JP2001514662A

JP2001514662A - ヒトｓｒｃＳＨ２ドメインの拮抗方法

Info

Publication number: JP2001514662A
Application number: JP53972698A
Authority: JP
Inventors: ホルト，デニス・エイ; ベバー，ダニエル・エフ; ヤマシタ，デニス・エス
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1997-03-10
Filing date: 1998-03-10
Publication date: 2001-09-11
Also published as: CA2283472A1; EP1007076A1; EP1007076A4; WO1998040093A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、src SH2ドメインのcys185への共有結合または連結を形成する化合物の治療有効量を対象に投与する工程を包含する、対象における骨吸収疾患を処置する方法である。ここで用いる好ましい化合物は、以下の式（Ｉ）の本発明の化合物： X＝OR"、SR"、NR"R"'；R"＝H、メチル、アルキル；R"'＝CONH₂、CONHMe、CONHアルキル、SONH₂、SONHMe、SONHアルキル、SO₂NH₂、SO₂NHMe、SO₂NHアルキル；n＝０、１、２；R＝H、CH₂CH(NHCOR"")CONHR""'、有機部分；R""＝glu-glu-ileu-glu-NH₂、ペプチド、ペプチド模倣物、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール；R'＝H、ペプチド模倣物；またはR、R'＝Hもしくはペプチド模倣物で置換された縮合環系；またはその医薬上許容される塩、溶媒和物の水和物である。本発明はまた、適切な医薬担体および式Ｉの化合物を含む医薬組成物である。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトｓｒｃＳＨ２ドメインの拮抗方法発明の背景哺乳動物の骨は、絶え間なく骨再造成を受けている。骨再造成は、骨吸収および骨形成の動的プロセスである。これらのプロセスは、特殊化された細胞型によって媒介される：骨形成は骨芽細胞により石灰化された骨の堆積の結果であり、そして骨吸収は破骨細胞による骨基質の分解の結果である。多くの骨疾患は、骨吸収に比較しての骨形成の不均衡によってもたらされる。例えば、骨粗鬆症およびパジェット病のような疾患は、骨基質の正味の損失によって特徴付けられる。従って、骨吸収を阻害する薬剤は、そのような疾患の処置のために有用である。活性化された破骨細胞は、骨基質に付着し、そして、その細胞膜と骨基質との間に形成される密封された区画中に、タンパク質分解酵素、有機酸、およびプロトンを分泌することによって、骨を吸収する。酸性環境およびタンパク質分解酵素は、密封された区画において骨の分解をもたらして、骨表面に小窩または骨小孔をつける。これは破骨細胞が骨から剥離すると、明らかになる。多数のポリペプチド増殖因子およびホルモンは、シグナル伝達経路を介してそれらの細胞性作用を媒介する。これらのリガンドに対する細胞表面受容体から細胞内エフェクターへのシグナルの伝達には、調節性タンパク質チロシンキナーゼ（PTK）およびホスファターゼによる特異的タンパク質基質のリン酸化または脱リン酸が頻繁に関与する。チロシンリン酸化は、多細胞生物におけるシグナル伝達の主な、またはことによると唯一の指標であり得る。受容体結合PTKおよび細胞内PTKは、免疫系細胞において細胞増殖、細胞分化、およびシグナリングプロセスを調節する。異常なタンパク質チロシンキナーゼ活性は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、乾癬、敗血症性ショック、骨損失、貧血、多くのガンおよびその他の増殖性疾患のような多数の病状と関連しているかまたはそれらの疑いがある。従って、チロシンキナーゼおよびそれらがその一部であるシグナル伝達経路は、ドラッグデザインの潜在的な標的である。総説については、Levitzkiら、Science 267，1782- 1788(1995)を参照のこと。シグナル伝達経路を構成するタンパク質の多くは、低レベルで存在し、そしてしばしば反対の活性を有する。これらのシグナリング分子の特性は、エフェクターの細胞配置および並置によって、ならびに１つの経路における小さな変化が作用の切換えを達成し得るように活性化を抑制と平衡化させることによって、細胞が伝達を制御することを可能にする。タンパク質−タンパク質相互作用を介するシグナリング分子の並置による伝達複合体の形成は、特異的ドッキングドメイン配列モチーフによって媒介される。 src相同２（SH2）ドメインは、非受容体PTKおよびキナーゼ標的エフェクター分子のような種々のシグナリング分子、ならびに腫瘍形成性タンパク質において見出される約100アミノ酸の保存された非触媒性配列であり、重要な役割を担う。S H2ドメインは、自己リン酸化PTK受容体または細胞内チロシンキナーゼにおいて見出される短いホスホチロシン含有ペプチド配列に対して高度に特異的である。異なる触媒性のまたはその他の機能性のドメインを有し、しかも、約100アミノ酸の保存された配列である保存されたSH2ドメインを共有する約60のタンパク質が同定されている。どの身体中の生理学的応答がこれらのSH2ドメインの各々によって制御されるかは正確には知られていない。さらに、SH2ドメイン−リガンド／化合物相互作用は高度に特異的であり、その結果、リガンド／化合物の構造における微少な改変は、リガンド／化合物が種々のSH2ドメインに結合する選択性を有意に変化させる。 SH2ドメインの非選択的拮抗作用の結果は非常に厳密であり得る。