JPH10179180A - Ｃｃ−ｃｋｒ５レセプターのマウスゲノムクローン - Google Patents
Ｃｃ−ｃｋｒ５レセプターのマウスゲノムクローンInfo
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7158—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規マウスＣＣ−ＣＫＲ５ポリペプチドおよ
び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）が望ま
れている。 【解決手段】 本発明は、配列番号２のアミノ酸からな
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なく
とも８５％の同一性を有するポリヌクレオチド；遺伝コ
ードの縮重性により、配列番号２と同じアミノ酸をコー
ドするポリヌクレオチド；前記のポリヌクレオチドに相
補的なポリヌクレオチド；および前記のポリヌクレオチ
ドの少なくとも１５個の連続した塩基からなるポリヌク
レオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを
含んでなる単離ポリヌクレオチドを提供するものであ
る。
び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）が望ま
れている。 【解決手段】 本発明は、配列番号２のアミノ酸からな
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なく
とも８５％の同一性を有するポリヌクレオチド；遺伝コ
ードの縮重性により、配列番号２と同じアミノ酸をコー
ドするポリヌクレオチド；前記のポリヌクレオチドに相
補的なポリヌクレオチド；および前記のポリヌクレオチ
ドの少なくとも１５個の連続した塩基からなるポリヌク
レオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを
含んでなる単離ポリヌクレオチドを提供するものであ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一部は、新規に同
定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体；ポ
リヌクレオチドおよびポリペプチド、およびそれらの変
種および誘導体の製造方法；ポリペプチドのアゴニスト
およびアンタゴニスト；ならびにポリヌクレオチド、ポ
リペプチド、変種、誘導体、アゴニストおよびアンタゴ
ニストの使用に関する。特に、これらの点および他の点
に関して、本発明は、以下、「マウスＣＣ−ＣＫＲ５」
と称するマウス・ケモカイン（chemokine）レセプター
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。
定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体；ポ
リヌクレオチドおよびポリペプチド、およびそれらの変
種および誘導体の製造方法；ポリペプチドのアゴニスト
およびアンタゴニスト；ならびにポリヌクレオチド、ポ
リペプチド、変種、誘導体、アゴニストおよびアンタゴ
ニストの使用に関する。特に、これらの点および他の点
に関して、本発明は、以下、「マウスＣＣ−ＣＫＲ５」
と称するマウス・ケモカイン（chemokine）レセプター
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】本発明は新規に同定されたポリヌクレオ
チド、かかるポリヌクレオチドによりコードされるポリ
ペプチド、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチド
の使用、ならびにかかるポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドの製造に関する。さらに詳しくは、本発明のポリ
ペプチドはケモカインレセプターである。本発明はまた
かかるポリペプチドの作用の阻害または活性化にも関す
る。
チド、かかるポリヌクレオチドによりコードされるポリ
ペプチド、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチド
の使用、ならびにかかるポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドの製造に関する。さらに詳しくは、本発明のポリ
ペプチドはケモカインレセプターである。本発明はまた
かかるポリペプチドの作用の阻害または活性化にも関す
る。
【０００３】ケモカインは、最初の２個の保存システイ
ンの相対的な位置に依り、ＣＣ−ケモカインまたはＣＸ
Ｃ−ケモカインの二つのサブファミリーに分けることの
できる小シグナル化タンパク質である。インターロイキ
ン−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣ
Ｐ−３、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α
およびＭＩＰ−１βを含む多くのケモカインについて報
告されている。例えば、Baggioliniら、Advances in Im
munology（Dixon,F.J.編）55巻、97-179頁、アカデミッ
クプレス、ニューヨーク（1994）を参照のこと。ケモカ
インは白血球の特異的サブセットを引き付けて刺激し、
急性および慢性炎症プロセスの生理学において非常に重
要な調節物質である。Oppenheimら、Annu.Rev.Immunol.
9:617-648（1991）。例えば、ＲＡＮＴＥＳは、単球、
メモリーＴセルおよび好酸球に対する化学的誘因物質で
あり、好塩基球によるヒスタミンの放出を誘起する。動
脈硬化性病変において平滑筋細胞により放出されるＭＣ
Ｐ−１は、これらの病変の悪化を進行させるマクロファ
ージ誘因に関与する因子であると考えられている。
ンの相対的な位置に依り、ＣＣ−ケモカインまたはＣＸ
Ｃ−ケモカインの二つのサブファミリーに分けることの
できる小シグナル化タンパク質である。インターロイキ
ン−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣ
Ｐ−３、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α
およびＭＩＰ−１βを含む多くのケモカインについて報
告されている。例えば、Baggioliniら、Advances in Im
munology（Dixon,F.J.編）55巻、97-179頁、アカデミッ
クプレス、ニューヨーク（1994）を参照のこと。ケモカ
インは白血球の特異的サブセットを引き付けて刺激し、
急性および慢性炎症プロセスの生理学において非常に重
要な調節物質である。Oppenheimら、Annu.Rev.Immunol.
9:617-648（1991）。例えば、ＲＡＮＴＥＳは、単球、
メモリーＴセルおよび好酸球に対する化学的誘因物質で
あり、好塩基球によるヒスタミンの放出を誘起する。動
脈硬化性病変において平滑筋細胞により放出されるＭＣ
Ｐ−１は、これらの病変の悪化を進行させるマクロファ
ージ誘因に関与する因子であると考えられている。
【０００４】最近の研究により、ＣＣ−およびＣＸＣ−
ケモカインの作用は共にＧ-タンパク質結合レセプター
のサブファミリーにより媒介されることが証明された。
ＣＣおよびＣＸＣケモカインの数種の機能的レセプター
がヒトにおいて同定された。例えば、インターロイキン
−８では２個のレセプターが同定されている。Holmes
ら、Science 253:1278-1283（1991）およびMurphy,P.M.
およびTiffany,H.L.、Science 253:1280-1283（199
1）。第１のＩＬ−８ＲＡはインターロイキン−８に特
異的に結合し、第２のＩＬ−８ＲＢはＩＬ−８およびＧ
ＲＯなどの他のＣＸＣ−ケモカインに結合する。ＣＣ−
ケモカインレセプターもまたいくつか同定されている。
ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αの両方に結合するＣＣ
−ケモカインレセプター１すなわちＣＣ−ＣＫＲ１と称
するレセプターが、Neoteら、Cell 72:415-425（1993）
により同定された。ＭＣＰ−１およびＭＣＰ−３に結合
する第２のＣＣケモカインレセプターＣＣ−ＣＫＲ２も
また同定された。Charoら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 9
1:2752-2756（1994）；Yamagamiら、Biochem.Biophys.R
es.Commun.202:1156-1162（1994）；Franciら、J.Immun
ol.154:6511-6517（1995）。ＣＣケモカインレセプタ
ー、ＣＣ−ＣＫＲ３およびＣＣ−ＣＫＲ４もまた同定さ
れた。Combadiereら、J.Biol.Chem.270:16491-16494（1
995）；Correction、J.Biol.Chem.270:30235（1995）お
よびPowerら、J.Biol.Chem.270:19495-19500（1995）を
各々参照のこと。
ケモカインの作用は共にＧ-タンパク質結合レセプター
のサブファミリーにより媒介されることが証明された。
ＣＣおよびＣＸＣケモカインの数種の機能的レセプター
がヒトにおいて同定された。例えば、インターロイキン
−８では２個のレセプターが同定されている。Holmes
ら、Science 253:1278-1283（1991）およびMurphy,P.M.
およびTiffany,H.L.、Science 253:1280-1283（199
1）。第１のＩＬ−８ＲＡはインターロイキン−８に特
異的に結合し、第２のＩＬ−８ＲＢはＩＬ−８およびＧ
ＲＯなどの他のＣＸＣ−ケモカインに結合する。ＣＣ−
ケモカインレセプターもまたいくつか同定されている。
ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αの両方に結合するＣＣ
−ケモカインレセプター１すなわちＣＣ−ＣＫＲ１と称
するレセプターが、Neoteら、Cell 72:415-425（1993）
により同定された。ＭＣＰ−１およびＭＣＰ−３に結合
する第２のＣＣケモカインレセプターＣＣ−ＣＫＲ２も
また同定された。Charoら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 9
1:2752-2756（1994）；Yamagamiら、Biochem.Biophys.R
es.Commun.202:1156-1162（1994）；Franciら、J.Immun
ol.154:6511-6517（1995）。ＣＣケモカインレセプタ
ー、ＣＣ−ＣＫＲ３およびＣＣ−ＣＫＲ４もまた同定さ
れた。Combadiereら、J.Biol.Chem.270:16491-16494（1
995）；Correction、J.Biol.Chem.270:30235（1995）お
よびPowerら、J.Biol.Chem.270:19495-19500（1995）を
各々参照のこと。
【０００５】ヒトレセプターであるＣｈｅｍＲ１３の分
子クローニングおよび機能的発現が最近報告された。Sa
msonら、Biochemistry，35:3362-3367（1996）。Ｃｈｅ
ｍＲ１３をコードする遺伝子は、ヒトゲノム中のＣＣ−
ＣＫＲ２レセプター遺伝子と物理的に連結している。Ｃ
ＨＯ−Ｋ１細胞に安定してトランスフェクションされた
ＣｈｅｍＲ１３レセプターは、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−
１βおよびＲＡＮＴＥＳにより刺激されることが見出さ
れたが、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＩＬ−
８およびＧＲＯαは作用がなかった。この新規ヒトＣＣ
−ケモカインレセプターをＣＣ−ＣＫＲ５と称する。
子クローニングおよび機能的発現が最近報告された。Sa
msonら、Biochemistry，35:3362-3367（1996）。Ｃｈｅ
ｍＲ１３をコードする遺伝子は、ヒトゲノム中のＣＣ−
ＣＫＲ２レセプター遺伝子と物理的に連結している。Ｃ
ＨＯ−Ｋ１細胞に安定してトランスフェクションされた
ＣｈｅｍＲ１３レセプターは、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−
１βおよびＲＡＮＴＥＳにより刺激されることが見出さ
れたが、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＩＬ−
８およびＧＲＯαは作用がなかった。この新規ヒトＣＣ
−ケモカインレセプターをＣＣ−ＣＫＲ５と称する。
【０００６】最近、さらに、フシン（fusin）と称され
る、ＨＩＶ−１ウイルスをＴ細胞に侵入させるコファク
ターとして作用しうるケモカイン様オルファン７ＴＭレ
セプターが同定された。Fengら、Science 272:872（199
6）。ヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプターはまたマクロファ
ージ・トロピックＨＩＶ−１ウイルスの細胞への侵入に
おける主要なコファクターとして報告された。これらの
ウイルスはインビボで主要な病原株であると考えられ
る。Dengら、Nature 381:661（1996）；Dragicら、Natu
re 381:667（1996）。
る、ＨＩＶ−１ウイルスをＴ細胞に侵入させるコファク
ターとして作用しうるケモカイン様オルファン７ＴＭレ
セプターが同定された。Fengら、Science 272:872（199
6）。ヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプターはまたマクロファ
ージ・トロピックＨＩＶ−１ウイルスの細胞への侵入に
おける主要なコファクターとして報告された。これらの
ウイルスはインビボで主要な病原株であると考えられ
る。Dengら、Nature 381:661（1996）；Dragicら、Natu
re 381:667（1996）。
【０００７】今回、ヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプターのマ
ウス・オルソログが同定された。従って、マウス株から
マウスＣＣ−ＣＫＲ５レセプター遺伝子を破壊し、マウ
ス遺伝子をヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプター遺伝子と置換
し、ヒト免疫不全ウイルスのためのマウスモデルを作る
ことが可能である。このマウスモデルもまたＴ細胞介在
炎症におけるこのケモカインレセプターの役割の研究に
有用である。
ウス・オルソログが同定された。従って、マウス株から
マウスＣＣ−ＣＫＲ５レセプター遺伝子を破壊し、マウ
ス遺伝子をヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプター遺伝子と置換
し、ヒト免疫不全ウイルスのためのマウスモデルを作る
ことが可能である。このマウスモデルもまたＴ細胞介在
炎症におけるこのケモカインレセプターの役割の研究に
有用である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】これらの点および他の
点について、本発明の一つの目的は、とりわけ図１およ
び２に示すアミノ酸配列およびヒトＣＣ−ＣＫＲ５の既
知アミノ酸配列間の相同性により、新規マウスＣＣ−Ｃ
ＫＲ５として同定されたポリペプチドを提供することで
ある。本発明のさらなる目的は、マウスＣＣ−ＣＫＲ５
をコードするポリヌクレオチド、特に本明細書において
マウスＣＣ−ＣＫＲ５と称されるポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを提供することである。
点について、本発明の一つの目的は、とりわけ図１およ
び２に示すアミノ酸配列およびヒトＣＣ−ＣＫＲ５の既
知アミノ酸配列間の相同性により、新規マウスＣＣ−Ｃ
ＫＲ５として同定されたポリペプチドを提供することで
ある。本発明のさらなる目的は、マウスＣＣ−ＣＫＲ５
をコードするポリヌクレオチド、特に本明細書において
マウスＣＣ−ＣＫＲ５と称されるポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明のこの態様の特に
好ましい具体例では、ポリヌクレオチドは、図１および
２に示す配列のマウスＣＣ−ＣＫＲ５をコードする領域
を含んでなる。本発明のこの態様によれば、ＡＴＣＣ受
託番号９８１７０に含まれるマウス遺伝子から発現可能
な成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子が提供さ
れる。本発明のこの態様によれば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡおよびフラグメント、本発明のこの態様のさらなる
具体例では、変種、アナログもしくは誘導体のフラグメ
ントを含め、生物学的、診断学的、臨床的もしくは治療
的に有用なその変種、アナログもしくは誘導体を含め、
マウスＣＣ−ＣＫＲ５をコードする、単離核酸分子が提
供される。本発明の別の態様によれば、ヒトＣＣ−ＣＫ
Ｒレセプターに結合し、その活性化を活性化または阻害
する化合物をスクリーニングするマウスモデルを作る方
法が提供される。本発明の別の目的によれば、とりわけ
研究、生物学的、臨床的および治療的目的で、前記のポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する製品、組
成物、工程および方法が提供される。
好ましい具体例では、ポリヌクレオチドは、図１および
２に示す配列のマウスＣＣ−ＣＫＲ５をコードする領域
を含んでなる。本発明のこの態様によれば、ＡＴＣＣ受
託番号９８１７０に含まれるマウス遺伝子から発現可能
な成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子が提供さ
れる。本発明のこの態様によれば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡおよびフラグメント、本発明のこの態様のさらなる
具体例では、変種、アナログもしくは誘導体のフラグメ
ントを含め、生物学的、診断学的、臨床的もしくは治療
的に有用なその変種、アナログもしくは誘導体を含め、
マウスＣＣ−ＣＫＲ５をコードする、単離核酸分子が提
供される。本発明の別の態様によれば、ヒトＣＣ−ＣＫ
Ｒレセプターに結合し、その活性化を活性化または阻害
する化合物をスクリーニングするマウスモデルを作る方
法が提供される。本発明の別の目的によれば、とりわけ
研究、生物学的、臨床的および治療的目的で、前記のポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する製品、組
成物、工程および方法が提供される。
【００１０】本発明のこの態様の特定の好ましい具体例
によれば、とりわけ、ＣＣ−ＣＫＲ５ポリペプチドまた
はＣＣ−ＣＫＲ５をコードするｍＲＮＡを測定すること
により、ヒトＣＣ−ＣＫＲ５発現を評価し、インビボで
ヒトＣＣ−ＣＫＲ５を発現するマウスをＣＣ−ＣＫＲ５
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに曝露することに
よって、Ｔ細胞介在炎症、さらに詳細にはＨＩＶ−感染
を治療し、ＣＣ−ＣＫＲ５機能を増強するか、またはＣ
Ｃ−ＣＫＲ５機能不全を治療するための生成物、組成物
および方法が提供される。本発明のさらに別の具体例に
よれば、かかる活性化化合物を用いて、ＣＣ−ＣＫＲ５
レセプターの過少発現に関与する症状の治療のために該
レセプターを刺激する方法が提供される。本発明の別の
態様によれば、かかる阻害化合物を用いて、ＣＣ−ＣＫ
Ｒ５レセプターの過剰発現に付随する症状を治療するた
めの方法が提供される。
によれば、とりわけ、ＣＣ−ＣＫＲ５ポリペプチドまた
はＣＣ−ＣＫＲ５をコードするｍＲＮＡを測定すること
により、ヒトＣＣ−ＣＫＲ５発現を評価し、インビボで
ヒトＣＣ−ＣＫＲ５を発現するマウスをＣＣ−ＣＫＲ５
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに曝露することに
よって、Ｔ細胞介在炎症、さらに詳細にはＨＩＶ−感染
を治療し、ＣＣ−ＣＫＲ５機能を増強するか、またはＣ
Ｃ−ＣＫＲ５機能不全を治療するための生成物、組成物
および方法が提供される。本発明のさらに別の具体例に
よれば、かかる活性化化合物を用いて、ＣＣ−ＣＫＲ５
レセプターの過少発現に関与する症状の治療のために該
レセプターを刺激する方法が提供される。本発明の別の
態様によれば、かかる阻害化合物を用いて、ＣＣ−ＣＫ
Ｒ５レセプターの過剰発現に付随する症状を治療するた
めの方法が提供される。
【００１１】本発明のまた別の態様によれば、本発明の
マウスＣＣ−ＣＫＲ５の少なくとも一つのドメインを保
存アミノ酸置換したフラグメント、コンセンサスフラグ
メントおよび／または配列である非天然組換えＣＣ−Ｃ
ＫＲ５ポリペプチドが提供され、該レセプターはヒトＣ
Ｃ−ＣＫＲ５リガンドに結合するか、またはヒトＣＣ−
ＣＫＲ５リガンド結合を定性的または定量的に変調する
こともできる。本発明のさらに別の態様によれば、リガ
ンドに結合することにより、またはリガンド結合を調節
することにより、ヒトＣＣ−ＣＫＲ５機能の潜在的モデ
ュレーターとして有用でありうる、合成または組換えマ
ウスＣＣ−ＣＫＲ５ポリペプチド、その保存的置換およ
び誘導体、それに対する抗体、抗イディオタイプ抗体、
組成物ならびに方法が提供され、その期待される生物学
的特性のために、それを診断学的、治療的および／また
は研究的用途に用いることができる。
マウスＣＣ−ＣＫＲ５の少なくとも一つのドメインを保
存アミノ酸置換したフラグメント、コンセンサスフラグ
メントおよび／または配列である非天然組換えＣＣ−Ｃ
ＫＲ５ポリペプチドが提供され、該レセプターはヒトＣ
Ｃ−ＣＫＲ５リガンドに結合するか、またはヒトＣＣ−
ＣＫＲ５リガンド結合を定性的または定量的に変調する
こともできる。本発明のさらに別の態様によれば、リガ
ンドに結合することにより、またはリガンド結合を調節
することにより、ヒトＣＣ−ＣＫＲ５機能の潜在的モデ
ュレーターとして有用でありうる、合成または組換えマ
ウスＣＣ−ＣＫＲ５ポリペプチド、その保存的置換およ
び誘導体、それに対する抗体、抗イディオタイプ抗体、
組成物ならびに方法が提供され、その期待される生物学
的特性のために、それを診断学的、治療的および／また
は研究的用途に用いることができる。
【００１２】本発明のさらなる目的は、レセプター型ま
たはサブタイプとして種々のマウスＣＣ−ＣＫＲ５また
はそのフラグメントを阻害または擬似するように設計し
た組換えポリペプチドを提供することである。本発明の
この態様および他の態様のある種の好ましい具体例によ
れば、ＣＣ−ＣＫＲ５配列にハイブリダイゼーションす
るプローブが提供される。本発明のこの態様のある種の
さらに好ましい具体例では、マウスＣＣ−ＣＫＲ５ポリ
ペプチドに対する抗体を提供する。この点におけるある
種の特に好ましい具体例では、抗体はマウスおよびヒト
ＣＣ−ＣＫＲ５に対して高度に選択的である。本発明の
他の目的、特徴、利点および態様は、以下の記載より当
業者に明白となるであろう。しかしながら、以下の記載
および特殊な実施例は、本発明の好ましい具体例を示す
ものであり、単に説明しているにすぎないことを理解す
べきである。開示された発明の精神および観点内での種
々の変更および修飾は、以下の記載を読むこと、および
本開示物の他の部分を読むことにより、当業者に容易に
明らかになるであろう。
たはサブタイプとして種々のマウスＣＣ−ＣＫＲ５また
はそのフラグメントを阻害または擬似するように設計し
た組換えポリペプチドを提供することである。本発明の
この態様および他の態様のある種の好ましい具体例によ
れば、ＣＣ−ＣＫＲ５配列にハイブリダイゼーションす
るプローブが提供される。本発明のこの態様のある種の
さらに好ましい具体例では、マウスＣＣ−ＣＫＲ５ポリ
ペプチドに対する抗体を提供する。この点におけるある
種の特に好ましい具体例では、抗体はマウスおよびヒト
ＣＣ−ＣＫＲ５に対して高度に選択的である。本発明の
他の目的、特徴、利点および態様は、以下の記載より当
業者に明白となるであろう。しかしながら、以下の記載
および特殊な実施例は、本発明の好ましい具体例を示す
ものであり、単に説明しているにすぎないことを理解す
べきである。開示された発明の精神および観点内での種
々の変更および修飾は、以下の記載を読むこと、および
本開示物の他の部分を読むことにより、当業者に容易に
明らかになるであろう。
【００１３】
定義 以下に例示する説明は、本明細書、特に実施例において
頻繁に用いられるある単語の理解を容易にするために提
供されるものである。説明は簡便性のために提供される
のであって、本発明を限定するものではない。ＤＮＡの
「消化」は、ＤＮＡのある配列でのみ作用する制限酵素
などの酵素を用いるＤＮＡの触媒的分裂をいうが、これ
に限定されるものではない。本明細書にいう種々の制限
酵素は市販されており、その反応条件、補酵素および使
用についての他の要件は知られており、当業者にとって
慣用的である。解析を目的とする場合、典型的には、１
μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２０
μｌの反応緩衝液中、約２ユニットの酵素で消化する。
プラスミド構築のためにＤＮＡフラグメントを単離する
ことを目的とする場合、典型的には５ないし５０μｇの
ＤＮＡを、比例して大きくした容量中、２０ないし２５
０ユニットの酵素で消化する。
頻繁に用いられるある単語の理解を容易にするために提
供されるものである。説明は簡便性のために提供される
のであって、本発明を限定するものではない。ＤＮＡの
「消化」は、ＤＮＡのある配列でのみ作用する制限酵素
などの酵素を用いるＤＮＡの触媒的分裂をいうが、これ
に限定されるものではない。本明細書にいう種々の制限
酵素は市販されており、その反応条件、補酵素および使
用についての他の要件は知られており、当業者にとって
慣用的である。解析を目的とする場合、典型的には、１
μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２０
μｌの反応緩衝液中、約２ユニットの酵素で消化する。
プラスミド構築のためにＤＮＡフラグメントを単離する
ことを目的とする場合、典型的には５ないし５０μｇの
ＤＮＡを、比例して大きくした容量中、２０ないし２５
０ユニットの酵素で消化する。
【００１４】個々の制限酵素についての適当な緩衝液お
よび基質の量は、以下に述べるごとき標準的実験室マニ
ュアルに記載されており、それらは供給者によって特定
されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時
間が通常使用されるが、条件は、標準的方法、供給者の
指示および反応の詳細に従って変えることができる。消
化後、当業者にとって日常的なよく知られた方法を用い
て反応物を解析し、フラグメントをアガロースまたはポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって精製してもよ
い。
よび基質の量は、以下に述べるごとき標準的実験室マニ
ュアルに記載されており、それらは供給者によって特定
されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時
間が通常使用されるが、条件は、標準的方法、供給者の
指示および反応の詳細に従って変えることができる。消
化後、当業者にとって日常的なよく知られた方法を用い
て反応物を解析し、フラグメントをアガロースまたはポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって精製してもよ
い。
【００１５】「遺伝的因子」は、一般に、ポリペプチド
をコードする領域あるいは複写、転写もしくは翻訳また
は宿主細胞におけるポリペプチドの発現に重要な他のプ
ロセスを調節する領域を含んでなるポリヌクレオチド、
