JPH10232210A - 光熱変換分光分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 試料の２次元像を短時間で分析することがで
きる光熱変換分光分析装置を提供する。 【解決手段】 励起光源１０から出射された励起光Ａお
よび検出光源２０から出射された検出光Ｂは、ダイクロ
イックミラー３０により同軸とされ、スキャナ３１およ
び３２により順次反射され、顕微鏡３５により試料４０
上に集光照射される。励起光Ａおよび検出光Ｂは、スキ
ャナドライバ３３により制御されたスキャナ３１および
３２により試料４０上を２次元走査される。励起光Ａの
集光照射により形成された熱レンズに検出光Ｂが集光照
射されると、検出光Ｂは熱レンズにより発散され、信号
光Ｃとなる。信号光Ｃは、集光レンズ５０によりピンホ
ール５１の開口部５１Ａに集光され、開口部５１Ａを通
過し、フィルタ５２を透過して、検出器５３により受光
される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、励起光を試料に照
射することにより生じる光熱効果を利用し、検出光を試
料に照射して生じた信号光を検出して、これにより試料
を分析する光熱変換分光分析技術に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】試料に光を集光照射すると、その試料
は、光吸収により局所的に温度上昇し、この温度上昇に
応じて屈折率が変化し、熱レンズが形成される。これを
光熱効果という。多くの物質では、温度上昇に伴い屈折
率は小さくなるので、熱レンズとして凹レンズが形成さ
れる。したがって、この凹レンズの中央およびその周辺
に光を入射させると、その光は発散または集光する。ま
た、この凹レンズの中央以外の部分に光を入射させる
と、その光は偏向する。

【０００３】従来より、この光熱効果を利用して試料を
分光分析することが行われており、この分析方法を光熱
変換分光法という。従来の入射光と透過光との比に基づ
いて試料分析する吸光法とは異なり、この光熱変換分光
法は、熱の拡散すなわち屈折率変化を観察するものであ
るので、吸光法に比べて極微量な試料濃度を検出するこ
とができる。それ故、光熱変換分光分析技術は、キャピ
ラリー電気泳動装置用の高感度分析装置としての利用
や、従来の吸光法の適用が困難な細胞等の生体試料への
応用が提案されている。

【０００４】この光熱変換分光分析技術を応用した光熱
変換分光分析装置として、「熱レンズ顕微鏡」なるもの
が知られている（原田明、他、熱レンズ顕微鏡の開発と
毛髪計測への応用、色材、第68巻、第10号、pp.606-612
(1995) ）。図２は、この従来の光熱変換分光分析装置
の構成図である。

【０００５】この光熱変換分光分析装置では、励起光源
１１０から出力された励起光は、チョッパ１１１により
変調され、ダイクロイックミラー１３０を透過し、反射
鏡１３１により反射され、顕微鏡１３５に入射し、この
顕微鏡１３５により試料１４０に集光照射される。その
集光照射された励起光は、試料１４０上の焦点位置で吸
収されて、その照射位置を中心として熱レンズが形成さ
れる。試料１４０に照射された励起光のうち試料１４０
により吸収されなかった光は、試料１４０を透過する
が、フィルタ１５２により吸収され、検出器１５３には
入射しない。

【０００６】一方、検出光源１２０から出力された検出
光は、ダイクロイックミラー１３０および反射鏡１３１
それぞれに順次反射され、顕微鏡１３５に入射し、この
顕微鏡１３５により試料１４０に集光照射される。顕微
鏡１３５から出射される検出光は、励起光により試料１
４０に形成された熱レンズに集光照射され、試料１４０
を透過して発散または集光する。この試料１４０から発
散または集光して出射された光は信号光となり、その信
号光は、集光レンズ１５０およびフィルタ１５２を経て
検出器１５３により検出される。

【０００７】この検出器１５３により検出された信号光
の強度は、試料１４０において形成された熱レンズに応
じたものであり、また、チョッパ１１１による励起光変
調周期に同期して変化するものである。そこで、この検
出器１５３から出力されプリアンプ１６０により増幅さ
れた信号は、ロックインアンプ１６１により、チョッパ
１１１による励起光変調周期に同期して検波され、その
ロックインアンプ１６１からの出力信号に基づいてコン
ピュータ１７０により試料１４０の分析がなされる。

