JPH10201495A - セルロース生産菌とその他の微生物との混合培養によるバクテリアセルロースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 特に糖源として安価なシュクロースを用いた
場合に、高収率でセルロースを生産させることのできる
方法を提供すること。 【解決手段】 セルロース生産菌をその他の微生物と混
合培養し、培地中にセルロース性物質を生成蓄積せし
め、該物質を回収することから成る、該セルロース性物
質の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、セルロース生産菌
をその他の微生物と混合培養し、セルロース性物質（以
下、「バクテリアセルロース」又は「ＢＣ」という。）
を製造する方法に係わるものである。

【０００２】

【従来の技術】ＢＣ（バクテリアセルロース）は可食性
であり無味無臭であるため、食品分野で利用されるほ
か、水系分散性及び生分解性に優れているので食品、化
粧品又は塗料等の粘度の保持、食品原料生地の強化、水
分の保持、食品安定性向上、低カロリー添加物又は乳化
安定化助剤としての産業上利用価値がある。ＢＣは木材
パルプ等から製造されるセルロースに較べ、フィブリル
の断片幅が２ケタ程度も小さいことを特徴とする。従っ
て、ＢＣの離解物はフィブリルのかかる構造的物理的特
徴に基づき高分子、特に水系高分子用補強剤として各種
の産業用用途がある。このようなセルロース性離解物を
紙状または固型状に固化した物質は高い引張弾性率を示
すのでフィブリルの構造的特徴に基づくすぐれた機械特
性が期待され、各種産業用素材としての応用がある。従
来から、セルロース生産性の向上を目的として、セルロ
ース生産菌の培養培地に各種の特定栄養素によるセルロ
ース生成促進因子を添加する試みがなされてきた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は、特に、糖
源として安価なシュクロースを用いた場合に、セルロー
ス生産菌を乳酸菌及び酵母等のその他の微生物と混合培
養することにより、微生物間の共生現象を利用して、高
収率でセルロースを生産させることのできることを見い
だし、本発明を完成させたのである。普通、共生現象と
は、それに関わるパートナーの両方がお互いに何らかの
利益を得る狭い意味での共生（双利的共生）を指すが、
この他に、一方のみが利益を受けて他方は特別の影響を
受けない片利共生も含まれる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、セルロ
ース生産菌をその他の微生物と混合培養し、培地中にセ
ルロース性物質を生成蓄積せしめ、該物質を回収するこ
とから成る、該セルロース性物質の製造方法に係わる。
その他の微生物としては、例えば、乳酸菌又は酵母菌を
挙げることが出来るが、本発明の所望の効果を達成する
ことができる限り、特に、菌の種類に制限はない。ここ
で、「乳酸菌」とは一般に、糖類より乳酸を生成する一
群の細菌の総称であり、その代表的な例として、ラクト
バチルス(Lactobacillus) 属、ロイコノストック(Leuco
nostoc) 属、ペディオコッカス(Pediococcus) 属及びス
トレプトコッカス(Streptococcus) 属等がある。又、
「酵母」とは一般に、糖分からアルコールと二酸化炭素
を生産する真核細胞の一群の総称であり、菌類に属し、
パン酵母並びにビール、ワイン及び日本酒等の酒類の発
酵醸造に使用されているSaccharomyces cerevisiae, Sa
ccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces sake等を含
むSaccharomyces 属等がある。セルロース生産菌とその
他の微生物との菌体数の割合は、各菌株の種類等に応じ
て当業者が適宜選択することが出来るが、通常、１：１
ないし１：¹/₂₀₀ の範囲が適当であろう。尚、混合培養
をセルロース生産菌の培養の全過程で必ずしも採用する
必要はなく、例えば、最初はセルロース生産菌単独で培
養し、その後の適当な時期に、その他の微生物との混合
培養を実施しても良い。