例えば、src SH2ドメイン、lck SH2ドメインおよびfyn SH2ドメインは構造的に類似し、ドメイン間での高度の保存性を保持しているが、src SH2ドメインの拮抗作用は骨吸収をもたらすとして本明細書において示しており、一方lck SH2ドメインまたはf yn SH2ドメインの拮抗作用は免疫抑制を誘発する。免疫抑制の誘発は、骨吸収疾患のための長期治療においては所望されない。 src SH2ドメインを拮抗することによって骨吸収疾患の処置を可能にする方法および化合物を提供することが所望される。ヒトsrc SH2ドメインを拮抗する改善された方法を、本明細書中に開示する。発明の要旨本発明は、src SH2ドメインのcys185への共有結合または連結を形成する化合物の治療有効量を治療対象に投与する工程を包含する、治療対象における骨吸収疾患を処置する方法を提供する。本発明はまた、src SH2ドメインのcys185への共有結合または連結を形成する化合物の治療有効量を治療対象に投与する工程を包含する、治療対象における骨粗鬆症を処置する方法を提供する。本発明はまた、src SH2ドメインのcys185への共有結合または連結を形成する化合物の破骨細胞機能阻害量を対象に投与する工程を包含する、対象における破骨細胞の機能を損なわせる方法を提供する。本発明はまた、ヒトsrc SH2ドメインを拮抗することにおいて有用である化合物およびこの化合物の医薬組成物を提供する。発明の詳細な説明本明細書において使用する場合、用語「骨吸収疾患」は、破骨活性に起因する異常な骨損失によって特徴付けられるいずれもの障害、好ましくは骨粗鬆症を意味する。本明細書において使用する場合、用語「処置」およびその派生語は、予防的治療または治療的治療を意味する。本明細書において使用する場合、用語「化合物」は、ペプチドまたは化学的化合物を意味する。本明細書において使用する場合、他に定義しない限り、用語「ペプチド模倣物」は、J ．Med．Chem. 1993，36，3039-3049において定義されるとおりである。本明細書において使用する場合、他に定義しない限り、用語「src SH2ドメイン拮抗剤」は、src SH2ドメインのcys185への共有結合または連結を形成し得る化合物を意味する。本明細書において使用する場合、用語「src SH2ドメインのcys185」は、Natur e 1997，385，595-602において記載されるような従来の番号付けに従うsrc遺伝子の185位におけるシステインをいう。本明細書において使用する全てのsrc 遺伝子番号付け参照は、Nature 1997，385，595-602において記載されるような従来の番号付けに従う。本発明は、src SH2ドメインのcys185への共有結合または連結を形成する化合物の治療有効量を治療対象に投与する工程を包含する、治療対象における骨吸収疾患を処置する方法を提供する。本発明はまた、src SH2ドメインのcys185への共有結合または連結を形成する化合物の治療有効量を治療対象に投与する工程を包含する、治療対象における骨粗鬆症を処置する方法を提供する。本発明はまた、src SH2ドメインのcys185への共有結合または連結を形成する化合物の破骨細胞機能阻害量を対象に投与する工程を包含する、対象における破骨細胞の機能を損なわせる方法を提供する。非受容体チロシンキナーゼsrcは、破骨細胞による骨の吸収のために必須である。srcのsrc相同２（SH2）ドメインは、ホスホチロシンを含む短いペプチドモチーフへの結合を介する他のシグナリング分子との会合を制御する。これらの相互作用の阻害は、srcの受容体−エフェクター複合体へのリクルートメント（rec ruitment）を防止することによって、src媒介性シグナル伝達をブロックする。ヒトsrc SH2ドメインにおいて、システイン185（cys185）は、ヒスチジン201、a rg155、arg175、およびlys203の付近の、ホスホチロシン結合ポケット中に位置する。cys185への共有結合または連結を形成する化合物は、ヒトsrc SH2のホスホチロシン結合ポケットをブロックし、それによって、ヒトsrc SH2を不可逆的に阻害する。本発明の好ましい態様において、cys185への共有結合または連結を形成する化合物はまた、arg175と水素結合を形成し、そして1ys203の側鎖部分との疎水性相互作用を有する。本発明において使用されるヒトsrc SH2ドメイン構築物は、配列番号５に記載される。配列番号５は、src遺伝子の一部を使用する。参考として、cys185は配列番号５におけるcys67に対応し、his201は配列番号５におけるhis83に対応し、 arg155は配列番号５におけるarg37に対応し、arg175は配列番号５におけるarg57 に対応し、そしてlys203は配列番号５におけるlys85に対応する。 src SH2ドメインのcys185への共有結合または連結を形成する、本発明の現在好ましい化合物は、以下の式（Ｉ）： X＝OR"、SR"、NR"R"'； R"＝H、メチル、アルキル； R"'＝CONH₂、CONHMe、CONHアルキル、SONH₂、SONHMe、SONHアルキル、SO₂NH₂、S O₂NHMe、SO₂NHアルキル； n＝０、１、２； R＝H、CH₂CH(NHCOR"")CONHR""'、有機部分； R""＝glu-glu-ileu-glu-NH₂、ペプチド、ペプチド模倣物、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール； R'＝H、ペプチド模倣物；または R、R'＝Hもしくはペプチド模倣物で置換された縮合環系、を有するか、またはその医薬上許容される塩、溶媒和物の水和物である。式Ｉの化合物は、本発明の医薬化合物中に含まれ、そして本発明の方法において使用される。