【０００８】さらに、この光熱変化分光分析装置は、Ｘ
ＹＺステージ１８０を有している。このＸＹＺステージ
１８０は、試料１４０を光軸方向（Ｚ方向）に微動させ
て焦点調整するとともに、試料１４０を光軸方向に垂直
な平面（ＸＹ平面）上で２次元走査するためのものであ
る。そして、コンピュータ１７０は、ＸＹＺステージ１
８０を駆動して試料１４０をＸＹ平面上で２次元走査す
るとともに、ロックインアンプ１６１により同期検波さ
れて出力された信号を入力する。このようにすることよ
り、この光熱変換分光分析装置は、試料１４０の２次元
像を得ている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】上述のように光熱変換
分光法は、従来の吸光法に比べれば検出感度が優れてい
るものの、上記従来の光熱変換分光分析装置は、以下の
ような問題点がある。すなわち、試料１４０の２次元像
を得るために用いているＸＹＺステージ１８０は、機械
的アクチュエータを使用しているため、振動が発生し易
い。この振動は、試料１４０を分析する上でノイズとな
る。この振動によるノイズを排除するには、コンピュー
タ１７０は、ＸＹＺステージ１８０により試料１４０を
所定の変位だけ駆動した後に振動が無くなるのを待って
ロックインアンプ１６１からの出力信号を入力する操作
を１ステップとして、このステップを試料１４０上の測
定点の数だけ繰り返して行うことも考えられる。しか
し、これでは、試料１４０の２次元像の獲得に時間を要
し、実用的ではない。

【００１０】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、試料の２次元像を短時間で分析するこ
とができる光熱変換分光分析装置を提供することを目的
とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明に係る光熱変換分
光分析装置は、励起光が試料に照射されて形成される熱
レンズに検出光を入射させ、検出光が熱レンズにより発
散または集光されて出力された信号光に基づいて試料の
分光分析を行う光熱変換分光分析装置であって、(1) 励
起光を出力する励起光源と、(2) 検出光を出力する検出
光源と、(3) 励起光および検出光を互いに同軸として試
料に集光照射するとともに、試料上の集光位置を走査す
る照射光学系と、(4) 検出光の試料への照射に伴って発
生する信号光を所定点に集光する集光光学系と、(5) 所
定点に開口部を有するピンホールと、(6) ピンホールの
開口部を通過した信号光を検出する検出器と、を備える
ことを特徴とする。

【００１２】この光熱変換分光分析装置によれば、励起
光源から出力された励起光と検出光源から出力された検
出光とは、照射光学系により、互いに同軸とされて試料
に集光照射されるとともに、試料上の集光位置が走査さ
れる。励起光が試料に集光照射されると熱レンズが形成
され、検出光がその熱レンズに入射すると、信号光が発
生する。この信号光は、集光光学系によりピンホールの
開口部に集光されて、その開口部を通過し、検出器によ
り検出される。

【００１３】また、さらに、励起光および検出光それぞ
れが照射される試料上の領域を観察する観察手段を更に
備えることを特徴とする。この場合には、観察手段によ
り、照射光学系により励起光および検出光が集光照射さ
れるべき試料上の領域を確認することができ、また、集
光照射の状況を確認することにより照射光学系を調整す
ることができる。

【００１４】また、さらに、励起光源は、試料を２光子
励起し得る波長の光を励起光として出力することを特徴
とする。この場合には、試料中の光軸方向のごく限られ
た領域にのみが励起されるので、優れた分解能で試料を
分析することができる。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。図１は、本発明に係る光熱変換分光分析装置の
構成図である。

【００１６】励起光源１０は、試料４０に熱レンズを形
成するための励起光Ａを出力するものである。励起光源
１０として、指向性に優れピーク強度が高いレーザ光源
が好適に用いられ、例えば、フェムト秒パルス光を出力
するチタンサファイアレーザ光源（波長７１５ｎｍ、繰
り返し周波数７６ＭＨｚ、パルス幅１３０ｆｓ）や、モ
ードロックレーザ光励起の色素レーザ光源が用いられ
る。この励起光源１０から出力された励起光Ａは、チョ
ッパ１１により強度変調され、ビームエクスパンダ１２
により光束径が調整され、ダイクロイックミラー３０、
スキャナ３１および３２により順次反射され、瞳投影レ
ンズ３４を経て、顕微鏡３５に入射する。

【００１７】一方、検出光源２０は、試料４０に形成さ
れた熱レンズに照射すべき検出光Ｂを出力するものであ
る。検出光源２０として、同様にレーザ光源が好適に用
いられ、例えば、Ｈｅ−Ｎｅレーザ光源が用いられる。
この検出光源２０から出力された検出光Ｂは、ビームエ
クスパンダ２２により光束径が調整され、ダイクロイッ
クミラー３０を透過し、スキャナ３１および３２により
順次反射され、瞳投影レンズ３４を経て、顕微鏡３５に
入射する。

