JPH0987200A - 骨吸収疾患を治療するためのｓｒｃ ｓｈ２特異的化合物の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトｓｒｃ ＳＨ２ドメインと選択的に結合
する化合物を用いる骨吸収疾患の治療薬の提供。 【解決手段】 一の対象における骨吸収疾患の治療にて
用いる医薬組成物であって、ヒトｌｃｋ ＳＨ２ドメイ
ンおよびヒトｆｙｎ ＳＨ２ドメインに結合する結合親
和性よりも５０倍以上高い結合親和性でヒトｓｒｃ Ｓ
Ｈ２ドメインに結合し、かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメイン
に結合する結合親和性の５０分の１以下の結合親和性で
ヒトｈｃｐ ＳＨ２ドメイン、ヒトＧｒｂ２ ＳＨ２ドメ
イン、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ ＳＨ２ドメインおよびヒト
ｐ８５ ＳＨ２ドメインに結合する化合物からなる医薬
組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】哺乳
動物の骨は、骨吸収と骨形成の動的プロセスである、骨
再編成を常に行っている。これらのプロセスは分化した
細胞種により媒介される：骨形成は破骨細胞によって鉱
質化された骨を除去する結果であり、骨吸収は破骨細胞
による骨マトリックスが溶解する結果である。多くの骨
疾患は、骨形成の骨吸収に対する不調和から生じる。例
えば、骨粗鬆症およびパジェット病のような疾患は、骨
マトリックスの喪失により特徴付けられる。かくして、
骨吸収を阻害する薬剤はこのような疾患の治療について
有用である。活性化された破骨細胞は、骨マトリックス
に付着し、その細胞膜と骨マトリックスの間に形成され
た密封区画中にタンパク質分解酵素、有機酸およびプロ
トンを分泌することにより骨を吸収する。その酸性環境
およびタンパク質分解酵素はその密封区画中の骨を溶か
し、骨表面に小窩または間隙を形成する。破骨細胞を骨
から分離した場合にそれは明らかである。

【０００２】多くのポリペプチド成長因子およびホルモ
ンが、シグナルトランスダクション経路を介してその細
胞性作用を媒介する。これらのリガンドについての細胞
表面の受容体から細胞内エフェクターへのシグナルトラ
ンスダクションは、頻繁に、調節タンパク質チロシンキ
ナーゼ（ＰＴＫ）およびホスファターゼによる特異的タ
ンパク質基質のリン酸化または脱リン酸化に関連してい
る。チロシンのリン酸化は、最初の、または可能性とし
ては唯一の、多細胞生物におけるシグナルトランスダク
ションのインディケーターであるかもしれない。受容体
結合した、細胞内ＰＴＫは、免疫系細胞において、細胞
の増殖、細胞の分化およびシグナル伝達系を制御してい
る。異常なタンパク質チロシンキナーゼ活性が、糖尿
病、アテローム性動脈硬化症、乾癬、敗血性ショック、
骨損失、貧血症、多くの癌および他の増殖性疾患のごと
き多くの病態において関係しているか、または示唆され
ている。従って、チロシンキナーゼおよびそれが関わる
シグナルトランスダクション経路は、薬物設計の標的に
なりうる。例えば、レビツキー（Levitzki）ら、サイエ
ンス（Science）、第２６７巻、１７８２−１７８８頁
（１９９５年）参照のこと。

【０００３】シグナルトランスダクション経路を構成す
るタンパク質の多くは低濃度で存在し、しばしば反対の
活性を有する。これらのシグナル伝達分子の性質が、エ
フェクターの細胞内での局在化および並置によって、な
らびに一つの経路における小さな変化でスイッチ効果が
得られる程度に活性化と抑制のバランスを調整すること
により、細胞がトランスダクションを制御することを可
能とする。タンパク質−タンパク質相互作用を介するシ
グナル伝達分子の並置によるトランスダクション複合体
の形成は、特異的なドッキングドメイン配列モチーフに
よって媒介される。非受容体ＰＴＫおよびキナーゼ標的
エフェクター分子のような種々のシグナル伝達分子およ
び発癌タンパク質に見られる約１００個のアミノ酸の非
触媒配列を保存する、ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ド
メインが重要な役割を果たしている。ＳＨ２ドメイン
は、自己リン酸化されたＰＴＫ受容体または細胞内チロ
シンキナーゼ中に見られる短いホスホチロシン含有ペプ
チド配列に対して高特異的である。

【０００４】保存されているＳＨ２ドメイン、すなわち
約１００個のアミノ酸の保存配列を共有する個々の触媒
性または他の機能性ドメインを有する約６０個のタンパ
ク質が同定されている。生体中、いずれの生理学的応答
が、これらのＳＨ２ドメインのうちいずれによって制御
されているのかは正確にはわかっていない。さらに、Ｓ
Ｈ２ドメイン−リガンド／化合物相互作用は、リガンド
／化合物の構造における小さな修飾が、リガンド／化合
物が種々のＳＨ２ドメインに結合する選択性を著しく変
化させる程に高特異的である。ＳＨ２ドメインの非選択
的拮抗作用の結果はかなり厳格でありうる。例えば、ｓ
ｒｃ ＳＨ２ドメイン、ｌｃｋ ＳＨ２ドメインおよびｆ
ｙｎ ＳＨ２ドメインは構造的に類似であり、ドメイン
間で高い保存度を有するが、ｓｒｃ ＳＨ２ドメインの
拮抗作用は本明細書中にて骨吸収をなすと示唆されてお
り、一方、ｌｃｋ ＳＨ２ドメインまたはｆｙｎ ＳＨ２
ドメインの拮抗作用は免疫抑制を誘発する。免疫抑制の
誘発は、骨吸収疾患の長期治療において望ましくない。
さらに、６０個のすべての既知のＳＨ２ドメインに対す
る結合研究にて、潜在的ｓｒｃ ＳＨ２ドメインアンタ
ゴニストをアッセイすることは実際的ではない。現在ま
で、ｓｒｃ ＳＨ２ドメインと選択的に相互作用する化
合物は知られていない。

【０００５】ｓｒｃ ＳＨ２ドメインを拮抗することに
よって骨吸収疾患を治療するが、非選択的ＳＨ２ドメイ
ンアンタゴニストにおいて見られる副作用の発生を回避
する方法および化合物を提供することが望ましい。本明
細書に開示されているごとく、ｓｒｃ ＳＨ２ドメイ
ン、ｌｃｋ ＳＨ２ドメイン、ｆｙｎ ＳＨ２ドメイン、
ＳＨＰＴＰ２ ＳＨ２ドメイン、ｐ８５ドメイン、Ｇｒ
ｂ２ ＳＨ２ドメイン、およびｈｃｐ ＳＨ２ドメインか
らなる群のＳＨ２ドメインに対する結合アッセイによっ
て、意外にも、選択的ｓｒｃ ＳＨ２ドメインアンタゴ
ニストを同定できることが判明した。以下に記載する結
合情報から、意外にも、ヒトｌｃｋ ＳＨ２ドメインお
よびヒトｆｙｎ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和性
よりも５０倍以上高い結合親和性でヒトｓｒｃ ＳＨ２
ドメインに特異的であり、そのようなｓｒｃ ＳＨ２ド
メインに結合する結合親和性の５０分の１以下の結合親
和性でヒトｈｃｐ ＳＨ２ドメイン、ヒトＧｒｂ２ ＳＨ
２ドメイン、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ ＳＨ２ドメインおよ
びヒトｐ８５ ＳＨ２ドメインに結合する化合物が、骨
吸収疾患を治療するのに効果的であることが判明した。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、一の対象にお
ける骨吸収疾患の治療法であって、治療上有効量の、
（ａ）ヒトｌｃｋ ＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎ Ｓ
Ｈ２ドメインに結合する結合親和性より５０倍以上高い
結合親和性でヒトｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合し、
（ｂ）かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親
和性の５０分の１以下の結合親和性でヒトｈｃｐ ＳＨ
２ドメイン、ヒトＧｒｂ２ドメイン、ヒトＳＨ−ＰＴＰ
２ ＳＨ２ドメインおよびヒトｐ８５ ＳＨ２ドメインに
結合する化合物を対象に投与することからなる方法を提
供する。本発明はまた、一の対象における骨粗鬆症の治
療法であって、治療上有効量の、（ａ）ヒトｌｃｋ Ｓ
Ｈ２ドメインおよびヒトｆｙｎ ＳＨ２ドメインに結合
する結合親和性より５０倍以上高い結合親和性でヒトｓ
ｒｃ ＳＨ２ドメインに結合し、（ｂ）かかるｓｒｃ Ｓ
Ｈ２ドメインに結合する結合親和性の５０分の１以下の
結合親和性でヒトｈｃｐ ＳＨ２ドメイン、ヒトＧｒｂ
２ドメイン、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ ＳＨ２ドメインおよ
びヒトｐ８５ ＳＨ２ドメインに結合する化合物を対象
に投与することからなる方法を提供する。

【０００７】本発明はまた、一の対象における破骨細胞
の機能を減少させる方法であって、破骨細胞機能阻害量
の、（ａ）ヒトｌｃｋ ＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙ
ｎ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和性より５０倍以
上高い結合親和性でヒトｓｒｃＳＨ２ドメインに結合
し、（ｂ）かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結
合親和性の５０分の１以下の結合親和性でヒトｈｃｐ
ＳＨ２ドメイン、ヒトＧｒｂ２ドメイン、ヒトＳＨ−Ｐ
ＴＰ２ ＳＨ２ドメインおよびヒトｐ８５ ＳＨ２ドメイ
ンに結合する化合物を対象に投与することからなる方法
を提供する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本明細書において用いる「骨吸収
疾患」なる語は、破骨細胞活性による骨異常損失、好ま
しくは骨粗鬆症により特徴付けられるいずれの障害も意
味する。本明細書において用いる「治療」なる語および
その派生語は、予防的または治療的処理を意味する。本
明細書において用いる「化合物」なる語は、非ペプチド
性化合物を意味する。本明細書において用いる「ｓｒｃ
ＳＨ２ドメインアンタゴニスト」なる語は、特に記載
しない限り、（ａ）ヒトｌｃｋ ＳＨ２ドメインおよび
ヒトｆｙｎ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和性より
５０倍以上高い、好ましくは１００倍以上高い結合親和
性でヒトｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合し、（ｂ）かか
るｓｒｃＳＨ２ドメインに結合する結合親和性の５０分
の１以下、好ましくは１００分の１以下の結合親和性で
ヒトｈｃｐ ＳＨ２ドメイン、ヒトＧｒｂ２ ＳＨ２ドメ
イン、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ ＳＨ２ドメインおよびヒト
ｐ８５ ＳＨ２ドメインに結合する化合物を意味する。

【０００９】本発明は、一の対象における骨吸収疾患の
治療法であって、治療上有効量の、（ａ）ヒトｌｃｋ
ＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎ ＳＨ２ドメインに結
合する結合親和性より５０倍以上高い結合親和性でヒト
ｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合し、（ｂ）かかるｓｒｃ
ＳＨ２ドメインに結合する結合親和性の５０分の１以下
の結合親和性でヒトｈｃｐ ＳＨ２ドメイン、ヒトＧｒ
ｂ２ ＳＨ２ドメイン、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ ＳＨ２ドメ
インおよびヒトｐ８５ ＳＨ２ドメインに結合する化合
物を対象に投与することからなる方法を提供する。本発
明の好ましい態様は、一の対象における骨吸収疾患の治
療法であって、治療上有効量の、（ａ）ヒトｌｃｋ Ｓ
Ｈ２ドメインおよびヒトｆｙｎ ＳＨ２ドメインに結合
する結合親和性より５０倍以上高い結合親和性でヒトｓ
ｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する化合物を対象に投与す
ることからなる方法を提供する。

【００１０】本発明の好ましい態様は、一の対象におけ
る骨吸収疾患の治療法であって、治療上有効量の、
（ａ）ヒトｌｃｋ ＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎ Ｓ
Ｈ２ドメインに結合する結合親和性より１００倍以上高
い結合親和性でヒトｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合し、
（ｂ）かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親
和性の１００分の１以下の結合親和性でヒトｈｃｐ Ｓ
Ｈ２ドメイン、ヒトＧｒｂ２ ＳＨ２ドメイン、ヒトＳ
Ｈ−ＰＴＰ２ ＳＨ２ドメインおよびヒトｐ８５ ＳＨ２
ドメインに結合する化合物を対象に投与することからな
る方法を提供する。本発明の好ましい態様は、一の対象
における骨吸収疾患の治療法であって、治療上有効量
の、（ａ）ヒトｌｃｋ ＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙ
ｎ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和性より１００倍
以上高い結合親和性でヒトｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結
合する化合物を対象に投与することからなる方法を提供
する。

【００１１】本発明は、一の対象における骨粗鬆症の治
療法であって、治療上有効量の、（ａ）ヒトｌｃｋ Ｓ
Ｈ２ドメインおよびヒトｆｙｎ ＳＨ２ドメインに結合
する結合親和性より５０倍以上高い、好ましくは１００
倍以上高い結合親和性でヒトｓｒｃ ＳＨ２ドメインに
結合し、（ｂ）かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合す
る結合親和性の５０分の１以下、好ましくは１００分の
１以下の結合親和性でヒトｈｃｐ ＳＨ２ドメイン、ヒ
トＧｒｂ２ドメイン、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ ＳＨ２ドメ
インおよびヒトｐ８５ ＳＨ２ドメインに結合する化合
物を対象に投与することからなる方法を提供する。本発
明の好ましい態様は、一の対象における骨粗鬆症の治療
法であって、治療上有効量の、（ａ）ヒトｌｃｋ ＳＨ
２ドメインおよびヒトｆｙｎ ＳＨ２ドメインに結合す
る結合親和性より５０倍以上高い、好ましくは１００倍
以上高い結合親和性でヒトｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結
合する化合物を対象に投与することからなる方法を提供
する。

【００１２】本発明はまた、一の対象における破骨細胞
の機能を減少させる方法であって、破骨細胞機能阻害量
の、（ａ）ヒトｌｃｋ ＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙ
ｎ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和性より５０倍以
上高い、好ましくは１００倍以上高い結合親和性でヒト
ｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合し、（ｂ）かかるｓｒｃ
ＳＨ２ドメインに結合する結合親和性の５０分の１以
下、好ましくは１００分の１以下の結合親和性でヒトｈ
ｃｐ ＳＨ２ドメイン、ヒトＧｒｂ２ドメイン、ヒトＳ
Ｈ−ＰＴＰ２ ＳＨ２ドメインおよびヒトｐ８５ ＳＨ２
ドメインに結合する化合物を対象に投与することからな
る方法を提供する。本発明の好ましい態様は、一の対象
における破骨細胞の機能を減少させる方法であって、治
療上有効量の、（ａ）ヒトｌｃｋ ＳＨ２ドメインおよ
びヒトｆｙｎ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和性よ
り５０倍以上高い、好ましくは１００倍以上高い結合親
和性でヒトｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する化合物を
対象に投与することからなる方法を提供する。

【００１３】異なるヒトＳＨ２ドメインでの化合物の阻
害活性を、以下の実施例１１でさらに詳細に記載される
ごとく、イー・コリ（E.coli）中で融合タンパク質とし
て発現されたＳＨ２ドメインを使用してin vitroにて決
定した。付記した表１および２および実施例１２におい
て示したデータは、ｓｒｃ ＳＨ２ドメインアンタゴニ
ストが胎児ラット長骨（ＦＲＬＢ）アッセイにて顕著な
効果を有することを示す。このin vitro活性は、当該分
野において、in vivoでの骨吸収疾患の治療における効
能と相関関係にあると認識されている。このin vitro活
性はまた、当該分野において、in vivoにおける破骨細
胞の機能を減少させる効能とも相関していると認識され
ている。

【００１４】従って、本発明は、骨吸収疾患の治療法で
あって、ある量の、骨吸収を阻害するのに有効な量の、
本明細書において定義されるｓｒｃ ＳＨ２ドメインア
ンタゴニストを投与することからなる方法を提供する。
骨吸収疾患を患っている患者または骨吸収疾患にかかっ
ている危険のある患者に、限定されるものではないが、
静脈内、筋肉内、経口、皮下、皮内および非経口を包含
する、通常のいずれかの投与経路で薬剤を投与してもよ
い。骨吸収を阻害するのに有効な量は、対象の体重１ｋ
ｇ当たり０.００１ｍｇ〜１０.０ｍｇの間である。選択
される用量は、対象の体重１ｋｇ当たり約０.００１ｍ
ｇ〜１０.０ｍｇから選択される、有効な非毒性量であ
る。選択される用量を１日約１ないし６回投与する。

【００１５】本発明に開示する骨吸収疾患の治療法はま
た、本明細書において定義されるｓｒｃ ＳＨ２ドメイ
ンアンタゴニストと、医薬上許容される担体とからなる
医薬組成物を用いて実施してもよい。その組成物は、
０.０５ｍｇ〜５００ｍｇのｓｒｃ ＳＨ２ドメインアン
タゴニストを含有してもよく、選択される投与経路に適
当ないずれの形態に構成されていてもよい。経口投与に
適する組成物は、ピル、カプセル、顆粒、錠剤および散
剤のごとき固体形態、および溶液、シロップ、エリキシ
ルおよび懸濁液のごとき液体形態を包含する。非経口投
与に有用な形態は、滅菌の溶液、エマルジョンおよび懸
濁液を包含する。

