JPH1036267A - Ｈｓｐ２７ファミリーに属するタンパク質のエボジアミン誘導体含有合成抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 分子量１６キロダルトンから４０キロダルト
ンまでの間の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ２７ファミ
リー）がその悪性化や温熱療法の効果の減少に関連する
癌、又はＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質がそ
の発症に関連する多発性硬化症などの自己免疫疾患の患
者の生理学的状態を有効に改善させ、前記病気を効果的
に治療することができる、ＨＳＰ２７ファミリーに属す
るタンパク質の合成抑制剤を提供する。 【解決手段】 下記一般式（Ｉ）で表されるエボジアミ
ン誘導体を有効成分として含有する。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エボジアミン誘導
体を有効成分として含有する、分子量が１６キロダルト
ン（ｋＤ）から４０ｋＤまでの間の熱ショックタンパク
質群（以下、ＨＳＰ２７ファミリーと称する）に属する
タンパク質の合成抑制剤に関する。本発明によるＨＳＰ
２７ファミリーに属するタンパク質の合成抑制剤は、特
に、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の組織内
合成を抑制することによって、ＨＳＰ２７ファミリーに
属するタンパク質が発症、悪性化、又は治療の障害に関
与するものと考えられている病気、例えば、癌、又は多
発性硬化症などの患者の生理学的状態を有効に改善さ
せ、前記の病気を効果的に治療することができる。

【０００２】

【従来の技術】近年の化学療法、外科療法、放射線療
法、及び免疫療法などの進歩にもかかわらず、依然とし
て癌による死亡原因に癌の悪性化が直接的又は間接的に
関わっており、癌の悪性化の克服が今後の癌治療の大き
な課題の一つとなっている。癌の悪性度は、癌の増殖
性、浸潤性、又は転移性などによって定められる。悪性
化の現象の一つである転移は原発癌の種類により、転移
を起こしやすい臓器が異なる。癌の転移は複合事象であ
り、原発腫瘍の増殖、癌細胞の原発巣からの離脱と周辺
組織への浸潤・増殖から始まって、腫瘍血管新生、癌細
胞の最寄りの血管内への侵入、血流による遠隔部位への
移動と血管内皮細胞への接着・着床、更に、血管外への
浸潤、遠隔部位（転移組織）での増殖の開始に続いて新
たな腫瘍血管が新生され、やがて可視的な転移巣の形成
に至るまでの複雑な反応カスケードから成り立ってい
る。一般に、癌は、高い悪性度を有するものと、比較的
に悪性度の低いものとに分けられる。しかし、悪性度の
高い癌に対しては根本的な治療法は確立しておらず、患
者は遂には死に至ることが極めて多い。

【０００３】また、癌の温熱療法（ハイパーサーミア；
hyperthermia）とは、癌組織を加温することにより、腫
瘍細胞を選択的に殺し、癌を治療しようとする方法であ
り、近年注目を浴びている。温熱療法による癌治療は、
温熱の生物学的効果をみると、４１〜４５℃の比較的温
和な加温で細胞致死効果が得られること、また放射線や
抗癌剤などと併用することにより相乗的な効果が得られ
ることなど、有利な点が多い。温熱療法による癌の治療
法は、臨床においてはほとんどすべての各科で試みられ
ている。しかし、温熱療法の問題点の一つは、加温後一
過性に誘導される温熱耐性である。すなわち、癌細胞が
１回目の加温により一時的に温熱耐性になるために、次
の加温による殺細胞効果が減少する。温熱耐性とは、細
胞（又は組織）を一度亜致死的な加温をすることによ
り、次の加温に対してその細胞（又は組織）が一過性に
温熱抵抗性になることである。温熱耐性のため、現在ほ
とんどの施設において温熱療法を行うのは週１〜２回に
限定されているのが現状である。

【０００４】また、癌の化学療法においても、化学療法
に殆ど反応しない肺癌や大腸癌などの固型癌が依然とし
て存在する一方で、化学療法剤に反応する癌でも、やが
て抗癌剤が効かなくなる耐性化が問題となっている。１
９８８年のアメリカの統計によれば、１年間に診断され
た癌の４９％が化学療法に最初から抵抗性を示す内因性
耐性であり、４７％が当初化学療法が有効で、腫瘍がい
ったん消退した後に再発した獲得性耐性とされている。
これらの事実から、癌に対する化学療法の効果を妨げる
最も重要な問題の一つは細胞毒性薬剤に対する耐性であ
ることがわかる。