【００１８】ここで、チョッパ１１は、励起光Ａを周期
的に透過／遮断の変調をする。ビームエクスパンダ１２
および２２それぞれは、励起光Ａおよび検出光Ｂそれぞ
れの試料４０上での光軸方向集光位置の相対的位置関係
を調整して、感度調整等するためにも使用される。ダイ
クロイックミラー３０は、励起光Ａを反射させるととも
に、検出光Ｂを透過させ、また、反射した励起光Ａおよ
び透過した検出光Ｂを互いに略同軸にして出力する。

【００１９】また、スキャナ３１および３２それぞれ
は、スキャナドライバ３３による制御に従い反射面の傾
きが設定され、これにより、ダイクロイックミラー３０
から到達した励起光Ａおよび検出光Ｂの反射方向を調整
する。このスキャナ３１および３２として、例えば、１
対のガルバノメータミラー、ガルバノメータミラーとポ
リゴンミラーとの組合せ、ガルバノメータミラーとレゾ
ナントミラーとの組合せ、ガルバノメータミラーとＡＯ
Ｄ（Acoust-Optical Deflector）との組合せ、等が好適
である。

【００２０】また、顕微鏡３５は、励起光Ａおよび検出
光Ｂそれぞれを試料４０上に集光照射するものであり、
カメラ３６を備えている。このカメラ３６は、試料４０
自体だけでなく、試料４０上の励起光Ａおよび検出光Ｂ
の照射位置および集光状態を確認するものである。した
がって、分光分析に先だって試料４０の配置を決定する
とともに、励起光Ａおよび検出光Ｂが試料４０に照射さ
れる位置および集光状態を確認しながら光熱変換分光分
析を行うことができる。

【００２１】顕微鏡３５から出射された励起光Ａは、試
料４０に集光照射される。その励起光Ａの一部は試料４
０により吸収され、残部は透過する。試料４０では、励
起光吸収に伴い、励起光Ａが照射された位置を中心に温
度が上昇し熱レンズが形成される。励起光Ａがチョッパ
１１により変調されているので、この熱レンズも励起光
Ａの変調周期と同一周期で変調されたものとなる。

【００２２】同様に、顕微鏡３５から出射された検出光
Ｂは、試料４０に熱レンズが形成されている領域に照射
される。そして、検出光Ｂが試料４０に入射すると、試
料４０に形成された熱レンズにより検出光Ｂは発散また
は集光し信号光Ｃとして出射する。この信号光Ｃの強度
は、その発散または集光の度合い、即ち、熱レンズの形
成度合いを示すものであり、更には、励起光Ａが集光照
射された位置における試料４０の濃度等を示すものであ
る。

【００２３】試料４０から発生した信号光Ｃは、集光レ
ンズ５０、ピンホール５１およびフィルタ５２を順次経
て、検出器５３により検出される。ここで、集光レンズ
５０およびピンホール５１は、集光レンズ５０の前側焦
点位置が検出光Ｂの試料４０上の集光位置に一致し、且
つ、後側焦点位置がピンホール５１の開口部５１Ａに一
致するように配置される。したがって、集光レンズ５０
は、試料４０から発生した信号光Ｃを入力し、その信号
光Ｃをピンホール５１の開口部５１Ａに集光する。ま
た、フィルタ５２は、ピンホール５１の開口部５１Ａを
通過した信号光Ｃを透過させるが、試料４０を透過し更
に開口部５１Ａを通過した励起光Ａを反射または吸収す
る。検出器５３は、フィルタ５２を透過した信号光Ｃを
検出して、信号光強度に応じた電流信号を出力する。

【００２４】なお、瞳投影レンズ３４、顕微鏡３５、集
光レンズ５０、ピンホール５１、フィルタ５２および検
出器５３からなる光学系は、本装置により試料４０を分
光分析している間は固定配置されているものである。ま
た、試料４０も、分光分析中は位置固定されたままであ
り、走査されることはない。

【００２５】検出器５３から出力された電流信号を入力
するプリアンプ６０は、その電流信号を電圧信号に変換
し増幅して出力する。そして、ロックインプリアンプ６
１は、プリアンプ６０から出力された電圧信号を入力す
るとともに、チョッパ１１による励起光変調の同期信号
をも入力して、プリアンプ６０からの電圧信号を同期検
波する。このロックインアンプ６１からの出力信号は、
コントローラ６２を経て、コンピュータ７０に入力す
る。