【００１６】本発明はさらに、破骨細胞の機能を減少さ
せる方法であって、ある量の、骨吸収を阻害するのに有
効な量の、本明細書において定義されるｓｒｃ ＳＨ２
ドメインアンタゴニストを投与することからなる方法を
提供する。骨吸収疾患を患っている患者または骨吸収疾
患にかかっている危険のある患者に、限定されるもので
はないが、静脈内、筋肉内、経口、皮下、皮内および非
経口を包含する、通常のいずれかの投与経路で薬剤を投
与してもよい。破骨細胞機能を減少させるのに有効な量
は、対象の体重１ｋｇ当たり０.００１ｍｇないし１０.
０ｍｇの間である。選択される用量は、対象の体重１ｋ
ｇ当たり約０.００１ｍｇないし約１０.０ｍｇから選択
される、有効な非毒性量である。選択される用量を１日
約１ないし６回投与する。

【００１７】本発明に開示する破骨細胞の機能を減少さ
せる方法はまた、本明細書において定義されるｓｒｃ
ＳＨ２ドメインアンタゴニストと、医薬上許容される担
体とからなる医薬組成物を用いて実施してもよい。その
組成物は、０.０５ｍｇから５００ｍｇの間のｓｒｃ Ｓ
Ｈ２ドメインアンタゴニストを含有していてもよく、選
択される投与経路に適するいずれの形態に構成されてい
てもよい。経口投与に適する組成物は、ピル、カプセ
ル、顆粒、錠剤および散剤のごとき固体形態、および溶
液、シロップ、エリキシルおよび懸濁液のごとき液体形
態を包含する。非経口投与に有用な形態は、滅菌の溶
液、エマルジョンおよび懸濁液を包含する。薬剤は、別
に、滅菌水、セイライン、または他の適当な滅菌注射用
媒体を使用して投与時に溶解または懸濁させる滅菌固形
組成物として調製されてもよい。担体は、必要な、不活
性結合剤、沈殿防止剤、滑沢剤、香料、甘味料、保存
料、色素、およびコーティング剤を包含することを意図
とする。

【００１８】最適の投与量は、当業者によって容易に決
定され、使用される個々のｓｒｃＳＨ２ドメインアンタ
ゴニスト、調製物の強度、投与経路および病態の進行状
態により変化するであろう。患者の年齢、体重、食事お
よび投与時を包含する、治療中の個々の患者に依存する
さらなる因子により、用量を調整することが必要になろ
う。本発明はまた、骨吸収疾患の治療に使用するための
医薬の製造におけるｓｒｃＳＨ２ドメインアンタゴニス
トの使用を提供する。本発明はまた、骨粗鬆症の治療に
使用するための医薬の製造におけるｓｒｃＳＨ２ドメイ
ンアンタゴニストの使用を提供する。本発明はまた、破
骨細胞機能の阻害に使用するための医薬の製造における
ｓｒｃ ＳＨ２ドメインアンタゴニストの使用を提供す
る。

【００１９】本発明はまた、ｓｒｃ ＳＨ２ドメインア
ンタゴニストからなる骨吸収疾患の治療において使用さ
れる医薬組成物を提供する。本発明はまた、ｓｒｃ Ｓ
Ｈ２ドメインアンタゴニストからなる骨粗鬆症の治療に
おいて使用される医薬組成物を提供する。本発明はま
た、ｓｒｃ ＳＨ２ドメインアンタゴニストからなる破
骨細胞機能の阻害において使用される医薬組成物を提供
する。本発明の方法を本発明に従って用いる場合、許容
できない毒物学的作用は考えられない。さらに工夫する
ことなく、当業者は、上記の記載に従って本発明を十分
な程度まで利用することができると思われる。従って、
以下の実施例は単なる例示であって、本発明の範囲を何
ら限定するこのではない。

【００２０】特記しない限り、本明細書において使用さ
れる符号°は℃を意味する。Ｌ−３,５−ジブロモチロ
シンは、当該分野における既知の方法によって、例え
ば、「チロイド・ホルモンズ・アンド・アナログズ（Th
yroid Hormones and Analogues）、Ｉ、シンセシス・フ
ィジカル・プロパティーズ・アンド・セオレティカル・
カリュキュレーションズ（Synthesis, Physical Proper
ties and Theoretical Calculations）」イー・シー・
ジョーゲンセン（E.C.Jorgensen）、ホルモナル・プロ
テインズ・アンド・ペプチド（Hormonal Proteins and
Peptides）、第ＶＩ巻、１９７８年、アカデミック・プ
レス（Academic Press）、ＮＹ、およびその中で引用し
た参考文献に記載されたごとく調製できる。Ｌ−３,５
−ジブロモ−Ｎ−トリフルオロアセチル−チロシンメチ
ルエステル（実施例２（ｅ）および実施例２Ｂ（ｂ）に
おいて使用）は、以下の操作に従って調製できる。

【００２１】Ｌ−３,５−ジブロモチロシン（５００
ｇ）をメタノール（５リットル）に懸濁させ、撹拌した
懸濁液に乾燥塩化水素を５時間通した。反応混合物を蒸
発乾固させ、残渣を水（４リットル）に懸濁させ、pＨ
を４０％水酸化ナトリウムで６に調整した。沈澱物を集
め、水で洗浄し、Ｌ−３,５−ジブロモチロシンメチル
エステル（４６７ｇ、９０％）；融点２０１℃−２０３
℃を得た。そのエステル（７６８ｇ）をクロロホルム
（２.７リットル）および酢酸エチル（２.７リットル）
に懸濁させ、無水トリフルオロ酢酸（５６５ｇ）を、温
度を３５°以下に保ちながら０.５時間にわたって添加
した。混合物を一夜放置し、ついで、水（２リットル）
を添加し、pＨを飽和重炭酸ナトリウム溶液を添加する
ことにより７に調整した。有機層を取り出し、水で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させた。残渣
を水性メタノールから再結晶し、Ｌ−３,５−ジブロモ
−Ｎ−トリフルオロアセチル−チロシンメチルエステル
（７８６ｇ、８１％）；融点１３６℃−７℃を得た。

【００２２】以下の実施例６において使用するスキーム
１

【化１】

【００２３】４−トランス−アミノメチル−シクロヘキ
シル−カルボン酸１のアミノ基を、Ｂｏｃ基（無水Ｂｏ
ｃ、ＮaＯＨ、Ｈ₂Ｏ、ジオキサン）のごとき標準的保護
基で保護して２を形成し、ついでＤＣＣのごときカップ
リング試薬を用いてカイザー・オキシム・レジン（Kais
er oxime resin）（カイザー・イー・ティー（Kaiser,
E.T.）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・
ソサイエティー（J AmChem Soc）１９８５年、第１０７
巻、７０８７−７０９２頁）にカップリングさせ、３を
形成する。ついで、標準条件下（２５％ＴＦＡ、塩化メ
チレン）でアミンを脱保護して４を形成し、ついで、標
準条件（例、ＤＭＦ中のＨＢＴＵ、ＮＭＭあるいはＤＭ
ＦまたはＮＭＰ中のＤＣＣまたはＤＩＣ）でアセチル化
して５を形成する。ついで、該化合物を様々なアミンを
用いて樹脂から切断し、最終の所望の生成物６を形成す
る。化合物１ないし１０を、以下の実施例１ないし１０
に従って調製する。

【００２４】

【実施例】

実施例１ ７−［Ｄ,Ｌ−α−アミノ−α−（４−カルボキシフェ
ニル）アセトアミド］−３−［２−（５−メチル−１,
３,４−チアジアゾリル）チオメチル］Δ³−セフェム−
４−カルボン酸（化合物１）の調製

【化２】

【００２５】ａ）４−ヒドロキシメチルベンズアルデヒ
ド 窒素下、氷浴中の１,４−ベンゼンジカルボキシアルデ
ヒド（５０.０ｇ、０.３７３モル）の乾燥テトラヒドロ
フラン（２００ｍｌ）中溶液に、テトラヒドロフラン
（５００ｍｌ）中の水素化リチウムトリ（tert−ブトキ
シ）アルミニウム（１０４.０ｇ、０.４１０モル）を滴
下した。氷浴中で３０分間撹拌後、反応混合物を２Ｌの
氷冷した２Ｎ塩酸中に注いだ。その水溶液を８００ｍｌ
のエーテルで４回抽出した。合したエーテル層を重炭酸
ナトリウム溶液およびブラインで洗浄し、乾燥した。溶
媒を蒸発させて４６ｇの粗物質を得、クロマトグラフィ
ー（アルミナ、エーテル溶出液）によって精製し、標記
化合物を結晶物質として得た（１７.６ｇ、３５％）：
融点４４.５−４６℃。

【００２６】ｂ）５−（４−ヒドロキシメチルフェニ
ル）ヒダントイン ４−ヒドロキシメチルベンズアルデヒド（１０.０ｇ、
７３.５ミリモル）および炭酸アンモニウム（１７.１
ｇ、１５０ミリモル）の５０℃に加熱した６０％水性エ
タノール（１１０ｍｌ）中撹拌混合物に、水１０ｍｌ中
のシアン化ナトリウム（４.０ｇ、８１ミリモル）を添
加した。混合物を撹拌し、５０−６０℃で３時間、つい
で８５℃で１時間加熱した。氷浴中で冷却後、溶液のp
Ｈを濃塩酸の添加によって６に調整した。一夜冷却し、
沈澱した固体を濾過し、水で洗浄し、乾燥させて、標記
化合物（１１.０ｇ、７２％）を得た：融点１８９−１
９６℃。

【００２７】ｃ）４−ヒドロキシメチルフェニルグリシ
ン 実施例１（ｂ）の化合物（１０.９ｇ、５３ミリモル）
および水酸化バリウム８水和物（２５.５ｇ、８１ミリ
モル）の水（１２５ｍｌ）中混合物を１８時間撹拌還流
した。反応混合物を冷却し、濃硫酸でpＨ１に酸性化
し；硫酸バリウムを濾過し、濾液のpＨを炭酸鉛で６に
した。硫酸鉛の濾過後、濾液を硫化水素で飽和し、硫化
鉛を濾過した。次いで、その水溶液を減圧下でエタノー
ルとの共沸により１００ｍｌに濃縮し、冷却後、標記化
合物を得た（５.２ｇ、５４％）：融点２３０−２３１
℃。

【００２８】ｄ）Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−４−
ヒドロキシメチルフェニルグリシン ４−ヒドロキシメチルフェニルグリシン（８.０ｇ、４
４ミリモル）およびトリエチルアミン（８.８ｇ、８７
ミリモル）の水（１６０ｍｌ）中溶液に、テトラヒドロ
フラン（１２０ｍｌ）中のtert−ブトキシカルボニルア
ジド（６.９５ｇ、４９ミリモル）を添加した。一夜室
温で撹拌後、反応混合物を２００ｍｌのエーテルで２回
洗浄した。水層をエーテルで覆い、氷浴中、３Ｎ塩酸で
pＨ３〜３.５に酸性化した。その酸性の溶液をエーテル
で抽出し、合した有機抽出物をブラインで洗浄し、乾燥
し、蒸発させた。得られた油状物質をクロロホルム−ヘ
キサンでトリチュレートし、固形物を濾去して標記化合
物（７.７ｇ、６３％）を得た：融点１３９−１４１.５
℃。

【００２９】ｅ）Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−４−
ヒドロキシメチルフェニルグリシンメチルエステル 実施例１（ｅ）の化合物（５.６ｇ、２０ミリモル）の
溶液に、メタノール（１０ｍＬ）中の硫酸ジメチル
（３.１ｇ、２４ミリモル）およびジイソプロピルアミ
ン（５.２ｇ、４０ミリモル）を添加した。混合物を２
０分間還流し、ついで、２Ｎ塩酸水溶液で処理した。水
溶液を酢酸エチルで３回抽出し、合した有機抽出物を５
％重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで洗浄した。
溶媒を蒸発に付し、標記化合物を油状物質として得た
（３.２ｇ、５５％）。

【００３０】ｆ）Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−４−
カルボキシフェニルグリシンメチルエステル 実施例１（ｅ）の化合物（０.６２ｇ、２.１ミリモル）
のアセトン（５０ｍｌ）中溶液を、２５℃で過剰のジョ
ーンズ（Jones）試薬（８Ｎクロム酸）で処理した。反
応混合物を室温で２時間撹拌した。緑色の固体を濾去
し、過剰のＣｒＯ₃をイソプロピルアルコールで分解し
た。濾液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、活性炭で処理
した。固体を濾去し、濾液を蒸発乾固し、標記化合物
（０.３８ｇ）を白色の固体として得た：融点１２６−
１２８℃。

【００３１】ｇ）１,１−ジメチルエチルＮ,Ｎ'−ビス
（１−メチルエチル）カルバムイミデート 標記化合物を、サンティニ（Santini）らの方法（ジャ
ーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J.Org.Ch
em.）１９９４年、第５９巻、２２６１頁）に従って、
ＣuＣl（０.０１等量）の存在下、純粋なＮ,Ｎ'−ジイ
ソプロピルカルボジイミド（１.０等量）を２−メチル
−２−プロパノール（１.１５等量）と室温で１日反応
させることにより調製した。

【００３２】ｈ）Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−４−
（tert−ブトキシカルボニル）フェニルグリシンメチル
エステル 実施例１（ｆ）の化合物（１.０ｇ、３.２ミリモル）お
よび１,１−ジメチルエチルＮ,Ｎ'−ビス（１−メチル
エチル）カルバムイミデート（１.３ｍｇ、６.５ミリモ
ル）の乾燥ジクロロメタン中溶液を室温で一夜撹拌し
た。ジイソプロピル尿素を濾去し、過剰の１,１−ジメ
チルエチルＮ,Ｎ'−ビス（１−メチルエチル）カルバム
イミデートを水で分解した。層を分離し、ジクロロメタ
ン溶液を５％重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで
洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発さ
せ、残渣をジエチルエーテルで処理した。さらにジイソ
プロピル尿素を濾去し、有機濾液を蒸発させて標記化合
物を油状物質として得た（８７０ｍｇ、７４％）。

【００３３】ｉ）Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−４−
（tert−ブトキシカルボニル）フェニルグリシン 実施例１（ｈ）の化合物（７６０ｍｇ、２.１ミリモ
ル）の５％重炭酸ナトリウム水溶液（１８ｍｌ）、５％
炭酸ナトリウム水溶液（１８ｍｌ）およびメタノール
（３６ｍｌ）の溶液を５時間室温で一夜撹拌した。反応
混合物を水で希釈し、酢酸エチルで洗浄し、水溶液を新
鮮な酢酸エチルで覆い、３Ｎ ＨＣlでpＨ２に酸性化し
た。層を分離し、水溶液を酢酸エチルで２回以上抽出し
た。酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸
発させて標記化合物を白色の固体として得た（６００ｍ
ｇ、８２％）：融点７７−７９℃。

【００３４】ｊ）tert−ブチル７−アミノ−３−［２−
（５−メチル−１,３,４−チアジアゾリル）チオメチ
ル］Δ³−セフェム−４−カルボキシレート tert−ブチル７−アミノセファロスポラネート（ブラッ
クロック（Blacklock）ら、ジャーナル・オブ・オーガ
ニック・ケミストリー（J.Org.Chem.）１９８９年、第
５４巻、３９０７頁の方法に従って、１,２−ジメトキ
シエタン中のイソブチレンおよび硫酸との反応により７
−アミノセファロスポラン酸から調製される）、重炭酸
ナトリウムおよび２−メルカプト−５−メチル−１,３,
４−チアジアゾールのリン酸緩衝液（pＨ６.４）中溶液
を６０℃で６時間撹拌する。反応混合物を塩酸／酢酸エ
チル水溶液で抽出することで後処理を行い、標記化合物
を得る。

【００３５】ｋ）tert−ブチル７−［Ｄ,Ｌ−α−（ter
t−ブトキシカルボニルアミノ）−α−［４−（tert−
ブトキシカルボニル）フェニル］］アセトアミド−３−
［２−（５−メチル−１,３,４−チアジアゾリル）チオ
メチル］Δ³−セフェム−４−カルボキシレート 実施例１（ｉ）のＮ−tert−ブトキシカルボニル−４−
（tert−ブトキシカルボニル）フェニルグリシン（３５
１ｍｇ、１ミリモル）、実施例１（ｊ）のtert−ブチル
７−アミノ−３−［２−（５−メチル−１,３,４−チア
ジアゾリル）チオメチル］Δ³−セフェム−４−カルボ
キシレート（３６８ｍｇ、１ミリモル）およびＤＣＣ
（２１２ｍｇ、１ミリモル）の乾燥ジクロロメタン中混
合物を室温で３時間撹拌した。ジシクロヘキシル尿素を
濾去し、濾液を蒸発乾固した。残渣を酢酸エチルに溶解
し、酢酸エチル溶液を５％重炭酸ナトリウム水溶液、
２.５％硫酸、５％重炭酸ナトリウム水溶液、ブライン
で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発
させて粗生成物（０.６ｇ）を得た。シリカゲルクロマ
トグラフィー（３０：７０酢酸エチル／ベンゼンで溶
出）によって精製し、標記化合物を得た（４３０ｍｇ、
６１％）：融点１１０−１１２℃。

【００３６】ｌ）７−［Ｄ,Ｌ−α−アミノ−α−（４
−カルボキシフェニル）アセトアミド］−３−［２−
（５−メチル−１,３,４−チアジアゾリル）チオメチ
ル］Δ³−セフェム−４−カルボン酸 実施例１（ｋ）の化合物（４００ｍｇ、０.５７ミリモ
ル）の溶液を７.２ｍｌのトリフルオロ酢酸および０.８
ｍｌのチオフェノール中で撹拌した。反応混合物を０℃
で３０分間、室温で１時間撹拌した。溶媒を４０℃の水
浴中で蒸発させ、残渣をジエチルエーテル中で３回トリ
チュレートし；固体の生成物を少量のメタノールに溶解
し、ジエチルエーテルの添加により生成物を沈澱させて
標記化合物を得た（３００ｍｇ）：融点１７０−１７５
℃。