【０００５】また、多発性硬化症（multiple sclerosi
s，ＭＳ）は中枢神経白質を特異的に障害する炎症性脱
髄性疾患であり、その発症機序に、神経線維を包んでい
るミエリン鞘を免疫系が攻撃することが示されている自
己免疫疾患である。多発性硬化症は多くの場合、初期に
は急性憎悪・寛解を繰り返すが、その後徐々に進行性の
経過をとるようになる。急性期の症状改善を目的とした
ものとして、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）や副腎
皮質ステロイド剤が、また寛解期での再発予防や慢性進
行型の症状進展防止を目的として、アザチオプリンやサ
イクロフォスファミドなどの免疫抑制剤が用いられてき
た。しかし、現在、多発性硬化症患者に投与されている
薬剤の多くは、その効果が期待されていたほどでなく、
非特異的な療法で副作用も多くみられるなど、十分とは
いい難いのが現状である。多発性硬化症のより特異的な
治療法の開発が期待されている。

【０００６】一方、熱ショックタンパク質（heat shock
protein；ＨＳＰ、ストレスタンパク質ともいう）は、
細胞を何らかのストレス、例えば熱、重金属、薬剤、ア
ミノ酸類似体、又は低酸素（低濃度酸素）などで刺激す
ることにより、細胞に発現される一群のタンパク質であ
る。熱ショックタンパク質は、自然界に普遍的に存在し
ており、細菌、酵母、植物、昆虫、及びヒトを含む高等
動物により産生される。

【０００７】ＨＳＰは、その種類は多種多様であるが、
分子量の大きさからＨＳＰ９０ファミリー（例えば、９
０ｋＤ又は１１０ｋＤのＨＳＰなど）、ＨＳＰ７０ファ
ミリー（例えば、７０〜７３ｋＤのＨＳＰなど）、ＨＳ
Ｐ６０ファミリー（例えば、５７〜６８ｋＤのＨＳＰな
ど）、低分子ＨＳＰファミリー（例えば、２０ｋＤ、２
５〜２８ｋＤ、又は４７ｋＤのＨＳＰなど）の４ファミ
リーに大別することができる。なお、本明細書において
は、特定分子量を有するＨＳＰを、ＨＳＰとその直後に
記載する数字とによって示すものとし、例えば、分子量
２７ｋＤのＨＳＰを『ＨＳＰ２７』と称するものとす
る。以上のように、ＨＳＰには多くの種類が存在する
が、これらは分子量だけでなく、構造、機能、又は性質
などもそれぞれ異なるものである。ストレスへの応答に
加えて、これらのタンパク質の中には構成的に合成され
るものがあり、正常な環境の下で、タンパク質のフォー
ルディング、アンフォールディング、タンパク質サブユ
ニットの会合、タンパク質の膜輸送のような、必須の生
理的な役割を演じていることが示されている。熱ショッ
クタンパク質としてのこれらの機能は、分子シャペロン
と称される。

【０００８】ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質
の発現は、ヒト乳癌において、リンパ節転移、リンパや
血管への浸潤、より短い生存率との間に顕著な相関があ
る（"J. Natl. Cancer Inst." 83: 170-178, 1991)。胃
癌においてもＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質
はネガティブな予後因子であるとの報告がある（"Br.J.
Surg.", 78: 334-336, 1991)。ＨＳＰ２７ファミリー
に属するタンパク質の原発癌細胞における発現レベルが
癌悪性度、特に癌の再発率と正の相関があるという報告
もあるので（"Breast Cancer Res. Treat.", 12: 130,
1988; "Proc.Am. Assoc. Cancer Res.", 30: 252, 19
89)、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の発現
を抑制することにより、癌の悪性化を防止することが可
能である。