スキーム１スキーム１は、(S)-α-(アセチルアミノ)-1,3-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-1-オキソ-5-イソベンゾフランプロパンアミド-グルタメート-グルタメート-イソロイシン-グルタメート-アミン（化合物１）の形成を表す。N-アセチルチロシンエチルエステルを、TFA、AcOH中ヘキサメチレンテトラミン（メテナミン）でホルミル化した（J．Ind．Che．1987，26B，7071）。次いで、このアルデヒドを１，３− ジチアンとして保護し（Tet．Lett．1983，24，1289）、次いでこのフェノールを、N-フェニルトリフルオロメタンスルホンイミドを使用してトリフラート化した。パラジウム触媒ヒドロキシ−カルボニル化、続く2,3,6-トリクロロベンゾイルクロリドを使用するエステル化により、保護されたジエステルを得た。MeOH中水酸化ナトリウムでのエチルエステルの選択的加水分解により、所望されるアミノ酸アナログを得た。これを、標準的なカップリング化学反応（HBTU(2-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、N-メチルモルホリン、DMF）を使用して、固定化ペプチドにカップリングした。t-ブチルエステル保護基の同時脱保護と共に樹脂から切断し、ついでアルデヒドの最終的な脱保護により、インビトロにおける試験のための標的化合物を得た。式Ｉの化合物は、スキーム１に記載の方法に類似の方法によって調製される。以下の実施例２において詳細にさらに記載するように、異なるヒトSH2ドメインにおける化合物の阻害活性を、E．coli中で融合タンパク質として発現させたS H2ドメインを使用して、インビトロにおいて測定した。添付の表１に示すデータは、src SH2ドメイン拮抗剤が、胎児ラット長骨（FRL B）アッセイにおいて有意な効力を有することを示す。このインビトロ活性は、当該分野において、インビボにおいて骨吸収疾患を処置することにおける効力と相関すると認識されている。このインビトロ活性はまた、当該分野において、インビボにおいて破骨細胞の機能を損なうことにおける効力と相関すると認識されている。それゆえ、本発明は、骨吸収疾患を処置する方法を提供し、この方法は、本明細書において定義されるsrc SH2ドメイン拮抗剤の一定量を、骨吸収を阻害するために有効な量で投与する工程を包含する。薬物は、骨吸収疾患に罹患した、または骨吸収疾患にかかる危険性のある患者に、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、経口、皮下、皮内、および非経口を含むいずれかの従来の投与経路によって投与され得る。骨吸収を阻害するために有効な量は、対象の体重の１kg当たり約0.001mgから１kg当たり約10.0mgである。選択される用量は、対象の体重の１kg当たり約0.001mgから１kg当たり約10.0mgより選択される、有効な、非毒性の量となる。選択される用量は、毎日約１〜６回投与される。本発明において開示される骨吸収疾患を処置する方法はまた、本明細書において定義されるsrc SH2ドメイン拮抗剤および医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物を使用して実施され得る。組成物は、0.05mgと500mgとの間のsrc SH2ドメイン拮抗剤を含み得、そして選択される投与様式のために適切ないずれかの形態に構成され得る。経口投与のために適切な組成物としては、丸剤、カプセル、顆粒、錠剤および粉末のような固体形態、ならびに溶液、シロップ、エリキシル剤および懸濁剤のような液体形態が挙げられる。非経口投与のために有用な形態としては、無菌溶液、乳剤および懸濁剤が挙げられる。本発明はさらに、破骨細胞の機能を損なわせる方法を提供し、この方法は、本明細書において定義されるsrc SH2ドメイン拮抗剤の一定量を、骨吸収を阻害するために有効な量で投与する工程を包含する。薬物は、骨吸収疾患に罹患した、または骨吸収疾患にかかる危険性のある患者に、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、経口、皮下、皮内、および非経口を含むがいずれかの従来の投与経路によって投与され得る。破骨細胞機能を損なわせるために有効な量は、対象の体重１kg当たり約0.001mgから１kg当たり約10.0mgである。選択される用量は、対象の体重１kg当たり約0.001mgから１kg当たり約10.0mgより選択される、有効な、非毒性の量となる。選択される用量は、毎日約１〜６回投与される。本発明において開示される破骨細胞の機能を損なわせる方法はまた、本明細書において定義されるsrc SH2ドメイン拮抗剤および医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物を使用して実施され得る。組成物は、0.05mgと500mgとの間のsrc S H2ドメイン拮抗剤を含み得、そして選択される投与の様式のために適切ないずれかの形態に構成され得る。経口投与のために適切な組成物としては、丸剤、カプセル、顆粒、錠剤および粉末のような固体形態、ならびに溶液、シロップ、エリキシル剤および懸濁剤のような液体形態が挙げられる。非経口投与のために有用な形態としては、無菌溶液、乳剤および懸濁剤が挙げられる。また、薬剤は、滅菌水、生理食塩水、またはその他の適切な滅菌注射用媒質を使用して投与の時に溶解または懸濁され得る滅菌固体組成物として調製され得る。担体には、必要なそして不活性な結合剤、懸濁剤、潤滑剤、香料、甘味料、保存薬、色素およびコーティング包含される。投与されるべき最適の投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして使用される特定のsrc SH2ドメイン拮抗剤、製剤の強度、投与の様式、および病状の進行によって変動する。