【００３７】実施例２ Ｌ−３,５−ジブロモ−３'−（６−オキソ−３（１Ｈ）
−ピリダジニルメチル）−チロニン（化合物２）の調製

【化３】

【００３８】（ａ）ｏ−メトキシフェニルアセトニトリ
ル（２３.６４ｇ）および３,６−ジクロロピリダジン
（２３.９３ｇ）を乾燥ジメチルホルムアミド（５０ｍ
ｌ）に溶解し、２時間以上撹拌した溶液に、水素化ナト
リウム（油中５０％分散液、１６.２３ｇ）を徐々に少
しずつ添加した。混合物を過剰の砕氷の上に注ぎ、ジク
ロロメタンで抽出した。有機層を取り出し、水で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、活性炭処理して蒸
発乾固させた。残渣をジクロロメタン／石油スピリット
から結晶化して、１−（６−クロロ−３−ピリダジニ
ル）−１−（２−メトキシフェニル）−アセトニトリル
（３５.５ｇ、８５％）を得た；融点９１℃−９２℃。

【００３９】（ｂ）このニトリル（３３.５ｇ）を濃塩
酸（２００ｍｌ）、酢酸（１００ｍｌ）および水（１０
０ｍｌ）に溶解し、溶液を撹拌しながら還流した。６時
間後、溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチル／石油スピリ
ットから再結晶して２−（６−オキソ−３（１Ｈ）−ピ
リダジニルメチル）−アニソール（２１.４ｇ、７７
％）を得た；融点１４２℃−３℃。

【００４０】（ｃ）このピリダジノン（１５.７ｇ）を
オキシ塩化リン（２２ｍｌ）に溶解し、溶液を撹拌しな
がら５５℃（油浴）で１時間加熱した。冷却した混合物
を徐々に砕氷上に注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有
機層を分離し、飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、無
水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させた。残渣をより
小さなバッチ（２.１６ｇのピリダジノンから）と合
し、沸騰している石油スピリット（６０°−８０°）で
数回抽出した。合した抽出物を活性炭処理し、蒸発させ
て、２−（６−クロロ−３−ピリダジニルメチル）−ア
ニソール（１６.９５ｇ、８７％）を得た；融点６３
℃。

【００４１】（ｄ）−１５℃のヨウ素トリストリフルオ
ロアセテート（無水酢酸およびトリフルオロ酢酸中、ヨ
ウ素（２.５４ｇ）を発煙硝酸（５ｍｌ）で処理するこ
とによって調製）の無水トリフルオロ酢酸（２５ｍｌ）
中撹拌懸濁液に、温度を−１５℃に維持しながら、トリ
フルオロ酢酸（２０ｍｌ）中の前記のクロロピリダジン
（９.３９ｇ）および無水トリフルオロ酢酸（２５ｍ
ｌ）を添加した。混合物を室温で一夜撹拌し、濃縮し、
次いで、水（２００ｍｌ）中の酢酸ナトリウム（２５
ｇ）および過塩素酸ナトリウム（１５ｇ）の溶液を添加
した。混合物をクロロホルムで抽出し、有機溶液を無水
硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで、５０ｍｌに濃縮
し、撹拌エーテル（２５０ｍｌ）中に注いだ。沈澱を集
め、乾燥して粗４,４'−ジメトキシ−３,３'−ビス−
（６−クロロ−３−ピリダジニル−メチル）−ジフェニ
ルヨードニウムパークロレート（１４ｇ）を得た。¹Ｈ
ＮＭＲ δ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）３.８０（３Ｈ、ｓ、−Ｏ
ＣＨ₃）、４.２０（２Ｈ、ｓ、ＣＨ₂Ａｒ）、７.０５
（１Ｈ、ｍ、Ａｒ−５Ｈ）、７.６５（２Ｈ、ｍ、Ｐy
Ｈ）および８.００（２Ｈ、ｍ、Ａr−２，６Ｈ）。

【００４２】（ｅ）前記のヨードニウム塩（１２.４５
ｇ）、Ｌ−３,５−ジブロモ−Ｎ−トリフルオロアセチ
ルチロシンメチルエステル（８.９８ｇ）、トリエチル
アミン（４.０５ｇ）および青銅（１.０ｇ）をジクロロ
メタン（５０ｍｌ）中で１８時間撹拌した。混合物を濾
過し、酢酸水溶液、２Ｎ水酸化ナトリウム、ついで水で
洗浄し、ついで、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発
させた。残渣を（ヨードニウム塩０.７２ｇからの）小
バッチと合し、シリカゲル（４００ｇ）上のカラムクロ
マトグラフィーに付して精製した。酢酸エチル／石油ス
ピリット（６０°−８０°）［１：３］で溶出してＬ−
３,５−ジブロモ−３'−（６−クロロ−３−ピリダジニ
ルメチル）−Ｏ−メチル−Ｎ−トリフルオロアセチル−
１−チロニンメチルエステル（４.０ｇ）を黄褐色の泡
状物質として得た。¹Ｈ ＮＭＲ δ（ＣＤＣl₃）３.０６
（２Ｈ、ｍ、ＡrＣＨ₂ＣＨ）、３.８４および３.９３
（６Ｈ、２ｓ、−ＯＣＨ₃）、４.１９（２Ｈ、ｓ、Ａr
ＣＨ₂Ｐｙ）、４.７５（１Ｈ、ｍ、ＡrＣＨ₂ＣＨ）、
６.６２（３Ｈ、ｍ、ＡrＨ）、７.１７（２Ｈ、ｍ、Ｐy
Ｈ）および７.２３（２Ｈ、ｓ、ＡrＨ）。

【００４３】（ｆ）前記のジブロモ化合物（３.２７
ｇ）を酢酸ナトリウム（０.７９ｇ）を含有する酢酸
（２０ｍｌ）に溶解した。溶液を１.２５時間還流し、
十分な水（約２ｍｌ）を添加して沈澱した塩化ナトリウ
ムを溶解し、溶液を蒸発乾固させた。残渣を水と酢酸エ
チルに分配し、有機層を除去し、飽和重炭酸ナトリウム
で洗浄し、ついで無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発
乾固させた。残渣を酢酸エチル／石油スピリット（６０
°−８０°）から結晶化してＬ−３,５−ジブロモ−Ｏ
−メチル−３'−（６−オキソ−３（１Ｈ）−ピリダジ
ニルメチル）−Ｎ−トリフルオロアセチルチロニンメチ
ルエステル（２.５２ｇ、７９％）を得た；融点１７６
℃−８℃。

【００４４】（ｇ）このピリダジノン（２.４５ｇ）を
乾燥ジクロロメタン（４０ｍｌ）に溶解し、０℃で撹拌
しながら冷却した。ジクロロメタン（３ｍｌ）中の三臭
化ホウ素（６.４６ｇ）を添加した。赤褐色の沈澱が形
成された。混合物を室温で１.５時間撹拌し、ついで砕
氷を添加した。混合物を濾過し、沈澱を集め、２Ｎ水酸
化ナトリウム（３０ｍｌ）に溶解した。溶液を蒸気浴で
１５分間加熱し、ついで酢酸を添加してpＨ５にし、混
合物を冷却した。得られた沈澱を集め、洗浄し、乾燥し
てＬ−３,５−ジブロモ−３'−（６−オキソ−３（１
Ｈ）−ピリダジニルメチル)−チロニン（１.７４ｇ、８
８％）を得た；融点２７８℃−９℃（分解）。

【００４５】別法として、反応工程（ｅ）用の（ｄ）に
おいて調製された過塩素酸塩を使用する代わりに、ヨー
ドニウムトリフルオロ酢酸塩を以下のごとく調製して使
用できる：ヨウ素（１５９ｇ）を無水トリフルオロ酢酸
（１リットル）中に懸濁し、窒素下で撹拌し、温度を３
６℃ないし４０℃に維持しながら、発煙硝酸（３５０ｍ
ｌ）を１.５時間以上かけて添加した。ついで、無水ト
リフルオロ酢酸（３００ｍｌ）を添加し、すべての窒素
酸化物が除去されるまで、混合物を、窒素流下、４０°
に維持し、ついで、一夜室温で放置した。ついで、溶媒
を減圧下除去し、残りの溶媒を無水トリフルオロ酢酸
（２ｘ３００ｍｌ）と共沸することによって除去した。
ついで、残りの淡黄色固体を無水トリフルオロ酢酸
（１.２リットル）中に撹拌しながら懸濁し、−２０℃
に冷却した。ついで、２−（６−クロロ−３−ピリダジ
ニルメチル）アニソール（６００ｇ）のトリフルオロ酢
酸（１.２リットル）中溶液を温度を−１０℃ないし−
２０℃に維持しながら滴下した。混合物を−１０℃で１
時間、室温で一夜撹拌し、次いで、溶媒を減圧下で除去
し、残渣を水（２０リットル）中の硫酸ナトリウム
（３.５ｋｇ）の溶液に撹拌しながら注いだ。この混合
物のpＨを希水酸化ナトリウム水溶液を用いて約pＨ２に
調整し、ついでジクロロメタン（２ｘ３リットル、１ｘ
２リットル）で抽出し、有機抽出物を合し、乾燥し（Ｍ
gＳＯ₄）、濾過し、体積を２リットルにまで減少させ、
ついで、激しく撹拌したジエチルエーテル（１２リット
ル）に添加した。暗灰色の沈澱した固体を濾去し、エー
テルで洗浄し、減圧オーブン中で６時間４０°で乾燥し
て４,４'−ジメトキシ−３,３'−ビス−（６−クロロ−
３−ピリダジニル−メチル）ジフェニルヨードニウムト
リフルオロアセテート（８.１４ｇ、９０％）を得た；
融点１４５℃−１４７℃。前記の２（ｅ）、（ｆ）、お
よび（ｇ）において記載した方法に類似の方法を用いて
この塩をさらなる反応に付し、所望のＬ−３,５−ジブ
ロモ−３'−（６−オキソ−３（１Ｈ）−ピリダジニル
メチル）−チロニンを得る。

【００４６】実施例２Ａ Ｌ−３,５−ジブロモ−３'−（６−オキソ−３（１Ｈ）
−ピリダジニルメチル）チロニン（化合物２）の調製 （ａ）２−（６−クロロ−３−ピリダジニルメチル）ア
ニソール（実施例２（ｃ）に記載したごとく調製した）
（２.３５ｇ）を乾燥ジクロロメタン（２０ｍｌ）中に
溶解し、撹拌しながら−５０°に冷却した。ついで、三
臭化ホウ素（３ｍｌ）を滴下し、溶液を放置し室温まで
加温した。０.５時間後、橙色の反応混合物を氷／水
（２００ｍｌ）に注ぎ、アセトンを添加して沈澱した固
体を溶解した。混合物をジクロロメタンで抽出し、有機
抽出物を分離し、水で洗浄し、乾燥し、蒸発させた。残
渣を酢酸エチルおよび石油スピリットから再結晶して２
−（６−クロロ−３−ピリダジニルメチル）フェノール
（１.７５ｇ、８０％）；融点１３２℃−１３２.５℃を
得た。元素分析（％）Ｃ₁₁Ｈ₉ＣlＮ₂Ｏとして；測定
値：Ｃ、５９.６１；Ｈ、４.１３；Ｎ、１２.４７；Ｃ
l、１６.０９；計算値、Ｃ、５９.８７；Ｈ、４.１１；
Ｎ、１２.７０；Ｃl、１６.０７。

【００４７】（ｂ）７５％硫酸水溶液（１００ｍｌ）中
のこのフェノール（２.４ｇ）および尿素（１４ｇ）の
撹拌溶液にｔ−ブタノールをゆっくりと添加した。混合
物を十分に撹拌し、さらなるｔ−ブタノールを４時間後
（１８ｍｌ）、２４時間後（５ｍｌ）および２８時間後
（２０ｍｌ）に添加した。１２０時間後、混合物を水に
注ぎ、有機層を分離し、除去し、水層をエーテルを通し
て完全に抽出した。合したエーテル抽出物を飽和ブライ
ンで洗浄し、ついで蒸発乾固した。残渣をエーテルおよ
び石油スピリットから再結晶して２,４−ジ−ｔ−ブチ
ル−６−（６−クロロ−３−ピリダジニルメチル）フェ
ノール（３.４３ｇ、９４％）を得た；融点１４３.０℃
−１４３.５℃。元素分析（％）Ｃ₁₉Ｈ₂₅ＣlＮ₂Ｏとし
て、測定値：Ｃ、６８.３２；Ｈ、７.５１；Ｎ、８.３
６；Ｃl、１０.８９；計算値、Ｃ、６８.５６；Ｈ、７.
５７；Ｎ、８.４１；Ｃｌ、１０.６５。

【００４８】（ｃ）ジエチルエーテル（１００ｍｌ）中
のこのフェノール（１.９５ｇ）、Ｌ−３,５−ジブロモ
−Ｎ−トリフルオロアセチルチロシンメチルエステル
（３.２４ｇ）の溶液を、アルゴン下室温で撹拌し、つ
いで活性化二酸化マンガン（３ｘ５ｇ）で処理した。４
時間後、混合物を濾過し、四塩化チタン（５ｍｌ）を添
加した。２分後、暗色溶液を水で処理し、酢酸エチルで
十分に抽出した。有機抽出物を合し、飽和ブラインで洗
浄し、乾燥し、蒸発させた。残渣をシリカゲル上で石油
スピリットおよびエーテルを溶出液としてクロマトグラ
フィーに付し、Ｌ−３,５−ジブロモ−５'−ｔ−ブチル
−３'−（６−クロロ−３−ピリダジニルメチル）−Ｎ
−トリフルオロアセチルチロニンメチルエステル（２.
３１ｇ、５５％）を得た；融点８４℃−８６℃。

【００４９】（ｄ）このジブロモチロニン（２.７６
ｇ）および無水酢酸ナトリウム（０.７８ｇ）の酢酸
（２５ｍｌ）中溶液を１０時間加熱還流し、ついで冷却
し、氷水に注いだ。沈澱固体を濾去し、酢酸エチルに溶
解し、乾燥し、蒸発してＬ−３,５−ジブロモ−５'−ｔ
−ブチル−３'−（６−オキソ−３（１Ｈ）−ピリダジ
ニルメチル）−Ｎ−トリフルオロアセチルチロニンメチ
ルエステル（２.４ｇ、５５％）を得た；融点１１２℃
−１１５℃。

【００５０】（ｅ）このピリダジノン（０.２００ｇ）
およびＨＢr（１ｍｌ）の氷酢酸（２０ｍｌ）中溶液を
３日間加熱還流した。ついで、該溶液を冷却し、水で希
釈し、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で塩基性化し、酢酸
を添加してpＨ６にした。沈澱固体を濾過し、洗浄し、
乾燥してＬ−３,５−ジブロモ−３'−（６−オキソ−３
（１Ｈ）−ピリダジニルメチル）チロニン（０.１００
ｇ、６５％）；融点２４５℃−２４７℃（分解）を得、
それは以前に単離されたもの（実施例２(ｇ）と分光学
的に同一であった。

【００５１】実施例２Ｂ Ｌ−３,５−ジブロモ−３'−（６−オキソ−３（１Ｈ）
−ピリダジニルメチル）チロニン（化合物２）の調製 （ａ）−１０℃に冷却した、ヨウ素トリストリフルオロ
アセテート（ヨウ素（１０.０ｇ）を、無水酢酸および
トリフルオロ酢酸中、発煙硝酸（２０.９５ｍｌ）で処
理することによって調製した）の無水酢酸（５０ｍｌ）
中溶液に、シアン化２−メトキシベンジル（３０.０
ｇ）のトリフルオロ酢酸（６０ｍｌ）および無水酢酸
（３０ｍｌ）中溶液を滴下した。添加の間、混合物の温
度を０℃以下に維持し、ついで、室温で一夜放置した。
ついで、該混合物をよく撹拌氷冷した酢酸ナトリウム
（１００ｇ）および過塩素酸ナトリウム（１３.０ｇ）
の水（６００ｍｌ）中溶液に注いだ。沈澱した固体を濾
去し、水およびジエチルエーテルで洗浄して３,３'−ジ
シアノメチル−４,４'−ジメトキシ−ジフェニルヨード
ニウムパークロレートを鮮明な淡黄褐色固体として得た
（２３.６ｇ、５７％）；融点１８３℃−４℃（メタノ
ール／ジエチルエーテルから）。

【００５２】（ｂ）このヨードニウム塩（２２.６
ｇ）、Ｌ−３,５−ジブロモ−Ｎ−トリフルオロアセチ
ル−チロシンメチルエステル、トリエチルアミン（６.
１ｇ）のジクロロメタン（３００ｍｌ）中溶液を、青銅
（１ｇ）で処理し、混合物を室温で２０時間撹拌した。
ついで、混合物を濾過し、濾液を２Ｎ塩酸水溶液（２ｘ
２００ｍｌ）、水（２ｘ２００ｍｌ）および２Ｎ水酸化
ナトリウム水溶液（３ｘ２００ｍｌ）で洗浄し、つい
で、有機溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で蒸
発させた。油状残渣をジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶
解し、石油スピリットに注いだ。沈澱した固体を濾去
し、ジクロロメタン／石油スピリットから再結晶してＬ
−３,５−ジブロモ−３'−シアノメチル−Ｏ−メチル−
Ｎ−トリフルオロアセチルチロニンメチルエステルを無
色の結晶固形物；融点１４８℃−１４９℃として得た。
母液をシリカゲル上でクロマトグラフィーに付してさら
なる量のこの化合物を得た（全量＝８.０５ｇ、３１
％）。