【０００９】癌の温熱療法で問題となる温熱耐性にＨＳ
Ｐ２７ファミリーに属するタンパク質が関与するという
報告がある。ヒトＨＳＰ２７遺伝子をマウス又はハムス
ター細胞に導入して発現させたところ、熱ショック後に
生き残る温熱耐性の細胞がＨＳＰ２７のタンパク質の量
に依存して誘導され増加する（"J. Cell. Biol.", 109
: 7-15, 1989）。また、チャイニーズハムスター細胞
で、ＨＳＰ２７を定常的に発現するようになった変異株
が熱耐性を獲得できるようになる（"J. Cell. Physio
l.", 137 : 157, 1988)。α−Ｂクリスタリンは、熱シ
ョック処理で誘導され、ＨＳＰ２７とアミノ酸配列の相
同性が高いタンパク質であり、ＨＳＰ２７ファミリーに
属するタンパク質の一つであるが、α−Ｂクリスタリン
を過剰発現させた細胞も熱ストレスに対する耐性を獲得
する（"J. Cell. Biol.", 125 : 1385-1393, 1994)。こ
のことは、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の
発現を抑制することにより、温熱耐性を抑え、癌に対す
る温熱療法の効果を増強する可能性を示している。ま
た、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の発現と
薬剤耐性とが相関するとの報告もあるので（"Breast Ca
ncer Res. Treat.", 23:178, 1992; "Cancer Res.", 5
1: 5245-5252, 1991)、ＨＳＰ２７ファミリーに属する
タンパク質の発現を抑制することにより、薬剤耐性を抑
え、化学療法の効果を増強することも可能である。

【００１０】多発性硬化症における免疫的に優性な抗原
が、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質であるα
−Ｂクリスタリンであることが突き止められている（"N
ature", 375 : 739-740, 1995)。α−Ｂクリスタリン
は、多発性硬化症患者の神経組織中での発現が、非発病
者の組織中での発現よりも強く、非常に免疫原性が高い
（"Nature", 375 : 798-801, 1995)。これらの事実は、
多発性硬化症で自己抗原となっているのは、ＨＳＰ２７
ファミリーに属するタンパク質の１種であるα−Ｂクリ
スタリンであり、ミエリン鞘におけるα−Ｂクリスタリ
ンの発現を抑制することが多発性硬化症の根本的治療に
結び付くことを示している。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記事
情に鑑み、癌や多発性硬化症などの病気の患者の生理学
的状態を有効に改善させ、前記の病気を効果的に治療す
ることのできる方法を開発するために、ＨＳＰ２７ファ
ミリーに属するタンパク質に対して合成抑制作用を示す
化合物に関して、種々検討を重ねてきた。その結果、本
発明者らは、意外にも、呉茱萸（ごしゅゆ）の成分であ
るエボジアミン、又はその誘導体が、病態を示す組織の
細胞におけるＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質
の合成を特異的に抑制することを見出した。すなわち、
エボジアミン誘導体を投与することによって、細胞内で
のＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の合成が抑
制され、従って、癌や多発性硬化症などの病気の治療が
可能であることを見出したのである。本発明はこうした
知見に基づくものであり、癌や多発性硬化症などの病気
を効果的に治療することのできる、ＨＳＰ２７ファミリ
ーに属するタンパク質の合成抑制剤を提供することを目
的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、式
（Ｉ）：

【化３】 （式中、Ｒは炭素数１〜３のアルキル基である）で表さ
れるエボジアミン誘導体を有効成分として含有すること
を特徴とする、分子量１６キロダルトンから４０キロダ
ルトンまでの間の熱ショックタンパク質（すなわち、Ｈ
ＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質）の合成抑制剤
に関する。

