイオ・ラッド，カタ
ログ番号161-0717）４３．２ｇ、及びＳＤＳ３．０ｇに
蒸留水を加えて６００ｍｌにし、この溶液を蒸留水で５
倍希釈したものを用いた。サンプルバッファーは、蒸留
水２ｍｌ、２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）５００μ
ｌ、ＳＤＳ０．３２ｇ、β−メルカプトエタノール８０
０μｌ、及び０．０５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブ
ルー（バイオ・ラッド，カタログ番号161-0404）４００
μｌを混合したものを用いた。

【００２９】後述する実施例２に示す方法に基づいてＨ
ｅＬａ細胞を培養し、そのライセートを調製した。得ら
れたＨｅＬａ細胞ライセートのＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行った後、０．４５μｍニトロセル
ロース膜（Schleicher & Schuell，カタログ番号40119
6）にゲルを密着させ、タンパク質転写装置（Trans-Blo
t Electrophoretic Transfer Cell：バイオ・ラッド）
を用いて、室温にて１００Ｖで、３時間ブロッティング
を行った。ブロッティングバッファーとしては０．０２
５Ｍトリス及び０．１９２ＭグリシンよりなりｐＨ８．
５に調整されたトリスグリシンバッファー（Tris Gly R
unning and Blotting Buffer ; Enprotech，米国マサチ
ューセッツ州，カタログ番号SA100034）にメチルアルコ
ールを２０％になるように加えて調製したバッファーを
用いた。ブロッティング後、５％スキムミルク（雪印乳
業）を含むＰＢＳ（−）溶液にニトロセルロース膜を室
温にて３０分間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキ
ング後、スクリーナーブロッター（サンプラテック）を
用いて、前項（１）で取得したルーラット血清を１次抗
体として、１次抗体反応を行った。１次抗体反応は、２
％スキムミルク（雪印乳業）を含むＰＢＳ（−）にて１
０倍希釈した前記ルーラット血清２００μｌで、室温に
て１２０分間行った。１次抗体反応終了後、スロー・ロ
ッキング・シェイカーを用いて、ＰＢＳ（−）で５分間
の振盪を２回、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（バイオ・ラッ
ド，カタログ番号170-6531）を含むＰＢＳ（−）溶液で
１５分間の振盪を４回、更にＰＢＳ（−）で５分間の振
盪を２回行うことにより、ニトロセルロース膜を洗浄し
た。洗浄終了後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩ
ｇＧ抗体（Southern Biotechnology，カタログ番号3030
-05)を、２％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）溶液で５
０００倍に希釈した溶液５ｍｌを用いて、２次抗体反応
を２時間行った。反応終了後、ＰＢＳ（−）溶液、及び
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）溶液で、１
次抗体反応後の洗浄と同じ条件下にてニトロセルロース
膜の洗浄を行った。余分なＰＢＳ（−）溶液を除去した
後、ウェスタンブロッティング検出試薬（ECL Western
blotting detection reagent；アマーシャム，カタログ
番号RPN2106)をニトロセルロース膜上に振りかけ、１分
間室温にて静置した後、余分な検出試薬を除去し、ニト
ロセルロース膜をラップに包み、反応面をＸ線フィルム
（コダック X-OMAT, AR カタログ番号165 1454）に密着
させて露光させた。現像後、ＨＳＰ４７に相当する分子
量４７キロダルトン付近のバンドを測定することによっ
て、抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体の反応性の検討を
行った。抗体価の上昇が確認された血清を、抗ヒトＨＳ
Ｐ４７ポリクローナル抗体として、以下の実施例に用い
た。

【００３０】実施例２：ヒト培養癌細胞のＨＳＰ発現量
の測定 （１）ヒト培養癌細胞の培養 ヒト培養子宮癌細胞株ＨｅＬａ Ｓ３（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ ２．２）を、５％二酸化炭素条件下で、熱ショック
処理時以外は、３７℃で、１０％非働化ウシ胎児血清
（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ培地にて培養した。

【００３１】（２）ペオニフロリン処理及び熱ショック
処理 播種２日後の培養ヒト子宮癌細胞株ＨｅＬａ Ｓ３の培
地中に、最終濃度１００μＭになるようにペオニフロリ
ン（松浦薬業製、キシダ化学販売、キシダ化学カタログ
番号378-60093)を添加し、２４時間培養した。その後、
４５℃にて１５分間熱ショック処理をしてから、３７℃
にて終夜培養した。対照試験は、ペオニフロリンを添加
しないこと以外は前記と同様に実施した。