【００５３】（ｃ）このジブロモチロニン（１２０ｍ
ｇ）および３,６−ジクロロピリダジン（３１ｍｇ）の
乾燥ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）中溶液に、水素化
ナトリウム（油中５０％懸濁液、３０ｍｇ）を添加し、
反応混合物を室温で５０分間放置した。ついで、氷で処
理し、水性混合物をジクロロメタンで抽出し、有機溶液
を飽和ブラインで洗浄し、乾燥し、蒸発させた。残渣を
分取用シリカゲルクロマトグラフィープレート上でクロ
マトグラフィーを行い、それより３,５−ジブロモ−３'
−（１−（６−クロロ−３−ピリダジニル）−１−シア
ノメチル）−Ｏ−メチル−Ｎ−トリフルオロアセチルチ
ロニンメチルエステル（５ｍｇ）を単離した。¹Ｈ ＮＭ
Ｒ δ（ＣＤＣl₃）３.１２（１Ｈ、ｍ）、３.２７（１
Ｈ、ｍ）、３.７９（３Ｈ、ｓ）、３.８６（３Ｈ、
ｓ）、４.８６（１Ｈ、ｍ）、５.８０（１Ｈ、ｓ）、
６.７２（１Ｈ、ｄｄ）、６.８３（１Ｈ、ｄ）、７.０
４（１Ｈ、ｄ）、７.１５（１Ｈ、ブロードｍ）、７.３
７（２Ｈ、ｓ）、７.５０（２Ｈ、ｄｄ）。この中間体
を標準方法により操作し、標記化合物を得る。

【００５４】実施例３ ８,８−エチレンジオキシ−２,３,７,８,９,１０−ヘキ
サヒドロ−４−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］チエノ
［２,３−ｂ］ピラゾロ［３,４−ｄ］ピリジン−３−オ
ン（化合物３）の調製

【化４】

【００５５】ａ）２−シアノ−２−（４,４−エチレン
ジオキシシクロヘキシリデン）酢酸エチル １,４シクロヘキサンジオンモノエチレンケタル（２５
ｇ、０.１６０モル）およびシアノ酢酸エチル（１８
ｇ、０.１６０モル）のトルエン（４００ｍｌ）中混合
物に、室温でジエチルアミン（２５ｇ、０.３３７モ
ル）を滴下した。反応混合物を（ディーン・スターク
（Dean Stark）装置を使用して）一夜加熱還流した。混
合物を冷却し、酢酸エチルおよび飽和重炭酸ナトリウム
水溶液（３ｘ）で分配した。有機抽出物を硫酸ナトリウ
ムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、エタノールから
再結晶して標記化合物を白色固体として得た（１５.８
ｇ、４５％）：融点８０−８１℃；¹Ｈ ＮＭＲ（４００
ＭＨｚ、ＣＤＣl₃）δ ４.２８（ｑ、Ｊ＝７.２Ｈｚ、
２Ｈ）、４.００（ｓ、４Ｈ）、３.１８（ｔ、Ｊ＝６.
５Ｈｚ、２Ｈ）、２.８５（ｔ、Ｊ＝６.５Ｈｚ、２
Ｈ）、１.８９（ｔ、Ｊ＝６.５Ｈｚ、２Ｈ）、１.８２
（ｔ、Ｊ＝６.５Ｈｚ、２Ｈ）、１.３５（ｔ、Ｊ＝７.
１Ｈｚ、３Ｈ）。

【００５６】ｂ）２−アミノ−６,６−エチレンジオキ
シ−４,５,６,７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェ
ン−３−カルボン酸エチル ０℃の、実施例３（ａ）の化合物（１０ｇ、４５.６ミ
リモル）、硫黄（１.６ｇ、５０.２ミリモル）のエタノ
ール（１６４ｍｌ）中懸濁液に、ジエチルアミン（３.
６ｇ、５０.２ミリモル）のエタノール（２６ｍｌ）中
溶液を滴下した。得られた溶液を０℃で１時間、ついで
室温で３.５時間撹拌した。反応混合物に酢酸エチルで
クエンチし、飽和塩化アンモニウム水溶液で分配した。
水相を酢酸エチルで抽出し、有機抽出物をブラインで洗
浄した。合した有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、
濾過し、減圧下で濃縮し、クロマトグラフィー（シリカ
ゲル、５→１０％のＣＨ₂Ｃl₂：ＥtＯＡcの勾配）を行
って、標記化合物を油状物質として得た（１１.３ｇ、
８７％）。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣl₃）δ
４.２５（ｑ、Ｊ＝７.１Ｈｚ、２Ｈ）、４.０２（ｓ、
４Ｈ）、２.９２（ｔ、Ｊ＝６.５Ｈｚ、２Ｈ）、２.７
４（ｓ、２Ｈ）、１.９０（ｔ、Ｊ＝６.６Ｈｚ、２
Ｈ）、１.３３（ｔ、Ｊ＝７.１Ｈｚ、３Ｈ）。

【００５７】ｃ）７,７−エチレンジオキシ−４−ヒド
ロキシ−２−メチル−５,６,７,８−テトラヒドロベン
ゾ［ｂ］チエノ［２,３−ｂ］ピリジン−２−カルボン
酸エチル 室温の実施例３（ｂ）の化合物（１１.２ｇ、３９.５ミ
リモル）のトルエン（３０７ｍｌ）中溶液に、３−エト
キシクロトン酸エチル（１２.４ｇ、７８.６ミリモル）
およびショウノウスルホン酸（０.７８ｇ、３.４ミリモ
ル）を添加した。反応混合物をディーン・スターク・ト
ラップを用いて３.５時間加熱還流した。ついで、該混
合物を冷却し、それに新たに調製した１Ｍナトリウムエ
トキシド溶液（４９ｍｌ）を滴下した。添加終了後、反
応混合物を３時間加熱還流した。混合物を冷却し、沈澱
物を濾過した。その塩をメタノール（６０ｍｌ）に溶解
し、それに水（５００ｍｌ）および酢酸（２ｍｌ）を添
加して、標記化合物を黄色固体として得た（１０.４
ｇ，７６％）：融点９４−９５℃；¹Ｈ ＮＭＲ（４００
ＭＨz、ＣＤＣl₃）δ ４.４８（ｑ、Ｊ＝７.１Ｈｚ、２
Ｈ）、４.０６（ｓ、４Ｈ）、３.２６（ｔ、Ｊ＝６.５
Ｈｚ、２Ｈ）、３.０２（ｓ、２Ｈ）、２.８１（ｓ、３
Ｈ）、２.０２（ｔ、Ｊ＝６.５Ｈｚ、２Ｈ）、１.４７
（ｔ、Ｊ＝７.１Ｈｚ、３Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ
３５０［Ｍ＋Ｈ］⁺；元素分析（％） Ｃ₁₇Ｈ₁₉ＮＯ₅Ｓ
として；計算値：Ｃ、５８.４４；Ｈ、５.４８；Ｎ、
４.０１；測定値：Ｃ、５８.３４；Ｈ、５.４６；Ｎ、
３.８６。

【００５８】ｄ）７,７−エチレンジオキシ−４−トリ
フルオロメチルスルホニルオキシ−２−メチル−５,６,
７,８−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チエノ［２,３−ｂ］
ピリジン−３−カルボン酸エチル 実施例３（ｃ）の化合物（５.０ｇ、１４.３ミリモル）
のピリジン（５０ｍｌ）中溶液に、無水トリフリック
（４.０ｇ、１４.２ミリモル）を滴下した。反応混合物
を０℃で反応が終了するまで４時間撹拌した。反応混合
物を硫酸銅水溶液（３ｘ）、続いて水（２ｘ）およびブ
ライン（２ｘ）で洗浄した。有機層を蒸発させ、無水硫
酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。フラッシュ
クロマトグラフィー（シリカゲル、１：１ ヘキサン：
酢酸エチル）に付して精製し、標記化合物を明黄色の固
体として得た（３.７ｇ、５４％）：融点１３３−１３
４℃；¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨz、ＣＤＣl₃）δ ４.４
３（ｑ、Ｊ＝７.２Ｈz、２Ｈ）、４.０６（ｓ、４
Ｈ）、３.１６（ｔ、Ｊ＝６.５Ｈz、２Ｈ）、３.１０
（ｓ、２Ｈ）、２.７７（ｓ、３Ｈ）、２.０３（ｔ、Ｊ
＝６.８Ｈz、２Ｈ）、１.４１（ｔ、Ｊ＝７.１Ｈz、３
Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ４８２［Ｍ＋Ｈ］⁺；元素
分析（％）Ｃ₁₈Ｈ₁₈Ｆ₃ＮＯ₇Ｓ₂として：計算値；Ｃ、
４４.９０；Ｈ、３.７７；Ｎ、２.９１；測定値：Ｃ、
４５.０３；Ｈ、３.６２；Ｎ、２.８９。

【００５９】ｅ）８,８−エチレンジオキシ−２,３,７,
８,９,１０−ヘキサヒドロ−４−メチル−１Ｈ−ベンゾ
［ｂ］チエノ［２,３−ｂ］ピラゾロ［３,４−ｄ］ピリ
ジン−３−オン 室温の、実施例３（ｄ）の化合物（２.４ｇ、５.０ミリ
モル）のメタノール（４０ｍｌ）中溶液に、ヒドラジン
一水和物（４.１ｇ、８２.３ミリモル）を添加した。反
応混合物を３時間加熱還流した。ついで、混合物を冷却
し、pＨ７の水性緩衝液と酢酸エチルに分配した。有機
層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃
縮し、メタノール／酢酸エチルから再結晶して、標記化
合物を明黄色固体として得た（０.９９ｇ、６０％）。¹
Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ₄−ＭｅＯＨ）δ ４.０５
（ｓ、４Ｈ）、３.１５（ｔ、Ｊ＝６.５Ｈｚ、２Ｈ）、
３.０４（ｓ、２Ｈ）、２.８２（ｓ、３Ｈ）、２.０６
（ｔ、Ｊ＝６.５Ｈz、２Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ
３１８［Ｍ＋Ｈ］⁺；元素分析（％）Ｃ₁₅Ｈ₁₅Ｎ₃Ｏ₃Ｓ
・０.２５Ｈ₂Ｏとして：計算値；Ｃ、５５.９７；Ｈ、
４.８５；Ｎ、１３.０５；測定値：Ｃ、５５.８５；
Ｈ、４.７５；Ｎ、１３.３０。

【００６０】実施例４ ４−［４−（４−メチルベンゾイル）ベンゾイル］フェ
ニルアセトアルデヒド（化合物４）の調製

【化５】

【００６１】ａ）４−（４−メチルベンゾイル）安息香
酸メチル 塩化メチルテレフタノイル（６.２ｇ、３１ミリモル）
のトルエン（２５０ｍｌ）中溶液を、０℃、アルゴン雰
囲気下で、塩化アルミニウム（８.０ｇ、６０ミリモ
ル）で処理した。撹拌した混合物を０.５時間３５℃に
加温し、ついで、１００ｇの氷、続いて１５０ｍｌの酢
酸エチル、５０ｍｌの濃ＨＣl、および５０ｍｌの水に
ゆっくりと添加した。相を分離し、水性部を１００ｍｌ
の酢酸エチルで２回抽出した。合した有機部を水（２ｘ
７５ｍｌ）およびブライン（１ｘ７５ｍｌ）で洗浄し、
硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、白色固体に濃縮し
た。酢酸エチルおよびヘキサンから再結晶して標記化合
物（６.０ｇ（７９％））を白色針状晶として得た。融
点１１７−１１８℃；¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨz、ＣＤ
Ｃl₃）δ ８.１５（ｄ、Ｊ＝８.３５Ｈｚ、２Ｈ）、７.
８３（ｄ、Ｊ＝８.３０Ｈｚ、２Ｈ）、７.７３（ｄ、Ｊ
＝８.１８Ｈｚ、２Ｈ）、７.３１（ｄ、Ｊ＝８.０４Ｈ
ｚ、２Ｈ）、３.９８（ｓ、３Ｈ）、２.４６（ｓ、３
Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ２５５［Ｍ＋Ｈ］⁺。

【００６２】ｂ）４−（４−メチルベンゾイル）安息香
酸 ６５℃の、４−（４−メチルベンゾイル）安息香酸メチ
ル（５.００ｇ、２０.０ミリモル）のＴＨＦ：水（２：
１）（１５０ｍｌ）中撹拌溶液を、水酸化リチウム一水
和物（２.０ｇ、４８ミリモル）で処理した。０.５時間
後、濁った反応混合物を室温に冷却し、酢酸エチル（３
００ｍｌ）および１０％ＨＣl（水溶液）で処理した。
有機相を分離し、水（２ｘ５０ｍｌ）およびブライン
（１ｘ５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥
し、濾過し、白色泡沫体に濃縮した。¹Ｈ ＮＭＲ（４０
０ＭＨz、ＣＤＣl₃）δ８.２２（ｄ、Ｊ＝８.３４Ｈz、
２Ｈ）、７.８１（ｄ、Ｊ＝８.３１Ｈz、２Ｈ）、７.７
３（ｄ、Ｊ＝８.１５Ｈz、２Ｈ）、７.３１（ｄ、Ｊ＝
８.００Ｈz、２Ｈ）、２.４６（ｓ、３Ｈ）。

【００６３】ｃ）４−［４−（４−メチルベンゾイル）
ベンゾイル］アニソール 実施例４（ｂ）の化合物のトルエン（２５０ｍｌ）中溶
液を、塩化オキサリル（２１.８ｇ、０.１７モル）で処
理した。得られた混合物を２時間加熱還流し、ついで、
濃縮し、０.５ｍｍＨｇ、２５℃で一夜放置した。つい
で、この固体を１００ｍｌのアニソールに溶解し、０℃
で塩化アルミニウム（１１.２ｇ、８４ミリモル）で処
理した。混合物を７０℃で１時間加熱し、ついで１００
ｇの氷、続いて１５０ｍｌの酢酸エチル、５０ｍｌの濃
ＨＣl、および５０ｍｌの水にゆっくりと添加した。相
を分離し、水性部を１００ｍｌの酢酸エチルで抽出し
た。合した有機抽出物を水（２ｘ７５ｍｌ）およびブラ
イン（１ｘ７５ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾
燥し、濾過し、白色固体に濃縮した。酢酸エチルおよび
ヘキサンから再結晶して標記化合物４.６ｇ（７０％）
を得た。融点１６７−１６９℃；¹Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ
Ｈｚ、ＣＤＣl₃）δ ７.８−７.９（ｍ、６Ｈ）、７.７
７（ｄ、Ｊ＝８.０６Ｈz、２Ｈ）、７.３２（ｄ、Ｊ＝
８.０１Ｈz、２Ｈ）、７.０（ｄ、Ｊ＝８.７４Ｈz、２
Ｈ）、３.９２（ｓ、３Ｈ）、２.４７（ｓ、３Ｈ）；Ｍ
Ｓ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ３３１（Ｍ＋Ｈ）⁺。

【００６４】ｄ）４−［４−（４−メチルベンゾイル）
ベンゾイル］フェノール 実施例４（ｃ）の化合物（７００ｍｇ、２.１２ミリモ
ル）のジクロロメタン（２０ｍｌ）中溶液を、塩化アル
ミニウム（１.０ｇ、７.５ミリモル）およびジクロロメ
タン中、１.０Ｍ三塩化ホウ素（７.０ｍｌ）溶液で処理
し、１時間加熱還流した。ついで、混合物を１００ｍｌ
のジクロロメタンで希釈し、１０％ＨＣl（水溶液）
（１ｘ２５ｍｌ）、水（１ｘ２５ｍｌ）およびブライン
（１ｘ２５ｍｌ）で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウ
ムで乾燥し、濾過し、暗色残渣に濃縮し、それをフラッ
シュクロマトグラフィー（シリカゲル、１：１ 酢酸エ
チル：ヘキサンで溶出）に付し、５５０ｍｇ（８２％）
の標記化合物を得た。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨz、ＣＤ
Ｃl₃）δ ７.８−７.９（ｍ、６Ｈ）、７.７７（ｄ、Ｊ
＝８.０５Ｈｚ、２Ｈ）、７.３２（ｄ、Ｊ＝８.０１Ｈ
ｚ、２Ｈ）、６.９３（ｄ、Ｊ＝８.６Ｈｚ、２Ｈ）、
２.４７（ｓ、３Ｈ）。

【００６５】ｅ）４−［４−（４−メチルベンゾイル）
ベンゾイル］フェニルトリフルオロメチルスルホネート 実施例４（ｄ）の化合物（３２０ｍｇ、１.０ミリモ
ル）のＴＨＦ（２０ｍｌ）中溶液を、０℃で水素化ナト
リウム（４０ｍｇ、１.６７ミリモル）およびＮ−フェ
ニルトリフルオロメタンスルホンイミド（５００ｍｇ、
１.４０ミリモル）で処理した。反応混合物を室温に加
温し、ついで室温で１８時間撹拌した。ついで、反応物
を酢酸エチルおよびブラインに分配し；層を分離し、有
機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させた。フ
ラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、８０：２０
ヘキサン：酢酸エチル）に付して精製し、標記化合物
を得た（３００ｍｇ、６６％）。融点１８０−１８１
℃；¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣl₃）δ ７.９６
（ｄ、Ｊ＝８.６Ｈｚ、２Ｈ）、７.８９（ｓ、４Ｈ）、
７.７６（ｄ、Ｊ＝８.１Ｈｚ、２Ｈ）、７.４５（ｄ、
Ｊ＝８.６Ｈｚ、２Ｈ）、７.３３（ｄ、Ｊ＝８.１Ｈ
ｚ、２Ｈ）、２.４７（ｓ、３Ｈ）。