処置される個々の患者に依存する患者の年齢、体重、食事、および投与の時間を含むさらなる因子は、投薬量を調整する必要を生じさせる。本発明はまた、骨吸収疾患の処置における使用のための医薬の製造におけるsr c SH2ドメイン拮抗剤の使用を提供する。本発明はまた、骨粗鬆症の処置における使用のための医薬の製造におけるsrc SH2ドメイン拮抗剤の使用を提供する。本発明はまた、破骨細胞機能の阻害における使用のための医薬の製造における src SH2ドメイン拮抗剤の使用を提供する。本発明はまた、src SH2ドメイン拮抗剤を含む、骨吸収疾患の処置における使用のための医薬組成物を提供する。本発明はまた、src SH2ドメイン拮抗剤を含む、骨粗鬆症の処置における使用のための医薬組成物を提供する。本発明はまた、src SH2ドメイン拮抗剤を含む、破骨細胞機能の阻害における使用のための医薬組成物を提供する。本発明の方法が本発明に従って利用される場合、いかなる許容されない毒物学的効果も予想されない。さらなる推敲なしに、当業者は、以上の記載を使用して、本発明をその最も完全な程度に利用し得ると考えられる。それゆえ、以下の実施例は、単に例示であり、いかにしても本発明の範囲の限定するものではないと解釈されるべきである。実験の詳細実施例１ (S)- α-(アセチルアミノ)1,3-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-1-オキソ-5-イソベンゾフランプロパンアミド-グルタメート-グルタメート-イソロイシン-グルタメート- アミン（化合物１）の調製 a）N-アセチル-3-ホルミル-チロシンエチルエステルヘキサメチレンテトラアミン（Aldrich、25g、178mmol）を、TFA（30ml）およびAcOH（30ml）中のN-アセチルチロシンエチルエステル１水和物（Aldrich、10g 、37.1mmol）の溶液に添加し、そして反応液を4.5時間80℃に加熱した。反応液を室温に冷却し、次いでH₂O（200ml）を添加し、反応混合液をEtOAcで抽出した（３×200ml）。合した有機物を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、クロマトグラフィーに付して（シリカゲル、５％MeOH/CH₂Cl₂）、表題の化合物を白色固体として得た（4.5g、46％収率）：MS ES M+H⁺＝280。 b）N-アセチル-3-(1,3-ジチアン)-チロシンエチルエステル TiCl₄の溶液（Aldrich、1.0M、1.4ml、1.4mmol）を、０℃のCH₂Cl₂（7.0ml）中の1.3-プロパンジチオール（148mg、1.4mmol）およびN-アセチル-3-ホルミル- チロシンエチルエステル（400mg、1.4mmol）の溶液に滴下した。反応液を２時間撹拌し、次いで飽和NaHCO₃水溶液（10ml）を添加し、反応混合液をEtOAcで抽出した（３×200ml）。合した有機物を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、クロマトグラフィーに付して（シリカゲル、５％MeOH/CH₂Cl₂）、表題の化合物を白色固体として得た（420mg、81％収率）；MS ES M+H⁺＝370、M+ Na⁺＝392。 c）N-アセチル-3-(1,3-ジチアン)-4-トリフリル-フェニルアラニンエチルエステル N-フェニルトリフルオロメタンスルホンイミド（Aldrich、1.0g、2.8mmol）を、室温のCH₂Cl₂（9.0ml）中のN-アセチル-3-(1,3-ジチアン)-チロシンエチルエステル（1.0g、2.7mmol）およびトリエチルアミン（0.41ml、3.0mmol）の溶液に添加し、反応液を一晩撹拌した。反応液をH₂O（20ml）で希釈し、次いで反応混合液をEtOAcで抽出した（３×20ml）。合した有機物を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、クロマトグラフィーに付して（シリカゲル、５％MeOH/CH₂Cl₂）、表題の化合物をベージュ色固体として得た（1.14g、84 ％収率）：MS ES M+H⁺＝502、M+HCO₂ ^-＝546。 d）N-アセチル-3-(1,3-ジチアン)-4-カルボキシ-フェニルアラニンエチルエステル酢酸パラジウム(II)（11mg、0.215mmol）を、DMSO（10.0ml）中のN-アセチル- 3-(1,3-ジチアン)-4-トリフリル-フェニルアラニンエチルエステル（540mg）1.0 7mmol）、1,1'=ビス-(ジフェニルホスフィノ)フェロセン（Aldrich、119mg、0.2 15mmol）、酢酸カリウム（409mg、4.31mmol）の混合物に添加した。反応混合液を80℃に加熱し、次いで一酸化炭素を溶液を通して10分間通気した。次いで、反応液を一晩一酸化炭素のバルーン下で撹拌した。反応液を室温に冷却し、H₂O（3 0ml）で希釈し、EtOAcで抽出した（４×30ml）。次いで、合した有機物を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、そしてクロマトグラフィーに付して（シリカゲル、５％MeOH/CH₂Cl₂）、表題の化合物を白色固体として得た（3 20mg、76％収率）：MS ES M+H⁺＝398、M-H^-＝396。 e）N-アセチル-3-(1,3-ジチアン)-4-(t-ブチル-カルボキシレート)-フェニルアラニンエチルエステル 2,4,6-トリクロロベンゾイルクロリド（Aldrich、0.165ml、1.1mmol）を、THF （5.3ml）中のN-アセチル-3-(1,3-ジチアン)-4-カルボキシ-フェニルアラニンエチルエステル（420mg、1.1mmol）、トリエチルアミン（0.295ml、2.1mmol）の溶液に添加し、反応液を0.25時間撹拌した。