【００３２】（３）ヒト培養癌細胞でのＨＳＰ発現量の
測定 前項（２）で処理した細胞を、以下に示す方法によりホ
モジナイズし、ＨＳＰ発現量をウェスタンブロット法に
て測定した。すなわち、前項（２）で処理した細胞をＰ
ＢＳ（−）で洗浄した後、ライシスバッファー（ｌｙｓ
ｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）〔１．０％ＮＰ−４０、０．１５
Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、２ｍＭ−Ｎ−エチルマレイミ
ド、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、２μ
ｇ／ｍｌロイペプチン及び２μｇ／ｍｌペプスタチン〕
１ｍｌを加え、氷上で２０分間静置した。その後、４℃
で１２０００ｒｐｍにて、２０分間、遠心を行った。遠
心後の上清１０μｌをＰＢＳ（−）７９０μｌに加え、
更にプロテインアッセイ染色液（Dye Reagent Concentr
ate : バイオラッド，カタログ番号500-0006）２００μ
ｌを加えた。５分間、室温にて静置した後、５９５ｎｍ
で吸光度を測定してタンパク質定量を行った。タンパク
質定量を行った試料を用いて、Ｌａｅｍｍｌｉのバッフ
ァー系にて、等量のタンパク質を含むライセートのＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動
後、実施例１で述べた方法に従って、ブロッティング及
びそれに続くブロッキングを行った。すなわち、タンパ
ク質転写装置（Trans-Blot Electrophoretic Transfer
Cell：バイオ・ラッド）を用いて、室温にて１００Ｖに
て、０．４５μｍニトロセルロース膜（Schleicher & S
chuell，カタログ番号401196）にゲルを密着させ、３時
間ブロッティングを行った。ブロッティングバッファー
としては、前記実施例１（３）で用いたバッファーと同
じものを用いた。ブロッティング後、ニトロセルロース
膜を１０％スキムミルク（雪印乳業）−ＰＢＳ（−）溶
液に室温にて３０分間、インキュベートし非特異的結合
をブロックした。

【００３３】ブロッキング後、スクリーナーブロッター
（サンプラテック）を用いて、ニトロセルロース膜の上
で、実施例１にて製造した抗ヒトＨＳＰ４７ラットポリ
クローナル抗体により、１次抗体反応を行った。その
後、ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、溶液を取り替えて２回
の洗浄をスロー・ロッキング・シェイカーによって行
い、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（バイ
オ・ラッド，カタログ番号170-6531）溶液で１５分間ず
つ、溶液を取り替えて４回の洗浄を行った。最終的に、
ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、２回の洗浄を行った。洗浄
終了後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体
（Southern Biotechnology，カタログ番号3030-05)を、
２％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）溶液で５０００倍
に希釈して調製した抗体溶液５ｍｌを用いて、２時間、
２次抗体反応を行った。反応終了後、ニトロセルロース
膜に関して、ＰＢＳ（−）溶液で５分間ずつ溶液を変え
て２回、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶
液で１５分間ずつ溶液を変えて５回の洗浄をスロー・ロ
ッキング・シェイカーにより行った。最後にＰＢＳ
（−）溶液で５分間ずつ２回の洗浄を行った。余分なＰ
ＢＳ（−）溶液を除去した後、ウェスタンブロッティン
グ検出試薬（ECL Westernblotting detection reagen
t；Amersham，カタログ番号RPN2106)をニトロセルロー
ス膜上に振りかけ、１分間インキュベートした後、余分
な検出試薬を除去し、ニトロセルロース膜をラップに包
み、反応面をＸ線フィルム（コダック X-OMAT,AR,カタ
ログ番号165 1454）に密着させて露光し、現像してＨＳ
Ｐ４７の有無の検討を行った。その結果によれば、ペオ
ニフロリンは子宮癌細胞株ＨｅＬａ Ｓ３においてＨＳ
Ｐ４７の発現を抑制した。すなわち、ペオニフロリン
は、ＨＳＰ４７の発現を抑制するＨＳＰ４７合成抑制剤
の活性を有するものと結論づけられ、この事実は、ペオ
ニフロリンが細胞外マトリックス産生の亢進に抑制的に
働くことを示している。