【００６６】ｆ）４−［４−（４−メチルベンゾイル）
ベンゾイル］フェニルアセトアルデヒド 実施例４（ｅ）の化合物（４４５ｍｇ、１.０ミリモ
ル）のＤＭＦ（１０ｍｌ）中溶液に、アリルトリブチル
錫（０.３５ｍｌ、１.１２ミリモル）、塩化ビス（トリ
フェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（５５ｍｇ、
０.０７７ミリモル）および塩化リチウム（１２５ｍ
ｇ、２.９５ミリモル）を添加した。反応混合物を９０
℃で１時間加熱し、室温に冷却し、その後、酢酸エチル
およびブラインに分配した。有機層を硫酸マグネシウム
で乾燥し、所望生成物である３−［４−［４−（４−メ
チルベンゾイル）ベンゾイル］フェニル］−１−プロペ
ンおよび錫含有の副産物からなる残渣にまで濃縮した。
この物質をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲ
ル、９５：５ ヘキサン：酢酸エチルで溶出）に付し
て、すべてではないが、大部分の錫不純物を除去した。
二番目のクロマトグラフィー（ヘキサン中５％→１０％
酢酸エチル勾配）によって、１００ｍｇ（３０％）の澄
明なオレフィンを得、ついでそれを−７８℃でジクロロ
メタン／メタノール（３：１、１６ｍｌ）に溶解した。
オゾンをこの溶液に５分間通気した。反応を５滴の硫化
ジメチルでクエンチし、−７８℃で３０分間撹拌を続け
た。溶媒を蒸発させ、得られた物質をフラッシュクロマ
トグラフィー（シリカゲル、８５：１５→７５：２５の
ヘキサン：酢酸エチル勾配で溶出）に付して精製し、標
記化合物を得た（４０ｍｇ、４０％）。融点１８８−１
９０℃；¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣl₃）δ ９.
８３（ｓ、１Ｈ）、７.８８（ｓ、４Ｈ）、７.８６
（ｄ、Ｊ＝８.１Ｈｚ、２Ｈ）、４.０３（ｓ、４Ｈ）、
３.７３（ｓ、３Ｈ）、３.７６（ｔ、Ｊ＝６.０Ｈｚ、
２Ｈ）、３.００（ｓ、２Ｈ）、２.８０（ｓ、３Ｈ）、
２.０３（ｔ、Ｊ＝６.０Ｈｚ、２Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）
ｍ／ｚ ３４３（Ｍ＋Ｈ）⁺。

【００６７】実施例５ １,４−ジメチル−８,８−エチレンジオキシ−２,３,
７,８,９,１０−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］チ
エノ［２,３−ｂ］ピラゾロ［３,４−ｄ］ピリジン−３
−オン（化合物５）の調製

【化６】

【００６８】１,４−ジメチル−８,８−エチレンジオキ
シ−２,３,７,８,９,１０−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ベン
ゾ［ｂ］チエノ［２,３−ｂ］ピラゾロ［３,４−ｄ］ピ
リジン−３−オン 実施例３（ｄ）の化合物（０.４ｇ、０.８３ミリモル）
のメタノール（６.７ｍｌ）中溶液を室温で、メチルヒ
ドラジン（０.１６ｇ、３.４５ミリモル）で処理し、混
合物を２時間加熱還流する。混合物を冷却し、１５０ｍ
ｇの２,４−ジメチル位置異性体を含有する沈澱を濾過
した。濾液を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー
（シリカゲル、８０：２０：５酢酸エチル：メタノー
ル：酢酸で溶出）に付して精製し、標記化合物を黄色固
体（２２ｍｇ）として得た。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨ
z、ＣＤＣl₃）δ ４.０３（ｓ、４Ｈ）、３.７３（ｓ、
３Ｈ）、３.７６（ｔ、Ｊ＝６.０Ｈｚ、２Ｈ）、３.０
０（ｓ、２Ｈ）、２.８０（ｓ、３Ｈ）、２.０３（ｔ、
Ｊ＝６.０Ｈｚ、２Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ３３２
（Ｍ＋Ｈ）⁺。

【００６９】実施例６ ４−カルボキシ−ベンゾフェノン−４−カルボキシアミ
ド−トランス−４−メチル−シクロヘキシル−Ｎ−ヘキ
シルカルボキシアミド（化合物６）の調製

【化７】

【００７０】ａ）Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−ト
ランス−４−アミノメチルシクロヘキシルカルボン酸 水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ、１００ｍｌ、１００ミ
リモル）を、０℃で４−トランス−アミノメチル−シク
ロヘキシル−カルボン酸（９.０ｇ、６０ミリモル）の
ジオキサン（１００ｍｌ）および水（１００ｍｌ）中溶
液に添加した。Ｂｏｃ無水物（１５.９ｇ、６６ミリモ
ル）を添加し、反応物を室温に加温し、一夜撹拌した。
該溶液を５０ｍｌに濃縮し、ついでＥtＯＡc（１００ｍ
ｌ）で希釈し、ＫＨＳＯ₄（１Ｎ）水溶液でpＨ２に酸性
化した。ついで、有機層を水（１００ｍｌ）で２回抽出
し、有機物を減圧下で濃縮した。固体をＥtＯＡc／ヘキ
サンから再結晶して、９.２ｇ＋３.４ｇ（２回目の収
穫）の白色固体を得た（収率８０％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ
／ｅ ２４２［Ｍ＋Ｈ］⁺。

【００７１】ｂ）Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−ト
ランス−４−アミノメチルシクロヘキシル（カイザー・
オキシム（Kaiser Oxime）レジン）カルボキシレート カイザー・オキシム・レジン（２０ｇ、０.７ミリモル
／ｇ負荷、アドバンスト・ケム・テック（Advanced Che
m Tech））を、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−トラ
ンス−４−アミノメチルシクロヘキシルカルボン酸
（５.０ｇ、２０ミリモル）およびＤＣＣ（４.４ｇ、２
０ミリモル）の塩化メチレン（２００ｍｌ）中溶液に添
加し、一夜室温で緩やかに混合した。固体を濾過して集
め、ついで、塩化メチレン（５ｘ１００ｍｌ）で洗浄し
た。ついで、樹脂を塩化メチレン（２００ｍｌ）に再懸
濁し、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−トランス−４
−アミノメチルシクロヘキシルカルボン酸（５.０ｇ、
２０ミリモル）およびＤＣＣ（４.４ｇ、２０ミリモ
ル）を添加し、反応物を室温で一夜緩やかに混合した。
固体を濾過して集め、ついで塩化メチレン（５ｘ１００
ｍｌ）で洗浄し、ついで一夜減圧下で乾燥した。ＩＲ
（ＫＢr、ｃｍ^-1）＝１８２０、１７７１、１５２０。

【００７２】ｃ）トランス−４−アミノメチルシクロヘ
キシル（カイザー・オキシム・レジン）カルボキシレー
ト Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−トランス−４−アミ
ノメチルシクロヘキシル（カイザー・オキシム・レジ
ン）カルボキシレート（２０ｇ）を塩化メチレン（１０
０ｍｌ）に懸濁し、ＴＦＡ（２５ｍｌ）を添加した。反
応物を緩やかに０.５時間混合し、ついで、固体を濾過
して集め、ついで塩化メチレン（５ｘ１００ｍｌ）で洗
浄し、ついで一夜減圧下で乾燥した。ＩＲ（ＫＢr、ｃ
ｍ^-1）＝３１５０、１７７０、１５２６。

【００７３】ｄ）４−カルボキシ−ベンゾフェノン−４
−カルボキシアミド−トランス−４−メチル−シクロヘ
キシル（カイザー・オキシム・レジン）カルボキシレー
ト トランス−４−アミノメチルシクロヘキシル（カイザー
・オキシム・レジン）カルボキシレート（２００ｍｇ）
をＤＭＦ（３.０ｍｌ）およびＮ−メチルモルホリン
（０.２ｍｌ）に懸濁し、４,４'−ベンゾフェノンジカ
ルボン酸（１９０ｍｇ、０.７ミリモル）およびＨＢＴ
Ｕ（２６５ｍｇ、０.７ミリモル）を添加し、反応物を
緩やかに３時間混合した。固体を濾過して集め、ついで
ＤＭＦ（３ｘ２０ｍｌ）および水（３ｘ２０ｍｌ）で洗
浄し、ＤＭＦ（３.０ｍｌ）およびＮ−メチルモルホリ
ン（０.１ｍｌ）に再懸濁し、４,４'−ベンゾフェノン
ジカルボン酸（０.３５ミリモル）およびＨＢＴＵ（０.
３５ミリモル）を添加し、反応物を緩やかに３時間混合
した。固体を濾過して集め、ついでＤＭＦ（３ｘ２０ｍ
ｌ）で、水（３ｘ２０ｍｌ）で、ついで塩化メチレン
（５ｘ２０ｍｌ）で洗浄し、減圧下で乾燥した。

【００７４】ｅ）４−カルボキシ−ベンゾフェノン−４
−カルボキシアミド−トランス−４−メチル−シクロヘ
キシル−Ｎ−ヘキシル−カルボキシアミド ４−カルボキシ−ベンゾフェノン−４−カルボキシアミ
ド−トランス−４−メチル−シクロヘキシル−（カイザ
ー・オキシム・レジン）カルボキシレート（２００ｍ
ｇ）を塩化メチレン（３.０ｍｌ）に懸濁し、ヘキシル
アミン（０.３ミリモル）を添加した。反応物を緩やか
に３時間混合し、ついで濾過し、濾液を減圧下で濃縮し
て標記化合物を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ ４９３［Ｍ
＋Ｈ］⁺。

【００７５】実施例７ ４−ニトロ−ベンズアミド−トランス−４−メチル−シ
クロヘキシル−Ｎ−ヘキシルカルボキシアミド（化合物
７）の調製

【化８】

【００７６】４−ニトロ−ベンズアミド−トランス−４
−メチル−シクロヘキシル−Ｎ−ヘキシルカルボキシア
ミド ４,４'−ベンゾフェノンジカルボン酸を４−ニトロ安息
香酸に置き換えた以外は、実施例６（ａ）−（ｅ）の操
作に従って標記化合物を調製した：ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ
３９０［Ｍ＋Ｈ］⁺。

【００７７】実施例８ ４−アセトアミド−ベンズアミド−トランス−４−メチ
ル−シクロヘキシル−Ｎ−１−（アミノ−Ｒ−２−（メ
トキシメチル）−ピロリジン）カルボキシアミド（化合
物８）の調製

【００７８】

【化９】

【００７９】４,４'−ベンゾフェノンジカルボン酸を４
−アセトアミド安息香酸に、およびヘキシルアミンをＲ
−１−アミノ−２−（メトキシメチル）−ピロリジン
（ＲＡＭＰ）に置き換えた以外は、実施例６（ａ）−
（ｅ）の操作に従って標記化合物を調製した：ＭＳ（Ｅ
Ｓ）ｍ／ｅ ３３１［Ｍ＋Ｈ］⁺。

【００８０】実施例９ ４−ホルミル−Ｅ−シンアミド−トランス−４−メチル
−シクロヘキシル−Ｎ−（プロピル）カルボキシアミド
（化合物９）の調製

【化１０】

【００８１】４,４'−ベンゾフェノンジカルボン酸を４
−ホルミルけい皮酸に、ヘキシルアミンをプロピルアミ
ンに置き換えた以外は、実施例６（ａ）−（ｅ）の操作
に従って標記化合物を調製した：ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ
３５７［Ｍ＋Ｈ］⁺。

【００８２】実施例１０ ２,３,７,８,９,１０−ヘキサヒドロ−４−メチル−１
Ｈ−ベンゾ［ｂ］チエノ［２,３−ｂ］ピラゾロ［３,４
−ｄ］ピリジン−３−オン（化合物１０）の調製

【化１１】

【００８３】ａ）４−ヒドロキシ−２−メチル−５,６,
７,８−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チエノ［２,３−ｂ］
ピリジン−２−カルボン酸エチル ２−アミノ−４,５,６,７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］
チオフェン−３−カルボン酸エチル（８.９ｇ、３９ミ
リモル）および３−エトキシクロトン酸エチル（１２.
４ｇ、７８ミリモル）のトルエン（３００ｍｌ）中溶液
をショウノウスルホン酸（０.７８ｇ、３.４ミリモル）
で処理し、反応混合物をディーン・スターク・トラップ
を用いて３時間加熱還流した。ついで、混合物を室温に
冷却し、その後、新たに調製したナトリウムエトキシド
の１Ｍ溶液（４８ｍｌ、４８ミリモル）で処理した。添
加終了後、反応混合物を３時間加熱還流した。混合物を
冷却し、濃縮し、残渣を酢酸エチルに溶解した。酢酸
（２ｍｌ）を添加し、溶媒を蒸発させ、得られた固体を
メタノールでトリチュレートして灰白色固体として標記
化合物を得た（８.４ｇ、７４％）：融点１４０℃；¹Ｈ
ＮＭＲ（４００ＭＨz、ＣＤＣl₃）δ ４.４８（ｑ、Ｊ
＝７.２Ｈz、２Ｈ）、３.０４（ｂｒ ｓ、２Ｈ）、２.
８１（ｓ、３Ｈ）、２.８０（ｂｒ ｓ、２Ｈ）、１.８
７（ｂｒ ｓ、４Ｈ）、１.４７（ｔ、Ｊ＝７.２Ｈｚ、
３Ｈ）；元素分析（％）Ｃ₁₅Ｈ₁₇ＮＯ₃Ｓとして:計算
値：Ｃ、６１.８３；Ｈ、５.８８；Ｎ、４.８１；測定
値：Ｃ、６１.６９；Ｈ、５.８１；Ｎ、４.７３。

【００８４】ｂ）４−クロロ−２−メチル−５,６,７,
８−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チエノ［２,３−ｂ］ピ
リジン−２−カルボン酸エチル 実施例１０（ａ）の化合物（８.０ｇ、２７.４ミリモ
ル）のオキシ塩化リン（１００ｍｌ）中溶液を３.５時
間還流した。オキシ塩化リンを減圧下で除去し、残った
油状物質を酢酸エチルに溶解し、５％重炭酸ナトリウム
水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒
を蒸発させて標記化合物を結晶固体として得た（８.５
ｇ、９５％）：融点６５−６６℃；¹Ｈ ＮＭＲ（４００
ＭＨz、ＣＤＣl₃）δ ４.４７（ｑ、Ｊ＝７.１Ｈｚ、２
Ｈ）、３.１０（ｂｒ ｓ、２Ｈ）、２.８５（ｂｒ ｓ、
２Ｈ）、２.６０（ｓ、３Ｈ）、１.８９（ｂｒ ｓ、４
Ｈ）、１.４３（ｔ、Ｊ＝７.１Ｈｚ、３Ｈ）；元素分析
（％）Ｃ₁₅Ｈ₁₆ＣlＮＯ₂Ｓ・０.１２５Ｈ₂Ｏとして：計
算値；Ｃ、５７.７３；Ｈ、５.２５；Ｎ、４.４９；測
定値；Ｃ、５７.６９；Ｈ、５.０８；Ｎ、４.３０。

【００８５】ｃ）２,３,７,８,９,１０−ヘキサヒドロ
−４−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］チエノ［２,３−
ｂ］ピラゾロ−［３,４−ｄ］ピリジン−３−オン実施
例１０（ｂ）の化合物（２.０ｇ、６.４ミリモル）のメ
タノール（５０ｍｌ）中溶液をヒドラジン一水和物（１
０ｍｌ）で処理し、得られた混合物を１６時間加熱還流
した。反応物を希釈した塩酸水溶液に注ぎ、標記化合物
を黄色固体として沈澱させた（１.８ｇ）。¹Ｈ ＮＭＲ
（４００ＭＨz、ｄ₄−ＭeＯＨ）δ３.０１（ｂｒｓ、２
Ｈ）、３.００（ｓ、３Ｈ）、２.９２（ｂｒｓ、２
Ｈ）、２.００（ｂｒｓ、４Ｈ）；元素分析（％）Ｃ₁₃
Ｈ₁₃Ｎ₃ＯＳ・ＨＣl・０.２５Ｈ₂Ｏとして：計算値；
Ｃ、５２.００；Ｈ、４.８７；Ｎ、１３.９９；測定
値：Ｃ、５１.９２；Ｈ、５.０１；Ｎ、１３.７０。

【００８６】実施例１１−ＳＨ２ドメインアンタゴニス
トの効能を測定するためのプロトコル異なるヒト・ＳＨ
２ドメインでの化合物の阻害活性を、イー・コリ（E.co
li）で融合タンパク質として発現されたＳＨ２ドメイン
を用いてin vitroで決定した。本明細書で使用されるＳ
Ｈ２ドメインは、ヒト形態のｓｒｃ ＳＨ２ドメイン、
Ｇｒｂ２ ＳＨ２ドメイン、ｌｃｋ ＳＨ２ドメイン、ｆ
ｙｎ ＳＨ２ドメイン、ＳＨ−ＰＴＰ２ ＳＨ２ドメイ
ン、ｐ８５ ＳＨ２ドメインおよびｈｃｐ ＳＨ２ドメイ
ンであった。