あるいはポリペプチドをコードする領域、およびそれに
作動可能に連結された発現を調節する領域の両方を含ん
でなるポリヌクレオチドを意味する。遺伝的因子は、エ
ピソーム因子、即ち、宿主細胞ゲノムとは物理的に独立
した分子として複製されるベクター内に取り込まれてい
てもよい。それらは、真核細胞において、メトトレキセ
ート選択によるトランスフェクトされたＤＮＡの増幅の
間に生じるミニ染色体のごときものの中に取り込まれて
いてもよい。遺伝的因子は、宿主細胞ゲノム内に取り込
まれていてもよいが、それは天然の状態ではなく、むし
ろ、単離、クローニングおよび、とりわけ精製ＤＮＡの
形態の、またはベクターにて宿主細胞への導入といった
操作を受けている。
をコードする領域あるいは複写、転写もしくは翻訳また
は宿主細胞におけるポリペプチドの発現に重要な他のプ
ロセスを調節する領域を含んでなるポリヌクレオチド、
あるいはポリペプチドをコードする領域、およびそれに
作動可能に連結された発現を調節する領域の両方を含ん
でなるポリヌクレオチドを意味する。遺伝的因子は、エ
ピソーム因子、即ち、宿主細胞ゲノムとは物理的に独立
した分子として複製されるベクター内に取り込まれてい
てもよい。それらは、真核細胞において、メトトレキセ
ート選択によるトランスフェクトされたＤＮＡの増幅の
間に生じるミニ染色体のごときものの中に取り込まれて
いてもよい。遺伝的因子は、宿主細胞ゲノム内に取り込
まれていてもよいが、それは天然の状態ではなく、むし
ろ、単離、クローニングおよび、とりわけ精製ＤＮＡの
形態の、またはベクターにて宿主細胞への導入といった
操作を受けている。
【００１６】「単離」とは、「人工的」に天然状態から
変化させられていること、すなわち、単離が天然におい
て起こる場合には、その本来の環境から変化させられ、
あるいはその環境から除去されること、あるいはその両
方を意味する。例えば、その天然状態の生物中に存在す
る天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単
離」されていないが、その天然状態の共存物質から分離
されている同じポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、その語を本明細書で用いる場合の「単離」されてい
るである。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、単離
という語は、それが天然に存在している染色体および細
胞から分離されていることを意味する。
変化させられていること、すなわち、単離が天然におい
て起こる場合には、その本来の環境から変化させられ、
あるいはその環境から除去されること、あるいはその両
方を意味する。例えば、その天然状態の生物中に存在す
る天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単
離」されていないが、その天然状態の共存物質から分離
されている同じポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、その語を本明細書で用いる場合の「単離」されてい
るである。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、単離
という語は、それが天然に存在している染色体および細
胞から分離されていることを意味する。
【００１７】単離の一部として、あるいは単離後に、例
えば、融合タンパク質を形成するための突然変異誘発の
ために、および宿主中での増殖または発現のために、か
かるポリヌクレオチドをＤＮＡなどの他のポリヌクレオ
チドに結合させることができる。単離ポリヌクレオチド
は単独で、またはベクターなどの他のポリヌクレオチド
と結合して、培養細胞または生物全体における宿主細胞
に導入されうる。培養または生物全体における宿主細胞
へ導入される場合、その語を本明細書において用いる場
合、かかるＤＮＡはやはり単離されている、というの
も、それらは天然に存在する形態でなく、あるいは天然
環境に存在するものでないからである。同様に、ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドは、培地、処方、ポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドの、例えば細胞への導入
のための溶液、化学反応または酵素反応のための組成物
または溶液のごとき組成物の中に存在してもよく、例え
ば、それらは天然には存在しない組成のものであり、そ
の中で単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは本明
細書にいう単離を意味する。
えば、融合タンパク質を形成するための突然変異誘発の
ために、および宿主中での増殖または発現のために、か
かるポリヌクレオチドをＤＮＡなどの他のポリヌクレオ
チドに結合させることができる。単離ポリヌクレオチド
は単独で、またはベクターなどの他のポリヌクレオチド
と結合して、培養細胞または生物全体における宿主細胞
に導入されうる。培養または生物全体における宿主細胞
へ導入される場合、その語を本明細書において用いる場
合、かかるＤＮＡはやはり単離されている、というの
も、それらは天然に存在する形態でなく、あるいは天然
環境に存在するものでないからである。同様に、ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドは、培地、処方、ポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドの、例えば細胞への導入
のための溶液、化学反応または酵素反応のための組成物
または溶液のごとき組成物の中に存在してもよく、例え
ば、それらは天然には存在しない組成のものであり、そ
の中で単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは本明
細書にいう単離を意味する。
【００１８】「ライゲーション」とは、ほとんどの場
合、２本鎖ＤＮＡである２個またはそれ以上のポリヌク
レオチド間のホスホジエステル結合を形成するプロセス
をいう。ライゲーションの方法は当該分野においてよく
知られており、ライゲーションについてのプロトコルは
標準的実験室マニュアル、および例えば、Sambrookら、
MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed; Co
ld Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har
bor, New York (1989) （以下、Sambrookらという）な
どの文献に記載されている。「オリゴヌクレオチド」と
は比較的短いポリヌクレオチドをいう。しばしば、その
用語は１本鎖デオキシリボヌクレオチドをいうが、同様
に、１本鎖または２本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：Ｄ
ＮＡハイブリッドおよび２本鎖ＤＮＡなどをいうことも
できる。１本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドなど
のオリゴヌクレオチドは、自動オリゴヌクレオチド合成
機の使用のごとき、化学的方法により合成されることが
よくある。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、イン
ビトロ組換えＤＮＡ媒介法、細胞および生物におけるＤ
ＮＡ発現による方法を含め、他の種々の方法により製造
することができる。
合、２本鎖ＤＮＡである２個またはそれ以上のポリヌク
レオチド間のホスホジエステル結合を形成するプロセス
をいう。ライゲーションの方法は当該分野においてよく
知られており、ライゲーションについてのプロトコルは
標準的実験室マニュアル、および例えば、Sambrookら、
MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed; Co
ld Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har
bor, New York (1989) （以下、Sambrookらという）な
どの文献に記載されている。「オリゴヌクレオチド」と
は比較的短いポリヌクレオチドをいう。しばしば、その
用語は１本鎖デオキシリボヌクレオチドをいうが、同様
に、１本鎖または２本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：Ｄ
ＮＡハイブリッドおよび２本鎖ＤＮＡなどをいうことも
できる。１本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドなど
のオリゴヌクレオチドは、自動オリゴヌクレオチド合成
機の使用のごとき、化学的方法により合成されることが
よくある。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、イン
ビトロ組換えＤＮＡ媒介法、細胞および生物におけるＤ
ＮＡ発現による方法を含め、他の種々の方法により製造
することができる。
【００１９】最初、化学的に合成されたＤＮＡは典型的
には５'リン酸を欠く状態で得られる。かかるオリゴヌ
クレオチドの５'末端は、組換えＤＮＡ分子を形成する
ために典型的に用いられるＤＮＡリガーゼを使用するラ
イゲーション反応によるホスホジエステル結合形成の基
質ではない。かかるオリゴヌクレオチドのライゲーショ
ンが望ましい場合、キナーゼおよびＡＴＰを用いるよう
な標準的方法によりリン酸を付加することができる。化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドの３'末端は、一
般に、遊離のヒドロキシル基を有し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼなどのリガーゼの存在下、別のオリゴヌクレオチドな
どの、別のポリヌクレオチドの５'リン酸とホスホジエ
ステル結合を容易に形成するであろう。よく知られてい
るように、要すれば、ライゲーションの前に他のポリヌ
クレオチド（複数でも可）の５'リン酸を除去すること
によって、この反応を選択的に阻害できる。
には５'リン酸を欠く状態で得られる。かかるオリゴヌ
クレオチドの５'末端は、組換えＤＮＡ分子を形成する
ために典型的に用いられるＤＮＡリガーゼを使用するラ
イゲーション反応によるホスホジエステル結合形成の基
質ではない。かかるオリゴヌクレオチドのライゲーショ
ンが望ましい場合、キナーゼおよびＡＴＰを用いるよう
な標準的方法によりリン酸を付加することができる。化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドの３'末端は、一
般に、遊離のヒドロキシル基を有し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼなどのリガーゼの存在下、別のオリゴヌクレオチドな
どの、別のポリヌクレオチドの５'リン酸とホスホジエ
ステル結合を容易に形成するであろう。よく知られてい
るように、要すれば、ライゲーションの前に他のポリヌ
クレオチド（複数でも可）の５'リン酸を除去すること
によって、この反応を選択的に阻害できる。
【００２０】「プラスミド」は、宿主細胞の染色体の一
部ではない安定的に存在する遺伝的因子である。それら
はＤＮＡまたはＲＮＡを含んでなり、直鎖または環状で
あってもよい。プラスミドは細胞複製の間にその複製お
よび安定な存在を確実にする分子をコードしており、医
学的、農学的、および環境学的に非常に重要な産物をコ
ードしているかもしれない。例えば、プラスミドは病原
菌の毒性を非常に増加させる毒素をコードする。プラス
ミドはまた抗生物質に対する耐性を与える遺伝子をコー
ドすることができる。プラスミドは、組換え遺伝子をク
ローン化および発現するために用いられるベクターとし
て分子生物学において広く使用されている。プラスミド
は、一般に、本明細書中、当業者によく知られた標準的
命名法により、大文字および／または数字が前および／
または後に続く小文字のｐにより命名される。本明細書
に開示の開始プラスミドは、市販のもの、公的に利用可
能なものであるか、またはよく知られた、公開された操
作を慣用的に用いることにより利用可能なプラスミドか
ら構築可能なもののいずれかである。本発明に従って使
用可能な多くのプラスミドならびに他のクローニングお
よび発現ベクターはよく知られており、当業者が容易に
入手できるものである。さらに、当業者は、本発明にお
ける使用に適する数多くの他のプラスミドを容易に構築
することができる。本発明における、かかるプラスミド
ならびに他のベクターの性質、構築および使用は、本開
示から当業者に容易に明らかとなろう。
部ではない安定的に存在する遺伝的因子である。それら
はＤＮＡまたはＲＮＡを含んでなり、直鎖または環状で
あってもよい。プラスミドは細胞複製の間にその複製お
よび安定な存在を確実にする分子をコードしており、医
学的、農学的、および環境学的に非常に重要な産物をコ
ードしているかもしれない。例えば、プラスミドは病原
菌の毒性を非常に増加させる毒素をコードする。プラス
ミドはまた抗生物質に対する耐性を与える遺伝子をコー
ドすることができる。プラスミドは、組換え遺伝子をク
ローン化および発現するために用いられるベクターとし
て分子生物学において広く使用されている。プラスミド
は、一般に、本明細書中、当業者によく知られた標準的
命名法により、大文字および／または数字が前および／
または後に続く小文字のｐにより命名される。本明細書
に開示の開始プラスミドは、市販のもの、公的に利用可
能なものであるか、またはよく知られた、公開された操
作を慣用的に用いることにより利用可能なプラスミドか
ら構築可能なもののいずれかである。本発明に従って使
用可能な多くのプラスミドならびに他のクローニングお
よび発現ベクターはよく知られており、当業者が容易に
入手できるものである。さらに、当業者は、本発明にお
ける使用に適する数多くの他のプラスミドを容易に構築
することができる。本発明における、かかるプラスミド
ならびに他のベクターの性質、構築および使用は、本開
示から当業者に容易に明らかとなろう。
【００２１】一般に、「ポリヌクレオチド（複数でも
可）」は、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリ
ボヌクレオチドをいい、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡある
いは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。かくし
て、例えば、本明細書で用いるポリヌクレオチドは、特
に、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領
域の混ざったＤＮＡ、１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、およ
び１本鎖および２本鎖領域の混ざったＲＮＡ、１本鎖で
あるＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなるハイブリッド分子
をいい、より典型的には、２本鎖のものまたは１本鎖お
よび２本鎖領域の混ざったものをいう。加えて、本明細
書にて用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ
あるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含んでなる３本鎖
領域をいう。かかる領域中の鎖は同じ分子由来であって
もよく、また異なる分子由来であってもよい。その領域
は１つまたはそれ以上の分子の全体を含んでいてもよい
が、より典型的には、分子のいくつかの領域のみを含
む。３本鎖らせん領域の分子の１つは、しばしば、オリ
ゴヌクレオチドである。
可）」は、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリ
ボヌクレオチドをいい、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡある
いは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。かくし
て、例えば、本明細書で用いるポリヌクレオチドは、特
に、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領
域の混ざったＤＮＡ、１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、およ
び１本鎖および２本鎖領域の混ざったＲＮＡ、１本鎖で
あるＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなるハイブリッド分子
をいい、より典型的には、２本鎖のものまたは１本鎖お
よび２本鎖領域の混ざったものをいう。加えて、本明細
書にて用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ
あるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含んでなる３本鎖
領域をいう。かかる領域中の鎖は同じ分子由来であって
もよく、また異なる分子由来であってもよい。その領域
は１つまたはそれ以上の分子の全体を含んでいてもよい
が、より典型的には、分子のいくつかの領域のみを含
む。３本鎖らせん領域の分子の１つは、しばしば、オリ
ゴヌクレオチドである。
【００２２】本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチド
なる語は、１個またはそれ以上の修飾塩基を含む上記Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡを包含する。かくして、安定性または
他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたは
ＲＮＡは、その用語を本明細書にて用いるところのポリ
ヌクレオチドである。さらに、例えば２つの例だけを挙
げると、イノシンのような普通でない塩基、またはトリ
チル化された塩基などの修飾塩基を含んでなるＤＮＡま
たはＲＮＡも、その用語を本明細書に用いるポリヌクレ
オチドである。多種な修飾が、当業者に公知の多くの有
用な目的に役立つＤＮＡおよびＲＮＡについて行われて
いることは明らかである。本明細書で用いるポリヌクレ
オチドなる用語は、かかる化学的、酵素的、または代謝
的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびに、特
に、ウイルスおよび単純型および複雑型細胞を含む、細
胞の特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含す
る。
なる語は、１個またはそれ以上の修飾塩基を含む上記Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡを包含する。かくして、安定性または
他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたは
ＲＮＡは、その用語を本明細書にて用いるところのポリ
ヌクレオチドである。さらに、例えば２つの例だけを挙
げると、イノシンのような普通でない塩基、またはトリ
チル化された塩基などの修飾塩基を含んでなるＤＮＡま
たはＲＮＡも、その用語を本明細書に用いるポリヌクレ
オチドである。多種な修飾が、当業者に公知の多くの有
用な目的に役立つＤＮＡおよびＲＮＡについて行われて
いることは明らかである。本明細書で用いるポリヌクレ
オチドなる用語は、かかる化学的、酵素的、または代謝
的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびに、特
に、ウイルスおよび単純型および複雑型細胞を含む、細
胞の特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含す
る。
【００２３】本明細書で用いる「ポリペプチド」は、以
下に説明するようなすべてのポリペプチドを包含する。
ポリペプチドの基本的構造はよく知られており、当該分
野の多数の教科書および他の刊行物に記載されている。
この点からすると、この用語は、本明細書にてペプチド
結合により互いに直鎖状に結合した２個またはそれ以上
のアミノ酸を含んでなるペプチドまたはタンパク質をい
う。本明細書において用いる場合、該用語は、当該分野
において、通常、例えば、ペプチド、オリゴペプチドお
よびオリゴマーともいわれる短い鎖、および、当該分野
において一般に、多くのタイプが存在するタンパク質と
いわれる長い鎖の両方をいう。
下に説明するようなすべてのポリペプチドを包含する。
ポリペプチドの基本的構造はよく知られており、当該分
野の多数の教科書および他の刊行物に記載されている。
この点からすると、この用語は、本明細書にてペプチド
結合により互いに直鎖状に結合した２個またはそれ以上
のアミノ酸を含んでなるペプチドまたはタンパク質をい
う。本明細書において用いる場合、該用語は、当該分野
において、通常、例えば、ペプチド、オリゴペプチドお
よびオリゴマーともいわれる短い鎖、および、当該分野
において一般に、多くのタイプが存在するタンパク質と
いわれる長い鎖の両方をいう。
【００２４】ポリペプチドが、しばしば、一般に２０個
の天然アミノ酸といわれる２０個のアミノ酸以外のアミ
ノ酸を含んでいること、および、プロセッシングおよび
他の翻訳後修飾のごとき天然プロセスにより、あるいは
当該分野でよく知られた化学的修飾法によっても、末端
アミノ酸を含む多くのアミノ酸が所定のポリペプチド中
で修飾されていてもよいことが理解されよう。ポリペプ
チドにおいて自然に起こる普通の修飾でさえも膨大すぎ
てここに列挙できないが、それらは基本的な教科書およ
びさらに詳細な研究論文、ならびに膨大な研究文献にも
記載されており、それらは当業者によく知られている。
の天然アミノ酸といわれる２０個のアミノ酸以外のアミ
ノ酸を含んでいること、および、プロセッシングおよび
他の翻訳後修飾のごとき天然プロセスにより、あるいは
当該分野でよく知られた化学的修飾法によっても、末端
アミノ酸を含む多くのアミノ酸が所定のポリペプチド中
で修飾されていてもよいことが理解されよう。ポリペプ
チドにおいて自然に起こる普通の修飾でさえも膨大すぎ
てここに列挙できないが、それらは基本的な教科書およ
びさらに詳細な研究論文、ならびに膨大な研究文献にも
記載されており、それらは当業者によく知られている。
【００２５】本発明のポリペプチドに行いうる公知修飾
の例として、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル
化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結
合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結
合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイ
ノシトールの共有結合、交差結合、環化、ジスルフィド
結合の形成、脱メチル化、共有交差結合の形成、システ
インの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガ
ンマ−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形
成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイ
ル化、酸化、タンパク質分解的プロセッシング、リン酸
化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、ア
ルギニル化などの転移ＲＮＡ介在のタンパク質へのアミ
ノ酸付加、およびユビキチン化が挙げられる。
の例として、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル
化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結
合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結
合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイ
ノシトールの共有結合、交差結合、環化、ジスルフィド
結合の形成、脱メチル化、共有交差結合の形成、システ
インの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガ
ンマ−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形
成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイ
ル化、酸化、タンパク質分解的プロセッシング、リン酸
化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、ア
ルギニル化などの転移ＲＮＡ介在のタンパク質へのアミ
ノ酸付加、およびユビキチン化が挙げられる。
【００２６】かかる修飾は当業者によく知られており、
科学文献に非常に詳細に記載されている。いくつかの特
に一般的な修飾、例えば糖鎖形成、脂質形成、硫酸化、
グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキ
シル化およびＡＤＰ−リボシル化は、例えば、PROTEINS
-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,2nd Ed.,T.E.Cr
eighton, W.H.Freemen and Company, New York (1993)
のごとき基本テキストに記載されている。この問題に関
して、詳細な報文が利用可能である。例えば、POSTTRAN
SLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C.J
ohnson編, Academic Press, New York (1983) 中、Wol
d,F.、Posttranslational Protein Modifications: Pre
spectives and Prospects, pgs.1-12； Seifterら、Met
h.Enzymol. 182:626-646 (1990) および Rattmanら、An
n. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992) を参照のこと。
科学文献に非常に詳細に記載されている。いくつかの特
に一般的な修飾、例えば糖鎖形成、脂質形成、硫酸化、
グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキ
シル化およびＡＤＰ−リボシル化は、例えば、PROTEINS
-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,2nd Ed.,T.E.Cr
eighton, W.H.Freemen and Company, New York (1993)
のごとき基本テキストに記載されている。この問題に関
して、詳細な報文が利用可能である。例えば、POSTTRAN
SLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C.J
ohnson編, Academic Press, New York (1983) 中、Wol
d,F.、Posttranslational Protein Modifications: Pre
spectives and Prospects, pgs.1-12； Seifterら、Met
h.Enzymol. 182:626-646 (1990) および Rattmanら、An
n. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992) を参照のこと。
【００２７】よく知られ、上記したごとく、ポリペプチ