【０００５】本発明におけるバクテリアセルロースの製
造方法に使用されるセルロース生産菌は、例えば、ＢＰ
Ｒ２００１株に代表されるアセトバクター・キシリナム
・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンス（Acet
obacter xylinum subsp. sucrofermentans）、アセトバ
クター・キシリナム（Acetobacter xylinum ）ＡＴＣＣ
２３７６８、アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ２３
７６９、アセトバクター・パスツリアヌス（A. pasteur
ianus ）ＡＴＣＣ１０２４５、アセトバクター・キシリ
ナムＡＴＣＣ１４８５１、アセトバクター・キシリナム
ＡＴＣＣ１１１４２及びアセトバクター・キシリナムＡ
ＴＣＣ１０８２１等の酢酸菌（アセトバクター属）、そ
の他に、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、サルシ
ナ属、シュードモナス属、アクロモバクター属、アルカ
リゲネス属、アエロバクター属、アゾトバクター属及び
ズーグレア属並びにそれらをＮＴＧ（ニトロソグアニジ
ン）等を用いる公知の方法によって変異処理することに
より創製される各種変異株である。尚、ＢＰＲ２００１
株は、平成５年２月２４日に通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され
（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３４６６）、その後１９９
４年２月７日付で特許手続上の寄託の国際的承認に関す
るブダペスト条約に基づく寄託（受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４５４５）に移管されている。

【０００６】ＮＴＧ等の変異剤を用いての化学的変異処
理方法には、例えば、Bio Factors,Vol. l, p.297−302
(1988)及び J. Gen. Microbiol, Vol. 135, p.2917−2
929(1989) 等に記載されているものがある。従って、当
業者であればこれら公知の方法に基づき本発明で用いる
変異株を得ることができる。また、本発明で用いる変異
株は他の変異方法、例えば放射線照射等によっても得る
ことができる。本発明に使用するセルロース生産菌とし
ては、特に、酢酸塩及び乳酸塩の酸化能が実質的にない
（陰性）か、又は微弱である、アセトバクター・キシリ
ナム・サブスピーシーズ・ノンアセトオキシダンス（Ac
etobacter xylinum subsp. nonacetoxidans)が好まし
い。該アセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ
・ノンアセトオキシダンスに属する具体的な菌株の例と
して、Ｓ−３５′−３、７５７−３−５−１１、及び１
８４−２−２と命名された株があり、これらは、１９９
６年４月１２日付で通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され、それぞ
れ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５５６３、ＦＥＲＭ Ｐ
−１５５６４、及びＦＥＲＭ Ｐ−１５５６５を付され
ている。

【０００７】上述の方法によって創製されるセルロース
生産菌の中でも、通気攪拌培養することによって、ポリ
スチレン換算の重量平均重合度が１．６×１０⁴ 以上、
好ましくは１．７×１０⁴ 以上である高重合度のバクテ
リアセルロースを製造するか、又は、静置培養すること
によって、ポリスチレン換算の重量平均重合度が２．０
×１０⁴ 以上である高重合度のバクテリアセルロースを
製造する菌株も好ましい。本発明で使用し得る高重合度
のバクテリアセルロースの生産菌のうち、ＢＰＲ３００
１Ａは、平成７年６月１２日付で通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託
され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４９８２を付されてい
る。一般的に、高分子材料の強度や弾性率は、高分子の
重合度が高いほど、高いものとなることが知られてい
る。バクテリアセルロースの場合にも同様で、高重合度
のバクテリアセルロースを原料として形成させた被膜
は、相対的に低い重合度のバクテリアセルロースを原料
として形成させた被膜と比較して、その強度や弾性率が
高い。従って、本発明に於いて、高強度や弾性率のもの
を形成させたい場合には、先に述べたような高重合度の
バクテリアセルロースを用いた方が高い効果が得られ
る。