【００１３】本明細書において、「ＨＳＰ２７ファミリ
ー」とは、前記のとおり、分子量が１６ｋＤ〜４０ｋＤ
の熱ショックタンパク質群を意味する。ＨＳＰ２７ファ
ミリーに属するタンパク質としては、例えば、哺乳動物
のＨＳＰ２７（すなわち、分子量２７ｋＤの熱ショック
タンパク質）〔若しくはＨＳＰ２８（すなわち、分子量
２８ｋＤの熱ショックタンパク質）〕、トリのＨＳＰ２
５（すなわち、分子量２５ｋＤの熱ショックタンパク
質）、又は酵母のＨＳＰ２６（すなわち、分子量２６ｋ
Ｄの熱ショックタンパク質）などを挙げることができ
る。なお、一般的に、タンパク質の分子量は、例えば、
分子量測定方法又は実験条件などの違いにより多少の差
が生じるので、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク
質の中には、例えば、哺乳動物におけるＨＳＰ２７とＨ
ＳＰ２８とのように、分子量表記が異なっていても、そ
れらがアミノ酸配列の異なる別異のタンパク質であるの
か、あるいは単に分子量表記のみが外見上異なる同一の
タンパク質であるのかが、現在のところ明らかではない
ものも含まれている。ＨＳＰ２７ファミリーに属するタ
ンパク質は、前記の低分子ＨＳＰファミリーに属する熱
ショックタンパク質のうち哺乳動物において最も主要な
熱ショックタンパク質であり、生物種を超えてよく保存
された特徴を示す。しかし、ＨＳＰ２７ファミリーに属
するタンパク質は、他の熱ショックタンパク質とは異な
り、種ごとに異なる分子量を有しており、分子量１６ｋ
Ｄ〜４０ｋＤと、非常に多様なタンパク質である。ま
た、ＨＳＰ２７とアミノ酸配列の相同性の高いα−Ｂク
リスタリンも熱ショック処理で誘導され、ＨＳＰ２７フ
ァミリーに属するタンパク質の一つである

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明の合成抑制剤は、有効成分として前記式
（Ｉ）で表されるエボジアミン誘導体を含有する。炭素
数１〜３のアルキル基とは、例えば、メチル基、エチル
基、ｎ−プロピル基、又はｉ−プロピル基である。前記
式（Ｉ）で表されるエボジアミン誘導体には、立体異性
体が存在し、それらの任意の純粋の立体異性体又はそれ
らの混合物を、本発明の合成抑制剤の有効成分として用
いることができる。

【００１５】本発明の合成抑制剤において有効成分とし
て使用することのできるエボジアミン誘導体としては、
式（II）：

【化４】 で表されるエボジアミン（ｅｖｏｄｉａｍｉｎｅ）が好
ましい。エボジアミンは、例えば、呉茱萸（ごしゅゆ）
等の生薬に含まれている。

【００１６】本発明の合成抑制剤に含有されるエボジア
ミン誘導体は、化学合成によって、又は天然物から抽出
して精製することによって、調製することができる。あ
るいは、市販品を用いてもよい。本発明の合成抑制剤に
おいて有効成分として用いるエボジアミン誘導体を、天
然物から抽出する場合には、例えば、エボジアミン誘導
体を含有する植物の全体又は一部分（例えば、全草、
葉、根、根茎、茎、根皮、花、若しくは果実）をそのま
ま用いて、又は簡単に加工処理（例えば、乾燥、切断、
湯通し、蒸気加熱、若しくは粉末化）したもの（例え
ば、生薬）を用いて抽出する。抽出条件は一般的に植物
抽出に用いられる条件ならば特に制限はない。エボジア
ミンを含有する植物としては、これに限定するものでは
ないが、例えば、ゴシュユ（Ｅｖｏｄｉａ ｒｕｔａｅ
ｃａｒｐａ Ｂｅｎｔｈａｍ）又は石虎（Ｅｖｏｄｉａ
ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｄｏｄｅ）等を使用するこ
とができる。

【００１７】本発明におけるエボジアミンを生薬から抽
出する場合、これに限定するものではないが、例えば、
呉茱萸から抽出することが好ましい。呉茱萸（Ｅｖｏｄ
ｉａＦｒｕｉｔ；Ｅｖｏｄｉａｅ Ｆｒｕｃｔｕｓ）と
は、ゴシュユ又は石虎の果実を意味し、それらの部分を
単独であるいは任意に組み合わせて使用することができ
る。なお、本明細書においては、便宜上、植物としての
『ゴシュユ』と、生薬としての『呉茱萸』とを、カタカ
ナと漢字で区別して表記する。