ドは常に全体が直鎖状であるとは限らないことが理解さ
れよう。例えば、ポリペプチドはユビキチン化の結果と
して分枝していてもよく、一般に、天然に起こるプロセ
ッシング事象および自然には起こらないヒトによりもた
らされる事象を含め、翻訳後の事象の結果として、それ
らは分枝の有無にかかわらず、環状であってもよい。環
状、分枝および分枝環状のポリペプチドが、同様に非翻
訳的天然プロセスおよび完全な合成法によって合成され
てもよい。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖および
アミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプチドの
どこででも起こり得る。実際、ポリペプチドにおけるア
ミノまたはカルボキシル基、あるいはそれら両方の共有
結合の修飾による遮断は、天然および合成ポリペプチド
において共通であり、かかる修飾は本発明ポリペプチド
においても同様に存在してもよい。例えば、プロセッシ
ングの前にエシェリキア・コリにおいて形成されるポリ
ペプチドのアミノ末端残基は、ほとんど例外なくＮ−ホ
ルミルメチオニンである。
ドは常に全体が直鎖状であるとは限らないことが理解さ
れよう。例えば、ポリペプチドはユビキチン化の結果と
して分枝していてもよく、一般に、天然に起こるプロセ
ッシング事象および自然には起こらないヒトによりもた
らされる事象を含め、翻訳後の事象の結果として、それ
らは分枝の有無にかかわらず、環状であってもよい。環
状、分枝および分枝環状のポリペプチドが、同様に非翻
訳的天然プロセスおよび完全な合成法によって合成され
てもよい。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖および
アミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプチドの
どこででも起こり得る。実際、ポリペプチドにおけるア
ミノまたはカルボキシル基、あるいはそれら両方の共有
結合の修飾による遮断は、天然および合成ポリペプチド
において共通であり、かかる修飾は本発明ポリペプチド
においても同様に存在してもよい。例えば、プロセッシ
ングの前にエシェリキア・コリにおいて形成されるポリ
ペプチドのアミノ末端残基は、ほとんど例外なくＮ−ホ
ルミルメチオニンである。
【００２８】ポリペプチドにおいて生じる修飾は、しば
しば、ポリペプチドの形成の仕方と相関関係にある。例
えば、宿主中でクローン化された遺伝子を発現すること
により形成されるポリペプチドの場合、修飾の性質およ
び程度の大部分は、宿主細胞での翻訳後修飾能およびポ
リペプチドのアミノ酸配列に存在する修飾シグナルによ
って決定されるであろう。例えば、よく知られているよ
うに、糖鎖形成は、しばしば、エシェリキア・コリのご
とき細菌宿主では起こらない。従って、糖鎖形成が望ま
しい場合には、糖鎖形成宿主、一般には真核生物の細胞
中でポリペプチドを発現させるべきである。昆虫細胞
は、しばしば、哺乳動物と同じ翻訳後糖鎖形成を行う。
この理由のため、昆虫細胞発現系が、とりわけ、元来の
糖鎖形成のパターンを有する哺乳動物タンパク質を効率
よく発現するために開発された。同様の考え方が他の修
飾にも適用される。
しば、ポリペプチドの形成の仕方と相関関係にある。例
えば、宿主中でクローン化された遺伝子を発現すること
により形成されるポリペプチドの場合、修飾の性質およ
び程度の大部分は、宿主細胞での翻訳後修飾能およびポ
リペプチドのアミノ酸配列に存在する修飾シグナルによ
って決定されるであろう。例えば、よく知られているよ
うに、糖鎖形成は、しばしば、エシェリキア・コリのご
とき細菌宿主では起こらない。従って、糖鎖形成が望ま
しい場合には、糖鎖形成宿主、一般には真核生物の細胞
中でポリペプチドを発現させるべきである。昆虫細胞
は、しばしば、哺乳動物と同じ翻訳後糖鎖形成を行う。
この理由のため、昆虫細胞発現系が、とりわけ、元来の
糖鎖形成のパターンを有する哺乳動物タンパク質を効率
よく発現するために開発された。同様の考え方が他の修
飾にも適用される。
【００２９】同じタイプの修飾が、所定のポリペプチド
のいくつかの部位にて同じまたは様々な程度にて存在し
てもよいことが理解されよう。また、所定のポリペプチ
ドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。一般に、
本明細書にて用いる場合、ポリペプチドなる用語は、か
かる修飾のすべて、特に、宿主細胞にてポリヌクレオチ
ドを発現させることにより合成されるポリペプチドにて
存在する修飾を包含する。
のいくつかの部位にて同じまたは様々な程度にて存在し
てもよいことが理解されよう。また、所定のポリペプチ
ドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。一般に、
本明細書にて用いる場合、ポリペプチドなる用語は、か
かる修飾のすべて、特に、宿主細胞にてポリヌクレオチ
ドを発現させることにより合成されるポリペプチドにて
存在する修飾を包含する。
【００３０】ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの
「変種（複数でも可）」を、本明細書にて用いる場合、
それは、各々、対照のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドとは異なる、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド
をいう。この意味における変種は、以下の部分および本
開示のいずれかの部分においてより詳細に記載されてい
る。変種は、ヌクレオチド配列にて、別の対照ポリヌク
レオチドと異なるポリヌクレオチドを包含する。一般
に、相違は対照と変種のヌクレオチド配列が全体的に極
めて類似し、多くの領域において同一であるようなもの
に限られる。
「変種（複数でも可）」を、本明細書にて用いる場合、
それは、各々、対照のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドとは異なる、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド
をいう。この意味における変種は、以下の部分および本
開示のいずれかの部分においてより詳細に記載されてい
る。変種は、ヌクレオチド配列にて、別の対照ポリヌク
レオチドと異なるポリヌクレオチドを包含する。一般
に、相違は対照と変種のヌクレオチド配列が全体的に極
めて類似し、多くの領域において同一であるようなもの
に限られる。
【００３１】下記のごとく、変種におけるヌクレオチド
配列の変化はサイレントであってもよい。すなわち、そ
れらは、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸
を変えなくてもよい。変化がこの型のサイレント変化に
限定される場合、変種は対照のポリペプチドと同じアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードするであろう。
また、下記のごとく、変種のヌクレオチド配列における
変化が、対照のポリヌクレオチドによりコードされるポ
リペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよい。かかる
ヌクレオチドの変化は、下記のごとく、対照配列により
コードされるポリペプチドにてアミノ酸置換、付加、欠
失、融合および切断をもたらすかもしれない。
配列の変化はサイレントであってもよい。すなわち、そ
れらは、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸
を変えなくてもよい。変化がこの型のサイレント変化に
限定される場合、変種は対照のポリペプチドと同じアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードするであろう。
また、下記のごとく、変種のヌクレオチド配列における
変化が、対照のポリヌクレオチドによりコードされるポ
リペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよい。かかる
ヌクレオチドの変化は、下記のごとく、対照配列により
コードされるポリペプチドにてアミノ酸置換、付加、欠
失、融合および切断をもたらすかもしれない。
【００３２】変種はまた、アミノ酸配列にて、別の対照
ポリペプチドと異なるポリペプチドを包含する。一般
に、相違は、対照と変種の配列が全体的に極めて類似
し、多くの領域において同一であるようなものに限られ
る。変種および対照のポリペプチドは、アミノ酸配列に
て、１個またはそれ以上の置換、付加および欠失により
異なっていてもよく、それらはいずれの組み合わせにて
存在してもよい。
ポリペプチドと異なるポリペプチドを包含する。一般
に、相違は、対照と変種の配列が全体的に極めて類似
し、多くの領域において同一であるようなものに限られ
る。変種および対照のポリペプチドは、アミノ酸配列に
て、１個またはそれ以上の置換、付加および欠失により
異なっていてもよく、それらはいずれの組み合わせにて
存在してもよい。
【００３３】本明細書にて用いる場合の「融合タンパク
質」なる用語は、２種の、しばしば、無関係の融合遺伝
子またはそのフラグメントによりコードされるタンパク
質である。「結合分子」（そうでなければ「相互作用分
子」または「レセプター成分因子」と称される）は、本
発明のレセプターポリペプチドに特異的に結合または相
互作用するリガンド以外の分子をいう。かかる結合分子
は本発明の一部である。結合分子はまた、本発明のポリ
ペプチドに特異的に結合する抗体および抗体誘導試薬な
どの非天然物であってもよい。
質」なる用語は、２種の、しばしば、無関係の融合遺伝
子またはそのフラグメントによりコードされるタンパク
質である。「結合分子」（そうでなければ「相互作用分
子」または「レセプター成分因子」と称される）は、本
発明のレセプターポリペプチドに特異的に結合または相
互作用するリガンド以外の分子をいう。かかる結合分子
は本発明の一部である。結合分子はまた、本発明のポリ
ペプチドに特異的に結合する抗体および抗体誘導試薬な
どの非天然物であってもよい。
【００３４】当該分野に知られているごとく、２つのポ
リペプチドの間の「類似性」は、一のポリペプチドのア
ミノ酸配列およびその同類アミノ酸置換基を、別のポリ
ペプチドの配列と比較することにより決定する。さら
に、かかる配列の２つの鎖の間の対合の同一性によって
決定されるごとき、２つのポリペプチドまたは２つのポ
リヌクレオチド配列の間の配列の関連性の度合いを意味
する「同一性」も当該分野において知られている。同一
性および類似性は共に容易に計算できる（COMPUTATIONA
L MOLECULAR BIOLOGY，Lesk,A.M.編, Oxford Universit
y Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING：INFORMATICS
AND GENOME PROJECTS, Smith,D.W.編, Academic Pres
s, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE D
ATA，PART I，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編, Hum
ana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALTSIS IN
MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje, G.,Academic Press,
1987;およびSEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gribskov,M.お
よびDevereux,J.編, M Stockton Press, New York, 199
1）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列
の間の同一性および類似性を測定するための多くの方法
が存在する一方、「同一性」および「類似性」なる用語
は当業者によく知られている（Carillo,H.およびLipto
n,D.、SIAM J.Applied Math. 48:1073 (1988)）。通
常、２つの配列間の同一性または類似性を決定するため
に用いられる方法は、これに限定されないが、Guide to
Huge Computers, Martin J.Bishop編, Academic Pres
s, San Diego,1994 およびCarillo,H.および Lipton，
D.、SIAM J.Applied Math. 48:1073（1988）に開示され
ている方法を包含する。同一性を測定する好ましい方法
は、試験する２つの配列間に最大の対合を与えるように
設計される。同一性および類似性を測定する方法はコン
ピュータープログラムに書き込まれている。２つの配列
間の同一性および類似性を決定する好ましいコンピュー
タープログラムの方法は、これに限定されないが、ＧＣ
Ｇプログラム・パッケージ（Devereux,J.ら、Nucleic A
cids Research 12（1）：387（1984）,BLASTP, BLASTN,
FASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.，215:403（19
90））を包含する。
リペプチドの間の「類似性」は、一のポリペプチドのア
ミノ酸配列およびその同類アミノ酸置換基を、別のポリ
ペプチドの配列と比較することにより決定する。さら
に、かかる配列の２つの鎖の間の対合の同一性によって
決定されるごとき、２つのポリペプチドまたは２つのポ
リヌクレオチド配列の間の配列の関連性の度合いを意味
する「同一性」も当該分野において知られている。同一
性および類似性は共に容易に計算できる（COMPUTATIONA
L MOLECULAR BIOLOGY，Lesk,A.M.編, Oxford Universit
y Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING：INFORMATICS
AND GENOME PROJECTS, Smith,D.W.編, Academic Pres
s, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE D
ATA，PART I，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編, Hum
ana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALTSIS IN
MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje, G.,Academic Press,
1987;およびSEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gribskov,M.お
よびDevereux,J.編, M Stockton Press, New York, 199
1）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列
の間の同一性および類似性を測定するための多くの方法
が存在する一方、「同一性」および「類似性」なる用語
は当業者によく知られている（Carillo,H.およびLipto
n,D.、SIAM J.Applied Math. 48:1073 (1988)）。通
常、２つの配列間の同一性または類似性を決定するため
に用いられる方法は、これに限定されないが、Guide to
Huge Computers, Martin J.Bishop編, Academic Pres
s, San Diego,1994 およびCarillo,H.および Lipton，
D.、SIAM J.Applied Math. 48:1073（1988）に開示され
ている方法を包含する。同一性を測定する好ましい方法
は、試験する２つの配列間に最大の対合を与えるように
設計される。同一性および類似性を測定する方法はコン
ピュータープログラムに書き込まれている。２つの配列
間の同一性および類似性を決定する好ましいコンピュー
タープログラムの方法は、これに限定されないが、ＧＣ
Ｇプログラム・パッケージ（Devereux,J.ら、Nucleic A
cids Research 12（1）：387（1984）,BLASTP, BLASTN,
FASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.，215:403（19
90））を包含する。
【００３５】本発明は、とりわけ、以下にさらに詳細に
記載する、新規マウスＣＣ−ＣＫＲ５ポリペプチドおよ
びポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、ヒトＣ
Ｃ−ＣＫＲ５に対するアミノ酸相同性により関連付けら
れる、新規マウスＣＣ−ＣＫＲ５のポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、図１およ
び２に示すヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有す
るマウスＣＣ−ＣＫＲ５に、および本明細書中、「寄託
クローン」または「寄託クローンの遺伝子」と称するＡ
ＴＣＣ受託番号９８１７０の遺伝子のマウスＣＣ−ＣＫ
Ｒ５ヌクレオチド配列およびそれによりコードされるア
ミノ酸配列に関する。図１および２に示すヌクレオチド
配列およびアミノ酸配列は、寄託クローンの遺伝子を配
列決定することにより得られる。これゆえ、寄託クロー
ンの配列は２者の間の不一致を調整しており、図１およ
び２の配列に関するものは寄託クローンのマウス遺伝子
の配列に関するものを包含する。
記載する、新規マウスＣＣ−ＣＫＲ５ポリペプチドおよ
びポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、ヒトＣ
Ｃ−ＣＫＲ５に対するアミノ酸相同性により関連付けら
れる、新規マウスＣＣ−ＣＫＲ５のポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、図１およ
び２に示すヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有す
るマウスＣＣ−ＣＫＲ５に、および本明細書中、「寄託
クローン」または「寄託クローンの遺伝子」と称するＡ
ＴＣＣ受託番号９８１７０の遺伝子のマウスＣＣ−ＣＫ
Ｒ５ヌクレオチド配列およびそれによりコードされるア
ミノ酸配列に関する。図１および２に示すヌクレオチド
配列およびアミノ酸配列は、寄託クローンの遺伝子を配
列決定することにより得られる。これゆえ、寄託クロー
ンの配列は２者の間の不一致を調整しており、図１およ
び２の配列に関するものは寄託クローンのマウス遺伝子
の配列に関するものを包含する。
【００３６】ポリヌクレオチド 本発明の一つの態様によれば、図１および２の推定アミ
ノ酸配列を有するマウスＣＣ−ＣＫＲ５ポリペプチドを
コードする単離ポリヌクレオチドが得られる。図１およ
び２ならびに配列番号１に示すポリヌクレオチド配列の
ごとき本明細書に示す情報を用いて、マウスＣＣ−ＣＫ
Ｒ５をコードする本発明のポリヌクレオチドを、ハイブ
リダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡ配列を用
いるマウスゲノムラムダライブラリーより遺伝子をクロ
ーニングする方法などの、標準的クローニングおよびス
クリーニング法を用いて得ることができる。本発明の代
表例である、図１および２に示すポリヌクレオチドは、
ハイブリダイゼーションプローブとしてクローンＨＤＧ
ＮＲ１０のコーディング領域（図３、配列番号３を参照
のこと）を用いてマウス株１２９ＳＶＪゲノムラムダラ
イブラリー（Ｃat＃９４６３０９；Ｓtratagene，Ｌa
Ｊolla，ＣＡ）中で見つけられた。この方法を用いて、
このプローブをハイブリダーゼイションするのに観察さ
れたあるゲノムクローンを単離し、精製し、ＤＮＡ配列
決定により特徴づけを行った。
ノ酸配列を有するマウスＣＣ−ＣＫＲ５ポリペプチドを
コードする単離ポリヌクレオチドが得られる。図１およ
び２ならびに配列番号１に示すポリヌクレオチド配列の
ごとき本明細書に示す情報を用いて、マウスＣＣ−ＣＫ
Ｒ５をコードする本発明のポリヌクレオチドを、ハイブ
リダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡ配列を用
いるマウスゲノムラムダライブラリーより遺伝子をクロ
ーニングする方法などの、標準的クローニングおよびス
クリーニング法を用いて得ることができる。本発明の代
表例である、図１および２に示すポリヌクレオチドは、
ハイブリダイゼーションプローブとしてクローンＨＤＧ
ＮＲ１０のコーディング領域（図３、配列番号３を参照
のこと）を用いてマウス株１２９ＳＶＪゲノムラムダラ
イブラリー（Ｃat＃９４６３０９；Ｓtratagene，Ｌa
Ｊolla，ＣＡ）中で見つけられた。この方法を用いて、
このプローブをハイブリダーゼイションするのに観察さ
れたあるゲノムクローンを単離し、精製し、ＤＮＡ配列
決定により特徴づけを行った。
【００３７】本発明のマウスＣＣ−ＣＫＲ５は、構造的
に、寄託クローン中のマウスＣＣ−ＣＫＲ５をコードす
る遺伝子を配列決定した結果より明らかなように、Ｇ結
合タンパク質レセプターファミリーの他のタンパク質に
関連付けられる。マウスＣＣ−ＣＫＲ５は、各々、約２
０−３０個のアミノ酸の７つの疎水領域を含有し、典型
的には、Ｇ−タンパク質結合したレセプターのスーパー
ファミリーの間に見られる。さらに詳細には、このタン
パク質はヒトＣＣ−ＣＫＲ５とその全体にわたって９
０.６％の類似性および８１.８％の同一性を共有する。
全体のヌクレオチド配列の同一性は８３.９％である。
この配列の保存の程度は、そのコードされたレセプター
がヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプターのマウス補体であると
いう結論と一致する。このクローンは、ＣＣ−ＣＫＲ２
（７４％同一性）、ヒトＣＣ−ＣＫＲ１（５５％同一
性）、マウスＣＣ−ＣＫＲ１（５３％同一性）、マウス
ＣＣ−ＣＫＲ４（５０％同一性）およびヒトＣＣ−ＣＫ
Ｒ４（４８％同一性）などの他の既知ヒトＣＣ−ＣＫＲ
レセプタータンパク質とは相同性が低下している。得ら
れた遺伝子配列を図１および２、さらには配列番号１に
て表示する。このクローンのオープン・リーディング・
フレームをそのＤＮＡ配列を逆翻訳することで同定し、
図１および２ならびに配列番号２に示す、３５４個のア
ミノ酸のタンパク質をコードすることが見出された。
に、寄託クローン中のマウスＣＣ−ＣＫＲ５をコードす
る遺伝子を配列決定した結果より明らかなように、Ｇ結
合タンパク質レセプターファミリーの他のタンパク質に
関連付けられる。マウスＣＣ−ＣＫＲ５は、各々、約２
０−３０個のアミノ酸の７つの疎水領域を含有し、典型
的には、Ｇ−タンパク質結合したレセプターのスーパー
ファミリーの間に見られる。さらに詳細には、このタン
パク質はヒトＣＣ−ＣＫＲ５とその全体にわたって９
０.６％の類似性および８１.８％の同一性を共有する。
全体のヌクレオチド配列の同一性は８３.９％である。
この配列の保存の程度は、そのコードされたレセプター
がヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプターのマウス補体であると
いう結論と一致する。このクローンは、ＣＣ−ＣＫＲ２
（７４％同一性）、ヒトＣＣ−ＣＫＲ１（５５％同一
性）、マウスＣＣ−ＣＫＲ１（５３％同一性）、マウス
ＣＣ−ＣＫＲ４（５０％同一性）およびヒトＣＣ−ＣＫ
Ｒ４（４８％同一性）などの他の既知ヒトＣＣ−ＣＫＲ
レセプタータンパク質とは相同性が低下している。得ら
れた遺伝子配列を図１および２、さらには配列番号１に
て表示する。このクローンのオープン・リーディング・
フレームをそのＤＮＡ配列を逆翻訳することで同定し、
図１および２ならびに配列番号２に示す、３５４個のア
ミノ酸のタンパク質をコードすることが見出された。
【００３８】本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡの
ごときＲＮＡの形態であってもよく、あるいは、例えば
クローニングにより得られるか、または化学合成法もし
くはその組み合わせにより産生されるｃＤＮＡおよびゲ
ノムＤＮＡを含め、ＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮ
Ａは２本鎖または１本鎖であってもよい。１本鎖ＤＮＡ
はセンス鎖としても知られるコーディング鎖であっても
よく、または、アンチセンス鎖とも称される非コーディ
ング鎖であってもよい。ポリペプチドをコードするコー
ディング配列は、図１および２（配列番号１）に示すポ
リヌクレオチドのコーディング配列と同じであってもよ
い。そのコーディング配列はまた、遺伝コードの重複性
（縮重性）の結果として、図１および２（配列番号２）
のポリペプチドをもコードする、別の配列を有するポリ
ヌクレオチドであってもよい。
ごときＲＮＡの形態であってもよく、あるいは、例えば
クローニングにより得られるか、または化学合成法もし
くはその組み合わせにより産生されるｃＤＮＡおよびゲ
ノムＤＮＡを含め、ＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮ
Ａは２本鎖または１本鎖であってもよい。１本鎖ＤＮＡ
はセンス鎖としても知られるコーディング鎖であっても
よく、または、アンチセンス鎖とも称される非コーディ
ング鎖であってもよい。ポリペプチドをコードするコー
ディング配列は、図１および２（配列番号１）に示すポ
リヌクレオチドのコーディング配列と同じであってもよ
い。そのコーディング配列はまた、遺伝コードの重複性
（縮重性）の結果として、図１および２（配列番号２）
のポリペプチドをもコードする、別の配列を有するポリ
ヌクレオチドであってもよい。
【００３９】図１および２のポリペプチドをコードする
本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチド用のコ
ーディング配列自体；成熟ポリペプチド用のコーディン
グ配列および付加的なコーディング配列；および前記し
た付加的なコーディング配列を有するか、または有する
ことなく、付加的な非コーディング配列を有する、成熟
ポリペプチドのコーディング配列を包含するが、これに
限定されるものではない。付加的なコーディング配列と
して、例えば、プレ−、プロ−またはプレプロ−タンパ
ク質配列などのリーダー配列または分泌配列をコードす
る配列が挙げられるが、これに限定されるものではな
い。付加的な非コーディング配列として、例えば、転写
およびスプライシングを含め、ｍＲＮＡプロセッシング
にて役割を果たす、転写され、かつ非翻訳の配列および
例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合および安定性のため
のポリアデニル化シグナルなどのイントロンおよび非コ
ーディング５’および３’配列を包含するが、これに限
定されない。付加的な官能性を付与するコーディング配
列をポリペプチドに組み入れてもよい。かくして、例え
ば、ポリペプチドを、細胞表面にある発現レセプターの
同定を容易にする、ペプチドなどのマーカー配列に融合
させてもよい。本発明のこの態様のある好ましい具体例
において、マーカー配列は、ＨＡタグなどのペプチドで
ある。そのＨＡタグはインフルエンザ・赤血球凝集素タ
ンパク質由来のエピトープに対応するものであり、例え
ば、Wilsonら、Cell 37:767 (1984) に記載されてい
る。他の多くのそのようなタグが商業上入手可能であ
る。
本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチド用のコ
ーディング配列自体；成熟ポリペプチド用のコーディン
グ配列および付加的なコーディング配列；および前記し