【０００８】本発明におけるＢＣ等の各種セルロースの
重量平均重合度は、検出器としてＲＩを内蔵したＧＰＣ
システム（Tosoh ＨＬＣ−８０２０）を用いて以下のよ
うにして測定する。各種セルロース試料を発煙硝酸−五
酸化リン溶液で W.J. Alexander, R.L. Mitchell, Anal
ytical chemistry 21, 12, 1497-1500 (1949) の方法に
よりニトロ化する。コントロールとして同時にニトロ化
したコットンリンターを用いる。セルロースニトロ化物
はＴＨＦ（和光純薬 １級）に０．０５％濃度で溶かし
たのち、１．０μｍポアサイズのフィルターで濾過す
る。ＧＰＣの溶離液にもＴＨＦを用いる。流速は０．５
ml／min 、圧力は１０〜１３kg f／cm² 、サンプル注入
量は１００μl とする。カラムはＴＳＫｇｅｌ ＧＭＨ
−ＨＲ（Ｓ）（７．５ＩＤ×３００mm×２本）とガード
カラム（ＨＨＲ（Ｓ））(Tosoh Co., Ltd.) を用い３５
℃で測定する。分子量算出のためにスタンダードポリス
チレン(Tosoh) を用いポリスチレン換算の相対分子量を
求める。２×１０⁷ から２６３０の分子量のポリスチレ
ンを用い、溶出時間（ｔ）と分子量の対数（ｌｏｇＭ）
について、３次式：（ｌｏｇＭ＝Ａｔ³ ＋Ｂｔ² ＋Ｃｔ
＋Ｄ）による近似を行いスタンダード曲線を作製する。
分子量はTosoh のデータ処理専用機（ＳＣ−８０２０）
に内蔵されたプログラム（ｖｅｒ．３，１０）により重
量平均分子量を計算する。これらの分子量の値からニト
ロ化後の置換度を考慮して重量平均重合度を計算する。

【０００９】培養に用いる培地の組成物中、炭素源とし
てはシュクロース、グルコース、フラクトース、マンニ
トール、ソルビトール、ガラクトース、マルトース、エ
リスリット、グリセリン、エチレングリコール、エタノ
ール等を単独或いは併用して使用することができる。更
にはこれらのものを含有する澱粉水解物、シトラスモラ
セス、ビートモラセス、ビート搾汁、サトウキビ搾汁、
柑橘類を始めとする果汁等をシュクロースに加えて使用
することもできる。 また、窒素源としては硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のア
ンモニウム塩、硝酸塩、尿素等有機或いは無機の窒素源
を使用することができ、或いはＰｅｐｔｏｎｅ、Ｓｏｙ
ｔｏｎｅ、Ｙｅａｓｔ−Ｅｘｔｒａｃｔ、大豆加水分解
物などの含窒素天然栄養源を使用してもよい。有機微量
栄養素としてアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、２，
７，９−トリカルボキシ−１Ｈピロロ〔２，３，５〕−
キノリン−４，５−ジオン、亜硫酸パルプ廃液、リグニ
ンスルホン酸等を添加してもよい。

【００１０】生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変
異株を使用する場合には、要求される栄養素を補添する
ことが必要である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネ
シウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、コバルト
塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート金属類等が使用
される。更に、イノシトール、フィチン酸、ピロロキノ
リンキノン（ＰＱＱ）（特公平５−１７１８号公報；高
井光男，紙パ技協誌，第４２巻，第３号，第２３７〜２
４４頁）、カルボン酸又はその塩（特願平５−１９１４
６７号）、インベルターゼ（特願平５−３３１４９１
号）、メチオニン（特願平５−３３５７６４号）、サポ
ニン（特願平６−２１４３３４号）並びにコリンホスホ
グリセリド、脂肪酸及びその塩又はエステル、コリン誘
導体並びにベタイン（特願平８−３１６９２２号）等の
従来のセルロース生成促進因子を培地中に添加し、より
優れた相乗効果を得ることも出来る。又、乳酸菌及び酵
母等のその他の微生物の培養に必要な因子を適宜添加す
ることも出来る。本発明の混合培養のｐＨは３ないし７
に、好ましくは５付近に制御する。培養温度は１０〜４
０℃、好ましくは２５〜３５℃の範囲で行う。培養装置
に供給する酸素濃度は１〜１００％、望ましくは２１〜
８０％であれば良い。これら培地中の各成分の組成割合
及び培地に対する菌体の接種等は培養方法に応じて当業
者が適宜選択し得るものである。バクテリアセルロース
は、従来より、微生物を培養する培養形式として公知の
形式、即ち、静置、振盪もしくは通気攪拌培養等、ま
た、培養操作法として公知の、いわゆる回分発酵法、流
加回分発酵法、反復回分発酵法及び連続発酵法等によっ
て製造することができる。