【００１８】本発明による合成抑制剤において有効成分
として用いることのできる呉茱萸抽出物は、前記のエボ
ジアミンを含有していればよく、従って、呉茱萸の粗抽
出物を用いることができる。本発明で用いることのでき
る呉茱萸抽出物の製造方法としては、呉茱萸を、水（例
えば、冷水、温水、又は熱湯）によって抽出するか、又
は有機溶媒を用いて抽出することによって、得ることが
できる。有機溶媒としては、例えば、炭素数１〜６のア
ルコール（例えば、メチルアルコール、エチルアルコー
ル、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコー
ル、若しくはブチルアルコール）、エステル（例えば、
酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、若しくは酢酸
ブチル）、ケトン（例えば、アセトン若しくはメチルイ
ソブチルケトン）、エーテル、石油エーテル、ｎ−ヘキ
サン、シクロヘキサン、トルエン、ベンゼン、炭化水素
のハロゲン誘導体（例えば、四塩化炭素、ジクロロメタ
ン、若しくはクロロホルム）、ピリジン、グリコール
（例えば、プロピレングリコール、若しくはブチレング
リコール）、ポリエチレングリコール、又はアセトニト
リルなどを用いることができ、これらの有機溶媒を単
独、又は適宜組み合わせ、一定の比率で混合し、更には
無水又は含水状態で用いることができる。好ましくは、
メチルアルコール及び／又はジクロロメタン等が望まし
い。水抽出又は有機溶媒抽出の方法としては、通常の生
薬抽出に用いられる方法を用いることができ、例えば、
（乾燥）呉茱萸１重量部に対し、水又は有機溶媒３〜３
００重量部を用いて、攪拌しながら、その沸点以下の温
度で加熱還流、常温で超音波抽出、あるいは冷浸するこ
とが望ましい。抽出工程は、通常は５分〜７日間、好ま
しくは１０分〜６０時間実施し、必要に応じて、攪拌等
の補助的手段を加えることにより、抽出時間を短縮する
ことができる。

【００１９】抽出工程終了後、濾過又は遠心分離等の適
当な方法により、水又は有機溶媒抽出液から、不溶物を
分離して粗抽出物を得ることができる。なお、本発明の
合成抑制剤において、天然物より抽出、分画したエボジ
アミンを用いる場合には、前記の粗抽出物を特に精製す
ることなく、そのまま使用してもよい。常法による水抽
出物又は有機溶媒抽出物の他に、前記の粗抽出物を各種
有機溶媒又は吸着剤等により、更に処理した精製抽出物
も、本発明の合成抑制剤の有効成分として用いることが
できる。これらの粗抽出物及び各種の精製処理を終えた
精製抽出物を含む呉茱萸抽出物は、抽出したままの溶液
を用いても、溶媒を濃縮したエキスを用いても良いし、
溶媒を留去し乾燥した粉末、更には結晶化して精製した
もの、あるいは粘性のある物質を用いても良く、またそ
れらの希釈液を用いることもできる。こうして得られた
呉茱萸抽出物は、呉茱萸に含まれるエボジアミンを含
み、同時に原料の呉茱萸に由来する不純物を含んでい
る。

【００２０】本発明の合成抑制剤は、エボジアミン誘導
体、エボジアミン誘導体を含有する植物の抽出物、例え
ば、エボジアミン誘導体を含有する生薬の抽出物（特に
は、呉茱萸抽出物）を、それ単独で、又は好ましくは製
剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の
担体と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）
に投与することができる。投与剤型としては、特に限定
がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセ
ル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス
剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、
軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬な
どの非経口剤を挙げることができる。これらの経口剤
は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、
コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、
カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニ
ルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ
糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウ
ム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無
水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、
結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、
希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保
湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従っ
て製造することができる。例えば、エボジアミン１重量
部と乳糖９９重量部とを混合して充填したカプセル剤な
どである。

【００２１】非経口投与方法としては、注射（皮下、静
脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなか
で、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の
調製においては、有効成分としてのエボジアミン誘導
体、又はエボジアミン誘導体を含有する植物の抽出物、
例えば、エボジアミン誘導体を含有する生薬の抽出物
（特には、呉茱萸抽出物）の他に、例えば、生理食塩水
若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂
肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化
ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐
剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることがで
きる。また、本発明の合成抑制剤は、徐放性ポリマーな
どを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。
例えば、本発明の合成抑制剤をエチレンビニル酢酸ポリ
マーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療す
べき組織中に外科的に移植することができる。