た付加的なコーディング配列を有するか、または有する
ことなく、付加的な非コーディング配列を有する、成熟
ポリペプチドのコーディング配列を包含するが、これに
限定されるものではない。付加的なコーディング配列と
して、例えば、プレ−、プロ−またはプレプロ−タンパ
ク質配列などのリーダー配列または分泌配列をコードす
る配列が挙げられるが、これに限定されるものではな
い。付加的な非コーディング配列として、例えば、転写
およびスプライシングを含め、ｍＲＮＡプロセッシング
にて役割を果たす、転写され、かつ非翻訳の配列および
例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合および安定性のため
のポリアデニル化シグナルなどのイントロンおよび非コ
ーディング５’および３’配列を包含するが、これに限
定されない。付加的な官能性を付与するコーディング配
列をポリペプチドに組み入れてもよい。かくして、例え
ば、ポリペプチドを、細胞表面にある発現レセプターの
同定を容易にする、ペプチドなどのマーカー配列に融合
させてもよい。本発明のこの態様のある好ましい具体例
において、マーカー配列は、ＨＡタグなどのペプチドで
ある。そのＨＡタグはインフルエンザ・赤血球凝集素タ
ンパク質由来のエピトープに対応するものであり、例え
ば、Wilsonら、Cell 37:767 (1984) に記載されてい
る。他の多くのそのようなタグが商業上入手可能であ
る。
【００４０】前記によれば、本明細書にて用いる場合の
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる語
は、遺伝暗号の重複性により、本発明のポリペプチド、
特に、図１および２に示すアミノ酸配列を有するマウス
ＣＣ−ＣＫＲ５をコードするいずれの配列をも含むポリ
ヌクレオチドを包含する。該用語はまた、コーディング
および／または非コーディング配列を含んでいてもよい
さらなる領域と共に、該ポリペプチドをコードする単一
の連続または不連続領域（例えば、イントロンにより分
断されている）を含むポリヌクレオチドも包含する。さ
らに本発明は、図１および２の推定アミノ酸配列を有す
るポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体
をコードする、本明細書にて前記したポリヌクレオチド
の変種に関する。ポリヌクレオチドの変種は、天然の対
立遺伝子変種などの天然に存在する変種であってもよ
く、あるいは、天然に存在することが知られていない変
種であってもよい。かかるポリヌクレオチドの天然に存
在しない変種は、ポリヌクレオチド、細胞または生物に
用いる方法を含め、突然変異誘発法により製造してもよ
い。
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる語
は、遺伝暗号の重複性により、本発明のポリペプチド、
特に、図１および２に示すアミノ酸配列を有するマウス
ＣＣ−ＣＫＲ５をコードするいずれの配列をも含むポリ
ヌクレオチドを包含する。該用語はまた、コーディング
および／または非コーディング配列を含んでいてもよい
さらなる領域と共に、該ポリペプチドをコードする単一
の連続または不連続領域（例えば、イントロンにより分
断されている）を含むポリヌクレオチドも包含する。さ
らに本発明は、図１および２の推定アミノ酸配列を有す
るポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体
をコードする、本明細書にて前記したポリヌクレオチド
の変種に関する。ポリヌクレオチドの変種は、天然の対
立遺伝子変種などの天然に存在する変種であってもよ
く、あるいは、天然に存在することが知られていない変
種であってもよい。かかるポリヌクレオチドの天然に存
在しない変種は、ポリヌクレオチド、細胞または生物に
用いる方法を含め、突然変異誘発法により製造してもよ
い。
【００４１】この点で変種の中には、ヌクレオチド置
換、欠失または付加により前記したポリヌクレオチドと
異なる変種がある。置換、欠失または付加には１個また
はそれ以上のヌクレオチドが関与しているかもしれな
い。変種は、コーディング配列または非コーディング配
列あるいはそれらの両方において変化していてもよい。
コーディング配列の変化により、同類または非同類アミ
ノ酸置換、欠失または付加が生じてもよい。この点で本
発明の特に好ましい具体例は、図１および２に示すマウ
スＣＣ−ＣＫＲ５のアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド；その変種、アナログ、
誘導体およびフラグメント、ならびにその変種、アナロ
グおよび誘導体のフラグメントである。
換、欠失または付加により前記したポリヌクレオチドと
異なる変種がある。置換、欠失または付加には１個また
はそれ以上のヌクレオチドが関与しているかもしれな
い。変種は、コーディング配列または非コーディング配
列あるいはそれらの両方において変化していてもよい。
コーディング配列の変化により、同類または非同類アミ
ノ酸置換、欠失または付加が生じてもよい。この点で本
発明の特に好ましい具体例は、図１および２に示すマウ
スＣＣ−ＣＫＲ５のアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド；その変種、アナログ、
誘導体およびフラグメント、ならびにその変種、アナロ
グおよび誘導体のフラグメントである。
【００４２】さらに、この点において、数個、わずか
な、５ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１個
または０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで
置換、欠失または付加されている、図１および２のマウ
スＣＣ−ＣＫＲ５ポリペプチドのアミノ酸配列を有す
る、マウスＣＣ−ＣＫＲ５変種、アナログ、誘導体およ
びフラグメント、ならびにそのフラグメントの変種、ア
ナログおよび誘導体をコードするポリヌクレオチドが特
に好ましい。これらのうち特に好ましいのは、マウスＣ
Ｃ−ＣＫＲ５の特性および活性を変化させないサイレン
ト置換、付加および欠失である。またこの点において、
同類置換が特に好ましい。置換されていない、図１およ
び２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドが最も好ましい。
な、５ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１個
または０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで
置換、欠失または付加されている、図１および２のマウ
スＣＣ−ＣＫＲ５ポリペプチドのアミノ酸配列を有す
る、マウスＣＣ−ＣＫＲ５変種、アナログ、誘導体およ
びフラグメント、ならびにそのフラグメントの変種、ア
ナログおよび誘導体をコードするポリヌクレオチドが特
に好ましい。これらのうち特に好ましいのは、マウスＣ
Ｃ−ＣＫＲ５の特性および活性を変化させないサイレン
ト置換、付加および欠失である。またこの点において、
同類置換が特に好ましい。置換されていない、図１およ
び２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドが最も好ましい。
【００４３】本発明のさらに好ましい具体例は、図１お
よび２に示すアミノ酸配列を有するマウスＣＣ−ＣＫＲ
５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して
少なくとも８５％同一であるポリヌクレオチド、およ
び、かかるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチ
ドである。この点において、その同じポリペプチドに対
して少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドが特
に好ましく、これらのうちでも特に好ましいのは、少な
くとも９５％同一のものである。さらには、少なくとも
９７％同一のものが非常に好ましく、少なくとも９８−
９９％同一のものがさらに好ましく、少なくとも９９％
同一のものが最も好ましい。さらに、この点において特
に好ましい具体例は、図１および２の遺伝子によりコー
ドされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能
または活性を保持しているポリペプチドをコードしてい
るポリヌクレオチドである。
よび２に示すアミノ酸配列を有するマウスＣＣ−ＣＫＲ
５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して
少なくとも８５％同一であるポリヌクレオチド、およ
び、かかるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチ
ドである。この点において、その同じポリペプチドに対
して少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドが特
に好ましく、これらのうちでも特に好ましいのは、少な
くとも９５％同一のものである。さらには、少なくとも
９７％同一のものが非常に好ましく、少なくとも９８−
９９％同一のものがさらに好ましく、少なくとも９９％
同一のものが最も好ましい。さらに、この点において特
に好ましい具体例は、図１および２の遺伝子によりコー
ドされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能
または活性を保持しているポリペプチドをコードしてい
るポリヌクレオチドである。
【００４４】本発明はさらに本明細書にて前記した配列
とハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。こ
の点において、本発明は、特に、ストリンジェントな条
件下、本明細書にて前記したポリヌクレオチドとハイブ
リッド形成するポリヌクレオチドに関する。本明細書に
て用いる場合、「ストリンジェントな条件」なる用語
は、ハイブリッド形成が、配列間で少なくとも９５％、
好ましくは少なくとも９７％同一である場合にのみ生じ
ることを意味する。本発明のポリヌクレオチドアッセイ
に関してさらに検討するように、例えば、前記した本発
明のポリヌクレオチドをｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用
のハイブリダイゼーションプローブとして用いて、マウ
スＣＣ−ＣＫＲ５をコードする完全長のｃＤＮＡおよび
ゲノムクローンを単離し、マウスＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子
に対して高度の配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮ
Ａおよびゲノムクローンを単離してもよい。かかるプロ
ーブは、一般に、少なくとも１５個のヌクレオチドを有
してなる。好ましくは、かかるプローブは少なくとも３
０個のヌクレオチドを有するであろうし、少なくとも５
０個のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましい
プローブは３０と５０個の範囲にあるヌクレオチドを有
するであろう。
とハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。こ
の点において、本発明は、特に、ストリンジェントな条
件下、本明細書にて前記したポリヌクレオチドとハイブ
リッド形成するポリヌクレオチドに関する。本明細書に
て用いる場合、「ストリンジェントな条件」なる用語
は、ハイブリッド形成が、配列間で少なくとも９５％、
好ましくは少なくとも９７％同一である場合にのみ生じ
ることを意味する。本発明のポリヌクレオチドアッセイ
に関してさらに検討するように、例えば、前記した本発
明のポリヌクレオチドをｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用
のハイブリダイゼーションプローブとして用いて、マウ
スＣＣ−ＣＫＲ５をコードする完全長のｃＤＮＡおよび
ゲノムクローンを単離し、マウスＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子
に対して高度の配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮ
Ａおよびゲノムクローンを単離してもよい。かかるプロ
ーブは、一般に、少なくとも１５個のヌクレオチドを有
してなる。好ましくは、かかるプローブは少なくとも３
０個のヌクレオチドを有するであろうし、少なくとも５
０個のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましい
プローブは３０と５０個の範囲にあるヌクレオチドを有
するであろう。
【００４５】例えば、マウスＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子のコ
ーディング領域は、既知ＤＮＡ配列を用いてスクリーニ
ングし、オリゴヌクレオチドプローブを合成することに
より単離することができる。ついで、本発明の遺伝子の
配列に相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチ
ドを用いて、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡの
ライブラリーをスクリーニングし、ライブラリーのどの
メンバーがプローブとハイブリッド形成するかを決定す
る。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、
ポリヌクレオチドアッセイに関してさらに説明するよう
に、ヒトの疾患に対する治療および診断の発見のための
研究試薬および材料として用いることができる。
ーディング領域は、既知ＤＮＡ配列を用いてスクリーニ
ングし、オリゴヌクレオチドプローブを合成することに
より単離することができる。ついで、本発明の遺伝子の
配列に相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチ
ドを用いて、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡの
ライブラリーをスクリーニングし、ライブラリーのどの
メンバーがプローブとハイブリッド形成するかを決定す
る。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、
ポリヌクレオチドアッセイに関してさらに説明するよう
に、ヒトの疾患に対する治療および診断の発見のための
研究試薬および材料として用いることができる。
【００４６】寄託材料 マウスＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子を含む寄託株を、１９９６
年９月１８日に、アメリカ合衆国、メリーランド２０８
５２、ロックビル、パーク・ローン・ドライブ１２３０
１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
寄託し、ＡＴＣＣ受託番号９８１７０が付された。その
マウス遺伝子寄託株を、本明細書にて「寄託クローン」
または「寄託クローンのＤＮＡ］という。寄託株は、寄
託の際に「ｍＨＤＧＮＲ１０／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ」と命名された、完全長マウスＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子
を含有するエシェリキア・コリｍＨＤＧＮＲ１０：ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＤＨ５α（Ｓtratagene，Ｌa Ｊo
lla，ＣＡ）である。
年９月１８日に、アメリカ合衆国、メリーランド２０８
５２、ロックビル、パーク・ローン・ドライブ１２３０
１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
寄託し、ＡＴＣＣ受託番号９８１７０が付された。その
マウス遺伝子寄託株を、本明細書にて「寄託クローン」
または「寄託クローンのＤＮＡ］という。寄託株は、寄
託の際に「ｍＨＤＧＮＲ１０／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ」と命名された、完全長マウスＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子
を含有するエシェリキア・コリｍＨＤＧＮＲ１０：ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＤＨ５α（Ｓtratagene，Ｌa Ｊo
lla，ＣＡ）である。
【００４７】寄託は特許手続き上の微生物寄託の国際承
認に関するブタペスト条約の条件下で行われている。特
許が発行されると何ら制限または条件もなく、最終的に
株は分譲される。寄託株は当業者の便宜のためにのみ提
供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条の下に要求されるよう
な、寄託が実施可能要件であることを承認するものでは
ない。寄託株に含まれるポリヌクレオチドの配列、なら
びにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配
列は、本明細書における配列の記載とのいずれの不一致
をも調節するものである。寄託株を製造、使用または販
売するには、ライセンスが必要である。そのようなライ
センスはここで付与されるものではない。
認に関するブタペスト条約の条件下で行われている。特
許が発行されると何ら制限または条件もなく、最終的に
株は分譲される。寄託株は当業者の便宜のためにのみ提
供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条の下に要求されるよう
な、寄託が実施可能要件であることを承認するものでは
ない。寄託株に含まれるポリヌクレオチドの配列、なら
びにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配
列は、本明細書における配列の記載とのいずれの不一致
をも調節するものである。寄託株を製造、使用または販
売するには、ライセンスが必要である。そのようなライ
センスはここで付与されるものではない。
【００４８】ポリペプチド 本発明は、さらに図１および２（配列番号２）の推定ア
ミノ酸配列を有するマウスＣＣ−ＣＫＲ５ポリペプチド
に関する。本発明はまた、これらのポリペプチドのフラ
グメント、アナログおよび誘導体にも関する。「フラグ
メント」、「誘導体」および「アナログ」なる用語は、
図１および２のポリペプチドについて言う場合、かかる
ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を
保持している、すなわち、マウスＣＣ−ＣＫＲ５のごと
く機能するポリペプチド、または、たとえそのポリペプ
チドがマウスＣＣ−ＣＫＲ５として機能しなくてもリガ
ンドまたは結合分子に結合する能力を保持している、例
えばレセプターの可溶性形態である、ポリペプチドを意
味する。かくして、アナログは、プロタンパク質部分の
開裂により活性化され、活性成熟ポリペプチドを産生し
うるプロタンパク質を包含する。
ミノ酸配列を有するマウスＣＣ−ＣＫＲ５ポリペプチド
に関する。本発明はまた、これらのポリペプチドのフラ
グメント、アナログおよび誘導体にも関する。「フラグ
メント」、「誘導体」および「アナログ」なる用語は、
図１および２のポリペプチドについて言う場合、かかる
ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を
保持している、すなわち、マウスＣＣ−ＣＫＲ５のごと
く機能するポリペプチド、または、たとえそのポリペプ
チドがマウスＣＣ−ＣＫＲ５として機能しなくてもリガ
ンドまたは結合分子に結合する能力を保持している、例
えばレセプターの可溶性形態である、ポリペプチドを意
味する。かくして、アナログは、プロタンパク質部分の
開裂により活性化され、活性成熟ポリペプチドを産生し
うるプロタンパク質を包含する。
【００４９】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであっ
てもよい。ある種の好ましい具体例において、本発明の
ポリペプチドは組換えポリペプチドである。図１および
２のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナロ
グは、（ｉ）１個またはそれ以上のアミノ酸残基が同類
または非同類アミノ酸残基（好ましくは、同類アミノ酸
残基）で置換されており、かかる置換アミノ酸残基は遺
伝暗号によりコードされているものであっても、なくて
もよいもの；（ｉｉ）１個またはそれ以上のアミノ酸残
基が置換基を含むもの；または（ｉｉｉ）ポリペプチド
の細胞表面の発現を検出するのに利用される配列など
の、付加的なアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合してい
るものである。かかるフラグメント、誘導体およびアナ
ログは、本明細書の教示から当業者の観点の範囲内であ
ると考えられる。
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであっ
てもよい。ある種の好ましい具体例において、本発明の
ポリペプチドは組換えポリペプチドである。図１および
２のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナロ
グは、（ｉ）１個またはそれ以上のアミノ酸残基が同類
または非同類アミノ酸残基（好ましくは、同類アミノ酸
残基）で置換されており、かかる置換アミノ酸残基は遺
伝暗号によりコードされているものであっても、なくて
もよいもの；（ｉｉ）１個またはそれ以上のアミノ酸残
基が置換基を含むもの；または（ｉｉｉ）ポリペプチド
の細胞表面の発現を検出するのに利用される配列など
の、付加的なアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合してい
るものである。かかるフラグメント、誘導体およびアナ
ログは、本明細書の教示から当業者の観点の範囲内であ
ると考えられる。
【００５０】この点において、本発明の特に好ましい具
体例は、図１および２に示すマウスＣＣ−ＣＫＲ５のア
ミノ酸配列を有するポリペプチド、その変種、アナロ
グ、誘導体およびフラグメント、ならびに該フラグメン
トの変種、アナログおよび誘導体である。さらに、この
点において本発明の特に好ましい具体例は、マウスＣＣ
−ＣＫＲ５の活性／機能を保持している、マウスＣＣ−
ＣＫＲ５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変
種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびに該
フラグメントの変種、アナログおよび誘導体である。
体例は、図１および２に示すマウスＣＣ−ＣＫＲ５のア
ミノ酸配列を有するポリペプチド、その変種、アナロ
グ、誘導体およびフラグメント、ならびに該フラグメン
トの変種、アナログおよび誘導体である。さらに、この
点において本発明の特に好ましい具体例は、マウスＣＣ
−ＣＫＲ５の活性／機能を保持している、マウスＣＣ−
ＣＫＲ５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変
種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびに該
フラグメントの変種、アナログおよび誘導体である。
【００５１】同類アミノ酸置換によって対照から変化し
ている変種も好ましい変種である。かかる置換は、ポリ
ペプチド中の所定のアミノ酸を同様の特性の別のアミノ
酸で置換したものである。同類アミノ酸置換として認め
られる典型的なものは、脂肪族アミノ酸であるＡｌａ、
Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間での相互置換；ヒドロ
キシル残基であるＳｅｒおよびＴｈｒの相互置換、酸性
残基であるＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基であ
るＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基であるＬ
ｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基であるＰ
ｈｅおよびＴｙｒの間の置換である。
ている変種も好ましい変種である。かかる置換は、ポリ
ペプチド中の所定のアミノ酸を同様の特性の別のアミノ
酸で置換したものである。同類アミノ酸置換として認め
られる典型的なものは、脂肪族アミノ酸であるＡｌａ、
Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間での相互置換；ヒドロ
キシル残基であるＳｅｒおよびＴｈｒの相互置換、酸性
残基であるＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基であ
るＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基であるＬ
ｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基であるＰ
ｈｅおよびＴｙｒの間の置換である。
【００５２】さらにこの点において特に好ましいのは、
数個、わずかな、５ないし１０、１ないし５、１ないし
３、２、１個または０個のアミノ酸残基が、いずれかの
組み合わせで置換、欠失または付加されている、図１お
よび２のマウスＣＣ−ＣＫＲ５ポリペプチドのアミノ酸
配列を有する変種、アナログ、誘導体およびフラグメン
ト、ならびに該フラグメントの変種、アナログおよび誘
導体である。これらのうち特に好ましいのは、マウスＣ
Ｃ−ＣＫＲ５の性質および活性を変化させないサイレン
ト置換、付加および欠失である。またこの点において、
同類アミノ酸置換が特に好ましい。最も好ましいのは、
置換されていない図１および２のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである。
数個、わずかな、５ないし１０、１ないし５、１ないし
３、２、１個または０個のアミノ酸残基が、いずれかの
組み合わせで置換、欠失または付加されている、図１お
よび２のマウスＣＣ−ＣＫＲ５ポリペプチドのアミノ酸
配列を有する変種、アナログ、誘導体およびフラグメン
ト、ならびに該フラグメントの変種、アナログおよび誘
導体である。これらのうち特に好ましいのは、マウスＣ
Ｃ−ＣＫＲ５の性質および活性を変化させないサイレン
ト置換、付加および欠失である。またこの点において、
同類アミノ酸置換が特に好ましい。最も好ましいのは、
置換されていない図１および２のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである。
【００５３】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは、哺乳動物細胞の細胞表面で発現さ
れ、機能的にＧ−タンパク質に結合している。本発明の
ポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド（詳細には
成熟ポリペプチド）、ならびに配列番号２のポリペプチ
ドに対して少なくとも８５％の同一性を有し、より好ま
しくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも９
０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一
性）を有し、さらにより好ましくは配列番号２のポリペ
プチドに対して少なくとも９５％の類似性（さらにより
好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペ
プチドを包含する。