次いで、t-ブタノール（0.2ml、2.1mm ol）、続いて4-ジメチルアミノピリジン（DMAP）（258mg、2.11mmol）を添加し、反応液を一晩撹拌した。反応混合液をクロマトグラフィーカラムに付して（シリカゲル、５％MeOH/CH₂Cl₂）、表題の化合物を白色固体として得た（250mg、55 ％収率）：MS ES M+H⁺＝454。 f）N-アセチル-3-(1,3-ジチアン)-4-(t-ブチル-カルボキシレート)-フェニルアラニン水酸化ナトリウム水溶液（Aldrich、1.0N、0.55ml、0.55mmol）を、MeOH（1.5 ml）中のN-アセチル-3-(1,3−ジチアン)-4-(t-ブチル-カルボキシレート)-フェニルアラニンエチルエステル（250mg、0.55mmol）の溶液に添加し、反応液を一晩撹拌した。次いで、反応混合液をAcOH（1.0ml）およびH₂O（10ml）で希釈し、反応混合液をEtOAcで抽出した（４×30ml）。次いで、合わせた有機物を硫酸マグネシウムを用いて乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、クロマトグラフィーに付して（シリカゲル、５％MeOH/CH₂Cl₂）、表題の化合物を白色固体として得た（1 20mg、51％収率）：MS ES M+H⁺＝426、M+NH₄＝443、M-H^-=424。 g）γ-t-ブチルーグルタメート-γ-y-t-ブチル-グルタメート-イソロイシン-γ- t-ブチル-グルタメート-Rink樹脂表題のペプチドを、標準的な固相化学により、Symphony Multiple Peptide Sy nthesizer（Rainin）上で、標準的なFMOC保護アミノ酸（２×1.5時間、６当量、 DMF中HBTU(2-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）/N-メチルモルホリンのカップリング条件を使用）および20％ピペリジン/DMFの脱保護条件（10分間）を使用して、Rink Amide樹脂（Nova、0.3mmol/g、PS/１％DVB、100〜200メッシュ、H．Rink Tet．Lett．19 87，28，3787）を用いて開始して調製した h）N-アセチル-3-(1,3-ジチアン)-4-(t-ブチル-カルボキシレート)-フェニルアラニン-γ-t-ブチル-グルタメート-γ-t-ブチル-グルタメート-イソロイシン-γ -t-ブチル-グルタメート-Rink樹脂 HBTU(2-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）（61mg、0.16mmol）を、DMF（5.0ml）中のN-アセチル -3-(1,3-ジチアン)-4-(t-ブチル-カルボキシレート)-フェニルアラニン（68mg、 0.16mmol）、γ-t-ブチル-グルタメート-γ-t-ブチル-グルタメート-イソロイシン-γ-t-ブチル-グルタメート-Rink樹脂（200mg、0.08mmol）、N-メチルモルホリン（0.023ml、0.24mmol）のスラリーに添加し、室温で48時間振とうした。反応混合物を濾過し、DMF（300ml）、次いでCH₂Cl₂（300ml）で洗浄し、減圧下で一晩乾燥した。樹脂は定量的カップリングと一致してKaiserニンヒドリン陰性と試験され、表題の化合物を得た。 i）N-アセチル-3-(1,3-ジチアン)-4-(t-ブチル-カルボキシレート)-フェニルアラニン-グルタメート-グルタメート-イソロイシン-グルタメート-アミン N-アセチル-3-(1,3-ジチアン)-4-(t-ブチル-カルボキシレート)-フェニルアラニン-γ-t-ブチル-グルタメート-γ-t-ブチル-グルタメートイソロイシン-γ-t- ブチル-グルタメート-Rink樹脂（100mg、0.04mmol）を、95％TFA/H₂Oの溶液に添加し、４時間室温で振とうした。反応混合液を濾過し、100mlの冷エタノールで希釈し、沈殿を採集し、AcOH（５ml）中に溶解し、-78℃に凍結し、そして凍結乾燥して、表題の化合物を白色の綿毛状の固体として得た：MS ES M+H⁺＝869、M -H^-＝867。 j）(S)-α-(アセチルアミノ)-1,3-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-1-オキソ-5-イソベンゾフランプロパンアミド-グルタメート-グルタメート-イソロイシン-グルタメート-アミン N-アセチル-3-(1,3-ジチアン)-4-(t-ブチル-カルボキシレート)-フェニルアラニン-グルタメート-グルタメート-イソロイシン-グルタメート-アミン（５mg、0 .006mmol）を、90％アセトン/H₂O（0.3ml）中に溶解し、次いでN-クロロスクシンイミド（５mg、0.037mmol）および過塩素酸銀（10mg、0.048mmol）を添加し、そして反応液を10分間室温で撹拌した。反応混合液をクロマトグラフィーにかけ（C₁₈逆相シリカ、MeCN、H₂O）、そしてUV活性画分を合わせ、減圧下で濃縮し、そしてMeOH（0.2ml）中に溶解した。冷エタノールを添加し、沈殿を採集し、エーテルで洗浄し、AcOH中に溶解し、-78℃に凍結し、凍結乾燥して、白色の綿毛状の固体を生じた（３mg、64％収率）：MS ES M+H⁺＝M+Na⁺＝801、M-H^-＝777。実施例２−src SH2ドメイン拮抗剤の効力の測定用のプロトコルヒトsrc SH2ドメインにおける化合物の阻害活性を、E．coliにおいて融合タンパク質として発現させたヒトsrc SH2ドメインを使用して、インビトロにおいて測定した。ヒトSH2ドメインを含む融合タンパク質を、一般配列：DET1-DET2-スペーサー- ek-SH2として発現させた。ここで、DET1、DET2、スペーサー、ek、およびSH2は下記のとおりである。