【００８７】ｓｒｃ、ｌｃｋおよびｈｃｐ ＳＨ２ドメ
インを含有する融合タンパク質は、一般的配列：ＤＥＴ
１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ＳＨ２（ここに、Ｄ
ＥＴ１、ＤＥＴ２、スペーサー、ｅｋおよびＳＨ２は以
下の記載と同じ）として発現された。ＤＥＴ１（「エピ
トープ・タグ１と定義」）（配列番号：１）は、ヒト免
疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）エンベロープタンパ
ク質ｇｐ１２０（またはｇｐ１６０）において見られる
１１アミノ酸配列である。ＨＩＶ−１ｇｐ１２０（また
はｇｐ１６０）の種々のエピトープに対するモノクロー
ナル抗体が当該分野において知られている、例えば、米
国特許第５,１６６,０５０号を参照のこと。好ましい一
例は、モノクローナル抗体１７８.１（例えば、シリア
ート（Thiriart）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー
（J.Immunol.）、第１４３巻：１８３２−１８３６頁
（１９８９年）を参照）であり、これはＢＨ１０株から
の酵母で発現されたＨＩＶ−１ ｇｐ１６０分子でマウ
スを免疫化することにより調製された（ラトナー（Ratn
er）ら、ネイチャー（Nature）、第３１３巻：２７７−
２８４頁（１９８５年））。このタグは、発現の検出
（ウェスタンブロットによる)、タンパク質の精製（ア
フィニティクロマトグラフィーによる）、および配列ア
ッセイのために使用され、そこでは融合タンパク質を１
７８.１抗体を用いて捕獲または固定化した。ＤＥＴ２
は、ニッケル含有樹脂に結合するヘキサヒスチジン配列
タグ（配列番号：２）であり、精製目的に用いた。スペ
ーサー（配列番号：３）は、構築物の指示された位置に
ＢａｍＨＩ制限部位を設計するために用いた。−ｅｋ−
なる語は、ＳＨ２ドメインから所望によりタグを除去
し、無関係のアミノ酸を含有しないＳＨ２ドメインを産
生させるエンテロキナーゼプロテアーゼのための認識配
列（配列番号：４）をいう。無関係のアミノ酸を含有し
ないＳＨ２ドメインは、結晶学的研究のためのタグ付け
されたタンパク質に好ましい。ＳＨ２は種々のタンパク
質のＳＨ２ドメインをいう。

【００８８】各ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ
−ＳＨ２をコードするＤＮＡ配列は、指示された制限部
位（ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ）がスペーサー−ｅｋ−
ＳＨ２領域の隣にくるように設計され、それにより異な
るスペーサー−ｅｋ−ＳＨ２構築物を、ＤＥＴ１−ＤＥ
Ｔ２−スペーサー−ｅｋ−ＳＨ２タグ付けタンパク質を
形成するための以下の方法２または３に記載されたベク
ターのいずれか１つに容易に置換できる。各ＤＥＴ１−
ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ＳＨ２構築物をコードす
るＤＮＡ配列はまた、タグ付けされたＳＨ２ドメイン全
体がＮｄｅＩ−ＸｂａＩ断片として、イー・コリの転写
および翻訳調節配列より適当な距離をおいた下流のＮｄ
ｅＩ部位およびＸｂａＩと一致する下流のクローニング
部位を含有するいずれかの発現ベクター中へ移動できる
ようにも設計された。いずれの適当なベクターでも類似
する結果が得られるであろうが（例えば、ｐＥＴ−１１
ａ；ノバゲン・インク（Novagen, Inc.））、この実験
において使用したベクターは、イー・コリ発現ベクター
ｐＥＡ１ＫｎＲＢＳ３であった。このベクターは、カレ
ント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロ
ジー（Current Protocols in Molecular Biology）（エ
フ・エー・オースベル（F.A.Ausubel）ら編）、１６.
３.１−１６.３.１１頁、グリーン・パブリッシング・
アンド・ウィレイ-インターサイエンス（Greene Publis
hing and Wiley-Interscience）、Ｎ.Ｙ.（以下、エフ
・エー・オースベルらという）中のシャッツマン・エー
（Shatzman,A.）、グロス・エム（Gross,M.）およびロ
ーゼンバーグ・エム（Rosenberg,M.）、１９９０年、
「エクスプレッション・ユージング・ベクターズ・ウイ
ズ・ファージ・ラムダ・レギュラトリー・シークエンシ
ーズ（Expression using vectors with phage lambda r
egulatory sequences）」中に記載された一連のベクタ
ーの誘導体である。特定のベクター、ｐＥＡ１ＫｎＲＢ
Ｓ３がバーグスマ（Bergsma）ら、１９９１年、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.C
hem.）、第２６６巻、２３２０４−２３２１４頁に記載
されている。

【００８９】以下の方法は、ニワトリｓｒｃ、ヒトｓｒ
ｃ、ヒトｌｃｋ、およびヒトｈｃｐＳＨ２ドメインの発
現を記載する。最初に、ニワトリｓｒｃ ＳＨ２ドメイ
ンをＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２として発
現させた。ついで、他のものをニワトリｓｒｃの代わり
にこのベクターに挿入し、ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペー
サー−ｅｋ−スペーサー−ＳＨ２の形態でタンパク質を
発現させた。

【００９０】方法１： ＤＥＴ１およびＤＥＴ２タグを
含有するニワトリｓｒｃ ＳＨ２ドメイン（ＤＥＴ１−
ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２）のクローニングおよび
発現 タグ付けされたタンパク質ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペー
サー−ＳＨ２をコードするＤＮＡ配列を、ニワトリＳｒ
ｃ遺伝子を含有するｃＤＮＡクローン（ｐ５Ｈ；レビィ
（Levy）ら、１９８６年、プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユー
・エス・エー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第８３巻：４
２２８頁）から、以下のプライマー：

【００９１】

【化１２】 下線の部位は、ＮｄｅＩ認識部位（５'）およびＢａｍ
ＨＩ認識部位（３'）である。

【００９２】

【化１３】 下線の領域は、ＸｂａＩ認識部位である。を用いて、当
該業者によく知られた方法によりＰＣＲ増幅した。

【００９３】ＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＸｂａＩで消
化し、続いて消化断片をアガロースゲル上で単離した。
その断片を、６.５ｋｂｐ断片としてアガロースゲルで
精製されたＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ｐＥＡ１ＫｎＲＢＳ
３ベクター（バーグスマら、前掲）に連結した。連結反
応を用いて、イー・コリＭＭ２９４ｃＩ⁺（エフ・エー
・オースベルら、前掲）を形質転換させた。正しい断片
の挿入物を含有するプラスミドを同定し、ＤＮＡ配列決
定により確認した。得られたプラスミドは、ファージラ
ムダＰ_Lプロモーターおよび調節系の制御下にあるＤＥ
Ｔ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２をコードしてい
る。プラスミドＤＮＡをＭＭ２９４ｃＩ⁺から精製し、
イー・コリＡＲ１２０株を形質転換するために用いた。
この宿主株において、ファージプロモーターの発現は、
前記のエフ・エー・オースベルらにおいて記載されてい
るごとく、生育培養にナリジクス酸を添加することによ
り誘発できる。このプラスミドを含有するＡＲ１２０の
ナリジクス酸誘発、続いて、クマシーブルー染色された
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での細胞性タンパク
質の解析により（エフ・エー・オースベルら、前掲）、見
かけの分子量１５,０００のタンパク質のバンドが現
れ；このバンドは、非誘発細胞、または、ＰＣＲ増幅断
片を欠失したｐＥＡ１ＫｎＲＢＳ３を含有する誘発細胞
においては見られなかった。ウェスタンブロッティング
により、誘発されたタンパク質バンドが抗ＤＥＴ１モノ
クローナル抗体１７８.１と反応することを確認した。

【００９４】方法２：タグおよびエンテロキナーゼプロ
テアーゼによる開裂部位を含有するヒトｓｒｃ ＳＨ２
ドメイン（ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｓ
ｒｃ ＳＨ２）のクローニング、発現および精製。 タンパク質ｅｋ−ｓｒｃ ＳＨ２をコードするＤＮＡ配
列を、ヒトｓｒｃ遺伝子を含有するｃＤＮＡクローン
（タケヤ・ティー（Takeya, T.）およびハナフサ・エイ
チ（Hanafusa, H.）、１９８３年、セル（Cell）、第３
２巻：８８１−８９０頁に記載されたものと同じｃ−ｓ
ｒｃ ＳＨ２のＤＮＡ配列）から、以下のプライマー：

【００９５】

【化１４】 下線の部位は、ＢａｍＨＩ認識部位である。

【化１５】 下線の領域は、ＸｂａＩ認識部位である。を用いてＰＣ
Ｒで増幅した。

【００９６】ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで
消化し、続いて消化断片をアガロースゲル上で単離し
た。その断片を、前記の方法１に記載したタグ付けされ
たニワトリｓｒｃ遺伝子ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサ
ー−ＳＨ２を含有するＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ消化された
発現ベクターに連結した。該ベクターにおいて、Ｂａｍ
ＨＩ部位はＤＥＴ２およびＳＨ２についての暗号領域の
間に存在し、ＸｂａＩ部位はＳＨ２暗号領域の３'末端
の後ろに存在する。連結反応を用いて、イー・コリＭＭ
２９４ｃＩ⁺を形質転換させた。構築物ＤＥＴ１−ＤＥ
Ｔ２−スペーサー−ｅｋ−ｓｒｃ ＳＨ２を、ＤＮＡ配
列決定により確認し（配列番号：５）、イー・コリＡＲ
１２０株において前記した方法１のごとく誘発させた。
ナリジクス酸誘発後、クマシーブルー染色された、ウェ
スタンブロッティング陽性の見かけの分子量１６,００
０の誘発されたタンパク質バンドが観察された。

【００９７】細胞を中性ｐＨでリソゾーム存在下で超音
波により溶解した。遠心後、可溶性抽出物をＮi⁺⁺ＮＴ
Ａカラム上でクロマトグラフィーを行った。カラムを平
衡緩衝液（０.５Ｍ ＮaＣlを含有するトリス（Tris）緩
衝液（pＨ８））および１５ｍＭ イミダゾールを含有す
る同じ緩衝液で洗浄後、高度に精製された形態のタンパ
ク質が平衡緩衝液中２５ｍＭイミダゾールで溶出した。
このようにして精製されたＳＨ２ドメインは、以下に記
載する「結合アッセイ」において、適当なｐＹペプチド
に特異的飽和形式で高親和性で結合することが見いださ
れ、タグが機能を妨害しないことを示した。この発現し
た融合タンパク質、ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−
ｅｋ−ｓｒｃ ＳＨ２を、ヒトｓｒｃ ＳＨ２ドメインを
選択的に阻害する化合物の特異性を測定するためニ、以
下に記載する「結合アッセイ」において使用した。

【００９８】方法３：タグおよびエンテロキナーゼプロ
テアーゼによる開裂部位を含有するヒトｌｃｋ ＳＨ２
ドメイン（ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｌ
ｃｋ ＳＨ２）のクローニングおよび発現。 タンパク質ｅｋ−ｌｃｋ ＳＨ２をコードするＤＮＡ配
列を、ヒトｌｃｋ遺伝子を含有するｃＤＮＡクローン
（ジンバンク（Genbank）受託番号Ｍ３６８８１）か
ら、以下のプライマー：

【００９９】

【化１６】 下線の部位は、ＢａｍＨＩ認識部位である。

【化１７】 下線の領域は、ＸｂａＩ認識部位である。を用いてＰＣ
Ｒで増幅した。

【０１００】ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで
消化し、続いて消化断片をアガロースゲル上で単離し
た。その断片を、前記した方法１に記載したタグ付けさ
れたニワトリｓｒｃ遺伝子ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペー
サー−ＳＨ２を含有するＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ消化され
た発現ベクターに連結した。該ベクターにおいて、Ｂａ
ｍＨＩ部位はＤＥＴ２およびＳＨ２についての暗号領域
の間に存在し、ＸｂａＩ部位はＳＨ２暗号領域の３'末
端の後ろに存在する。かくして、ｅｋ−ｌｃｋ ＳＨ２
配列を前記のベクターのｓｒｃ ＳＨ２配列に置換し
た。連結反応を用いて、イー・コリＭＭ２９４ｃＩ⁺を
形質転換させた。ＤＥＴ１−ＤＥＴ１−スペーサー−ｅ
ｋ−ｌｃｋ ＳＨ２を含有する構築物を、ＤＮＡ配列決
定により確認し（配列番号：６）、イー・コリＡＲ１２
０株を前記した方法１のごとく誘発した。ナリジクス酸
誘導後、クマシーブルー染色された、ウェスタンブロッ
ティング陽性の見かけの分子量１７,０００の誘導され
たタンパク質バンドが観察された。

【０１０１】細胞を中性pＨでリソゾーム存在下で超音
波により溶解した。遠心後、可溶性抽出物をＮi⁺⁺ＮＴ
Ａカラム上でクロマトグラフィーを行った。カラムを平
衡緩衝液（０.５Ｍ ＮaＣlを含有するトリス緩衝液（p
Ｈ８））および１５ｍＭ イミダゾールを含有する同じ
緩衝液で洗浄後、高度に精製された形態のタンパク質を
平衡緩衝液中２５ｍＭイミダゾールで溶出した。このよ
うにして精製されたＳＨ２ドメインは、以下に記載する
「結合アッセイ」において適当なｐＹペプチドに特異的
飽和形式で高親和性で結合することが見いだされ、タグ
が機能を妨害しないことを示した。この発現した融合タ
ンパク質、ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｌ
ｃｋ ＳＨ２を、ヒトｌｃｋ ＳＨ２ドメインを選択的に
阻害する化合物の特異性を測定するために、以下に記載
する「結合アッセイ」において使用した。

【０１０２】方法４：タグおよびエンテロキナーゼプロ
テアーゼによる開裂部位を含有するヒトｈｃｐ ＳＨ２
ドメイン（ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｈ
ｃｐ ＳＨ２）のクローニングおよび発現。 タンパク質ｅｋ−ｈｃｐ ＳＨ２をコードするＤＮＡ配
列を、ヒト胎児肝ＲＮＡから逆転写酵素ＰＣＲにより増
幅した。ＲＮＡ単離は、トリ・リエージェント（Tri-Re
agent）（モレキュラー・リサーチ・センター・インク
（Molecular Research Center Inc.））およびリバース
・トランスクリプターゼ・システム（Reverse Transcri
ptase system）（ギブコ（GIBCO）−ＢＲＬ）を使用説
明書に従って使用した。ＰＣＲは以下のプライマー：

【０１０３】

【化１８】 下線の部位は、ＢｇｌＩＩ認識部位である。

【化１９】 下線の領域は、ＸｂａＩ認識部位である。を用いて行わ
れた。

【０１０４】ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで
消化し、続いて消化断片をアガロースゲル上で単離し
た。その断片を、前記した方法２で記載したタグ付けさ
れたヒトｓｒｃ遺伝子ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー
−ｅｋ−ｓｒｃ ＳＨ２を含有するＢａｍＨＩ−Ｘｂａ
Ｉで消化された発現ベクターに連結した。該ベクターに
おいて、ＢａｍＨＩ部位はＤＥＴ２およびｅｋについて
の暗号領域の間に存在し、ＸｂａＩ部位はＳＨ２暗号領
域の３'末端の後ろに存在する。かくして、ｅｋ−ｈｃ
ｐ ＳＨ２配列を前記ベクターのｅｋ−ｓｒｃ ＳＨ２配
列に置換した。連結反応を用いて、イー・コリＭＭ２９
４ｃＩ⁺を形質転換させた。ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペ
ーサー−ｅｋ−ｈｃｐ ＳＨ２を含有する構築物を、Ｄ
ＮＡ配列決定により確認し（配列番号：７）、それを用
いてイー・コリＧＩ６９８（インビトロジェン・コーポ
レーション（Invitrogen Corporation）、サンジエゴ、
ＣＡ）株を形質転換した。ファージラムダプロモーター
の誘発を、説明書に従って、培地にトリプトファンを１
０ｍｇ／ｍｌまで添加することにより誘導した。３０℃
で生育させた細胞のトリプトファン誘導後、クマシーブ
ルー染色された、ウェスタンブロッティング陽性の見か
けの分子量１５,０００の誘導されたタンパク質バンド
が観察された。

【０１０５】細胞を中性pＨでリソゾーム存在下で超音
波により溶解した。遠心後、不溶性ペレットをトリス緩
衝液（pＨ８）中の８Ｍ尿素で可溶化し、Ｎi⁺⁺ＮＴＡカ
ラムに結合させた。樹脂を平衡緩衝液（０.５Ｍ ＮaＣ
l、８Ｍ尿素および５ｍＭ ＢＭＥを含有するトリス緩衝
液（pＨ８））および１５ｍＭ イミダゾールを含有する
同じ緩衝液で洗浄した。５ｍＭ ＢＭＥ存在下で尿素を
除去する間にタンパク質はカラム上で再び折り畳まれ、
再び折り畳まれた精製タンパク質をトリス緩衝液（pＨ
８）中の３００ｍＭイミダゾールで溶出した。このよう
にして精製されたＳＨ２ドメインは、以下に記載する
「結合アッセイ」において適当なｐＹペプチドに特異的
飽和形式で高親和性で結合することが見いだされ、タグ
が機能を妨害しないこと、および、タンパク質が再びう
まく折り畳まれることを示した。この発現した融合タン
パク質、ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｈｃ
ｐＳＨ２を、ヒトｈｃｐ ＳＨ２ドメインを選択的に阻
害する化合物の特異性を測定するために、以下に記載す
る「結合アッセイ」において利用した。

【０１０６】構築物ＧＳＴ−Ｘ−ＳＨ２を有する融合タ
ンパク質は、ファルマシア社（ニュージャージー州）か
ら市販されているＧＳＴ遺伝子融合キットシステムにお
いて記載されているごとく調製された。ＧＳＴは、ｆｙ
ｎ、Ｇｒｂ２およびＳＨ−ＰＴＰ２に関するタグ配列、
グルタチオンｓ−トランスフェラーゼエピトープ（配列
番号：８）であり、ｐ８５に関するタグ配列グルタチオ
ンｓ−トランスフェラーゼエピトープ（配列番号：９）
である。ＳＨ２は、エフ・エム・オースベルら編、ジョ
ン・ウィレイ・アンド・サンズ・インク（１９９５年）
発行、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラ
ー・バイオロジー」、１６.７.１頁に従って、グルタチ
オン・セファロース４Ｂ（ファルマシア）を用いて発現
および精製された、ｆｙｎ、Ｇｒｂ２、ｐ８５およびＳ
Ｈ−ＰＴＰ２のＳＨ２ドメインをいう。Ｘは、好ましく
は６ないし２１塩基対の適当なリンカーであり、ＳＨ２
構築物の読み枠を維持し、相補的クローニングを行うた
めに使用される。Ｘの配列それ自体は臨界的ではない。
当業者は容易に適当なリンカーを構築できる。指示され
た制限部位（ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ）がＳＨ２領
域の隣にくるように、各ＧＳＴ−Ｘ−ＳＨ２融合タンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列を消化した。この実験で使
用されたベクターは、ｆｙｎ、Ｇｒｂ２およびＳＨ−Ｐ
ＴＰ２については、イー・コリ発現ベクターｐＧＥＸ−
２Ｔ（ファルマシア）、およびｐ８５についてはｐＧＥ
Ｘ−３Ｘ（ファルマシア）であった。これら各ベクター
により、以下に記載するように、付加的Ｃ−末端アミノ
酸を有するＳＨ２構築物を得る。