チドは、好ましくは、哺乳動物細胞の細胞表面で発現さ
れ、機能的にＧ−タンパク質に結合している。本発明の
ポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド（詳細には
成熟ポリペプチド）、ならびに配列番号２のポリペプチ
ドに対して少なくとも８５％の同一性を有し、より好ま
しくは配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも９
０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一
性）を有し、さらにより好ましくは配列番号２のポリペ
プチドに対して少なくとも９５％の類似性（さらにより
好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペ
プチドを包含する。
【００５４】ベクター、宿主細胞、発現 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、
本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞お
よび組換え法による本発明のポリペプチドの製造にも関
する。宿主細胞を遺伝子操作してポリヌクレオチドを取
り込ませ、本発明のポリペプチドを発現させることがで
きる。例えば、感染、トランスダクション、トランスフ
ェクションおよび形質転換といったよく知られた方法を
用いて、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入してもよ
い。ポリヌクレオチドを単独または他のポリヌクレオチ
ドと一緒に導入してもよい。かかる他のポリヌクレオチ
ドを本発明のポリヌクレオチドとは別個に導入するか、
同時に導入するか、あるいは結合させて導入してもよ
い。
本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞お
よび組換え法による本発明のポリペプチドの製造にも関
する。宿主細胞を遺伝子操作してポリヌクレオチドを取
り込ませ、本発明のポリペプチドを発現させることがで
きる。例えば、感染、トランスダクション、トランスフ
ェクションおよび形質転換といったよく知られた方法を
用いて、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入してもよ
い。ポリヌクレオチドを単独または他のポリヌクレオチ
ドと一緒に導入してもよい。かかる他のポリヌクレオチ
ドを本発明のポリヌクレオチドとは別個に導入するか、
同時に導入するか、あるいは結合させて導入してもよ
い。
【００５５】かくして、例えば、本発明のポリヌクレオ
チドを、例えば、哺乳動物細胞において同時トランスフ
ェクションおよび選択のための標準的方法を用いて、選
択可能マーカーをコードするもう１つ別のポリペプチド
で宿主細胞中にトランスフェクションしてもよい。この
場合、一般に、ポリヌクレオチドは宿主細胞ゲノム中に
安定に取り込まれるであろう。別法として、ポリヌクレ
オチドを、宿主における増殖用の選択可能マーカーを有
するベクターに結合させてもよい。前記した方法によ
り、ベクター構築物を宿主細胞中に導入してもよい。一
般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物
のごとき沈殿物中、あるいは荷電脂質との複合体中のＤ
ＮＡとして導入される。エレクトロポレーションを用い
てポリヌクレオチドを宿主に導入してもよい。ベクター
がウイルスである場合、それをインビトロでパッケージ
し、またはパッケージ細胞中に導入し、そのパッケージ
ウイルスを細胞中に形質導入してもよい。本発明のこの
態様によれば、ポリヌクレオチドを製造し、ポリヌクレ
オチドを細胞に導入するのに適した種々の方法は当業者
によく知られた、慣用的なものである。かかる方法は、
詳細に、Sambrookらの報文に記載されており、それはこ
れらの方法を詳述する多くの実験室マニュアルを説明し
ている。
チドを、例えば、哺乳動物細胞において同時トランスフ
ェクションおよび選択のための標準的方法を用いて、選
択可能マーカーをコードするもう１つ別のポリペプチド
で宿主細胞中にトランスフェクションしてもよい。この
場合、一般に、ポリヌクレオチドは宿主細胞ゲノム中に
安定に取り込まれるであろう。別法として、ポリヌクレ
オチドを、宿主における増殖用の選択可能マーカーを有
するベクターに結合させてもよい。前記した方法によ
り、ベクター構築物を宿主細胞中に導入してもよい。一
般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物
のごとき沈殿物中、あるいは荷電脂質との複合体中のＤ
ＮＡとして導入される。エレクトロポレーションを用い
てポリヌクレオチドを宿主に導入してもよい。ベクター
がウイルスである場合、それをインビトロでパッケージ
し、またはパッケージ細胞中に導入し、そのパッケージ
ウイルスを細胞中に形質導入してもよい。本発明のこの
態様によれば、ポリヌクレオチドを製造し、ポリヌクレ
オチドを細胞に導入するのに適した種々の方法は当業者
によく知られた、慣用的なものである。かかる方法は、
詳細に、Sambrookらの報文に記載されており、それはこ
れらの方法を詳述する多くの実験室マニュアルを説明し
ている。
【００５６】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えばプラスミドベクター、１本鎖または２本鎖のファ
ージベクター、１本鎖または２本鎖のＲＮＡまたはＤＮ
Ａウイルスベクターであってもよい。かかるベクター
は、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞に導入するためのよく知
られた方法によって、ポリヌクレオチド、好ましくはＤ
ＮＡとして細胞中に導入される。ファージおよびウイル
スベクターの場合、感染およびトランスダクションのた
めのよく知られた方法によって、ベクターはまた、パッ
ケージされ、または封入されたウイルスとして細胞中に
導入されてもよく、好ましくは導入される。ウイルスベ
クターは複製可能であってもよく、複製欠損であっても
よい。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、相補的宿
主細胞においてのみ起こるであろう。ベクターの中で
も、特定の態様において、本発明のポリヌクレオチドお
よびポリペプチドの発現用ベクターが好ましい。一般
に、かかるベクターは、発現されるべきポリヌクレオチ
ドに作動可能に連結された宿主中での発現に効果的なシ
ス−作用性制御領域を含んでなる。適当なトランス−作
用性因子は、宿主により供給されるか、相補的ベクター
により供給されるか、または宿主中に導入した後のベク
ター自身によって供給されるかである。
例えばプラスミドベクター、１本鎖または２本鎖のファ
ージベクター、１本鎖または２本鎖のＲＮＡまたはＤＮ
Ａウイルスベクターであってもよい。かかるベクター
は、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞に導入するためのよく知
られた方法によって、ポリヌクレオチド、好ましくはＤ
ＮＡとして細胞中に導入される。ファージおよびウイル
スベクターの場合、感染およびトランスダクションのた
めのよく知られた方法によって、ベクターはまた、パッ
ケージされ、または封入されたウイルスとして細胞中に
導入されてもよく、好ましくは導入される。ウイルスベ
クターは複製可能であってもよく、複製欠損であっても
よい。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、相補的宿
主細胞においてのみ起こるであろう。ベクターの中で
も、特定の態様において、本発明のポリヌクレオチドお
よびポリペプチドの発現用ベクターが好ましい。一般
に、かかるベクターは、発現されるべきポリヌクレオチ
ドに作動可能に連結された宿主中での発現に効果的なシ
ス−作用性制御領域を含んでなる。適当なトランス−作
用性因子は、宿主により供給されるか、相補的ベクター
により供給されるか、または宿主中に導入した後のベク
ター自身によって供給されるかである。
【００５７】この点におけるある種の好ましい具体例に
おいて、ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異
的発現は誘導可能な発現であってもよく、またはある型
の細胞においてのみ起こる発現であってもよく、または
誘導可能および細胞特異的の両方であってもよい。誘導
可能なベクターの中でも、温度および栄養添加物などの
操作容易な環境因子によって発現を誘導することのでき
るベクターが、特に好ましい。原核細胞および真核細胞
宿主において使用される構成的および誘導可能な発現ベ
クターを含め、本発明のこの態様に適する種々のベクタ
ーは当業者によく知られており、慣用的に使用されてい
る。遺伝子操作された宿主細胞は通常の栄養培地で培養
することができ、そのような培地は、特にプロモーター
の活性化、形質転換体の選択、または遺伝子の増幅に関
して、適宜修飾されていてもよい。温度、ｐＨなどの、
発現のために選択される宿主細胞で予め使用された培養
条件は、一般に、本発明のポリペプチドの発現に適して
おり、それは当業者に明らかであろう。
おいて、ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異
的発現は誘導可能な発現であってもよく、またはある型
の細胞においてのみ起こる発現であってもよく、または
誘導可能および細胞特異的の両方であってもよい。誘導
可能なベクターの中でも、温度および栄養添加物などの
操作容易な環境因子によって発現を誘導することのでき
るベクターが、特に好ましい。原核細胞および真核細胞
宿主において使用される構成的および誘導可能な発現ベ
クターを含め、本発明のこの態様に適する種々のベクタ
ーは当業者によく知られており、慣用的に使用されてい
る。遺伝子操作された宿主細胞は通常の栄養培地で培養
することができ、そのような培地は、特にプロモーター
の活性化、形質転換体の選択、または遺伝子の増幅に関
して、適宜修飾されていてもよい。温度、ｐＨなどの、
発現のために選択される宿主細胞で予め使用された培養
条件は、一般に、本発明のポリペプチドの発現に適して
おり、それは当業者に明らかであろう。
【００５８】非常に多種の発現ベクターを用いて、本発
明のポリペプチドを発現させることができる。かかるベ
クターは、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベ
クター、例えば、バキュロウイルス、パポーバウイル
ス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、
ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病ウイルス、アルフ
ァーウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス由来
のベクター、およびそのウイルスの組み合わせに由来の
ベクターを包含する。この点における発現のために、一
般に、宿主中でポリペプチドを発現するためのポリヌク
レオチドを維持、増殖または発現するのに適したベクタ
ーを用いることができる。
明のポリペプチドを発現させることができる。かかるベ
クターは、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベ
クター、例えば、バキュロウイルス、パポーバウイル
ス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、
ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病ウイルス、アルフ
ァーウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス由来
のベクター、およびそのウイルスの組み合わせに由来の
ベクターを包含する。この点における発現のために、一
般に、宿主中でポリペプチドを発現するためのポリヌク
レオチドを維持、増殖または発現するのに適したベクタ
ーを用いることができる。
【００５９】種々のよく知られた慣用的方法のいずれに
よっても、適当なＤＮＡ配列をベクターに挿入すること
ができる。一般に、発現させるＤＮＡ配列を、そのＤＮ
Ａ配列および発現ベクターを１種またはそれ以上の制限
エンドヌクレアーゼで開裂させ、ついで、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて制限フラグメントを一緒に結合させる
ことにより、発現ベクターに結合させる。この目的に用
いることのできる制限的開裂およびライゲーションの操
作は当業者によく知られており、慣用的なものである。
この点における、および別法を用いる発現ベクターの構
築のための適当な操作も当業者によく知られており、慣
用的なものであり、Sambrookらにて非常に詳細に説明さ
れている。
よっても、適当なＤＮＡ配列をベクターに挿入すること
ができる。一般に、発現させるＤＮＡ配列を、そのＤＮ
Ａ配列および発現ベクターを１種またはそれ以上の制限
エンドヌクレアーゼで開裂させ、ついで、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて制限フラグメントを一緒に結合させる
ことにより、発現ベクターに結合させる。この目的に用
いることのできる制限的開裂およびライゲーションの操
作は当業者によく知られており、慣用的なものである。
この点における、および別法を用いる発現ベクターの構
築のための適当な操作も当業者によく知られており、慣
用的なものであり、Sambrookらにて非常に詳細に説明さ
れている。
【００６０】発現ベクター中のＤＮＡ配列を、例えば、
ｍＲＮＡ転写を指令するプロモーターを含む、適当な発
現制御配列（複数でも可）に作動可能に連結する。かか
るプロモーターの代表例は、ＳＶ４０初期および後期プ
ロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモータ
ーを包含するが、それらは周知プロモーターのほんの例
示に過ぎない。本発明のこの態様にて有用な多数の他の
プロモーターはよく知られており、本明細書の記載およ
び実施例で説明されるようにして当業者であれば慣用的
に使用することができる。一般に、発現構築物は、転写
開始部位および停止部位、および、転写領域に翻訳のた
めのリボソーム結合部位を有するであろう。構築物によ
り発現される成熟転写物のコーディング部分は、翻訳さ
れるべきポリペプチドの初めの部分に翻訳開始ＡＵＧ
を、および終わりの部分に適宜位置する終止コドンを含
むであろう。
ｍＲＮＡ転写を指令するプロモーターを含む、適当な発
現制御配列（複数でも可）に作動可能に連結する。かか
るプロモーターの代表例は、ＳＶ４０初期および後期プ
ロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモータ
ーを包含するが、それらは周知プロモーターのほんの例
示に過ぎない。本発明のこの態様にて有用な多数の他の
プロモーターはよく知られており、本明細書の記載およ
び実施例で説明されるようにして当業者であれば慣用的
に使用することができる。一般に、発現構築物は、転写
開始部位および停止部位、および、転写領域に翻訳のた
めのリボソーム結合部位を有するであろう。構築物によ
り発現される成熟転写物のコーディング部分は、翻訳さ
れるべきポリペプチドの初めの部分に翻訳開始ＡＵＧ
を、および終わりの部分に適宜位置する終止コドンを含
むであろう。
【００６１】加えて、構築物は、発現を調節ならびに発
生させる制御領域を含んでいてもよい。一般に、多くの
通常なされる操作に従って、かかる領域は、転写を調節
することにより、すなわち、エンハンサーとして作動す
るであろう。一般に、増殖および発現のためのベクター
は選択可能なマーカーを有する。選択可能なマーカー遺
伝子は形質転換された宿主細胞を選択するための表現型
特徴を提供する。好ましいマーカーは、真核細胞を培養
するためのジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐
性を包含するが、これに限定されるものではない。かか
るマーカーはまた、増幅に適していてもよい。また、ベ
クターがこの目的のための別のマーカーを有していても
よい。
生させる制御領域を含んでいてもよい。一般に、多くの
通常なされる操作に従って、かかる領域は、転写を調節
することにより、すなわち、エンハンサーとして作動す
るであろう。一般に、増殖および発現のためのベクター
は選択可能なマーカーを有する。選択可能なマーカー遺
伝子は形質転換された宿主細胞を選択するための表現型
特徴を提供する。好ましいマーカーは、真核細胞を培養
するためのジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐
性を包含するが、これに限定されるものではない。かか
るマーカーはまた、増幅に適していてもよい。また、ベ
クターがこの目的のための別のマーカーを有していても
よい。
【００６２】所望ポリペプチドの宿主中での発現に適し
た種々の周知方法を用いて、本明細書にて記載した適当
なＤＮＡ配列、ならびに適当なプロモーター、および他
の適当な制御配列を含むベクターを、適当な宿主中に導
入してもよい。適当な宿主の代表例は、ドロソフィラ
（Drosophila）S2およびスポドプテラ（Spodoptera）Sf
9細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳおよびボウエス
（Bowes）メラノーマ細胞などの動物細胞を包含する。
多種の発現構築物用宿主が周知であり、当業者は本開示
により本発明のこの態様に従ってポリペプチドの発現の
ための宿主を容易に選択することができる。
た種々の周知方法を用いて、本明細書にて記載した適当
なＤＮＡ配列、ならびに適当なプロモーター、および他
の適当な制御配列を含むベクターを、適当な宿主中に導
入してもよい。適当な宿主の代表例は、ドロソフィラ
（Drosophila）S2およびスポドプテラ（Spodoptera）Sf
9細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳおよびボウエス
（Bowes）メラノーマ細胞などの動物細胞を包含する。
多種の発現構築物用宿主が周知であり、当業者は本開示
により本発明のこの態様に従ってポリペプチドの発現の
ための宿主を容易に選択することができる。
【００６３】より詳細には、本発明はまた、発現構築物
などの組換え構築物も包含し、それらは１種またはそれ
以上の前記した配列を含んでなる。構築物は、本発明の
かかる配列が挿入されたプラスミドまたはウイルスベク
ターなどのベクターを含んでなる。その配列を順方向ま
たは逆方向に挿入することができる。この点において、
ある種の好ましい具体例において、構築物はさらに、例
えば、該配列に作動可能に連結されたプロモーターを含
め、調節配列を含んでなる。多数の適当なベクターおよ
びプロモーターが当業者に知られており、本発明におけ
る使用に適した多くのベクターが市販されている。
などの組換え構築物も包含し、それらは１種またはそれ
以上の前記した配列を含んでなる。構築物は、本発明の
かかる配列が挿入されたプラスミドまたはウイルスベク
ターなどのベクターを含んでなる。その配列を順方向ま
たは逆方向に挿入することができる。この点において、
ある種の好ましい具体例において、構築物はさらに、例
えば、該配列に作動可能に連結されたプロモーターを含
め、調節配列を含んでなる。多数の適当なベクターおよ
びプロモーターが当業者に知られており、本発明におけ
る使用に適した多くのベクターが市販されている。
【００６４】市販されている後記のベクターを例示す
る。それらのうち、好ましい真核生物のベクターは、St
ratageneから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡ
Ｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならびに、Ph
armaciaから市販のｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧお
よびｐＳＶＬがある。これらのベクターは、本発明のこ
の態様により使用するために当業者に利用可能である商
業上入手可能な、周知のベクターを例示するためにのみ
列挙する。例えば、宿主中における本発明のポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの導入、維持、増殖または発
現に適する他のプラスミドまたはベクターを本発明のこ
の態様に使用してもよいことが理解されよう。
る。それらのうち、好ましい真核生物のベクターは、St
ratageneから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡ
Ｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならびに、Ph
armaciaから市販のｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧお
よびｐＳＶＬがある。これらのベクターは、本発明のこ
の態様により使用するために当業者に利用可能である商
業上入手可能な、周知のベクターを例示するためにのみ
列挙する。例えば、宿主中における本発明のポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの導入、維持、増殖または発
現に適する他のプラスミドまたはベクターを本発明のこ
の態様に使用してもよいことが理解されよう。
【００６５】制限部位、または、候補プロモーターフラ
グメント；すなわち、プロモーターを含んでいるかもし
れない断片を導入するための部位の下流の、クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）転写
ユニットのごとき、プロモーター領域を欠くレポーター
転写ユニットを含むベクターを用いて、プロモーター領
域をいずれか所望の遺伝子より選択することができる。
周知なように、プロモーター含有フラグメントをベクタ
ー中のｃａｔ遺伝子上流の制限部位へ導入することによ
り、ＣＡＴ活性を生じさせ、それを標準的ＣＡＴアッセ
イにより検出することができる。この目的に適するベク
ターはよく知られており、容易に入手できる。２種のか
かるベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７であ
る。かくして、本発明のポリヌクレオチドの発現用のプ
ロモーターはよく知られていて容易に入手できるプロモ
ーターだけでなく、レポーター遺伝子を用いて上記方法
により容易に得ることのできるプロモーターも包含す
る。
グメント；すなわち、プロモーターを含んでいるかもし
れない断片を導入するための部位の下流の、クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）転写
ユニットのごとき、プロモーター領域を欠くレポーター
転写ユニットを含むベクターを用いて、プロモーター領
域をいずれか所望の遺伝子より選択することができる。
周知なように、プロモーター含有フラグメントをベクタ
ー中のｃａｔ遺伝子上流の制限部位へ導入することによ
り、ＣＡＴ活性を生じさせ、それを標準的ＣＡＴアッセ
イにより検出することができる。この目的に適するベク
ターはよく知られており、容易に入手できる。２種のか
かるベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７であ
る。かくして、本発明のポリヌクレオチドの発現用のプ
ロモーターはよく知られていて容易に入手できるプロモ
ーターだけでなく、レポーター遺伝子を用いて上記方法
により容易に得ることのできるプロモーターも包含す
る。
【００６６】この点において適当な公知の真核細胞プロ
モーターには、ＣＭＶ即時初期プロモーター、ＨＳＶチ
ミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０
プロモーター、ラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）の
プロモーターなどのレトロウイルスＬＴＲのプロモータ
ー、ならびにマウス・メタロチオネイン−Ｉプロモータ
ーなどのメタロチオネインプロモーターがある。宿主細
胞中での発現用の適当なベクターおよびプロモーターの
選択は、よく知られた操作であり、発現ベクターの構
築、宿主中へのベクターの導入および宿主における発現
に関する方法は、当業者にとって慣用的なものである。
本発明はまた、前記の構築物を含む宿主細胞にも関す
る。宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核細胞とす
ることもできる。
モーターには、ＣＭＶ即時初期プロモーター、ＨＳＶチ
ミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０
プロモーター、ラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）の
プロモーターなどのレトロウイルスＬＴＲのプロモータ
ー、ならびにマウス・メタロチオネイン−Ｉプロモータ
ーなどのメタロチオネインプロモーターがある。宿主細
胞中での発現用の適当なベクターおよびプロモーターの
選択は、よく知られた操作であり、発現ベクターの構
築、宿主中へのベクターの導入および宿主における発現
に関する方法は、当業者にとって慣用的なものである。
本発明はまた、前記の構築物を含む宿主細胞にも関す
る。宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核細胞とす
ることもできる。
【００６７】リン酸カルシウムトランスフェクション、
ＤＥＡＥ−デキストラン媒介のトランスフェクション、
陽イオン性脂質媒介のトランスフェクション、エレクト
ロポレーション、トランスダクション、感染または他の
方法により、宿主細胞中への構築物の導入を行うことが
できる。かかる方法は、多くの標準的実験室マニュアル
に記載されている。宿主中の構築物を慣用的方法で使用
して、組換え配列によりコードされた遺伝子産物を製造
することができる。適当なプロモーターの制御下で、哺
乳動物細胞において成熟蛋白を発現させることができ
る。原核生物宿主および真核生物宿主での使用に適する
クローニングおよび発現ベクターは、Sambrookらにより
記載されている。
ＤＥＡＥ−デキストラン媒介のトランスフェクション、
陽イオン性脂質媒介のトランスフェクション、エレクト
ロポレーション、トランスダクション、感染または他の
方法により、宿主細胞中への構築物の導入を行うことが
できる。かかる方法は、多くの標準的実験室マニュアル
に記載されている。宿主中の構築物を慣用的方法で使用
して、組換え配列によりコードされた遺伝子産物を製造
することができる。適当なプロモーターの制御下で、哺
乳動物細胞において成熟蛋白を発現させることができ
る。原核生物宿主および真核生物宿主での使用に適する
クローニングおよび発現ベクターは、Sambrookらにより
記載されている。
【００６８】ベクター中にエンハンサー配列を挿入する
ことにより、高等真核細胞による本発明のポリペプチド
をコードするＤＮＡの転写を増大させることができる。
エンハンサーは、普通、約１０ないし３００ｂｐのＤＮ
Ａのシス−作用性因子であり、所定の宿主細胞型におけ
るプロモーターの転写活性を増大させるように作用す
る。エンハンサーとして、例えば、複製開始点の後期側
１００ないし２７０ｂｐに位置するＳＶ４０エンハンサ
ー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサ
ー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサ
ー、ならびにアデノウイルスエンハンサーが挙げられ
る。
ことにより、高等真核細胞による本発明のポリペプチド
をコードするＤＮＡの転写を増大させることができる。
エンハンサーは、普通、約１０ないし３００ｂｐのＤＮ