【００２２】本発明の合成抑制剤は、これに限定される
ものではないが、エボジアミン誘導体を、０．０１〜９
９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有す
ることができる。また、エボジアミン誘導体を含有する
植物の抽出物、例えば、エボジアミン誘導体を含有する
生薬の抽出物（特には、呉茱萸抽出物）を有効成分とし
て含有する本発明の合成抑制剤は、その中に含まれるエ
ボジアミン誘導体が前記の量範囲になるように適宜調整
して、調製することができる。なお、エボジアミン誘導
体を含有する植物の抽出物、例えば、エボジアミン誘導
体を含有する生薬の抽出物（特には、呉茱萸抽出物）を
有効成分として含有する合成抑制剤を、経口投与用製剤
とする場合には、製剤学的に許容することのできる担体
を用いて、製剤化することが好ましい。

【００２３】本発明の合成抑制剤を用いる場合の投与量
は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程
度、又は投与方法などにより異なり、特に制限はない
が、エボジアミン誘導体量として通常成人１人当り１ｍ
ｇ〜１０ｇ程度を、１日１〜４回程度にわけて、経口的
に又は非経口的に投与する。更に、用途も医薬品に限定
されるものではなく、種々の用途、例えば、機能性食品
や健康食品として飲食物の形で与えることも可能であ
る。

【００２４】

【作用】上記したように、本発明の合成抑制剤に含有さ
れるエボジアミン誘導体は、細胞内のＨＳＰ２７ファミ
リーに属するタンパク質の合成を特異的に抑制する作用
があるので、前記エボジアミン誘導体を投与すると細胞
でのＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の生合成
が特異的に減少する。従って、前記エボジアミン誘導体
は、例えば、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質
がその悪性化に関連する癌の予防及び治療、ＨＳＰ２７
ファミリーに属するタンパク質がその療法への障害とな
る温熱耐性に関連する癌温熱療法の効果の増強、又はＨ
ＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質がその発症に関
連する多発性硬化症などの自己免疫疾患の予防及び治療
などに使用することができる。また、ＨＳＰ２７ファミ
リーに属するタンパク質の発現と薬剤耐性とが相関する
との報告もあるので（"Breast Cancer Res. Treat.",
23: 178, 1992; "Cancer Res.", 51: 5245-5252, 199
1)、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の発現を
抑制することにより、薬剤耐性を抑え、化学療法の効果
を増強することも可能である。

【００２５】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：ヒト培養癌細胞のＨＳＰ発現量の測定 （１）ヒト培養癌細胞の培養 以下の各種ヒト培養癌細胞を、５％二酸化炭素条件下
で、熱ショック処理時以外は、３７℃で培養した。大腸
癌細胞株ＣＯＬＯ ２０５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２２２）
は、１０％非働化ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと称す
る）含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。子宮癌細
胞株ＨｅＬａ Ｓ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２．２）は、
１０％非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて培養した。神
経腫瘍細胞株（神経芽細胞腫）ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣ
Ｃ ＨＴＢ １０）は、非必須アミノ酸（Ｌ−アラニン
８．９ｍｇ／ｌ、Ｌ−アスパラギン・Ｈ₂ Ｏ１５．０ｍ
ｇ／ｌ、Ｌ−アスパラギン酸１３．３ｍｇ／ｌ、Ｌ−グ
ルタミン酸１４．７ｍｇ／ｌ、グリシン７．５ｍｇ／
ｌ、Ｌ−プロリン１１．５ｍｇ／ｌ及びＬ−セリン１
０．５ｍｇ／ｌ）及び１０％非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ
培地にて培養した。

【００２６】（２）エボジアミン処理及び熱ショック処
理 播種２日後の大腸癌細胞株ＣＯＬＯ ２０５及び神経腫
瘍細胞株（神経芽細胞腫）ＳＫ−Ｎ−ＭＣの培地中に、
最終濃度２０μＭになるように前記式（II）で表される
エボジアミン（松浦薬業）を添加し、２４時間培養し
た。また、播種２日後の子宮癌細胞株ＨｅＬａ Ｓ３の
培地中に、最終濃度１μＭになるように前記エボジアミ
ンを添加し、２４時間培養した。その後、４５℃にて１
５分間熱ショック処理をしてから、３７℃にて終夜培養
した。対照試験は、エボジアミンを添加しないこと以外
は前記と同様に実施した。