DET1（「規定エピトープタグ１」）（配列番号１）は、ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV-1）エンベロープタンパク質gp120（またはgp160 ）において見出される11アミノ酸の配列である。HIV-1 gp120（またはgp160）の種々のエピトープに対するモノクローナル抗体が当該分野において公知である。例えば、米国特許第5,166,050号を参照のこと。１つの好ましい例は、モノクローナル抗体178.1であり（例えば、Thiriartら、J ．Immunol.，143:1832-1836(19 89)を参照のこと）、これはBH10株由来の酵母発現HIV-1gp160分子でのマウスの免疫によって調製された（Ratnerら、Nature，313:277-284(1985)）。このタグを、発現の検出（ウエスタンブロットによる）用、タンパク質の精製（アフィニティークロマトグラフィーによる）用および融合タンパク質を１７８．１抗体を使用して捕獲または固定化する配置アッセイ（configuring assay）用に使用した。DET2は、ニッケル含有樹脂に結合するヘキサヒスチジン配列タグ（配列番号２）であり、そしてこれを精製目的のために使用した。スペーサー（配列番号３）を、構築物の示す位置におけるBamHI制限部位を設計するために利用した。用語-ek-は、エンテロキナーゼプロテアーゼのための認識配列（配列番号４）をいい、これはSH2ドメインからのタグの最適な除去を提供し、従って外来のアミノ酸を含まないSH2ドメインを生じる。外来アミノ酸を含まないSH2ドメインは、結晶学的研究のために、タグ化されたタンパク質に好ましい。SH2は、ヒトsrc SH2 ドメイン、または下記のように、ヒトsrc SH2ドメインの調製において使用される構築物をいう。 DET1-DET2-スペーサー-ek-SH2の各々をコードするDNA配列を、示された制限部位（BamHIおよびXbaI）がスペーサー-ek-SH2領域に隣接し、それによって異なるスペーサーek-SH2構築物が、以下の手順２または３に記載のいずれかのベクター中に容易に置換されて、DET1-DET2-スペーサー-ek-SH2タグ付きタンパク質を作製することを可能にするように設計した。DET1-DET2-スペーサー-ek-SH2の各々をコードするDNA配列をまた、タグ付きSH2ドメインの全体が、NdeI-XbaIフラグメントとして、E．coliの転写および翻訳調節配列の下流の適切な距離におけるN deI部位ならびにXbaIと適合性の下流のクローニング部位を含むいずれかの発現ベクター中に移動され得るように設計した。いずれかの適切なベクターも同様な結果をもたらすが（例えば、pET-11a；Novagen，Inc.）、本実験において使用したベクターは、E．coli発現ベクターpEA1KnRBS3であった。このベクターは、Sha tzman，A，Gross，M，およびRosenberg，M，1990，「ファージλ調節配列を有するベクターを使用する発現」：Current Protocols in Molecular Biology (F.A ．Ausubelら，編)，16.3.1-16.3.11頁，Greene Publishing and Wiley-Intersci ence，N.Y．（本明細書中以下、F.A．Ausubelら）に記載の一連のベクターの誘導体である。特定のベクターpEA1KnRBS3は、Bergsmaら，1991，J ．Biol.Chem．2 66 :23204-23214に記載されている。以下の手順は、ニワトリsrcおよびヒトsrc SH2ドメインの発現を記載する。まず、ニワトリsrc SH2ドメインをDET1-DET2-スペーサー-SH2として発現させた。次いで、もう一方をこのベクター中にニワトリsrcの代わりに挿入して、DET1-DE T2-スペーサー-ek-SH2の形態のタンパク質を発現させた。手順１：タグDET1およびDET2を含むニワトリsrc SH2ドメイン（DET1-DET2-スペーサー-SH2）のクローニングおよび発現。タグ付きタンパク質DET1-DET2-スペーサー-SH2をコードするDNA配列を、ニワトリsrc遺伝子を含むcDNA（p5H；Levyら，1986．Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 3 :4228）から、当業者に周知の方法によって、以下のプライマーを使用することによってPCR増幅した：下線を付した部位は、NdeI認識部位（5'）およびBamHI認識部位（3'）である。下線を付した領域は、XbaI認識部位である。 PCR産物をNdeIおよびXbaIで消化し、続いて消化したフラグメントをアガロースゲル上で単離した。フラグメントを、6.5kbpのフラグメントとしてアガロ-スゲル精製しておいたNdeI-XbaI消化したpEA1KnRBS3ベクター（Bergsmaら、前出）中に連結した。連結反応液を使用して、E. co1i MM294cI⁺を形質転換した（F.A ．Ausubelら、前出）。正しいフラグメントの挿入を含むプラスミドを同定し、そしてDNA配列決定によって確認した。得られたプラスミドは、ファージλのP_L プロモーターおよび調節系の制御下のDET1-DET2-スペーサー-SH2をコードする。プラスミドDNAをMM294cI⁺から精製し、そしてこれを使用してE．coli AR120株を形質転換した。F.A．Ausubelら（前出）に記載のように、この宿主株において、ファージプロモーターの発現は、増殖中の培養物へのナリジクス酸の添加によって誘導され得る。このプラスミドを含むAR120のナリジクス酸誘導、続くクマーシーブルーで染色したSDS-ポリアクリルアミドゲル上での細胞性タンパク質の分析（F.A．