Ａのシス−作用性因子であり、所定の宿主細胞型におけ
るプロモーターの転写活性を増大させるように作用す
る。エンハンサーとして、例えば、複製開始点の後期側
１００ないし２７０ｂｐに位置するＳＶ４０エンハンサ
ー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサ
ー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサ
ー、ならびにアデノウイルスエンハンサーが挙げられ
る。
【００６９】一般に、本発明のポリペプチドの異種構造
配列をコードする本発明のポリヌクレオチドを、発現用
プロモーターに作動可能に連結されるように標準的方法
を用いてベクター中に挿入する。転写開始部位がリボソ
ーム結合部位の５'付近に位置するようにポリヌクレオ
チドを配置する。リボソーム結合部位は、発現されるポ
リペプチドの翻訳を開始するＡＵＧに対して５'側にあ
る。一般に、通常、ＡＵＧである開始コドンから始ま
り、リボソーム結合部位と開始ＡＵＧとの間に位置す
る、他のオープン・リーディング・フレームなどないで
あろう。また、一般に、ポリペプチド末端に翻訳終止コ
ドンが存在し、転写される領域の３'末端に適当に散在
するポリアデニル化シグナルおよび転写終止シグナルが
存在するであろう。
配列をコードする本発明のポリヌクレオチドを、発現用
プロモーターに作動可能に連結されるように標準的方法
を用いてベクター中に挿入する。転写開始部位がリボソ
ーム結合部位の５'付近に位置するようにポリヌクレオ
チドを配置する。リボソーム結合部位は、発現されるポ
リペプチドの翻訳を開始するＡＵＧに対して５'側にあ
る。一般に、通常、ＡＵＧである開始コドンから始ま
り、リボソーム結合部位と開始ＡＵＧとの間に位置す
る、他のオープン・リーディング・フレームなどないで
あろう。また、一般に、ポリペプチド末端に翻訳終止コ
ドンが存在し、転写される領域の３'末端に適当に散在
するポリアデニル化シグナルおよび転写終止シグナルが
存在するであろう。
【００７０】ポリペプチドを、融合タンパク質のごとき
修飾形態で発現させてもよく、それは分泌シグナルだけ
でなく、さらなる異種機能領域を含んでいてもよい。細
胞表面発現を促進するために、一の領域を該ポリペプチ
ドに付加してもよい。ペプチド部分をポリペプチドに付
加して検出を生じさせることは、当業者にとって慣用的
な技法を用いる一般的なことである。同様に、種々の哺
乳動物細胞培養系を発現に使用することができる。哺乳
動物発現系として、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨ
Ｏ、ＨｅＬａ、ヒト腎臓２９３およびＢＨＫ細胞系、お
よびＧluzmanら、Cell 23:175 (1981) に記載されたサ
ル腎線維芽細胞のＣＯＳ−７細胞系を包含する。適合す
るベクターの発現能を有する他の細胞系は、例えば、前
記のベクターを包含する。
修飾形態で発現させてもよく、それは分泌シグナルだけ
でなく、さらなる異種機能領域を含んでいてもよい。細
胞表面発現を促進するために、一の領域を該ポリペプチ
ドに付加してもよい。ペプチド部分をポリペプチドに付
加して検出を生じさせることは、当業者にとって慣用的
な技法を用いる一般的なことである。同様に、種々の哺
乳動物細胞培養系を発現に使用することができる。哺乳
動物発現系として、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨ
Ｏ、ＨｅＬａ、ヒト腎臓２９３およびＢＨＫ細胞系、お
よびＧluzmanら、Cell 23:175 (1981) に記載されたサ
ル腎線維芽細胞のＣＯＳ−７細胞系を包含する。適合す
るベクターの発現能を有する他の細胞系は、例えば、前
記のベクターを包含する。
【００７１】哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適
当なプロモーターおよびエンハンサー、および、必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス
ドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、およ
び、発現に必要とされる５’隣接非転写配列を含んでな
るであろう。ある種の好ましい具体例において、ＳＶ４
０スプライス部位由来のＤＮＡ配列、およびＳＶ４０ポ
リアデニル化部位が、必要な非転写遺伝学因子として用
いられる。本発明によれば、マウスＣＣ−ＣＫＲ５ポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドを種々の用途、特にマ
ウスＣＣ−ＣＫＲ５の化学的および生物学的特性を用い
る用途に使用することができる。さらなる用途は、細
胞、組織および器官の障害の診断および治療に関する。
本発明のこれらの態様を以下においてさらに説明する。
当なプロモーターおよびエンハンサー、および、必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス
ドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、およ
び、発現に必要とされる５’隣接非転写配列を含んでな
るであろう。ある種の好ましい具体例において、ＳＶ４
０スプライス部位由来のＤＮＡ配列、およびＳＶ４０ポ
リアデニル化部位が、必要な非転写遺伝学因子として用
いられる。本発明によれば、マウスＣＣ−ＣＫＲ５ポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドを種々の用途、特にマ
ウスＣＣ−ＣＫＲ５の化学的および生物学的特性を用い
る用途に使用することができる。さらなる用途は、細
胞、組織および器官の障害の診断および治療に関する。
本発明のこれらの態様を以下においてさらに説明する。
【００７２】抗体 ポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、ま
たはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞はま
た、それらに対する抗体を製造するための免疫原として
使用することができる。これらの抗体は、例えば、ポリ
クローナルまたはモノクローナル抗体とすることができ
る。本発明はまた、キメラ、１本鎖およびヒト化抗体な
らびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラ
リーの生成物も包含する。当該分野で公知の種々の操作
をかかる抗体およびフラグメントの製造に用いることが
できる。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して
生成された抗体は、ポリペプチドを動物中に直接注射す
ることにより、あるいはポリペプチドを動物、好ましく
はヒト以外の動物に投与することにより得ることができ
る。ついで、そのようにして得られた抗体はそのポリペ
プチド自体と結合するであろう。このようにして、ポリ
ペプチドのフラグメントのみをコードする配列であって
も、未変性ポリペプチド全体に結合する抗体を得るのに
用いることができる。ついで、かかる抗体を用いて、ポ
リペプチドを発現する組織からそのポリペプチドを単離
することができる。
たはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞はま
た、それらに対する抗体を製造するための免疫原として
使用することができる。これらの抗体は、例えば、ポリ
クローナルまたはモノクローナル抗体とすることができ
る。本発明はまた、キメラ、１本鎖およびヒト化抗体な
らびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラ
リーの生成物も包含する。当該分野で公知の種々の操作
をかかる抗体およびフラグメントの製造に用いることが
できる。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して
生成された抗体は、ポリペプチドを動物中に直接注射す
ることにより、あるいはポリペプチドを動物、好ましく
はヒト以外の動物に投与することにより得ることができ
る。ついで、そのようにして得られた抗体はそのポリペ
プチド自体と結合するであろう。このようにして、ポリ
ペプチドのフラグメントのみをコードする配列であって
も、未変性ポリペプチド全体に結合する抗体を得るのに
用いることができる。ついで、かかる抗体を用いて、ポ
リペプチドを発現する組織からそのポリペプチドを単離
することができる。
【００７３】モノクローナル抗体の調製のためには、連
続的セルライン系により産生される抗体を提供するいず
れかの方法を用いることができる。例えば、ハイブリド
ーマ法（Kohler,G.およびMilstein,C.、Nature 256:495
-497(1975)）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドー
マ法（Kozborら, Immunology Today 4:72(1983)）およ
びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら, MONOCLONAL ANT
IBODIES AND CANCER THERAPY. Alan R.Liss,Inc,(198
5)）が挙げられる。
続的セルライン系により産生される抗体を提供するいず
れかの方法を用いることができる。例えば、ハイブリド
ーマ法（Kohler,G.およびMilstein,C.、Nature 256:495
-497(1975)）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドー
マ法（Kozborら, Immunology Today 4:72(1983)）およ
びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら, MONOCLONAL ANT
IBODIES AND CANCER THERAPY. Alan R.Liss,Inc,(198
5)）が挙げられる。
【００７４】１本鎖抗体の製造に関して記載された方法
（米国特許第４,９４６,７７８号）を適用して、本発明
の免疫原性ポリペプチド産物に対する１本鎖抗体を産生
することができる。また、トランスジェニックマウス、
または他の哺乳動物を含め他の生物を用いて、本発明の
免疫原性ポリペプチド産生に対するヒト化抗体を発現さ
せてもよい。前記した抗体を用いて、ポリペプチドを発
現するクローンを単離または同定してもよく、あるいは
該抗体をアフィニティークロマトグラフィーによる単離
および／または精製用の固体支持体に結合させることに
より、本発明ポリペプチドを精製してもよい。マウスＣ
Ｃ−ＣＫＲ５に対する抗体は、とりわけ、Ｔ−細胞介在
炎症およびＨＩＶ−１感染を阻害するのに用いることが
できる。
（米国特許第４,９４６,７７８号）を適用して、本発明
の免疫原性ポリペプチド産物に対する１本鎖抗体を産生
することができる。また、トランスジェニックマウス、
または他の哺乳動物を含め他の生物を用いて、本発明の
免疫原性ポリペプチド産生に対するヒト化抗体を発現さ
せてもよい。前記した抗体を用いて、ポリペプチドを発
現するクローンを単離または同定してもよく、あるいは
該抗体をアフィニティークロマトグラフィーによる単離
および／または精製用の固体支持体に結合させることに
より、本発明ポリペプチドを精製してもよい。マウスＣ
Ｃ−ＣＫＲ５に対する抗体は、とりわけ、Ｔ−細胞介在
炎症およびＨＩＶ−１感染を阻害するのに用いることが
できる。
【００７５】マウスＣＣ−ＣＫＲ５結合分子およびアッ
セイ マウスＣＣ−ＣＫＲ５を用いて、これと相互作用するタ
ンパク質を単離することができる；この相互作用を妨害
についての標的とすることができる。マウスＣＣ−ＣＫ
Ｒ５と他の因子の間のタンパク質−タンパク質の相互作
用の阻害剤は、ヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプター活性を調
節する医薬品の開発を先導できる。かくして、本発明は
また、マウスＣＣ−ＣＫＲ５に結合する分子の同定方法
も提供する。分子をマウスＣＣ−ＣＫＲ５に結合させる
タンパク質をコードする遺伝子は、当業者に公知の多く
の方法、例えば、放射性リガンド結合アッセイ、カルシ
ウム動態化アッセイ、リガンドパンニング（panning）
およびＦＡＣＳソーティングにより、同定することがで
きる。かかる方法は多くの実験室マニュアル、例えば、
Coliganら, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 1、第５
章（１９９１年）に記載されている。
セイ マウスＣＣ−ＣＫＲ５を用いて、これと相互作用するタ
ンパク質を単離することができる；この相互作用を妨害
についての標的とすることができる。マウスＣＣ−ＣＫ
Ｒ５と他の因子の間のタンパク質−タンパク質の相互作
用の阻害剤は、ヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプター活性を調
節する医薬品の開発を先導できる。かくして、本発明は
また、マウスＣＣ−ＣＫＲ５に結合する分子の同定方法
も提供する。分子をマウスＣＣ−ＣＫＲ５に結合させる
タンパク質をコードする遺伝子は、当業者に公知の多く
の方法、例えば、放射性リガンド結合アッセイ、カルシ
ウム動態化アッセイ、リガンドパンニング（panning）
およびＦＡＣＳソーティングにより、同定することがで
きる。かかる方法は多くの実験室マニュアル、例えば、
Coliganら, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 1、第５
章（１９９１年）に記載されている。
【００７６】別法として、結合パートナーについてのペ
プチドライブラリーのスクリーニングが挙げられる。組
換えマウスＣＣ−ＣＫＲ５を発現するトランスフェクシ
ョン細胞を用いて、マウスＣＣ−ＣＫＲ５と相互作用す
るペプチドまたはリンペプチドライブラリーからペプチ
ドを同定する。そのペプチドの配列決定は、相互作用す
るタンパク質中に見られるかもしれないコンセンサスペ
プチド配列の同定をもたらす。当業者に公知のこれらの
方法または他の方法によって同定されるマウスＣＣ−Ｃ
ＫＲ５の結合パートナーならびに前記した推定結合パー
トナーを、本発明のアッセイ方法において用いることが
できる。マウスＣＣ−ＣＫＲ５／結合パートナーの複合
体の存在についてのアッセイは、例えば、放射性リガン
ド結合アッセイおよびカルシウム動態化研究によりなさ
れる。マウスＣＣ−ＣＫＲ５／結合パートナーの相互作
用の形成を妨害または阻害する試験物質の存在下、複合
体の減少量を、試験物質を欠いている対照との比較にて
測定する。
プチドライブラリーのスクリーニングが挙げられる。組
換えマウスＣＣ−ＣＫＲ５を発現するトランスフェクシ
ョン細胞を用いて、マウスＣＣ−ＣＫＲ５と相互作用す
るペプチドまたはリンペプチドライブラリーからペプチ
ドを同定する。そのペプチドの配列決定は、相互作用す
るタンパク質中に見られるかもしれないコンセンサスペ
プチド配列の同定をもたらす。当業者に公知のこれらの
方法または他の方法によって同定されるマウスＣＣ−Ｃ
ＫＲ５の結合パートナーならびに前記した推定結合パー
トナーを、本発明のアッセイ方法において用いることが
できる。マウスＣＣ−ＣＫＲ５／結合パートナーの複合
体の存在についてのアッセイは、例えば、放射性リガン
ド結合アッセイおよびカルシウム動態化研究によりなさ
れる。マウスＣＣ−ＣＫＲ５／結合パートナーの相互作
用の形成を妨害または阻害する試験物質の存在下、複合
体の減少量を、試験物質を欠いている対照との比較にて
測定する。
【００７７】遊離結合パートナーに関するアッセイは、
放射性リガンド結合アッセイおよびカルシウム動態化に
よりなされる。マウスＣＣ−ＣＫＲ５／結合パートナー
の相互作用の形成を妨害または阻害する試験物質の存在
下、結合パートナーの増加量を、試験物質を欠いている
対照との比較にて測定する。本発明ポリペプチドを用い
て、細胞中または膜調製物中のマウスＣＣ−ＣＫＲ５結
合分子のヒトＣＣ−ＣＫＲ５結合許容量を評価すること
もできる。
放射性リガンド結合アッセイおよびカルシウム動態化に
よりなされる。マウスＣＣ−ＣＫＲ５／結合パートナー
の相互作用の形成を妨害または阻害する試験物質の存在
下、結合パートナーの増加量を、試験物質を欠いている
対照との比較にて測定する。本発明ポリペプチドを用い
て、細胞中または膜調製物中のマウスＣＣ−ＣＫＲ５結
合分子のヒトＣＣ−ＣＫＲ５結合許容量を評価すること
もできる。
【００７８】アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセ
イおよび分子 マウスＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子の知見を用いて、ヒトＣＣ
−ＣＫＲ５レセプターの発現能を有するマウスを産生す
ることが可能である。マウス株由来のマウスＣＣ−ＣＫ
Ｒ５レセプターを破壊し、そのレセプターをヒトＣＣ−
ＣＫＲ５レセプターと置き換えることができる。好まし
い具体例において、マウスＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子を、図
３に示す、ヒトＨＤＧＮＲ１０クローンと置き換える。
例えば、マウス遺伝子破壊株は、マウスＣＣ−ＣＫＲ５
遺伝子をネオカセットで分裂させ、内因性マウス遺伝子
を破壊することにより形成される。ついで、この株を用
いてヒトＨＤＧＮＲ１０レセプターを再挿入し、マウス
ＣＣ−ＣＫＲ５レセプターの喪失と置き換えることがで
きる。かかる株はＴ−細胞媒介炎症の研究における動物
実験として非常に有用である。加えて、ヒトＣＣ−ＣＫ
Ｒ５はＨＩＶ−１感染にて重要な役割を果たすため、こ
れらの動物はこのヒトウイルスの研究にて有用なモデル
に供すると考えられる。
イおよび分子 マウスＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子の知見を用いて、ヒトＣＣ
−ＣＫＲ５レセプターの発現能を有するマウスを産生す
ることが可能である。マウス株由来のマウスＣＣ−ＣＫ
Ｒ５レセプターを破壊し、そのレセプターをヒトＣＣ−
ＣＫＲ５レセプターと置き換えることができる。好まし
い具体例において、マウスＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子を、図
３に示す、ヒトＨＤＧＮＲ１０クローンと置き換える。
例えば、マウス遺伝子破壊株は、マウスＣＣ−ＣＫＲ５
遺伝子をネオカセットで分裂させ、内因性マウス遺伝子
を破壊することにより形成される。ついで、この株を用
いてヒトＨＤＧＮＲ１０レセプターを再挿入し、マウス
ＣＣ−ＣＫＲ５レセプターの喪失と置き換えることがで
きる。かかる株はＴ−細胞媒介炎症の研究における動物
実験として非常に有用である。加えて、ヒトＣＣ−ＣＫ
Ｒ５はＨＩＶ−１感染にて重要な役割を果たすため、こ
れらの動物はこのヒトウイルスの研究にて有用なモデル
に供すると考えられる。
【００７９】これらの遺伝子破壊動物を用いて、化合物
をスクリーニングし、ヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプターの
活性に対するその効果を測定することができる。例え
ば、本発明のマウスを、ヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプター
の活性を活性化（アゴニスト）または阻害（アンタゴニ
スト）する化合物についてのスクリーニング方法にて利
用することができる。加えて、化合物に対する応答にて
ヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプターの発現のレベルの変化を
評価することができる。一般に、このようなスクリーニ
ング操作は、本発明のヒトレセプターポリペプチドを発
現する遺伝子破壊マウスを産生することからなる。つい
で、マウスに試験化合物を投与し、結合、機能応答の刺
激または阻害を観察する。
をスクリーニングし、ヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプターの
活性に対するその効果を測定することができる。例え
ば、本発明のマウスを、ヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプター
の活性を活性化（アゴニスト）または阻害（アンタゴニ
スト）する化合物についてのスクリーニング方法にて利
用することができる。加えて、化合物に対する応答にて
ヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプターの発現のレベルの変化を
評価することができる。一般に、このようなスクリーニ
ング操作は、本発明のヒトレセプターポリペプチドを発
現する遺伝子破壊マウスを産生することからなる。つい
で、マウスに試験化合物を投与し、結合、機能応答の刺
激または阻害を観察する。
【００８０】別法として、スクリーニングは、その表面
でマウスＣＣ−ＣＫＲ５レセプターを発現する細胞を用
いてインビトロにて行ってもよい。このような細胞は、
哺乳動物または昆虫由来の細胞、例えば、ドロソフィラ
を包含する。特に、本発明のレセプターをコードするポ
リヌクレオチドを用いて細胞をトランスフェクション
し、それによりマウスＣＣ−ＣＫＲ５を発現させる。つ
いで、該レセプターを発現する細胞を試験化合物と接触
させ、結合、機能応答の刺激または阻害を観察する。
でマウスＣＣ−ＣＫＲ５レセプターを発現する細胞を用
いてインビトロにて行ってもよい。このような細胞は、
哺乳動物または昆虫由来の細胞、例えば、ドロソフィラ
を包含する。特に、本発明のレセプターをコードするポ
リヌクレオチドを用いて細胞をトランスフェクション
し、それによりマウスＣＣ−ＣＫＲ５を発現させる。つ
いで、該レセプターを発現する細胞を試験化合物と接触
させ、結合、機能応答の刺激または阻害を観察する。
【００８１】一のかかるスクリーニング操作は、本発明
のマウスＣＣ−ＣＫＲ５を発現するようにトランスフェ
クションされている黒色素胞を使用することからなる。
そのようなスクリーニング方法はＰＣＴ ＷＯ９２／０
１８１０に記載されている。一の具体例において、この
方法を用いて、レセプターをコードする黒色素因胞細胞
をレセプターリガンドおよびスクリーニングすべき化合
物の両方と接触させることで、本発明のレセプターポリ
ペプチドの活性化を阻害する化合物をスクリーニングす
るのに用いる。そのリガンドにより得られるシグナルが
阻害されるということは、化合物がそのレセプターの潜
在的アンタゴニストであり、すなわち、該レセプターの
活性化を阻害することを示す。その方法を、かかる細胞
をスクリーニングすべき化合物と接触させ、そのような
化合物がシグナルを発するかどうかどうか、すなわち、
該レセプターを活性化するかどうかを測定することによ
り、レセプターを活性化する化合物をスクリーニングす
るのに用いることができる。
のマウスＣＣ−ＣＫＲ５を発現するようにトランスフェ
クションされている黒色素胞を使用することからなる。
そのようなスクリーニング方法はＰＣＴ ＷＯ９２／０
１８１０に記載されている。一の具体例において、この
方法を用いて、レセプターをコードする黒色素因胞細胞
をレセプターリガンドおよびスクリーニングすべき化合
物の両方と接触させることで、本発明のレセプターポリ
ペプチドの活性化を阻害する化合物をスクリーニングす
るのに用いる。そのリガンドにより得られるシグナルが
阻害されるということは、化合物がそのレセプターの潜
在的アンタゴニストであり、すなわち、該レセプターの
活性化を阻害することを示す。その方法を、かかる細胞
をスクリーニングすべき化合物と接触させ、そのような
化合物がシグナルを発するかどうかどうか、すなわち、
該レセプターを活性化するかどうかを測定することによ
り、レセプターを活性化する化合物をスクリーニングす
るのに用いることができる。
【００８２】他のスクリーニング法は、レセプターの活
性化により誘起される細胞外ｐＨ変化を測定するシステ
ムにて、マウスＣＣ−ＣＫＲ５を発現する細胞（例え
ば、トランスフェクションされたＣＨＯ細胞）を使用す
ることからなる。（例えば、Science，246：181−296
（1989）を参照のこと）。この方法においては、化合物
を本発明のレセプターポリペプチドを発現する細胞と接
触させてもよい。ついで、別のメッセンジャー応答、例
えば、シグナル・トランスダクションまたはｐＨ変化を
測定し、その潜在的化合物がレセプターを活性化するか
阻害するかを測定する。もう一つ別のスクリーニング法
は、マウスＣＣ−ＣＫＲ５をコードするＲＮＡをＸenop
us 卵母細胞に導入し、そのレセプターを一時的に発現
させることからなる。ついで、レセプター卵母細胞をレ
セプターリガンドおよびスクリーニングすべき化合物と
接触させる。ついで、該レセプターの活性化を阻害する
と思われる化合物をスクリーニングする場合、カルシウ
ム、プロトンまたは他のイオンなどのシグナルを検出す
ることによって、該レセプターの阻害または活性化を測
定する。
性化により誘起される細胞外ｐＨ変化を測定するシステ
ムにて、マウスＣＣ−ＣＫＲ５を発現する細胞（例え
ば、トランスフェクションされたＣＨＯ細胞）を使用す
ることからなる。（例えば、Science，246：181−296
（1989）を参照のこと）。この方法においては、化合物
を本発明のレセプターポリペプチドを発現する細胞と接
触させてもよい。ついで、別のメッセンジャー応答、例
えば、シグナル・トランスダクションまたはｐＨ変化を
測定し、その潜在的化合物がレセプターを活性化するか
阻害するかを測定する。もう一つ別のスクリーニング法
は、マウスＣＣ−ＣＫＲ５をコードするＲＮＡをＸenop
us 卵母細胞に導入し、そのレセプターを一時的に発現
させることからなる。ついで、レセプター卵母細胞をレ
セプターリガンドおよびスクリーニングすべき化合物と
接触させる。ついで、該レセプターの活性化を阻害する
と思われる化合物をスクリーニングする場合、カルシウ
ム、プロトンまたは他のイオンなどのシグナルを検出す
ることによって、該レセプターの阻害または活性化を測
定する。
【００８３】別のスクリーニング法は、レセプターがホ
スホリパーゼＣまたはＤに結合しているマウスＣＣ−Ｃ
ＫＲ５を発現させることからなる。そのような細胞の代
表例として、内皮細胞、平滑筋細胞および胚腎細胞が挙
げられるが、これに限定されるものではない。スクリー
ニングは、前記したように、レセプターの活性化または
ホスホリパーゼ２次シグナルからのレセプターの活性化
の阻害を検出することによりなされる。別法は、標識さ
れたリガンドの、その細胞表面にレセプターを有する細
胞への結合の阻害を測定することにより、アンタゴニス
トである、すなわちＣＣ−ＣＫＲ５の活性化を阻害する
化合物をスクリーニングすることからなる。そのような
方法は、細胞がその細胞表面でレセプターを発現するよ
うに、真核細胞をマウスＣＣ−ＣＫＲ５をコードするＤ
ＮＡでトランスフェクションすることからなる。つい
で、その細胞を、標識された形態の既知リガンドの存在
下で化合物と接触させる。リガンドは、例えば、放射能
により標識化することができる。レセプターに結合した
標識化リガンドの量を、例えば、これらの細胞からの細
胞または膜のトランスフェクションに付随する放射活性
を測定することにより決定する。化合物がレセプターに
結合する場合、標識化リガンドのレセプターへの結合
は、標識化リガンドの減少により測定されるように阻害
される。
スホリパーゼＣまたはＤに結合しているマウスＣＣ−Ｃ
ＫＲ５を発現させることからなる。そのような細胞の代
表例として、内皮細胞、平滑筋細胞および胚腎細胞が挙
げられるが、これに限定されるものではない。スクリー
ニングは、前記したように、レセプターの活性化または
ホスホリパーゼ２次シグナルからのレセプターの活性化
の阻害を検出することによりなされる。別法は、標識さ
れたリガンドの、その細胞表面にレセプターを有する細
胞への結合の阻害を測定することにより、アンタゴニス
トである、すなわちＣＣ−ＣＫＲ５の活性化を阻害する
化合物をスクリーニングすることからなる。そのような