【００２６】コンピュータ７０は、スキャンコントロー
ラ７１およびフレームグラバ７２を有し、スキャナドラ
イバ３３およびコントローラ６２に接続されている。ス
キャンコントローラ７１は、鋸波信号を発生し、その鋸
波信号をスキャナドライバ３３に送り、スキャナドライ
バ３３は、その鋸波信号に基づいて、スキャナ３１およ
び３２それぞれを駆動制御し、試料４０上の励起光Ａお
よび検出光Ｂの照射位置を２次元走査する。同時に、ス
キャンコントローラ７１は、その鋸波信号をコントロー
ラ６２にも送り、コントローラ６２は、入力したロック
インアンプ６１からの出力信号を鋸波信号に同期してサ
ンプリングしホールドする。また、フレームグラバ７２
は、コントローラ６２によりサンプリングされホールド
された信号を入力し、試料４０上の励起光Ａおよび検出
光Ｂの照射位置に対応付けて、その信号を記憶する。そ
して、コンピュータ７０は、フレームグラバ７２に記憶
された試料４０の２次元像を、そのまま或いは画像処理
して表示部７３に表示する。

【００２７】本実施形態に係る光熱変換分光分析装置は
以上のように構成されているので、以下のように作用す
る。すなわち、励起光源１０から出射された励起光Ａ
は、チョッパ１１により強度変調され、ビームエクスパ
ンダ１２により光束径が調整され、ダイクロイックミラ
ー３０により反射される。一方、検出光源２０から出射
された検出光Ｂは、ビームエクスパンダ２２により光束
径が調整され、ダイクロイックミラー３０を透過する。
ダイクロイックミラー３０で反射された励起光Ａおよび
透過した検出光Ｂは、同軸とされ、スキャナ３１および
３２により順次反射され、瞳投影レンズ３４を経て顕微
鏡３５に入射し、顕微鏡３５により試料４０上に集光照
射される。このとき、励起光Ａおよび検出光Ｂは、スキ
ャナドライバ３３により制御されたスキャナ３１および
３２により、試料４０上を２次元走査される。

【００２８】試料４０上に励起光Ａが集光照射される
と、その位置を中心に熱レンズが形成され、また、その
熱レンズに検出光Ｂが集光照射されると、その検出光Ｂ
は熱レンズにより発散または集光され、その光線は信号
光Ｃとなる。この信号光Ｃは、集光レンズ５０によりピ
ンホール５１の開口部５１Ａに集光されて、その開口部
５１Ａを通過し、フィルタ５２を透過して、検出器５３
により受光される。信号光Ｃを受光した検出器５３から
出力される電流信号は、プリアンプ６０により電圧信号
に変換され、その電圧信号は、ロックインアンプ６０に
より、チョッパ１１における励起光Ａの変調に同期して
検波される。

【００２９】このロックインアンプ６１から出力される
信号は、信号光Ｃの強度に応じたものであり、試料４０
における熱レンズの形成度合いに応じたものであり、さ
らには、励起光Ａが集光照射された位置における試料４
０の濃度等を示すものである。そして、ロックインアン
プ６１から出力された信号は、スキャナドライバ３３を
介してスキャナ３１および３２をも制御するスキャンコ
ントローラ７１による指示により、コントローラ６２を
介してコンピュータ７０に入力され、試料４０上の励起
光Ａおよび検出光Ｂの照射位置に対応付けられてフレー
ムグラバ７２に記憶される。このようにして、試料４０
の２次元像は、フレームグラバ７２に記憶され、表示部
７３に表示される。

【００３０】以上のように、本実施形態に係る光熱変換
分光分析装置によれば、試料４０を走査することなく位
置固定し、スキャナ３１および３２を用いて励起光Ａお
よび検出光Ｂを試料４０上で走査することにしたので、
従来の振動の問題を解消することができ、したがって、
短時間で試料４０を光熱変換分光分析することができ
る。また、試料４０で発生した信号光Ｃを集光レンズ５
０によりピンホール５１の開口部５１Ａの位置に集光す
ることにしたので、試料４０上の検出光Ｂの照射位置す
なわち信号光Ｃの発生位置に依らず、同一条件で信号光
Ｃを検出することができ、試料４０の２次元像を得るこ
とができる。

【００３１】また、本実施形態に係る光熱変換分光分析
装置によれば、顕微鏡３５を用いて励起光Ａを試料４０
上に集光照射することにしたので、励起光Ａの集光領域
は極めて微小な領域となり、その集光領域では励起光Ａ
は極めて高い強度になる。このように励起光Ａの強度が
高い領域においては、２光子励起が起こる確率が高い。
一般に、２光子励起は、或波長の１個の光子を吸収して
励起される分子が、その倍の波長の２個の光子を同時に
吸収することにより励起されることであり、この２光子
励起の起こる確率は、光強度の２乗に比例する。したが
って、試料４０上において２光子励起が起こる確率が高
くなる領域は、焦点近傍の極めて限られた微小な領域と
なる。