Ausubelら、前出）の結果、15,000の見かけの分子量を有するタンパク質バンドが出現した；このバンドは、非誘導細胞においても、PCR増幅フラグメントを欠くpEA1KnRBS3を含む誘導細胞においても見られなかった。ウエスタンブロッティングによって、誘導されたタンパク質バンドが、抗DET1モノクローナル抗体178.1と反応することが確認された。手順２：タグおよびエンテロキナーゼタンパク質分解切断部位を含むヒトsrc SH 2ドメイン（DET1-DET2-スペーサー-ek-src SH2）のクローニング、発現、および精製。タンパク質ek-src SH2をコードするDNA配列を、ヒトsrc遺伝子を含むcDNAクローン（Takeya,T.およびHanafusa，H，1983 Cell 32:881-890に記載のものと同一であるc-src SH2 DNA配列）から、以下のプライマーを使用してPCR増幅した：下線を付した部位はBamHI認識部位である。下線を付した部位はXbaI認識部位である。 PCR産物をBamHIおよびXbaIで消化し、続いて消化したフラグメントをアガロースゲル上で単離した。フラグメントを、上記の手順１に記載の、タグ化ニワトリ src遺伝子DET1-DET2-スペーサー-SH2を含む、BamHI-XbaI消化した発現ベクター中に連結した。そのベクターにおいて、BanmHI部位はDET1およびSH2のコード領域の間に位置し、そしてXbaI部位はSH2コード領域の3'末端の後に位置する。連結反応液を使用してE. coli MM294cI⁺を形質転換した。構築物DET1-DET2-スペーサー-ek-src SH2をDNA配列決定によって確認し（配列番号５）、そして上記の手順１に記載のようにE. coli AR120株において誘導した。16,000の見かけの分子量を有する、クマーシーブルー染色され、ウエスタンブロット陽性の、誘導されたタンパク質バンドが、ナリジクス酸誘導の後に観察された。細胞を、中性pHにおいて、リゾチームの存在下での超音波処理によって溶解した。遠心分離後、可溶性抽出物をNi⁺⁺NTAカラム上でクロマトグラフィーに付した。カラムを平衡化緩衝液（0.5M NaClを含有するTris緩衝液pH8）および15mMイミダゾールを含有する同じ緩衝液で洗浄した後、タンパク質を平衡化緩衝液中の 25mMイミダゾールで、高度に精製された形態で溶出した。この様式で精製したSH 2ドメインは、下記の「結合アッセイ」において適切なpYペプチドに特異的な飽和可能な様式で高親和性で結合することが見出された。このことは、タグが機能に干渉しなかったことを実証する。ヒトsrc SH2ドメインを選択的に阻害する化合物の特異性を決定するために、この発現させた融合タンパク質DET1-DET2-スペーサー-ek-src SH2を、下記の「結合アッセイ」において利用した。結合アッセイ：ヒトSH2ドメインにおける化合物の効力を、そのような化合物がSH2ドメインをそのそれぞれの特異的pYペプチドへの結合から選択的に阻害する能力に基づいて決定した。ヒトSH2ドメインおよびpYペプチドについての結合アッセイを、ELISAに基づく 96ウェルプレートアッセイにおいて実施した。Millipore 96ウェルフィルタープ MADVN6550）に、２μ1（50％懸濁液）のProtein-G Sepharose（N.J.のPharmacia から入手可能、カタログ番号17-0618-01）および２μlの２mg/mlのMAB178.1を添加した。10pmolの課題ののSH2ドメイン融合タンパク質を１つ以上のウェルに添加した。容量をTBS-T（tris緩衝化生理食塩水＋0.05％tween-20）で100μlにし、室温で１時間インキュベートおよび振とうし、次いでTBS-T（４℃）で１回洗浄した。次いで、90μlのTBS-Tを各々のウェルに添加した。特異的pYビオチン化ペプチドを、TBS-T中1.0μMの濃度に希釈した（このペプチドは、Pennsylvania のBachem Bioscience、TexasのGenosys Biotechnologies、およびCaliforniaのC alifornia Peptide Researchから入手され得る）。１ウェル当たり10μlを小分けして、0.1μMの最終濃度（ほぼSH2ドメイン/ペプチド対についてのK_d）および 100μlの最終容量を得た。平衡結合が達成されるまで、アッセイプレートをインキュベートした（振とうしながら４℃で３時間）。アッセイプレートを１ウェル当たり２回TBS-T（４℃）で洗浄し、次いで１ウェル当たり100μlのSABC（ストレプトアビジンビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体、CaliforniaのZy med corporationから入手可能、カタログ番号93-0043、10mlのTBS-T当たり１滴の試薬Ａ（ストレプトアビジン）および１滴の試薬Ｂ（AH-ビオチン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ）、37℃で30分間インキュベート、次いで４℃に冷却）を添加し、次いで４℃で30〜60分間インキュベートした。次いで、プレートをTBS- T（４℃）で４回洗浄した（250μl/ウェル/洗浄）。クエン酸緩衝液中１mg/mlの OPD（o-フェニルジアミン、Sigma Chemical Corporation，St．Louis Missouri ）を１ウェル当たり100μl添加した。発色を停止するために、１ウェル当たり10 0μlの10％硫酸を添加した。次いで、各プレートから150μlをアッセイプレートから取り出し、そしてELISAプレートに入れた。次いで、各々のELISAプレートの A₄₉₀を測定した。表Ｉについての（IC₅₀）の測定各々のコントロールまたは化合物を二連でアッセイした。