方法は、細胞がその細胞表面でレセプターを発現するよ
うに、真核細胞をマウスＣＣ−ＣＫＲ５をコードするＤ
ＮＡでトランスフェクションすることからなる。つい
で、その細胞を、標識された形態の既知リガンドの存在
下で化合物と接触させる。リガンドは、例えば、放射能
により標識化することができる。レセプターに結合した
標識化リガンドの量を、例えば、これらの細胞からの細
胞または膜のトランスフェクションに付随する放射活性
を測定することにより決定する。化合物がレセプターに
結合する場合、標識化リガンドのレセプターへの結合
は、標識化リガンドの減少により測定されるように阻害
される。
【００８４】別法は、マウスＣＣ−ＣＫＲ５介在ｃＡＭ
Ｐおよび／またはアデニレート・シクラーゼ蓄積の阻害
または刺激を測定することによりＣＣ−ＣＫＲ５阻害剤
をスクリーニングすることからなる。かかる方法は、真
核細胞をマウスＣＣ−ＣＫＲ５レセプターでトランスフ
ェクションし、その細胞表面で該レセプターを発現させ
ることからなる。ついで、該細胞をマウスＣＣ−ＣＫＲ
５の存在下で潜在的アンタゴニストに暴露する。つい
で、ｃＡＭＰ蓄積量を測定する。潜在的アンタゴニスト
がレセプターに結合する場合、すなわちＣＣ−ＣＫＲ５
結合を阻害する場合、マウスＣＣ−ＣＫＲ５介在ｃＡＭ
Ｐまたはアデニレートシクラーゼのレベル、活性は減少
するか、増加するであろう。レセプターのアゴニストお
よびアンタゴニストを検出する他の方法は、米国特許第
５４８２８３５号に記載の酵母に基づく技法である。
Ｐおよび／またはアデニレート・シクラーゼ蓄積の阻害
または刺激を測定することによりＣＣ−ＣＫＲ５阻害剤
をスクリーニングすることからなる。かかる方法は、真
核細胞をマウスＣＣ−ＣＫＲ５レセプターでトランスフ
ェクションし、その細胞表面で該レセプターを発現させ
ることからなる。ついで、該細胞をマウスＣＣ−ＣＫＲ
５の存在下で潜在的アンタゴニストに暴露する。つい
で、ｃＡＭＰ蓄積量を測定する。潜在的アンタゴニスト
がレセプターに結合する場合、すなわちＣＣ−ＣＫＲ５
結合を阻害する場合、マウスＣＣ−ＣＫＲ５介在ｃＡＭ
Ｐまたはアデニレートシクラーゼのレベル、活性は減少
するか、増加するであろう。レセプターのアゴニストお
よびアンタゴニストを検出する他の方法は、米国特許第
５４８２８３５号に記載の酵母に基づく技法である。
【００８５】本発明はまた、ＣＣ−ＣＫＲ５レセプター
への結合能を有することが不明なリガンドが該レセプタ
ーに結合することができるかどうかを測定する方法を提
供する。この方法は、リガンドのＣＣ−ＣＫＲ５レセプ
ターへの結合を可能とする条件下、マウスＣＣ−ＣＫＲ
５レセプターを発現する哺乳動物細胞をリガンドと接触
させ、マウスレセプターに結合するリガンドの存在を検
出し、それによりそのリガンドがＣＣ−ＣＫＲ５レセプ
ターに結合するかどうかを決定することからなる。アゴ
ニストおよび／またはアンタゴニストを決定するために
前記したシステムはまた、該レセプターに結合するリガ
ンドを決定するのに利用することもできる。
への結合能を有することが不明なリガンドが該レセプタ
ーに結合することができるかどうかを測定する方法を提
供する。この方法は、リガンドのＣＣ−ＣＫＲ５レセプ
ターへの結合を可能とする条件下、マウスＣＣ−ＣＫＲ
５レセプターを発現する哺乳動物細胞をリガンドと接触
させ、マウスレセプターに結合するリガンドの存在を検
出し、それによりそのリガンドがＣＣ−ＣＫＲ５レセプ
ターに結合するかどうかを決定することからなる。アゴ
ニストおよび／またはアンタゴニストを決定するために
前記したシステムはまた、該レセプターに結合するリガ
ンドを決定するのに利用することもできる。
【００８６】潜在的ＣＣ−ＣＫＲ５レセプターアンタゴ
ニストとして、例えば、抗体、またはある場合には、第
２メッセンジャー応答を誘起しないが、レセプターに結
合する、すなわち、該レセプターの活性を妨げる、オリ
ゴヌクレオチドが挙げられる。潜在的アンタゴニストは
また、マウスＣＣ−ＣＫＲ５レセプターのリガンドに密
接に関連付けられるタンパク質、すなわち、生物学的機
能を失っており、ＣＣ−ＣＫＲ５レセプターに結合した
場合に、何の応答も惹起しない、リガンドのフラグメン
トを包含する。
ニストとして、例えば、抗体、またはある場合には、第
２メッセンジャー応答を誘起しないが、レセプターに結
合する、すなわち、該レセプターの活性を妨げる、オリ
ゴヌクレオチドが挙げられる。潜在的アンタゴニストは
また、マウスＣＣ−ＣＫＲ５レセプターのリガンドに密
接に関連付けられるタンパク質、すなわち、生物学的機
能を失っており、ＣＣ−ＣＫＲ５レセプターに結合した
場合に、何の応答も惹起しない、リガンドのフラグメン
トを包含する。
【００８７】潜在的アンタゴニストはまた、アンチセン
ス法を用いて調製されたアンチセンス構築物も包含す
る。アンチセンス法を用いて、３重ヘリックス形成によ
り、またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡにより遺伝
子発現を制御することができ、どちらの方法もポリヌク
レオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいてい
る。例えば、ポリヌクレオチド配列の５'コーディング
部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコードしており、
それを用いて約１０ないし４０塩基対の長さのアンチセ
ンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリ
ゴヌクレオチドは、転写に関する遺伝子の領域に相補的
であるように設計され（３重ヘリックス −Leeら、Nuc
l.Acids Res. 6：3073（1979）；Cooneyら、Science 24
1：456（1988）；およびDervanら、Science 251：1360
（1991）を参照のこと）、それによりＣＣ−ＣＫＲ５レ
セプターの転写および製造を阻害する。アンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてｍＲＮＡ
にハイブリッド形成し、ｍＲＮＡ分子のＣＣ−ＣＫＲ５
レセプターへの翻訳を遮断する（アンチセンス − Okan
o、J.Neurochem.56：560（1991）；Oligodeoxynucleoti
des as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CR
C Press, Boca Raton, FL（1988））。前記したオリゴ
ヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ
がインビボにおいて発現されてＣＣ−ＣＫＲ５レセプタ
ーの生成を阻害するように、細胞にデリバリーすること
もできる。
ス法を用いて調製されたアンチセンス構築物も包含す
る。アンチセンス法を用いて、３重ヘリックス形成によ
り、またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡにより遺伝
子発現を制御することができ、どちらの方法もポリヌク
レオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいてい
る。例えば、ポリヌクレオチド配列の５'コーディング
部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコードしており、
それを用いて約１０ないし４０塩基対の長さのアンチセ
ンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリ
ゴヌクレオチドは、転写に関する遺伝子の領域に相補的
であるように設計され（３重ヘリックス −Leeら、Nuc
l.Acids Res. 6：3073（1979）；Cooneyら、Science 24
1：456（1988）；およびDervanら、Science 251：1360
（1991）を参照のこと）、それによりＣＣ−ＣＫＲ５レ
セプターの転写および製造を阻害する。アンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてｍＲＮＡ
にハイブリッド形成し、ｍＲＮＡ分子のＣＣ−ＣＫＲ５
レセプターへの翻訳を遮断する（アンチセンス − Okan
o、J.Neurochem.56：560（1991）；Oligodeoxynucleoti
des as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CR
C Press, Boca Raton, FL（1988））。前記したオリゴ
ヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ
がインビボにおいて発現されてＣＣ−ＣＫＲ５レセプタ
ーの生成を阻害するように、細胞にデリバリーすること
もできる。
【００８８】もう一つの潜在的アンタゴニストは、マウ
スＣＣ−ＣＫＲ５レセプターに結合する小分子であり、
正常な生物学的活性が妨げられるように、それをリガン
ドに接近させる。小分子の例として、小ペプチドまたは
ペプチド様分子が挙げられるが、これに限定されるもの
ではない。潜在的アンタゴニストはまた、可溶性形態の
ＣＣ−ＣＫＲ５レセプター、例えば、リガンドに結合
し、リガンドが膜結合ＣＣ−ＣＫＲ５レセプターと相互
反応することを妨げる、レセプターのフラグメントを包
含する。
スＣＣ−ＣＫＲ５レセプターに結合する小分子であり、
正常な生物学的活性が妨げられるように、それをリガン
ドに接近させる。小分子の例として、小ペプチドまたは
ペプチド様分子が挙げられるが、これに限定されるもの
ではない。潜在的アンタゴニストはまた、可溶性形態の
ＣＣ−ＣＫＲ５レセプター、例えば、リガンドに結合
し、リガンドが膜結合ＣＣ−ＣＫＲ５レセプターと相互
反応することを妨げる、レセプターのフラグメントを包
含する。
【００８９】ＣＣ−ＣＫＲ５レセプターは哺乳動物宿主
において普遍的に存在しており、多くの病因を含め、多
数の生物学的機能に関与している。従って、一方でＣＣ
−ＣＫＲ５を刺激し、他方でＣＣ−ＣＫＲ５の機能を阻
害しうる化合物および薬剤を見いだすことが望まれてい
る。ＣＣ−ＣＫＲ５レセプターに関するアゴニストおよ
びアンタゴニストは、Ｔ細胞介在炎症工程を媒介する治
療および予防目的、特にＨＩＶ−１感染の阻害に利用さ
れる。
において普遍的に存在しており、多くの病因を含め、多
数の生物学的機能に関与している。従って、一方でＣＣ
−ＣＫＲ５を刺激し、他方でＣＣ−ＣＫＲ５の機能を阻
害しうる化合物および薬剤を見いだすことが望まれてい
る。ＣＣ−ＣＫＲ５レセプターに関するアゴニストおよ
びアンタゴニストは、Ｔ細胞介在炎症工程を媒介する治
療および予防目的、特にＨＩＶ−１感染の阻害に利用さ
れる。
【００９０】加えて、本発明は、過剰なＣＣ−ＣＫＲ５
活性に関係した異常な状態を治療する方法であって、前
記した阻害化合物（アンタゴニスト）を医薬上許容され
る担体と共にリガンドのＣＣ−ＣＫＲ５レセプターへの
結合を遮断することにより、または第２シグナルを阻害
することにより、活性化を阻害するのに効果的な量にて
対象に投与し、それにより異常な状態を緩和することか
らなる方法を提供する。また、本発明は、ＣＣ−ＣＫＲ
５およびその活性の過小発現に関係した異常な状態を治
療する方法であって、前記した本発明のレセプターポリ
ペプチドを活性化する化合物（アゴニスト）を医薬上許
容される担体と組み合わせて治療上有効量を対象に投与
し、それにより異常な状態を緩和することからなる方法
を提供する。
活性に関係した異常な状態を治療する方法であって、前
記した阻害化合物（アンタゴニスト）を医薬上許容され
る担体と共にリガンドのＣＣ−ＣＫＲ５レセプターへの
結合を遮断することにより、または第２シグナルを阻害
することにより、活性化を阻害するのに効果的な量にて
対象に投与し、それにより異常な状態を緩和することか
らなる方法を提供する。また、本発明は、ＣＣ−ＣＫＲ
５およびその活性の過小発現に関係した異常な状態を治
療する方法であって、前記した本発明のレセプターポリ
ペプチドを活性化する化合物（アゴニスト）を医薬上許
容される担体と組み合わせて治療上有効量を対象に投与
し、それにより異常な状態を緩和することからなる方法
を提供する。
【００９１】組成物およびキット かかるレセプターを活性化または阻害する化合物を、適
当な医薬担体と組み合わせて用いてもよい。そのような
組成物は、治療上有効量のポリペプチドまたは化合物
と、医薬上許容される担体または賦形剤を含んでなる。
かかる担体は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、
水、グリセロール、エタノールおよびそれらの混合物を
包含するが、これらに制限されない。処方は投与方法に
適するものでなければならない。投与方法による適当な
担体の選択は、当業者であれば容易に行うことができ
る。本発明はさらに、前記した本発明の組成物の１また
はそれ以上の成分を充填した１またはそれ以上の容器か
らなる医薬用パックに関する。
当な医薬担体と組み合わせて用いてもよい。そのような
組成物は、治療上有効量のポリペプチドまたは化合物
と、医薬上許容される担体または賦形剤を含んでなる。
かかる担体は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、
水、グリセロール、エタノールおよびそれらの混合物を
包含するが、これらに制限されない。処方は投与方法に
適するものでなければならない。投与方法による適当な
担体の選択は、当業者であれば容易に行うことができ
る。本発明はさらに、前記した本発明の組成物の１また
はそれ以上の成分を充填した１またはそれ以上の容器か
らなる医薬用パックに関する。
【００９２】投与 本発明のポリペプチドおよび他の化合物を単独で、ある
いは治療化合物のごとき他の化合物と組み合わせて使用
してよい。医薬組成物は、例えば、特に、局所、経口、
経肛門、経膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経鼻内
または皮内経路による投与を含め、効果的で都合のよい
方法で投与することができる。一般に、医薬組成物を、
個々の徴候（複数でも可）の治療または予防のための有
効な量で投与する。一般に、少なくとも約１０μｇ／ｋ
ｇ体重の量で組成物を投与する。大抵の場合、１日につ
き約８ｍｇ／ｋｇ体重を越えない量で組成物が投与され
るであろう。好ましくは、大抵の場合、１日につき用量
は約１０μｇ／ｋｇ体重ないし約１ｍｇ／ｋｇ体重であ
る。症状、重篤度、投与経路、合併症等を考慮して、各
治療様式についての標準的方法および症状により最適用
量が決定されることが理解されよう。
いは治療化合物のごとき他の化合物と組み合わせて使用
してよい。医薬組成物は、例えば、特に、局所、経口、
経肛門、経膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経鼻内
または皮内経路による投与を含め、効果的で都合のよい
方法で投与することができる。一般に、医薬組成物を、
個々の徴候（複数でも可）の治療または予防のための有
効な量で投与する。一般に、少なくとも約１０μｇ／ｋ
ｇ体重の量で組成物を投与する。大抵の場合、１日につ
き約８ｍｇ／ｋｇ体重を越えない量で組成物が投与され
るであろう。好ましくは、大抵の場合、１日につき用量
は約１０μｇ／ｋｇ体重ないし約１ｍｇ／ｋｇ体重であ
る。症状、重篤度、投与経路、合併症等を考慮して、各
治療様式についての標準的方法および症状により最適用
量が決定されることが理解されよう。
【００９３】実施例 本発明を以下の実施例を用いてさらに詳しく説明する。
実施例は具体例について本発明を説明するためにのみ提
供されるにすぎない。これらの実例例は本発明のある種
の具体的な態様を説明するものであるが、開示されてい
る発明の観点を限定または制限するものではない。本明
細書で用いる特定の用語は前記した定義で説明する。全
ての実施例は、特記するもの以外は、当業者に周知で慣
用される標準法を用いて実施した。以下の実施例の慣用
的な分子生物学的技術は、例えばSambrookらのような標
準的な研究室マニュアルに記載されるように実施でき
る。
実施例は具体例について本発明を説明するためにのみ提
供されるにすぎない。これらの実例例は本発明のある種
の具体的な態様を説明するものであるが、開示されてい
る発明の観点を限定または制限するものではない。本明
細書で用いる特定の用語は前記した定義で説明する。全
ての実施例は、特記するもの以外は、当業者に周知で慣
用される標準法を用いて実施した。以下の実施例の慣用
的な分子生物学的技術は、例えばSambrookらのような標
準的な研究室マニュアルに記載されるように実施でき
る。
【００９４】実施例１：ヒト胚腎細胞２９３を用いたネ
ズミＣＣ−ＣＫＲ５の発現 ネズミＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子のアミノおよびカルボキシ
末端配列に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて、寄託株ポリヌクレオチドにおけるネズミＣ
Ｃ−ＣＫＲ５をコードするＤＮＡ配列を増幅する。クロ
ーニングを容易にする制限部位を含有するヌクレオチド
を５’および３’の配列の各々にさらに加える。５’オ
リゴヌクレオチドプライマーは配列：５’−ＡＧＧＣＣ
ＴＡＡＧＣＴＴＴＧＣＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＡＧ
ＧＧＴＣＡＧ−３’（配列番号：４）を有し、ＳｔｕＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩ認識配列（プライマー配列の下線
部）を含有し、ネズミＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子の２０塩基
がこれに続く。３’オリゴヌクレオチドプライマーは配
列：５’−ＣＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＣＡＴＡＡＡ
ＣＣＡＧＴＡＧＡＡＡＣＴＴＣ−３’（配列番号：５）
を有し、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ認識配列（プライマ
ー配列の下線部）を含有し、ネズミＣＣ−ＣＫＲ５遺伝
子の２１塩基がこれに続く。これらのプライマーで増幅
したＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子の領域は、図１で下線を付し
てある。
ズミＣＣ−ＣＫＲ５の発現 ネズミＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子のアミノおよびカルボキシ
末端配列に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて、寄託株ポリヌクレオチドにおけるネズミＣ
Ｃ−ＣＫＲ５をコードするＤＮＡ配列を増幅する。クロ
ーニングを容易にする制限部位を含有するヌクレオチド
を５’および３’の配列の各々にさらに加える。５’オ
リゴヌクレオチドプライマーは配列：５’−ＡＧＧＣＣ
ＴＡＡＧＣＴＴＴＧＣＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＡＧ
ＧＧＴＣＡＧ−３’（配列番号：４）を有し、ＳｔｕＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩ認識配列（プライマー配列の下線
部）を含有し、ネズミＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子の２０塩基
がこれに続く。３’オリゴヌクレオチドプライマーは配
列：５’−ＣＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＣＡＴＡＡＡ
ＣＣＡＧＴＡＧＡＡＡＣＴＴＣ−３’（配列番号：５）
を有し、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ認識配列（プライマ
ー配列の下線部）を含有し、ネズミＣＣ−ＣＫＲ５遺伝
子の２１塩基がこれに続く。これらのプライマーで増幅
したＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子の領域は、図１で下線を付し
てある。
【００９５】標準的なＰＣＲ反応条件を用いて、５’お
よび３’プライマー、およびＰＣＲ鋳型としてpBluescr
iptにクローン化したＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子を含有する
反応物から１０８４塩基対のフラグメントを生じた。Ｐ
ＣＲ生成物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタ
ノールで沈殿させ、次いでＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍ
ＨＩで消化した。消化したＣＣ−ＣＫＲ５フラグメント
をキアゲンＱＩＡＥＸＤＮＡフラグメント精製キットを
用いてゲル精製した。独特なＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａ
ｍＨＩ部位を用いて、このフラグメントをプラスミドｐ
ＣＤＮにクローン化した。ｐＣＤＮは（１）イー・コリ
（E.coli）およびその他の原核生物細胞における伸長に
有効なイー・コリ（E.coli）複製起点；（２）プラスミ
ド含有原核生物細胞の選別のためのアンピシリン抵抗性
遺伝子；（３）ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、お
よびポリアデニル化部位；（４）真核生物細胞における
伸長のためのＳＶ４０複製起点；（５）これらの細胞が
ヌクレオシド不存在下で成長できるようにプラスミドで
形質転換した細胞の選別のためのネズミジヒドロ葉酸還
元酵素をコードする遺伝子；および（６）形質転換した
細胞の選別のためのゲンチシンに対する抵抗性をコード
する遺伝子を含有する。ネズミＣＣ−ＣＫＲ５受容体の
発現がＣＭＶプロモーターにより指示されるように、フ
ラグメントをポリリンカー部位にクローン化した。ライ
ゲーション混合物をイー・コリ（E.coli）ＤＨ５α株に
形質転換し、アンピシリンの存在下で成長させることに
より、形質転換したコロニーを選別した。ＨｉｎｄＩＩ
ＩおよびＢａｍＨＩを用いる制限分析により、ネズミＣ
Ｃ−ＣＫＲ５フラグメントを含有する組換えプラスミド
を同定した。3個の別個のクローンからのＣＣ−ＣＫＲ
５フラグメントをＤＮＡ配列決定により分析し、ＰＣＲ
増幅中に塩基は変化しないことを確認した。
よび３’プライマー、およびＰＣＲ鋳型としてpBluescr
iptにクローン化したＣＣ−ＣＫＲ５遺伝子を含有する
反応物から１０８４塩基対のフラグメントを生じた。Ｐ
ＣＲ生成物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタ
ノールで沈殿させ、次いでＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍ
ＨＩで消化した。消化したＣＣ−ＣＫＲ５フラグメント
をキアゲンＱＩＡＥＸＤＮＡフラグメント精製キットを
用いてゲル精製した。独特なＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａ
ｍＨＩ部位を用いて、このフラグメントをプラスミドｐ
ＣＤＮにクローン化した。ｐＣＤＮは（１）イー・コリ
（E.coli）およびその他の原核生物細胞における伸長に
有効なイー・コリ（E.coli）複製起点；（２）プラスミ
ド含有原核生物細胞の選別のためのアンピシリン抵抗性
遺伝子；（３）ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、お
よびポリアデニル化部位；（４）真核生物細胞における
伸長のためのＳＶ４０複製起点；（５）これらの細胞が
ヌクレオシド不存在下で成長できるようにプラスミドで
形質転換した細胞の選別のためのネズミジヒドロ葉酸還
元酵素をコードする遺伝子；および（６）形質転換した
細胞の選別のためのゲンチシンに対する抵抗性をコード
する遺伝子を含有する。ネズミＣＣ−ＣＫＲ５受容体の
発現がＣＭＶプロモーターにより指示されるように、フ
ラグメントをポリリンカー部位にクローン化した。ライ
ゲーション混合物をイー・コリ（E.coli）ＤＨ５α株に
形質転換し、アンピシリンの存在下で成長させることに
より、形質転換したコロニーを選別した。ＨｉｎｄＩＩ
ＩおよびＢａｍＨＩを用いる制限分析により、ネズミＣ
Ｃ−ＣＫＲ５フラグメントを含有する組換えプラスミド
を同定した。3個の別個のクローンからのＣＣ−ＣＫＲ
５フラグメントをＤＮＡ配列決定により分析し、ＰＣＲ
増幅中に塩基は変化しないことを確認した。
【００９６】ネズミＣＣ−ＣＫＲ５受容体を発現するた
めに、製造者の指示書に準じてリポファクタミン（ギブ
コ−ライフサイエンシズ）により、ヒト胚腎細胞２９３
をｐＣＤＮｍＣＣ−ＣＫＲ５でトランスフェクションし
た。ゲンチシンを用いた選別により、安定した細胞系を
得た。125Ｉ−ＲＡＮＴＥＳを用いる放射性標識結合ア
ッセイにより、ネズミＣＣ−ＣＫＲ５の発現を検出し
た。再度125Ｉ−ＲＡＮＴＥＳおよび市販により入手可
能なＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、−２、
−３およびエオタキシンのごときケモカインを用いて、
競合結合実験を実施した。
めに、製造者の指示書に準じてリポファクタミン（ギブ
コ−ライフサイエンシズ）により、ヒト胚腎細胞２９３
をｐＣＤＮｍＣＣ−ＣＫＲ５でトランスフェクションし
た。ゲンチシンを用いた選別により、安定した細胞系を
得た。125Ｉ−ＲＡＮＴＥＳを用いる放射性標識結合ア
ッセイにより、ネズミＣＣ−ＣＫＲ５の発現を検出し
た。再度125Ｉ−ＲＡＮＴＥＳおよび市販により入手可
能なＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、−２、
−３およびエオタキシンのごときケモカインを用いて、
競合結合実験を実施した。
【００９７】実施例２：遺伝子機能破壊マウスの製造 翻訳開始コドンの上流に0.55kbおよび開始コドンの下流
に1.65kbを含む2.2kbのゲノムフラグメントを用いて、
遺伝子機能破壊マウスを作るための標的ベクターを構築
する。１２９ＳＶＪマウスゲノムライブラリーからフラ
グメントを単離した。ネオマイシンに対する抵抗性を付
与する遺伝子を含有するフラグメントを翻訳開始コドン
の200bp下流にある独特なＥｃｏＲＶ部位に挿入し、単
純疱疹ウイルスチミジンキナーゼカセットをゲノムフラ
グメントの５’末端にライゲーションする。ＥＳ Ｄ３
細胞を線状ベクターでトランスフェクションする。２μ
Ｍガンシクロヴィルおよび１７５μｇ／ｍｌ Ｇ４１８
中で選別することにより、トランスフェクションしたク
ローンを単離する。ネオマイシン抵抗性遺伝子をプロー
ブとして用いて、サザンブロット・ハイブリダイゼーシ
ョンにより、陽性のＥＳ細胞を同定する。分断されたＣ
Ｃ−ＣＫＲ５遺伝子座を含有するＥＳ細胞クローンをＢ
ａｌｂ／ｃ胚盤胞にマイクロインジェクションし、胚芽
系キメラを生じ、次いでＢａｌｂ／ｃ雌を育ててヘテロ
接合マウスを作る。ヘテロ接合マウスを育ててホモ接合
機能破壊マウスを得る。
に1.65kbを含む2.2kbのゲノムフラグメントを用いて、
遺伝子機能破壊マウスを作るための標的ベクターを構築
する。１２９ＳＶＪマウスゲノムライブラリーからフラ
グメントを単離した。ネオマイシンに対する抵抗性を付
与する遺伝子を含有するフラグメントを翻訳開始コドン
の200bp下流にある独特なＥｃｏＲＶ部位に挿入し、単
純疱疹ウイルスチミジンキナーゼカセットをゲノムフラ
グメントの５’末端にライゲーションする。ＥＳ Ｄ３
細胞を線状ベクターでトランスフェクションする。２μ
Ｍガンシクロヴィルおよび１７５μｇ／ｍｌ Ｇ４１８
中で選別することにより、トランスフェクションしたク
ローンを単離する。ネオマイシン抵抗性遺伝子をプロー
ブとして用いて、サザンブロット・ハイブリダイゼーシ