【０１０７】ヒトｆｙｎのＳＨ２ドメインをコードする
配列（アミノ酸１４３−２５２）（ヤマモト・ティー
（Yamamoto, T）ら、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユー・エ
ス・エー、第８３巻、５４５９−５４６３頁（１９８６
年））を、発現ベクターｐＧＥＸ−２ＴのＢａｍＨＩお
よびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。付加的Ｃ末端
アミノ酸、ロイシン−スレオニン−アスパラギン−セリ
ン−セリンを含有するＳＨ２ドメイン（配列番号：１
０）を当業者に公知のＰＣＲ法によってクローニング
し、発現された融合タンパク質ＧＳＴ−Ｘ−ｆｙｎを得
た。ついで、この発現された融合タンパク質を、ヒトｆ
ｙｎ ＳＨ２ドメインを選択的に阻害する化合物の特異
性を測定するために、以下に記載する「結合アッセイ」
において利用した。

【０１０８】ヒトｐ８５ ＳＨ２ドメイン：ヒトｐ８５
のＳＨ２ドメインをコードする配列（アミノ酸３２１−
４４０）（スコルニック・イー（Skolnik, E）ら、セ
ル、第６５巻、８３−９０頁（１９９１年））を、発現
ベクターｐＧＥＸ−３ＸのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ
部位にクローニングした。付加的Ｃ末端アミノ酸、アス
パラギン−セリン−セリンを含有するＳＨ２ドメイン
（配列番号：１１）を当業者に公知のＰＣＲ法によって
クローニングし、発現した融合タンパク質ＧＳＴ−Ｘ−
ｐ８５を得た。ついで、この発現した融合タンパク質
を、ヒトｐ８５ ＳＨ２ドメインを選択的に阻害する化
合物の特異性を決定するために、以下に記載する「結合
アッセイ」において利用した。

【０１０９】ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ ＳＨ２ドメイン：ヒ
トＳＨ−ＰＴＰ２のＳＨ２ドメインをコードする配列
（アミノ酸１−１０６）（バスティエン・エル（Bastie
n, L）ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル
・リサーチ・コミュニケーション（Biochem.Biophys.Re
s.Commun.）、第１９６巻、１２４−１３３頁（１９９
３年））を、発現ベクターｐＧＥＸ−２ＴのＢａｍＨＩ
およびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。付加的Ｃ末
端アミノ酸、グルタミン−フェニルアラニン−イソロイ
シン−バリン−スレオニン−アスパラギン酸を含有する
ＳＨ２ドメイン（配列番号：１２）を当業者に公知のＰ
ＣＲ法によってクローニングし、発現した融合タンパク
質ＧＳＴ−Ｘ−ＳＨ−ＰＴＰ２を得た。ついで、この発
現した融合タンパク質を、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ ＳＨ２
ドメインを選択的に阻害する化合物の特異性を測定する
ために、以下に記載する「結合アッセイ」において利用
した。

【０１１０】ヒトＧｒｂ２ ＳＨ２ドメイン：ヒトＧｒ
ｂ２のＳＨ２ドメインをコードする配列（アミノ酸５８
−１５９）（ロウエンスタイン・イー（Lowenstein,E）
ら、セル、第７０巻、４３１−４４２頁（１９９２
年））を、発現ベクターｐＧＥＸ−２ＴのＢａｍＨＩお
よびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。付加的Ｃ末端
アミノ酸イソロイシン−ヒスチジン−アルギニン−アス
パラギン酸を含有するＳＨ２ドメイン（配列番号：２
５）を当業者に公知のＰＣＲ法によってクローニング
し、発現した融合タンパク質ＧＳＴ−Ｘ−Ｇｒｂ２を得
た。６つのヌクレオチドリンカーを用い、ＧＳＴおよび
ＳＨ２ドメインの間にアミノ酸のグリシンおよびセリン
をもたらした。ついで、この発現した融合タンパク質
を、ヒトＧｒｂ２ＳＨ２ドメインを選択的に阻害する化
合物の特異性を測定するために、以下に記載する「結合
アッセイ」において利用した。

【０１１１】結合アッセイ：ＳＨ２ドメインにおける化
合物の効能を、該ＳＨ２ドメインのその各々特異的ｐＹ
ペプチドへの結合を選択的に阻害するかかる化合物の能
力を基礎に決定した。

【０１１２】ＳＨ２ドメインおよびｐＹペプチドについ
ての結合アッセイはＥＬＩＳＡに基づく９６ウェルプレ
ートアッセイにおいて行われた。ミリポア９６ウェルフ
ィルタープレート、親水性デュラポア（登録商標）（Dur
apore）（孔径０.６５μｍ、カタログ番号ＭＡＤＶＮ６
５５０）にて、２μｌ（５０％懸濁液）のプロテイン−
Ｇセファロース（Protein-G Sepharose）（ニュージャ
ージー州のファルマシアから入手、カタログ番号１７−
０６１８−０１）および２ｍｇ／ｍｌのＭＡＢ１７８.
１（２μＬ）（ｇｐ１２０／ＳＨ２ドメイン融合タンパ
ク質ｓｒｃ、ｌｃｋおよびｈｃｐについて）または抗Ｇ
ＳＴポリクローナル抗血清（０.２５μｌ）（ニュージ
ャージー州のファルマシアから入手）（ＧＳＴ／ＳＨ２
ドメイン融合タンパク質ｆｙｎ、Ｇｒｂ２、ｐ８５およ
びＳＨ−ＰＴＰ２について）のいずれかを添加した。１
０ピコモルの該ＳＨ２ドメイン融合タンパク質をその各
ウェルに添加した。体積をＴＢＳ−Ｔ（トリス緩衝セラ
イン＋０.０５％ツイン２０）で１００μｌにし、室温
で１時間インキュベートして振盪し、ついで、ＴＢＳ−
Ｔ（４℃）（ｘ１）で洗浄した。ついで、９０μｌのＴ
ＢＳ−Ｔを各ウェルに添加した。特異的ｐＹビオチン化
ペプチドを濃度１.０μＭになるようにＴＢＳ−Ｔで希
釈した（これらのペプチドはペンシルベニア州のバケム
・バイオサイエンス（Bachem Bioscience）、テキサス
州のジェノシス・バイオテクノロジーズ（Genosys Biot
echnologies）およびカリフォルニア州のカルフォルニ
ア・ペプチド・リサーチ（California peptide Researc
h）から入手可能である）。ウェル当たり１０μｌをア
リコートし、最終濃度０.１μＭ（各ＳＨ２ドメイン／
ペプチド対についてのおおよそのＫ_d）および１００μ
ｌの最終体積を得た。アッセイプレートを結合が平衡に
達するまでインキュベート（振盪しながら４℃で３時
間）した。アッセイプレートをウェル当たり２回ＴＢＳ
−Ｔ（４℃）で洗浄し、ついで、ウェル当たり１００μ
ｌのＳＡＢＣ（カリフォルニア州のザイムド・コーポレ
ーション（Zymed corporation）、カタログ番号９３−
００４３より入手可能である、ストレプトアビジン・ビ
オチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体、１０ｍｌ
のＴＢＳ−Ｔ当たり、１滴の試薬Ａ（ストレプトアビジ
ン）および１滴の試薬Ｂ（ＡＨ−ビオチン抱合西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ）を３７℃で３０分間インキュベー
トし、ついで、４℃に冷却されたもの）を添加し、つい
で４℃で３０−６０分間インキュベートした。ついで、
プレートをＴＢＳ−Ｔで４回（４℃）（２５０μｌ／ウ
ェル／洗浄）洗浄した。ウェル当たりクエン酸緩衝液中
１ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ（１００μｌ）（ｏ−フェニルジ
アミン、シグマ・ケミカル・コーポレーション、セント
ルイス、ミズーリ州）を添加した。発色を停止するため
に、ウェル当たり１００μｌの１０％硫酸を添加した。
ついで、アッセイプレートの各々のウェルから１５０μ
ｌをとり、ＥＬＩＳＡプレートにのせた。ついで、各Ｅ
ＬＩＳＡプレートのＡ₄₉₀を測定した。

【０１１３】表Ｉにおける（ＩＣ₅₀）の測定 各対照または化合物を二重アッセイした。二重系を平均
し、バックグラウンドを差し引いて、次いで、阻害のな
い最大値をプレートからとり、ついで、すべての他のデ
ータポイントを最大値のパーセントとして（または％対
照として）表した。これらの％対照データ値をマッキン
トッシュのカレイダグラフ（Kaleidagraph）（シネルジ
ー・ソフトウェア（Synergy Software））でグラフにし
た。これらのグラフの曲線は次式に適合した非直線性曲
線であった； Ｆ（ｘ）＝Ｅmax／（１＋（Ｋ_d／濃度）＾勾配）（式
中、Ｋ_dは各々の曲線のＩＣ₅₀を表す）。

【０１１４】表IIにおける（Ｋi）の決定 各化合物のＫiを次式を介して計算する。この長い式
は、ｐＹビオチン化ペプチドがＳＨ２ドメイン融合タン
パク質よりはるかに過剰な濃度（１００ｘ）では存在し
ないという事実から、このアッセイの条件下で使用され
なければならない。ＩＣ₅₀はカレイダグラフを用いる非
直線性曲線フィットに由来の補外値である。Ｒtotおよ
び*Ｄはアッセイに用いた試薬の既知の値である。ＫＤ
は、一般に、ＳＨ２ドメイン融合タンパク質およびｐＹ
ビオチン化ペプチドの各々の組み合わせについて実験的
に決定されるべきである。

【０１１５】

【数１】 ＫＩ＝（ＩＣ₅₀−Ｒtot＋Ｒtot／２（（*Ｄ／（ＫＤ＋*Ｄ））＋ （ＫＤ／（ＫＤ＋*Ｄ＋Ｒtot／２）））／ （１＋*Ｄ／ＫＤ＋Ｒtot／ＫＤ（（ＫＤ＋*Ｄ／２）／（ＫＤ＋*Ｄ）））

【０１１６】ＫＩ＝競合物のＫＤ（μＭ） ＩＣ₅₀＝阻害剤のＩＣ₅₀（μＭ）、各々のＳＨ２ドメイ
ンについての競合選択性アッセイデータの非直線性曲線
フィットに由来する Ｒtot＝１アッセイ（マイクロタイタープレート）ウェ
ルの全ＳＨ２ドメイン濃度（μＭ） *Ｄ＝各ＳＨ２ドメインについての特異的ｐＹおよびビ
オチン化ペプチドの濃度（μＭ） ＫＤ＝各ＳＨ２ドメインについての特異的ｐＹおよびビ
オチン化ペプチドについてのＫＤ値（μＭ） ＩＣ₅₀は、応答またはシグナルが５０％まで阻害される
阻害剤の濃度である。ＫＤは、受容体／リガンド相互作
用におけるリガンドについての解離定数であり、通常、
飽和結合曲線上で１／２Ｖmaxであるリガンドの濃度に
等しい。

【０１１７】上記結合アッセイに使用されたｐＹペプチ
ドリガンドは以下の通りである：ｓｒｃ、ｌｃｋおよび
ｆｙｎ ＳＨ２ドメインについて用いたアミノカプロン
酸（Ａｃａ）リンカー含有のビオチン化ｐＹペプチドリ
ガンド； Glu-Pro-Gln-pTyr-Glu-Glu-Ile-Pro-Ile-Tyr-Leu （配列番号：１３）

【０１１８】ｐ８５ ＳＨ２ドメインについて使用した
アミノカプロン酸（Ａｃａ）リンカー含有のビオチン化
ｐＹペプチドリガンド； Asp-Gly-Gly-pTyr-Met-Asp-Met-Ser-Lys-Asp-Glu （配列番号：１４）

【０１１９】ＳＨ−ＰＴＰ２ ＳＨ２ドメインについて
使用したアミノカプロン酸（Ａｃａ）リンカー含有のビ
オチン化ｐＹペプチドリガンド； Glu-Asn-Gly-Leu-Asn-pTyr-Ile-Asp-Leu-Asp-Leu （配列番号：１５）

【０１２０】ｈｃｐ ＳＨ２ドメインについて使用した
アミノカプロン酸（Ａｃａ）リンカー含有のビオチン化
ｐＹペプチドリガンド； Thr-Pro-Pro-His-Leu-Lys-pTyr-Phe-Tyr-Phe-Val-Val-Ser-Asp-Ser-Gly （配列番号：１６）

【０１２１】Ｇｒｂ２ ＳＨ２ドメインについて使用し
たアミノカプロン酸（Ａｃａ）リンカー含有のビオチン
化ｐＹペプチドリガンド； Leu-Pro-Val-Pro-Glu-pTyr-Ile-Asn-Gln-Ser-Val （配列番号：２６）

【０１２２】結合アッセイの結果：表ＩおよびIIは、指
示されたＳＨ２ドメインでのＳＨ２アンタゴニストの交
叉反応性を示す。化合物７のみが、ｓｒｃ ＳＨ２ドメ
インで、他のＳＨ２ドメインでの結合親和性／阻害濃度
よりも５０倍以上高い結合親和性／阻害濃度を有する。

【０１２３】

【表１】

【０１２４】

【表２】

【０１２５】実施例１２ ｓｒｃ ＳＨ２ドメインア
ンタゴニストの活性 ４−［４−（４−メチルベンゾイル）ベンゾイル］フェ
ニルアセトアルデヒド（化合物４）を、ライズ・エル・
ジー（Raisz LG）（１９６５）ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・インベスティゲーション（J Clin Invest）４
４：１０３−１１６、スターン・ピー・エッチ（Stern
PH）ら、（１９７９）スケレタール・リサーチ（Skelet
al Research）：アン・エクスペリメンタル・アプロー
チ（An experimental Approach）、ニューヨーク：アカ
デミック・プレス、２１−５９およびボッタ・ビー・ジ
ェイ（Votta BJ）ら、（１９９４）ボーン（Bone）１
５：５３３−５３８）に記載されているように、胎児ラ
ット長骨（ＦＲＬＢ）における破骨細胞介在骨吸収を阻
害するその効能について試験した。

【０１２６】経時−妊娠の実験を行うために、スプレー
グ・ドーリ・ラット（タコニック・ファームズ（Taconi
c Farms）、ジャーマンタウン、ニューヨーク州）に、
妊娠の１８日目に２００μＣiの⁴⁵ＣaＣl₂を皮下注射
し、一夜収容し、ついでInnovar-Vet（ピットマン−モ
ーアー（Pittman-Moore）、マンデリン、イリノイ州）
で麻酔し、頸部転位により殺した。胎児を無菌状態で取
り出し、橈骨および尺骨を軟組織および軟骨が回りにな
いように切開した。１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン
含有のＢＧＪ_b培地（シグマ（Sigma））に該骨を１８〜
２４時間培養し、ついで新たな培地に移し、化合物４の
不在下または存在下でさらに４８時間培養した。該培地
に放出された⁴⁵カルシウムおよび骨中の全カルシウムを
液体シンチレーション分光測光法により測定した。デー
タを対応の対照の骨と比較して、処理した骨より放出さ
れた⁴⁵カルシウム％として表した。統計学的差異を、非
対サンプルに関する一方向性変数解析を用いて評価し
た。データを平均値±ｓ.ｅ.ｍ.（ｎ＝４）として表し
た。実験を２回繰り返した。

【０１２７】４−［４−（４−メチルベンゾイル）ベン
ゾイル］フェニルアセトアルデヒド（化合物４）は前記
アッセイにおいて１９μＭのＩＣ₅₀を示した。該データ
は骨吸収疾患の治療におけるｓｒｃ ＳＨ２ドメインア
ンタゴニストとしての治療効果を示す。

【０１２８】本発明の好ましい具体例を上に示したが、
本発明は本明細書に開示された正確な説明に限定されな
いこと、および、以下の請求の範囲の観点内から生じる
すべての修飾に対する権利を保有することが、理解され
るべきである。

【０１２９】

【配列表】

（１）一般的情報： （ｉ）出願人：ダンニントン・ダミアン （ｉｉ）発明の名称： 骨吸収疾患を治療するためのＳ
ＲＣ ＳＨ２特異的化合物の使用 （ｉｉｉ）配列の数：２６ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）名称：スミス・クライン・ビーチャム・コーポレ
ーション（SmithKline Beecham Corporation） （Ｂ）通り名：スウェーデランド・ロード・７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：１９４０６ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム（Comput
er Readable Form）： （Ａ）媒体形態：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ファストセク（FastSEQ）バージ
ョン１.５ （ｖｉ）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号：０８／３８６,３８１ （Ｂ）出願日：１９９５年２月１０日 （Ａ）出願番号：０８／４００,２２０ （Ｂ）出願日：１９９５年３月７日 （Ａ）出願番号：０８／４９７,３５７ （Ｂ）出願日：１９９５年６月３０日 （ｖｉｉｉ）代理人の情報： （Ａ）氏名：ダストマン、ウェイン・ジェイ（Dustman,
Wayne J） （Ｂ）登録番号：３３,８７０ （Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ５０３２３−２Ｈ
２ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−５０２３ （Ｂ）ファックス番号： （Ｃ）テレックス番号：