【００１１】尚、攪拌培養とは、培養液を攪拌しながら
行なう培養法であり、当該攪拌培養中に受ける攪拌作用
によって、バクテリアセルロースの構造が、例えば、結
晶化指数が低下して非晶部が増すように変化する。攪拌
手段としては、例えばインペラー（攪拌羽根）、エアー
リフト発酵槽、発酵ブロスのポンプ駆動循環、及びこれ
ら手段の組合せ等を使用することができる。更に、本出
願人名義の特願平６−１９２２８７号に記載された培養
装置と分離装置の間で菌体を含む培養液を循環させるセ
ルロース性物質の製造方法であって、該分離装置に於い
て、生産物であるセルロース性物質を菌体及び培養液か
ら分離することを特徴とする前記方法や、同じく、本出
願人名義の特願平６−１９２２８８号に記載されたセル
ロース生産菌を培養してセルロース性物質を製造する方
法であって、培養期間中、培養系からの培養液の引き抜
き及び該引き抜き量とほぼ等容量の新たな培養液の供給
を連続的に行なうことによって、培養中の培養液に於け
るセルロース性物質の濃度を低く維持することを特徴と
する前記製造方法がある。

【００１２】前記攪拌培養を行なうための槽としては、
例えば、ジャーファーメンター及びタンク等の攪拌槽、
並びにバッフル付きフラスコ、坂口フラスコ及びエアー
リフト型の攪拌槽が使用可能であるがこの限りではな
い。本発明でいう攪拌培養においては、攪拌と同時に、
必要に応じて、通気を行なっても良い。ここでいう通気
とは、例えば空気等の酸素を含有するガス、並びに例え
ばアルゴン及び窒素等の酸素を含有しないガスのいずれ
を通気しても良く、これらガスは培養系の条件に合わせ
て当業者により適宜、選択されよう。例えば、嫌気性の
微生物の場合は、不活性ガスを通気をすれば、その気泡
によって培養液を攪拌することができる。好気性の微生
物の場合には、酸素を含有するガスを通気することで微
生物の成育に必要な酸素を供給すると同時に、培養液を
攪拌することができる。

【００１３】攪拌培養により得たバクテリアセルロース
を遠心分離法又は濾過法等により培養液から分離する。
バクテリアセルロースは菌体と一緒に回収してもよく、
さらに本物質中に含まれる菌体を含むセルロース性物質
以外の不純物を取り除く処理を施すことが出来る。不純
物を取り除くためには、水洗、加圧脱水、希酸洗浄、ア
ルカリ洗浄、次亜塩素酸ソーダ及び過酸化水素などの漂
白剤による処理、リゾチームなどの菌体溶解酵素による
処理、ラウリル硫酸ソーダ、デオキシコール酸などの界
面活性剤による処理、常温から２００℃の範囲の加熱洗
浄などを単独及び併用して行い、セルロース性物質から
不純物をほぼ完全に除去することができる。このように
して得られた本発明でいうセルロース性物質とは、セル
ロース及び、セルロースを主鎖としたヘテロ多糖を含む
もの及びβ−１，３、β−１，２等のグルカンを含むも
のである。ヘテロ多糖の場合のセルロース以外の構成成
分はマンノース、フラクトース、ガラクトース、キシロ
ース、アラビノース、ラムノース、グルクロン酸等の六
炭糖、五炭糖及び有機酸等である。なおこれ等の多糖が
単一物質である場合もあるし２種以上の多糖が水素結合
等により混在してもよい。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、実施例により本発明を詳細
に説明するが、これは本発明を限定するものではない。