ョンにより、陽性のＥＳ細胞を同定する。分断されたＣ
Ｃ−ＣＫＲ５遺伝子座を含有するＥＳ細胞クローンをＢ
ａｌｂ／ｃ胚盤胞にマイクロインジェクションし、胚芽
系キメラを生じ、次いでＢａｌｂ／ｃ雌を育ててヘテロ
接合マウスを作る。ヘテロ接合マウスを育ててホモ接合
機能破壊マウスを得る。
【００９８】
（１）一般的情報： （ｉ）出願人：ダーク・バーグスマ、メアリー・ブロー
ナーおよびウスマン・シャボン （ｉｉ）発明の名称： ＣＣ−ＣＫＲ５レセプターの新
規マウスゲノムクローン （ｉｉｉ）配列の数：５ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛名： ラトナー＆プレスチア （Ｂ）通り名： ピー・オー・ボックス （Ｃ）都市名： バレイ・フォージ （Ｄ）州名： ペンシルベニア州 （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： １９４８２ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスケット、３.５インチ、１.４４
Ｍｂ （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ４８６ （Ｃ）オペレーティングシステム：ウィンドウ・フォー
・ワークグループ （Ｄ）ソフトウェア：マイクロソフト・ワード （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号：０８／７２４,９８４ （Ｂ）出願日：１０／３／９６ （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ポウル・エフ・プレスチア （Ｂ）登録番号：２３,０３１ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＡＴＧ５００２３ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０ ４０７−０７００ （Ｂ）テレファックス番号：６１０ ４０７−０７０１
ナーおよびウスマン・シャボン （ｉｉ）発明の名称： ＣＣ−ＣＫＲ５レセプターの新
規マウスゲノムクローン （ｉｉｉ）配列の数：５ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛名： ラトナー＆プレスチア （Ｂ）通り名： ピー・オー・ボックス （Ｃ）都市名： バレイ・フォージ （Ｄ）州名： ペンシルベニア州 （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： １９４８２ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスケット、３.５インチ、１.４４
Ｍｂ （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ４８６ （Ｃ）オペレーティングシステム：ウィンドウ・フォー
・ワークグループ （Ｄ）ソフトウェア：マイクロソフト・ワード （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号：０８／７２４,９８４ （Ｂ）出願日：１０／３／９６ （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ポウル・エフ・プレスチア （Ｂ）登録番号：２３,０３１ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＡＴＧ５００２３ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０ ４０７−０７００ （Ｂ）テレファックス番号：６１０ ４０７−０７０１
【００９９】（２） 配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４４０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｘｉ）配列の記載：配列番号１： GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GaGaGaGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGaGA 50 GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA TCTTATTAGT 100 TACCAAGGAG TGACAAGCAA CATGTCAGTT AAGGTTTCAT ACTGCCCAAA 150 TTCAAAGTAA GTTACTTCCT GGTGGTGTGG TTTTTATATT AACATTCATT 200 CTCTCTATAC TTGGGGAGTG TTTTATCCAG AAAAACATAA ACAGTATATT 250 GCTTGCCTCA AGCAGTTAAc TCAAGTGTTT AGCAAAtGCA TATGTAATAC 300 TATAGAACAG TAATTAGCAC CCACTACTCA TTCTTTCTGG CATTTGTGTG 350 AACTCTAGGA TTTATGGATA AATGCCTAGA AGCAGCATCT TCAATAGAGA 400 TCTTAAGCCC ATGAATTATA TAGGACCTGA CTCAGTTTCA CAGATTAATT 450 CACCCCACAT TGATATGGAA AGCAAAATTT TATTTGATCA AATGCATCTT 500 TGGTGAATTT CGAGCCATCT GATGATGGGA AAATTAAATG TAGAAGTCTA 550 TGCCTCAAAG ACCTACTAAG TTATAAAACA ATAATTGTGG TAGGCCAGCA 600 ATTGCTTTAA CCTTTATTAA GCATTGTCTT TTATTTATTC ATAGGCTCTT 650 GCAGGATGGA TTTTCAAGGG TCAGTTCCGA CCTATATCTA TGACATCGAT 700 TAtGGTATGT CAGCACCCTG CCAAAAAATC AATGtGAAAC AAATTGCAGC 750 TcAGCTCCtg CCCCCAcTAT ACTCCctGGT ATTCATCTtt GGTTTtGcGG 800 GAAACATGAT GGTcTTCCTC ATCTTGATAA GCTGCAAAAA GCTGAAGAGC 850 GTGACTGATA TCTATCTGCT CAACTTGGCC ATCTCtGACC TGcTCTTCCT 900 GCTCACACTA CCATTCTGGG CTCACTATGC TGCAAATGAG TGGATCTTTG 950 GGAATATAAT GTGTAAAGTA TTCACAGGTG TCTATCATAT TGGTTATTTT 1000 GGTGGAATCT TCTTCATTAT CCTCCTGACA ATTGATAGGT ACTTGGCTAT 1050 TGTCCATGCT GTGTtTGCTT TAAAAGTCAC AACGGTCAAC TTTGGGGTGA 1100 TAACAAgTGT AGTCACTTGG GTGGTGGCTG TGTTTGCCTC TCTCCCAgAA 1150 ATAATCTtTA CCAgATCTCA gAAAgAAGGT TtTCATTATA CATGCAGTCC 1200 TCATTTTCCA CACACTCAGT ATCATTTCTG GAAGAGTTTC CAAACATTAA 1250 AGATGGTCAT CTTGAGCCTG ATCCTGCCTC TACTTGTCAT GATCATCTGC 1300 TACTCAGGAA TTCTCCACAC CCTGTTTCGC TGTAGGAATG AGAAGAAGAG 1350 GCACAGGGCT GTGAGGCTCA TCTTTGCCAT CATGATTGTC TACTTTCTCT 1400 TCTGGACTCC CTACAACATT GTCCTCCTCC TGACCACCTT CCAGGAATTC 1450 TTTGGACTGA ATAACTGCAG TAGTTCTAAT AGACTAGACC AGGCCATGCA 1500 GGCAACAGAG ACTCTTGGAA TGACACACTG CTGCCTAAAC CCTGTCATCT 1550 ATGCCTTTGT TGGAGAgAAG TTCCGGAGTT ATCTCTCAGT GTTCTTCCGA 1600 AAACACATTG TCAAACGCTT TTGCAAACGG TGTTCAATTT TCCAGCAAGA 1650 CAATCCTGAT CGTGTAAGCT CAGTCTATAC CCGATCCACA GGAGAACATG 1700 AAGTTTCTAC TGGTTTATGA CCTGGTTGAC TTTTGTGTAT CACGTAGTTT 1750 TTCTATGCAG CTTGGGAGTA GGAATGGTTC TTTTAAAAAA GAAATTAGTA 1800 TCATAGAGGG CCCAAGATAC ATGCATCTTT TTGATATTTA TTTTTAGATA 1850 GATTGGATCT TTTAAAACTG AATGGGGAGG TTGGGGTGGG GGAGCAgGGA 1900 gAACGAgTCT TTTATCAGGG CCGGGAAATA TGCACAAAGA gACTTGAGTC 1950 AGGTGCCATG ACCCATATGC AAAGGGACGG ACACAGGGCC gATGCTGTTG 2000 CCTAgAAATG ACGTGTCTCC CCGCTGGGTT CCTGAAAGGC GGCTGTAAAT 2050 ATGCCTGATT GCCATAAAGT CGCTTCTTGC TGTCTATGGA TGTGCCTGAC 2100 TGCCAACAGG GAAGAACCAC TTCTGCATAT AAAATGTAGA GTCAGCAGAA 2150 CTTGGGGTAA ATTGAAGTTA GAGGTGCATA AGAACCCCTA GGCTTAGTTA 2200 GGTTGAAATA CCCATTGAGG AAACAGCAAA TACAAAGGAA GAATAAAGAG 2250 TTTAGCCGGG AAGGTAGTCT CATTTTACAG CCGGAATATA ATGTTATCTC 2300 AGGCTAGCAT TTTGTTCCTG CCTTCAGACC TAAATCCTAC CACACCGGGA 2350 CTGTGAAACA CCTGGATTAT GAATCATGAg CCTGAgGTCT AgGAATAATA 2400 ACGTTTGTgA TTTTAgATgA GGGCTGTTTA CATAgTTTGA 2440
【０１００】（２） 配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３５９ （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Met Asp Phe Gln Gly Ser Val Pro Thr Tyr Ile Tyr Asp Ile Asp 5 10 15 Tyr Gly Met Ser Ala Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile 20 25 30 Ala Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe 35 40 45 Gly Phe Ala Gly Asn Met Met Val Phe Leu Ile Leu Ile Ser Cys 50 55 60 Lys Lys Leu Lys Ser Val Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala 65 70 75 Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala His 80 85 90 Tyr Ala Ala Asn Glu Trp Ile Phe Gly Asn Ile Met Cys Lys Val 95 100 105 Phe Thr Gly Val Tyr His Ile Gly Tyr Phe Gly Gly Ile Phe Phe 110 115 120 Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala 125 130 135 Val Phe Ala Leu Lys Val Thr Thr Val Asn Phe Gly Val Ile Thr 140 145 150 Ser Val Val Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser Leu Pro Glu 155 160 165 Ile Ile Phe Thr Arg Ser Gln Lys Glu Gly Phe His Tyr Thr Cys 170 175 180 Ser Pro His Phe Pro His Thr Gln Tyr His Phe Trp Lys Ser Phe 185 190 200 Gln Thr Leu Lys Met Val Ile Leu Ser Leu Ile Leu Pro Leu Leu 205 210 215 Val Met Ile Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu His Thr Leu Phe Arg 220 225 230 Cys Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg Leu Ile Phe 235 240 245 Ala Ile Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Thr Pro Tyr Asn Ile 250 255 260 Val Leu Leu Leu Thr Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn 265 270 275 Cys Ser Ser Ser Asn Arg Leu Asp Gln Ala Met Gln Ala Thr Glu 280 285 290 Thr Leu Gly Met Thr His Cys Cys Leu Asn Pro Val Ile Tyr Ala 295 300 305 Phe Val Gly Glu Lys Phe Arg Ser Tyr Leu Ser Val Phe Phe Arg 310 315 320 Lys His Ile Val Lys Arg Phe Cys Lys Arg Cys Ser Ile Phe Gln 325 330 335 Gln Asp Asn Pro Asp Arg Val Ser Ser Val Tyr Thr Arg Ser Thr 340 345 350 Gly Glu His Glu Val Ser Thr Gly Leu 355
【０１０１】（２） 配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１５９ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｘｉ）配列の記載：配列番号３： ATGGATTATC AAGTGTCAAG TCCAATCTAT GACATCAATT ATTATACATC 50 GGAGCCCTGC CAAAAAATCA ATGTGAAGCA AATCGCAGcC CGCCTCCTGC 100 CTCCGCTCTA CTCACTGGTG TTCATCTTTG GTTTtGTGGG CAACATGCTG 150 GTCATCCTCA TCCTGATAAA CTGcAAAAGG CTGAAGAGCA TGACTGACAT 200 CTaCCTGCTC AACCTGGCCA TCTCTGACCT GTTTTTCCTT CTTACTGTCC 250 CCTTCTGGGC TCACTATGCT GCCGCCCAGT GGGACTTTGG AAATACAATG 300 TGTCAACTCT TGACAGGGCT CTATTTTATA GGCTTCTTCT CTGGAATCTT 350 CTTCATCATC CTCCTGACAA TCGATAGGTA CCTGGCTGTC GTCCATGCTG 400 TGTTTGCTTT AAAAGCCAGG ACGGTCACCT TTGGGGTGGT GACAAGTGTG 450 ATCACTTGGG TGGTGgCTGT GTTTGCGTCT CTCCCAGGAA TCATCTTTAC 500 CAGATCTCAA AAAGAAGGTC TTCATTACAC CTGCAGCTCT CATTTTCCAT 550 ACAGTCAGTA TCAATTCTGG AAGAATTTCC AGACATTAAA GATAGTCATC 600 TTGGGGCTGG TCCTgCCgCT GCTTGTCATG GTCATCTGCT ACTCGGGAAT 650 CCTAAAAACT CTGCTTCGGT GTCGAAATGA GAAGAAGAGG CACAGGGCTG 700 TGAGGCTTAT CTTCACCATC ATGATTGTTT ATTTTCTCTT CTGGGCTCCC 750 TACAACAtTG TCCTTCTCCT GAACACCTTC CAGGAATTCT TTGGCCTGAA 800 TAATTGCAGT AGCTCTAACA GGTTGGACCA AGCTATGCAG GTGACAGAGA 850 CTCTTGGGAT GACGCACTGC TGCATCAACC CCATCATCTA TGCCTTTGTC 900 GGGGAGAAGT TCAGAAACTA CCTCTTAGTC TTCTTCCAAA AGCACATTGC 950 CAAACGCTTC TgCAAATGCT GTTCTATTTT CCAGCAAGAG GCTCCCGAGC 1000 GAGCAAGCTC AGTTTACACC CGATCCACTG ggGAGCAGGA AATATCTGTG 1150 GGCtTGTGA 1159
【０１０２】（２） 配列番号４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３６ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｖ）アンチンス：なし （ｘｉ）配列の記載：配列番号４： AGGCCTAAGC TTTGCGGATG GATTTTCAAG GGTCAG 36
【０１０３】（２） 配列番号５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３４ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｖ）アンチンス：なし （ｘｉ）配列の記載：配列番号５： CTCGAGGATC CTATCATAAA CCAGTAGAAA CTTC 34
【図１】 マウスＣＣ−ＣＫＲ５のヌクレオチド配列
（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）
を示す。
（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）
を示す。
【図２】 マウスＣＣ−ＣＫＲ５のヌクレオチド配列
（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）
を示す。
（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）
を示す。
【図３】 ヒト・クローンＨＤＧＮＲ１０、さらにヒト
ＣＣ−ＣＫＲ５と同定されたＲＡＮＴＥＳレセプターの
ヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
ＣＣ−ＣＫＲ５と同定されたＲＡＮＴＥＳレセプターの
ヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 メアリー・イー・ブローナー アメリカ合衆国19312ペンシルベニア州バ ーウィン、ショアライン・ドライブ210番 (72)発明者 ウスマン・シャボン アメリカ合衆国19081ペンシルベニア州ス ワースモアー、サウス・スワースモアー・ アベニュー225番
Claims (14)
- 【請求項１】（ａ）配列番号２のアミノ酸からなるポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも８
５％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）遺伝コードの縮重性により、配列番号２と同じア
ミノ酸をコードするポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的
なポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
の少なくとも１５個の連続した塩基からなるポリヌクレ
オチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含
んでなる単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号１に示すヌクレオチド１を含ん
でなる請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 配列番号２のアミノ酸を含んでなるポリ
ペプチドをコードする請求項２記載のポリヌクレオチ
ド。 - 【請求項６】（ａ）ＡＴＣＣ受託番号９８１７０に含ま
れるマウス遺伝子により発現されるのと同じ成熟ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも８５
％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）遺伝コードの縮重性により、ＡＴＣＣ受託番号９
８１７０に含まれるマウス遺伝子により発現されるのと
同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的
なポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
の少なくとも１５個の連続した塩基からなるポリヌクレ
オチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含
んでなる単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項７】 請求項２に記載のＤＮＡを有してなるベ
クター。 - 【請求項８】 請求項７に記載のベクターを有してなる
宿主細胞。 - 【請求項９】 前記したＤＮＡによってコードされるポ
リペプチドを請求項８の宿主細胞から発現させることか
らなるポリペプチドの製造方法。 - 【請求項１０】 細胞を請求項７記載のベクターで形質
転換またはトランスフェクションし、その細胞がベクタ
ー中に含まれるＤＮＡによってコードされるポリペプチ
ドを発現することからなる、ポリペプチドを発現する細
胞の製造方法。 - 【請求項１１】 配列番号２に示すアミノ酸配列からな
るポリペプチド。 - 【請求項１２】 請求項１１に記載のポリペプチドに対
する抗体。 - 【請求項１３】 ヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプターの発現
能を有するトランスジェニックマウスからなるヒト免疫
不全ウイルスについてのマウス実験。 - 【請求項１４】 ヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプターのアゴ
ニストまたはアンタゴニストである化合物をスクリーン
する方法であって、 （ａ）スクリーンすべき化合物を請求項１３記載のマウ
スに投与し；および （ｂ）マウスにおけるヒトＣＣ−ＣＫＲ５レセプターの
活性に対する化合物のいずれかの効果をモニターするこ
とからなる方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/724,984 US6388055B1 (en) | 1996-10-03 | 1996-10-03 | Mouse CC-CKR5 receptor polypeptide |
| US08/724984 | 1996-10-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10179180A true JPH10179180A (ja) | 1998-07-07 |
Family
ID=24912662
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9307784A Withdrawn JPH10179180A (ja) | 1996-10-03 | 1997-10-03 | Ｃｃ−ｃｋｒ５レセプターのマウスゲノムクローン |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6388055B1 (ja) |
| EP (1) | EP0834564A3 (ja) |
| JP (1) | JPH10179180A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US6511826B2 (en) | 1995-06-06 | 2003-01-28 | Human Genome Sciences, Inc. | Polynucleotides encoding human G-protein chemokine receptor (CCR5) HDGNR10 |
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| JP2009531022A (ja) * | 2006-02-17 | 2009-09-03 | ラパポート ファミリー インスティテュート フォー リサーチ イン ザ メディカル サイエンシーズ | Ｃｃｒ５／ｃｃｒ５リガンド関連疾患を治療するための分子およびその使用方法 |
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- 1996-10-03 US US08/724,984 patent/US6388055B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
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- 1997-10-03 EP EP97307823A patent/EP0834564A3/en not_active Withdrawn
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| US7175988B2 (en) | 2001-02-09 | 2007-02-13 | Human Genome Sciences, Inc. | Human G-protein Chemokine Receptor (CCR5) HDGNR10 |
| US7862818B2 (en) | 2001-02-09 | 2011-01-04 | Human Genome Sciences, Inc. | Method of inhibiting human G-protein chemokine receptor (CCR5) HDGNR10 |
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| US7501123B2 (en) | 2004-03-12 | 2009-03-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Human G-protein chemokine receptor (CCR5) HDGNR10 |
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|---|---|
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