【００３４】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明のＨＳＰ４
７合成抑制剤は、例えば、肝硬変、間質性肺疾患、慢性
腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕や
熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性
瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞
外マトリックス産生の亢進の病態を示す病気に罹患した
細胞にみられるコラーゲン合成亢進を改善する作用を有
する。従って、本発明によるＨＳＰ４７合成抑制剤を投
与することにより、臓器、組織の線維化、硬化が阻止さ
れ、その結果、前記病気の患者の生理学的状態を有効に
改善させ、前記病気を効果的に治療することができる。
また、本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤は、血管新生の異
常増殖を伴う各種疾患の予防治療にも有用である。更
に、Ｉ型コラーゲンとフィブロネクチンを基本骨格とす
る間質が、癌の転移において離脱した癌細胞が近傍の脈
管に侵入するまでのガイド役を果たすことが、明らかと
なっているので、本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤を投与
することにより、癌の転移を抑制することも可能であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 17/02 Ａ６１Ｋ 31/00 ６１７Ｃ 25/06 ６２６Ａ 35/04 ６３５Ｂ 43/00 ６４３Ｂ Ａ６１Ｋ 35/78 ６４３Ｄ 35/78 Ｃ // Ｃ０７Ｈ 17/04 Ｆ Ｃ０７Ｈ 17/04 (56)参考文献 特開 平７−258104（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 31/70 A61K 35/78 C07H 17/04 ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ペオニフロリン、あるいは、オキシペオ
   ニフロリン、ベンゾイルペオニフロリン、ベンゾイルオ
   キシペオニフロリン、アルビフロリン、ガロイルペオニ
   フロリン、ペオニフロリンテトラアセテート、ペオニフ
   ロリンペンタアセテート、デスベンゾイルペオニフロリ
   ン、ペオニフロリンテトラアセテートトシレート、ペオ
   ニフロリンモノベンゾエートトリアセテート、及びペオ
   ニフロリンモノベンゾエートからなる群から選んだペオ
   ニフロリン誘導体を有効成分として含有することを特徴
   とする、分子量４７キロダルトンの熱ショックタンパク
   質の合成抑制剤。
2. 【請求項２】 ペオニフロリン含有植物の抽出物を有効
   成分として含有することを特徴とする、分子量４７キロ
   ダルトンの熱ショックタンパク質の合成抑制剤。
3. 【請求項３】 芍薬の抽出物を有効成分として含有する
   ことを特徴とする、分子量４７キロダルトンの熱ショッ
   クタンパク質の合成抑制剤。
4. 【請求項４】 ペオニフロリン、あるいは、オキシペオ
   ニフロリン、ベンゾイルペオニフロリン、ベンゾイルオ
   キシペオニフロリン、アルビフロリン、ガロイルペオニ
   フロリン、ペオニフロリンテトラアセテート、ペオニフ
   ロリンペンタアセテート、デスベンゾイルペオニフロリ
   ン、ペオニフロリンテトラアセテートトシレート、ペオ
   ニフロリンモノベンゾエートトリアセテート、及びペオ
   ニフロリンモノベンゾエートからなる群から選んだペオ
   ニフロリン誘導体を有効成分として含有することを特徴
   とする、細胞外マトリックス産生の亢進の病態を示す病
   気の治療剤。
5. 【請求項５】 ペオニフロリン含有植物の抽出物を有効
   成分として含有することを特徴とする、細胞外マトリッ
   クス産生の亢進の病態を示す病気の治療剤。
6. 【請求項６】 芍薬の抽出物を有効成分として含有する
   ことを特徴とする、細胞外マトリックス産生の亢進の病
   態を示す病気の治療剤。
7. 【請求項７】 細胞外マトリックス産生の亢進の病態を
   示す病気が肝硬変、間質性肺疾患、又は慢性腎不全であ
   る、請求項４〜６のいずれか一項に記載の治療剤。
8. 【請求項８】 ペオニフロリン、あるいは、オキシペオ
   ニフロリン、ベンゾイルペオニフロリン、ベンゾイルオ
   キシペオニフロリン、アルビフロリン、ガロイルペオニ
   フロリン、ペオニフロリンテトラアセテート、ペオニフ
   ロリンペンタアセテート、デスベンゾイルペオニフロリ
   ン、ペオニフロリンテトラアセテートトシレート、ペオ
   ニフロリンモノベンゾエートトリアセテート、及びペオ
   ニフロリンモノベンゾエートからなる群から選んだペオ
   ニフロリン誘導体を有効成分として含有することを特徴
   とする、癌転移の抑制剤。