【００２７】（３）ヒト培養癌細胞でのＨＳＰ発現量の
測定 前項（２）で処理した各細胞を、以下に示す方法により
ホモジナイズし、ＨＳＰ発現量をウェスタンブロット法
にて測定した。すなわち、前項（２）で処理した細胞
を、リン酸緩衝生理食塩水〔組成：ＫＣｌ＝０．２ｇ／
ｌ，ＫＨ₂ ＰＯ₄ ＝０．２ｇ／ｌ，ＮａＣｌ＝８ｇ／
ｌ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄ （無水）＝１．１５ｇ／ｌ；以下、
ＰＢＳ（−）と称する〕で洗浄した後、ライシスバッフ
ァー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）〔１．０％ＮＰ−４
０、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、２ｍＭ−Ｎ−エ
チルマレイミド、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフル
オリド、２μｇ／ｍｌロイペプチン及び２μｇ／ｍｌペ
プスタチン〕１ｍｌを加え、氷上で２０分間静置した。
その後、４℃で１２０００ｒｐｍにて、２０分間、遠心
を行った。遠心後の上清１０μｌをＰＢＳ（−）７９０
μｌに加え、更にプロテインアッセイ染色液（Dye Reag
ent Concentrate : バイオラッド，カタログ番号500-00
06）２００μｌを加えた。５分間、室温にて静置した
後、５９５ｎｍで吸光度を測定してタンパク質定量を行
った。

【００２８】タンパク質定量を行った試料を用いて、Ｌ
ａｅｍｍｌｉのバッファー系（Laemmli, N. K., "Natur
e", 283 : pp. 249-256, 1970)にて、等量のタンパク質
を含むライセートのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行った。電気泳動後、ブロッティング及びそれに
続くブロッキングを行った。すなわち、タンパク質転写
装置（Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell：バ
イオ・ラッド，カタログ番号170-3946）を用いて、室温
にて１００Ｖにて、０．４５μｍニトロセルロース膜
（Schleicher & Schuell，カタログ番号401196）にゲル
を密着させ、３時間ブロッティングを行った。ブロッテ
ィングバッファーとしては、０．０２５Ｍトリス及び
０．１９２ＭグリシンよりなりｐＨ８．５に調整された
トリスグリシンバッファー（Tris Gly Running and Blo
tting Buffer；Enprotech, 米国マサチューセッツ州，
カタログ番号 SA100034)にメチルアルコールを２０％に
なるように加えて調製したバッファーを用いた。ブロッ
ティング後、ニトロセルロース膜を１０％スキムミルク
（雪印乳業）−ＰＢＳ（−）溶液に室温にて３０分間、
インキュベートし非特異的結合をブロックした。

【００２９】ブロッキング後、ニトロセルロース膜の上
で、抗ヒトＨＳＰ２７マウスモノクローナル抗体（Stre
ssGen, Victoria, B.C., Canada, カタログ番号 SPA-8
00）により、１次抗体反応を行った。この抗ヒトＨＳＰ
２７マウスモノクローナル抗体は、ヒト乳癌細胞株ＭＣ
Ｆ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ ２２）より単離したＨＳＰ２
４を免疫原として作製した抗体であり（"Cancer Res.",
42, 4256-4258, 1982)、ＨＳＰ２７（ヒトＨＳＰ２
７、チンパンジーＨＳＰ２７、及びヒツジＨＳＰ２７）
と特異的に反応し（"Cancer Res.", 42, 4256-4258, 1
982 ； "Cancer Res.", 43, 4297-4301, 1983)、ＨＳＰ
２４及びＨＳＰ２８とも特異的に反応する。１次抗体反
応後、ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、溶液を取り替えて２
回の洗浄をスロー・ロッキング・シェイカーによって行
い、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（バイ
オ・ラッド，カタログ番号170-6531）溶液で１５分間ず
つ、溶液を取り替えて４回の洗浄を行った。最終的に、
ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、２回の洗浄を行った。