【００３２】このように２光子励起を採用すれば、試料
４０上の焦点近傍の極めて微小な領域のみが励起される
ことから、光軸に垂直な方向だけでなく、光軸方向にも
優れた分解能で試料４０を分析することができる。ま
た、紫外域や可視域に吸収を有する分子を、赤外域の励
起光により励起することができ、例えば、励起光源１０
として、大出力の近赤外レーザ光を出射し得るＹＡＧレ
ーザ光源等を使用することができる。また、２光子励起
を採用することにより、光学系由来のバックグラウンド
を低減することができ、検出感度を向上させることがで
きる。さらに、試料４０が蛍光色素を標識としたもので
ある場合、２光子励起が焦点位置のみで起こることか
ら、その他の部分では光褪色が起こらず、試料４０全体
としての光褪色を少なく抑えることができる。

【００３３】

【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり本発明によ
れば、励起光源から出力された励起光と検出光源から出
力された検出光とは、照射光学系により、互いに同軸と
されて試料に集光照射されるとともに、試料上の集光位
置が走査される。励起光が試料に集光照射されると熱レ
ンズが形成され、検出光がその熱レンズに入射すると、
信号光が発生する。この信号光は、集光光学系によりピ
ンホールの開口部に集光されて、その開口部を通過し、
検出器により検出される。

【００３４】以上のように、試料を走査することなく位
置固定し、励起光および検出光を試料上で走査すること
にしたので、従来の振動の問題を解消することができ、
したがって、短時間で試料を光熱変換分光分析すること
ができる。また、試料で発生した信号光を集光光学系に
よりピンホールの開口部の位置に集光することにしたの
で、試料上の検出光の照射位置すなわち信号光の発生位
置に依らず、同一条件で信号光を検出することができ、
試料の２次元像を得ることができる。

【００３５】また、励起光および検出光それぞれが照射
される試料上の領域を観察する観察手段を更に備える場
合には、照射光学系により励起光および検出光が集光照
射されるべき試料上の領域を確認することができ、ま
た、集光照射の状況を確認することにより照射光学系を
調整することができる。

【００３６】また、試料を２光子励起し得る波長の光を
励起光として用いる場合には、試料中の光軸方向のごく
限られた領域にのみが励起されるので優れた分解能で試
料を分析することができ、検出感度が向上し、また、光
褪色の問題が低減される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本実施形態に係る光熱変換分光分析装置の構成
図である。

【図２】従来の光熱変換分光分析装置の構成図である。

【符号の説明】

１０…励起光源、１１…チョッパ、１２…ビームエクス
パンダ、２０…検出光源、２２…ビームエクスパンダ、
３０…ダイクロイックミラー、３１，３２…スキャナ、
３３…スキャナドライバ、３４…瞳投影レンズ、３５…
顕微鏡、３６…カメラ、４０…試料、５０…集光レン
ズ、５１…ピンホール、５２…フィルタ、５３…検出
器、６０…プリアンプ、６１…ロックインアンプ、６２
…コントローラ、７０…コンピュータ、７１…スキャン
コントローラ、７２…フレームグラバ、７３…表示部、
Ａ…励起光、Ｂ…検出光、Ｃ…信号光。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 励起光が試料に照射されて形成される熱
   レンズに検出光を入射させ、前記検出光が前記熱レンズ
   により発散または集光されて出力された信号光に基づい
   て前記試料の分光分析を行う光熱変換分光分析装置であ
   って、 前記励起光を出力する励起光源と、 前記検出光を出力する検出光源と、 前記励起光および前記検出光を互いに同軸として前記試
   料に集光照射するとともに、前記試料上の集光位置を走
   査する照射光学系と、 前記検出光の前記試料への照射に伴って発生する前記信
   号光を所定点に集光する集光光学系と、 前記所定点に開口部を有するピンホールと、 前記ピンホールの前記開口部を通過した前記信号光を検
   出する検出器と、 を備えることを特徴とする光熱変換分光分析装置。
2. 【請求項２】 前記励起光および前記検出光それぞれが
   照射される前記試料上の領域を観察する観察手段を更に
   備える、ことを特徴とする請求項１記載の光熱変換分光
   分析装置。
3. 【請求項３】 前記励起光源は、前記試料を２光子励起
   し得る波長の光を前記励起光として出力する、ことを特
   徴とする請求項１記載の光熱変換分光分析装置。