【００１５】

【実施例】実施例１ 以下に示す組成を有するＣＳＬ−Ｓｕｃ培地を用いて、
３００ml斜めバッフルフラスコ（培地張り込み７５ml）
に７５７−３−５−１１株のシード菌液７．５mlを無菌
的に植菌し、更に、市販の乳酸飲料等に含まれるラクト
バチルス属の乳酸菌であるＬＢ８１菌を含む市販の乳酸
飲料を種々の濃度で加えて混合培養系を作り、２８℃、
１５０rpm で３日間振盪培養後のＢＣ蓄積量を求めた。
その結果を表４に示す。

【００１６】

【表１】

【００１７】

【表２】ビタミン混合液 化合物 mg／Ｌ イノシトール ２００ ナイアシン ４０ ピリドキシンＨＣｌ ４０ チアミンＨＣｌ ４０ パントテン酸カルシウム ２０ リボフラビン ２０ ｐ−アミノ安息香酸 ２０ 葉 酸 ０．２ ビオチン ０．２

【００１８】

【表３】塩類混合液 ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ３６０mg／Ｌ ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ １４７０mg／Ｌ Ｎａ₂ ＭｏＯ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ ２４２mg／Ｌ ＺｎＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ １７３mg／Ｌ ＭｎＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ １３９mg／Ｌ ＣｕＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ ５mg／Ｌ

【００１９】

【表４】

【００２０】表４から明らかなように、乳酸菌ＬＢ８１
菌とセルロース生産菌を混合培養することにより、ＢＣ
蓄積量が最大約１．５倍程度に増大したことが判る。

【００２１】実施例２ ＣＳＬ濃度を２．０％にした実施例１記載のＣＳＬ−Ｓ
ｕｃ培地を用いて、各種ＢＣ生産菌の単独培養（植菌量
７％）及びそれらと乳酸菌（Lactobacillus sp. ATCC 1
3866）との混合培養（植菌量各３．５％）を実施例１の
培養系で３日間行ない、以下の表５に示す結果を得た。

【００２２】

【表５】

【００２３】この表から乳酸菌（Lactobacillus sp. AT
CC 13866）との混合培養によってＢＣの蓄積量が約３倍
程増大することが判る。

【００２４】実施例３ シュクロース濃度を２．０％、硫酸アンモニウム濃度を
０．１％及びＣＳＬ濃度を２．０％とした実施例１記載
のＣＳＬ−Ｓｕｃ培地１０mlを含む試験管にＢＣ生産菌
（Acetobacter xylinum ATCC 23769）及び酵母菌（Sacc
haromyces cere visae ATCC 9763)をそれぞれ一白金耳ず
つ接種し２８℃に保って静置培養し、培地表面に形成さ
れたＢＣ膜の厚さを７日目及び１４日目に測定した。そ
の結果を表６に示す。酵母菌と混合培養することでＢＣ
の生産量が約４〜５倍になったことが判る。

【００２５】

【表６】

【００２６】尚、上記実施例中、ＢＣ蓄積量（ｇ／Ｌ）
は、培養終了後、培養液中の固形物を集積し、水洗して
培地成分を除去した後、ＩＮＮａＯＨ水溶液中で８０
℃、２０分間処理して菌体を除去した。さらに、洗浄液
が中性付近になるまで生成セルロースを水洗した後、８
０℃で１２時間真空乾燥して乾燥重量を測定することで
求めた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:02 1:225） (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:02 1:865）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 セルロース生産菌をその他の微生物と混
   合培養し、培地中にセルロース性物質を生成蓄積せし
   め、該物質を回収することから成る、該セルロース性物
   質の製造方法。
2. 【請求項２】 その他の微生物が乳酸菌又は酵母である
   請求項１記載の製造方法。
3. 【請求項３】 乳酸菌がラクトバチルス属のものである
   請求項２記載の製造方法。