【００３０】洗浄終了後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
マウスＩｇＧ抗体（CAPPEL，カタログ番号55550)を、２
％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）溶液で５０００倍に
希釈して調製した抗体溶液５ｍｌを用いて、２時間、２
次抗体反応を行った。反応終了後、ニトロセルロース膜
に関して、ＰＢＳ（−）溶液で５分間ずつ溶液を変えて
２回、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液
で１５分間ずつ溶液を変えて５回の洗浄をスロー・ロッ
キング・シェイカーにより行った。最後にＰＢＳ（−）
溶液で５分間ずつ２回の洗浄を行った。余分なＰＢＳ
（−）溶液を除去した後、ウェスタンブロッティング検
出試薬（ECL Western blotting detectionreagent；Ame
rsham，カタログ番号RPN2106)をニトロセルロース膜上
に振りかけ、１分間インキュベートした後、余分な検出
試薬を除去し、ニトロセルロース膜をラップに包み、反
応面をＸ線フィルム（コダック X-OMAT, AR, カタログ
番号165 1454）に密着させて露光し、現像してＨＳＰ２
７の有無の検討を行った。結果を表１に示す。表中、
「↓」は、対照に比べて、エボジアミン処理によりＨＳ
Ｐ２７発現量が減少したことを意味する。

【００３１】

【表１】癌種 癌細胞 子宮 ＨｅＬａ Ｓ３ ↓ 大腸 ＣＯＬＯ ２０５ ↓神経 ＳＫ−Ｎ−ＭＣ ↓

【００３２】対照試験、すなわち、エボジアミンを添加
しなかった細胞では、子宮癌細胞株ＨｅＬａ Ｓ３、大
腸癌細胞株ＣＯＬＯ ２０５、及び神経腫瘍細胞株ＳＫ
−Ｎ−ＭＣにおいて、分子量約２７ｋＤのバンドが一本
検出された。なお、分子量は、前記抗ヒトＨＳＰ２７マ
ウスモノクローナル抗体との結合、及び分子量マーカー
（ダイズトリプシンインヒビター及びウシカーボニック
アンヒドラーゼ）により決定した。エボジアミンを添加
した細胞では、子宮癌細胞株ＨｅＬａ Ｓ３、大腸癌細
胞株ＣＯＬＯ ２０５、及び神経腫瘍細胞株ＳＫ−Ｎ−
ＭＣのいずれにおいても、分子量約２７ｋＤのバンドが
検出されなかった。すなわち、エボジアミンは、ＨＳＰ
２７の発現を抑制する合成抑制剤の活性を有するものと
結論することができる。

【００３３】

【発明の効果】以上詳述したように、エボジアミン誘導
体は、細胞内のＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク
質の発現を抑制する合成抑制剤の活性を有する。従っ
て、エボジアミン誘導体を投与することにより、例え
ば、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質がその悪
性化や温熱療法の効果の減少に関連する癌、その発症に
関連する多発性硬化症などの自己免疫疾患の患者の生理
学的状態を有効に改善させ、前記病気を効果的に治療す
ることができる。また、ＨＳＰ２７ファミリーに属する
タンパク質発現と薬剤耐性とが相関するとの報告もある
ので（"Breast CancerRes. Treat.",23: 178, 1992; "C
ancer Res.", 51: 5245-5252, 1991)、ＨＳＰ２７ファ
ミリーに属するタンパク質の発現を抑制することによ
り、薬剤耐性を抑え、化学療法の効果を増強することも
可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｄ 487/14 Ｃ０７Ｄ 487/14

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ｒは炭素数１〜３のアルキル基である）で表さ
   れるエボジアミン誘導体を有効成分として含有すること
   を特徴とする、分子量１６キロダルトンから４０キロダ
   ルトンまでの間の熱ショックタンパク質の合成抑制剤。
2. 【請求項２】 式（Ｉ）： 【化２】 （式中、Ｒは炭素数１〜３のアルキル基である）で表さ
   れるエボジアミン誘導体を含有する植物の抽出物を有効
   成分として含有することを特徴とする、分子量１６キロ
   ダルトンから４０キロダルトンまでの間の熱ショックタ
   ンパク質の合成抑制剤。
3. 【請求項３】 呉茱萸の抽出物を有効成分として含有す
   ることを特徴とする、分子量１６キロダルトンから４０
   キロダルトンまでの間の熱ショックタンパク質の合成抑
   制剤。