【０１３０】（２） 配列番号：１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｉｘ）特徴： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１：

【０１３１】（２） 配列番号：２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：６アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２：

【０１３２】（２） 配列番号：３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３：

【０１３３】（２） 配列番号：４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４：

【０１３４】（２） 配列番号：５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１３０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５：

【０１３５】 Met Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg His His His His 1 5 10 15 His His Gly Ile Leu Asp Asp Asp Asp Lys Ala Glu Glu Trp Tyr Phe 20 25 30 Gly Lys Ile Thr Arg Arg Glu Ser Glu Arg Leu Leu Leu Asn Ala Glu 35 40 45 Asn Pro Arg Gly Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Glu Thr Thr Lys Gly 50 55 60 Ala Tyr Cys Leu Ser Val Ser Asp Phe Asp Asn Ala Lys Gly Leu Asn 65 70 75 80 Val Lys His Tyr Lys Ile Arg Lys Leu Asp Ser Gly Gly Phe Tyr Ile 85 90 95 Thr Ser Arg Thr Gln Phe Asn Ser Leu Gln Gln Leu Val Ala Tyr Tyr 100 105 110 Ser Lys His Ala Asp Gly Leu Cys His Arg Leu Thr Thr Val Cys Pro 115 120 125 Thr Ser 130

【０１３６】（２） 配列番号：６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１３４アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：６：

【０１３７】 Met Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg His His His His 1 5 10 15 His His Gly Ile Leu Asp Asp Asp Asp Lys Glu Pro Glu Pro Trp Phe 20 25 30 Phe Lys Asn Leu Ser Arg Lys Asp Ala Glu Arg Gln Leu Leu Ala Pro 35 40 45 Gly Asn Thr His Gly Ser Phe Leu Ile Arg Glu Ser Glu Ser Thr Ala 50 55 60 Gly Ser Phe Ser Leu Ser Val Arg Asp Phe Asp Gln Asn Gln Gly Glu 65 70 75 80 Val Val Lys His Tyr Lys Ile Arg Asn Leu Asp Asn Gly Gly Phe Tyr 85 90 95 Ile Ser Pro Arg Ile Thr Phe Pro Gly Leu His Glu Leu Val Arg His 100 105 110 Tyr Thr Asn Ala Ser Asp Gly Leu Cys Thr Arg Leu Ser Arg Pro Cys 115 120 125 Gln Thr Gln Lys Pro Gln 130

【０１３８】（２） 配列番号：７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１３３アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：７：

【０１３９】 Met Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg His His His His 1 5 10 15 His His Gly Ile Leu Asp Asp Asp Asp Lys Ser Arg Gly Trp Phe His 20 25 30 Arg Asp Leu Ser Gly Leu Asp Ala Glu Thr Leu Leu Lys Gly Arg Gly 35 40 45 Val His Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser Arg Lys Asn Gln Gly Asp 50 55 60 Phe Ser Leu Ser Val Arg Val Gly Asp Gln Val Thr His Ile Arg Ile 65 70 75 80 Gln Asn Ser Gly Asp Phe Tyr Asp Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Phe Ala 85 90 95 Thr Leu Thr Glu Leu Val Glu Tyr Tyr Thr Gln Gln Gln Gly Val Leu 100 105 110 Gln Asp Arg Asp Gly Thr Ile Ile His Leu Lys Tyr Pro Leu Asn Cys 115 120 125 Ser Asp Pro Thr Ser 130

【０１４０】（２） 配列番号：８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２２４アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：８：

【０１４１】 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220

【０１４２】（２） 配列番号：９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２２５アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：９：

【０１４３】 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Ile Glu Gly 210 215 220 Arg 225

【０１４４】（２） 配列番号：１０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１７アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１０：

【０１４５】 Ser Ile Gln Ala Glu Glu Trp Tyr Phe Gly Lys Leu Gly Arg Lys Asp 1 5 10 15 Ala Glu Arg Gln Leu Leu Ser Phe Gly Asn Pro Arg Gly Thr Phe Leu 20 25 30 Ile Arg Glu Ser Glu Thr Thr Lys Gly Ala Tyr Ser Leu Ser Ile Arg 35 40 45 Asp Trp Asp Asp Met Lys Gly Asp His Val Lys His Tyr Lys Ile Arg 50 55 60 Lys Leu Asp Asn Gly Gly Tyr Tyr Ile Thr Thr Arg Ala Gln Phe Glu 65 70 75 80 Thr Leu Gln Gln Leu Val Gln His Tyr Ser Glu Arg Glu Arg Ala Ala 85 90 95 Gly Leu Cys Cys Arg Leu Val Val Pro Cys His Lys Gly Met Pro Arg 100 105 110 Leu Thr Asn Ser Ser 115

【０１４６】（２） 配列番号：１１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１２３アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１１：

【０１４７】 Gly Met Asn Asn Asn Met Ser Leu Gln Asn Ala Glu Trp Tyr Trp Gly 1 5 10 15 Asp Ile Ser Arg Glu Glu Val Asn Glu Lys Leu Arg Asp Thr Ala Asp 20 25 30 Gly Thr Phe Leu Val Arg Asp Ala Ser Thr Lys Met His Gly Asp Tyr 35 40 45 Thr Leu Thr Leu Arg Lys Gly Gly Asn Asn Lys Leu Ile Lys Ile Phe 50 55 60 His Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Ser Asp Pro Leu Thr Phe Ser Ser 65 70 75 80 Val Val Glu Leu Ile Asn His Tyr Arg Asn Glu Ser Leu Ala Gln Tyr 85 90 95 Asn Pro Lys Leu Asp Val Lys Leu Leu Tyr Pro Val Ser Lys Tyr Gln 100 105 110 Gln Asp Gln Val Val Lys Glu Asp Asn Ser Ser 115 120

【０１４８】（２） 配列番号：１２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１２アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１２：

【０１４９】 Met Thr Ser Arg Arg Trp Phe His Pro Asn Ile Thr Gly Val Glu Ala 1 5 10 15 Glu Asn Leu Leu Leu Thr Arg Gly Val Asp Gly Ser Phe Leu Ala Arg 20 25 30 Pro Ser Lys Ser Asn Pro Gly Asp Phe Thr Leu Ser Val Arg Arg Asn 35 40 45 Gly Ala Val Thr His Ile Lys Ile Gln Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Asp 50 55 60 Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Phe Ala Thr Leu Ala Glu Leu Val Gln Tyr 65 70 75 80 Tyr Met Glu His His Gly Gln Leu Lys Glu Lys Asn Gly Asp Val Ile 85 90 95 Glu Leu Lys Tyr Pro Leu Asn Cys Ala Asp Gln Phe Ile Val Thr Asp 100 105 110

【０１５０】（２） 配列番号：１３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１９アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｉｘ）特徴： （Ａ）特徴を表す記号：その他 （Ｂ）存在位置：４．．．４ （Ｃ）他の情報：リン酸化チロシン残基 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１３： Glu Pro Gln Tyr Glu Glu Ile Pro Ile Tyr Leu 1 5 10 15

【０１５１】（２） 配列番号：１４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１９アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｉｘ）特徴： （Ａ）特徴を表す記号：その他 （Ｂ）存在位置：４．．．４ （Ｃ）他の情報：リン酸化チロシン残基 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１４： Asp Gly Gly Tyr Met Asp Met Ser Lys Asp Glu 1 5 10 15

【０１５２】（２） 配列番号：１５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１９アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｉｘ）特徴： （Ａ）特徴を表す記号：その他 （Ｂ）存在位置：６．．．６ （Ｃ）他の情報：リン酸化チロシン残基 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１５： Glu Asn Gly Leu Asn Tyr Ile Asp Leu Asp Leu 1 5 10 15

【０１５３】（２） 配列番号：１６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２３アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｉｘ）特徴： （Ａ）特徴を表す記号：その他 （Ｂ）存在位置：７．．．７ （Ｃ）他の情報：リン酸化チロシン残基 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１６： Thr Pro Pro His Leu Lys Tyr Phe Tyr Phe Val Val Ser Asp Ser 1 5 10 15 Gly 20

【０１５４】（２） 配列番号：１７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：８７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型： （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１７： TTCCATATGA AAAGTATTCG TATTCAGCGT GGCCCGGGCC GTCACCACCA CCACCACCAC 60 GGGATCCCCG CTGAAGAGTG GTACTTT 87

【０１５５】（２） 配列番号：１８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型： （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１８： GGAATTCTAG ATTACTAGGA CGTGGGGCAG ACGTT 38

【０１５６】（２） 配列番号：１９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型： （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１９： CGGGATCCTG GACGACGACG ACAAAGCTGA GGAGTGGTAT TTT 46

【０１５７】（２） 配列番号：２０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型： （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２０： GGAATTCTAG ACTATTAGGA CGTGGGGCAC ACGGT 38

【０１５８】（２） 配列番号：２１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型： （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２１： CGGGATCCTG GACGACGACG ACAAAGAGCC CGAACCCTGG TTCTT 48

【０１５９】（２） 配列番号：２２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型： （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２２： GCTCTAGACT ATTACTGGGG CTTCTGGGTC TG 35

【０１６０】（２） 配列番号：２３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型： （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２３： GAAGATCTTG GACGACGACG ACAAATCCCG TGGGTGGTTT CAC 46

【０１６１】（２） 配列番号：２４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型： （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２４： GCTCTAGACT ATTAACTAGT GGGATCGGAG CA 35

【０１６２】（２） 配列番号：２５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０６アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２５：

【０１６３】 His Pro Trp Phe Phe Gly Lys Ile Pro Arg Ala Lys Ala Glu Glu Met 1 5 10 15 Leu Ser Lys Gln Arg His Asp Gly Ala Phe Leu Ile Arg Glu Ser Glu 20 25 30 Ser Ala Pro Gly Asp Phe Ser Leu Ser Val Lys Phe Gly Asn Asp Val 35 40 45 Gln His Phe Lys Val Leu Arg Asp Gly Ala Gly Lys Tyr Phe Leu Trp 50 55 60 Val Val Lys Phe Asn Ser Leu Asn Glu Leu Val Asp Tyr His Arg Ser 65 70 75 80 Thr Ser Val Ser Arg Asn Gln Gln Ile Phe Leu Arg Asp Ile Glu Gln 85 90 95 Val Pro Gln Gln Pro Thr Ile His Arg Asp 100 105

【０１６４】（２） 配列番号：２６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）断片型：内部 （ｖｉ）直接の起源： （ｉｘ）特徴： （Ａ）特徴を表す記号：その他 （Ｂ）存在位置：６．．．６ （Ｃ）他の情報：リン酸化チロシン残基 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２６：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 31/435 Ａ６１Ｋ 31/435 31/50 ＡＢＪ 31/50 ＡＢＪ 31/545 ＡＤＤ 31/545 ＡＤＤ Ｃ０７Ｄ 207/08 Ｃ０７Ｄ 207/08 237/14 237/14 495/14 495/14 Ｄ 495/22 495/22 // Ｃ０７Ｃ 49/86 9049−4Ｈ Ｃ０７Ｃ 49/86 237/42 9547−4Ｈ 237/42 Ｃ０７Ｄ 501/36 １０３ 9164−4Ｃ Ｃ０７Ｄ 501/36 １０３ (31)優先権主張番号 ５４１０８０ (32)優先日 1995年10月11日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ５８０８６８ (32)優先日 1995年12月29日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一の対象における骨吸収疾患の治療に
   て用いるための医薬組成物であって、 ａ．ヒトｌｃｋ ＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎ ＳＨ
   ２ドメインに結合する結合親和性より５０倍以上高い結
   合親和性でヒトｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合し； ｂ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の５０分の１以下の結合親和性でヒトｈｃｐ ＳＨ２
   ドメインに結合し； ｃ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の５０分の１以下の結合親和性でヒトＳＨ−ＰＴＰ２
   ＳＨ２ドメインに結合し； ｄ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の５０分の１以下の結合親和性でヒトｐ８５ ＳＨ２
   ドメインに結合し；および ｅ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の５０分の１以下の結合親和性でヒトＧｒｂ２ ＳＨ
   ２ドメインに結合する化合物からなる医薬組成物。
2. 【請求項２】 投与される化合物が、ヒトｌｃｋ Ｓ
   Ｈ２ドメインおよびヒトｆｙｎ ＳＨ２ドメインに結合
   する結合親和性より５０倍以上高い結合親和性でヒトｓ
   ｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する請求項１記載の組成
   物。
3. 【請求項３】 投与される化合物が、 ａ．ヒトｌｃｋ ＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎ ＳＨ
   ２ドメインに結合する結合親和性より１００倍以上高い
   結合親和性でヒトｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合し； ｂ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の１００分の１以下の結合親和性でヒトｈｃｐ ＳＨ
   ２ドメインに結合し； ｃ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の１００分の１以下の結合親和性でヒトＳＨ−ＰＴＰ
   ２ ＳＨ２ドメインに結合し； ｄ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の１００分の１以下の結合親和性でヒトｐ８５ ＳＨ
   ２ドメインに結合し；および ｅ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の１００分の１以下の結合親和性でヒトＧｒｂ２ Ｓ
   Ｈ２ドメインに結合する請求項１記載の組成物。
4. 【請求項４】 投与される化合物が、ヒトｌｃｋ Ｓ
   Ｈ２ドメインおよびヒトｆｙｎ ＳＨ２ドメインに結合
   する結合親和性より１００倍以上高い結合親和性でヒト
   ｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する請求項３記載の組成
   物。
5. 【請求項５】 一の対象における骨粗鬆症の治療にて
   用いるための医薬組成物であって、 ａ．ヒトｌｃｋ ＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎ ＳＨ
   ２ドメインに結合する結合親和性より５０倍以上高い結
   合親和性でヒトｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合し； ｂ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の５０分の１以下の結合親和性でヒトｈｃｐ ＳＨ２
   ドメインに結合し； ｃ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の５０分の１以下の結合親和性でヒトＳＨ−ＰＴＰ２
   ＳＨ２ドメインに結合し； ｄ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の５０分の１以下の結合親和性でヒトｐ８５ ＳＨ２
   ドメインに結合し；および ｅ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の５０分の１以下の結合親和性でヒトＧｒｂ２ ＳＨ
   ２ドメインに結合する化合物からなる医薬組成物。
6. 【請求項６】 投与される化合物が、ヒトｌｃｋ Ｓ
   Ｈ２ドメインおよびヒトｆｙｎ ＳＨ２ドメインに結合
   する結合親和性より５０倍以上高い結合親和性でヒトｓ
   ｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する請求項５記載の組成
   物。
7. 【請求項７】 投与される化合物が、 ａ．ヒトｌｃｋ ＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎ ＳＨ
   ２ドメインに結合する結合親和性より１００倍以上高い
   結合親和性でヒトｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合し； ｂ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の１００分の１以下の結合親和性でヒトｈｃｐ ＳＨ
   ２ドメインに結合し； ｃ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の１００分の１以下の結合親和性でヒトＳＨ−ＰＴＰ
   ２ ＳＨ２ドメインに結合し； ｄ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の１００分の１以下の結合親和性でヒトｐ８５ ＳＨ
   ２ドメインに結合し；および ｅ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の１００分の１以下の結合親和性でヒトＧｒｂ２ Ｓ
   Ｈ２ドメインに結合する請求項５記載の組成物。
8. 【請求項８】 投与される化合物が、ヒトｌｃｋ Ｓ
   Ｈ２ドメインおよびヒトｆｙｎ ＳＨ２ドメインに結合
   する結合親和性より１００倍以上高い結合親和性でヒト
   ｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する請求項７記載の組成
   物。
9. 【請求項９】 一の対象における破骨細胞の機能の阻
   害にて用いるための医薬組成物であって、 ａ．ヒトｌｃｋ ＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎ ＳＨ
   ２ドメインに結合する結合親和性より５０倍以上高い結
   合親和性でヒトｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合し； ｂ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の５０分の１以下の結合親和性でヒトｈｃｐ ＳＨ２
   ドメインに結合し； ｃ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の５０分の１以下の結合親和性でヒトＳＨ−ＰＴＰ２
   ＳＨ２ドメインに結合し； ｄ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の５０分の１以下の結合親和性でヒトｐ８５ ＳＨ２
   ドメインに結合し；および ｅ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
   性の５０分の１以下の結合親和性でヒトＧｒｂ２ ＳＨ
   ２ドメインに結合する化合物からなる医薬組成物。
10. 【請求項１０】 投与される化合物が、ヒトｌｃｋ
    ＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎ ＳＨ２ドメインに結
    合する結合親和性より５０倍以上高い結合親和性でヒト
    ｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する請求項９記載の組成
    物。
11. 【請求項１１】 投与される化合物が、 ａ．ヒトｌｃｋ ＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎ ＳＨ
    ２ドメインに結合する結合親和性より１００倍以上高い
    結合親和性でヒトｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合し； ｂ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
    性の１００分の１以下の結合親和性でヒトｈｃｐ ＳＨ
    ２ドメインに結合し； ｃ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
    性の１００分の１以下の結合親和性でヒトＳＨ−ＰＴＰ
    ２ ＳＨ２ドメインに結合し； ｄ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
    性の１００分の１以下の結合親和性でヒトｐ８５ ＳＨ
    ２ドメインに結合し；および ｅ．かかるｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する結合親和
    性の１００分の１以下の結合親和性でヒトＧｒｂ２ Ｓ
    Ｈ２ドメインに結合する請求項９記載の組成物。
12. 【請求項１２】 投与される化合物が、ヒトｌｃｋ
    ＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎ ＳＨ２ドメインに結
    合する結合親和性より１００倍以上高い結合親和性でヒ
    トｓｒｃ ＳＨ２ドメインに結合する請求項１１記載の
    組成物。