二連を平均し、そしてバックグラウンドを差し引き、そして阻害なしの最大値をプレートから取り、次いで全てのその他のデータ点を、最大値の百分率として（または％コントロールとして）表した。これらの％コントロールデータ値を、Kaleidagraph for Mac intosh（Synergy Software）においてグラフ化した。これらのグラフ上での曲線は、以下の方程式F(x)＝Emax/(1+(Kd/濃度)^∧勾配)に適合される非直線であり、ここでｋ_d項は各々の曲線についてのIC₅₀を表す。表IIについての（Ki）の測定それぞれの化合物についてのKiは、以下の方程式を介して算出される（以下を参照のこと）。pYビオチン化ペプチドはSH2ドメイン融合タンパク質を上回っての大過剰濃度（×100）ではないという事実により、この展開された方程式はこのアッセイの条件下で使用されなければならない。IC₅₀は、Kaleidagraphを使用して非直線曲線適合から外挿される値である。Rtotおよび^*Dは、アッセイ中への試薬投入について既知の値である。KDは、一般に、SH2ドメイン融合タンパク質とpYビオチン化ペプチドの各々の組み合わせについて実験的に決定されなければならない。 KI=(IC₅₀- Rtot+Rtot/2((*D/(KD+*D))+(KD/(KD+*D+Rtot/2)))/(1+*D/KD+Rtot/KD((KD+*D/2) /(KD+*D))) KI＝競合物の（μM）KD IC₅₀＝インヒビターについての（μM）IC₅₀、SH2ドメインについての競合選択性アッセイデータの非直線曲線適合を介して導かれる Rtot＝１アッセイ（マイクロタイタープレート）ウェル内の（μM）総SH2ドメイン濃度^* D＝SH2ドメインに対する特異的pYおよびビオチン化ペプチドの（μM）濃度 KD＝SH2ドメインに対する特異的pYおよびビオチン化ペプチドについての（μM） KD値 IC₅₀は、応答またはシグナルが50％阻害されるインヒビターの濃度であるKDは、受容体/リガンド相互作用におけるリガンドについての解離定数であり、通常は、飽和結合曲線上の1/2 Vmaxにおけるリガンドの濃度と等しくなる上記の結合アッセイにおいて使用したpYペプチドリガンドは以下のとおりである。ヒトsrc SH2ドメインのために使用したアミノカプロン酸（Aca）リンカーを含むビオチン化pYペプチドリガンド。 Glu-Pro-Gln-pTyr-Glu-Glu-Ile-Pro-Ile-Tyr-Leu（SEQ ID NO:13）結合アッセイの結果：表ＩおよびIIは、ヒトsrc SH2ドメインにおけるSH2アンタゴニストの活性を示す。 NI−300μＭまで阻害は観察されずＸ−試験せず NI−1000μＭより下で阻害は観察されずｘ−算出せず XX−試験せず実施例３ src SH2ドメイン拮抗剤の活性ヒトsrc SH2ドメインの拮抗剤である本発明の化合物を、Raisz LG（1965）J C lin Invest 44:103-116、Stern PHら，（1979）Skeletal Research:Anexperimen tal Approach．New York:Academic Press，21-59、およびVotta BJら，（1994） Bone 15:533-538に記載されるような胎児ラット長骨（FRLB）アッセイにおいて破骨細胞媒介性骨吸収を阻害するそれらの効力について試験する。実験を実施するために、定期妊娠（timed-pregnant）Sprague Dawleyラット（ Taconic Farms，Germantown，NY）に200μCiの⁴⁵CaCl₂を妊娠18日目に皮下注射し、これを一晩飼育し、次いでInnovar-Vet（Pittman-Moore，Mundelein，IL）を用いて麻酔し、そして頸部脱臼によって屠殺する。胎児を無菌的に取り出し、そして橈骨および尺骨を、周囲の軟組織および軟骨末端なしに切除した。骨を１ mg/mlウシ血清アルブミンを含有するBGJ_b培地（Sigma）中で18〜24時間培養し、次いで新鮮な培地に移し、そしてさらに48時間、ヒトsrc SH2ドメインのアンタゴニストである化合物の存在下または非存在下で培養する。培地中に遊離される⁴⁵ カルシウムおよび骨中の総カルシウムを、液体シンチレーション分光測定法によって測定する。データを、対応するコントロール骨に比較しての処理した骨から遊離される⁴⁵カルシウムの％として表す。統計的差異を、非対試料についての分散の一方向分析を用いることによって評価する。データを平均±s.e.m.、ｎ＝４として示す。実験を一般に２回繰り返す。上記の実験からのデータは、src SH2ドメイン拮抗剤の、骨吸収疾患の処置における治療的効果を実証する。本発明の好ましい実施態様を上記により示したが、本発明は本明細書中に開示される明確な教示には限定されず、そして以下の請求の範囲の範囲内に入る全ての改変に対する権利が保持されることが理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ヤマシタ，デニス・エスアメリカ合衆国19406ペンシルベニア州キング・オブ・プルシア、エッジウッド・ロード703番

Claims

【特許請求の範囲】１．src SH2ドメインのcys185への共有結合または連結を形成する化合物の治療有効量を対象に投与する工程を包含することを特徴とする対象における骨吸収疾患を処置する方法。２．src SH2ドメインのcys185への共有結合または連結を形成する化合物の治療有効量を対象に投与する工程を包含することを特徴とする対象における骨粗鬆症を処置する方法。３．src SH2ドメインのcys185への共有結合または連結を形成する化合物の破骨細胞機能阻害量を対象に投与する工程を包含することを特徴とする対象における破骨細胞の機能を損なう方法。４．化合物が以下の式Ｉ： X＝OR"、SR"、NR"R"'； R"＝H、メチル、アルキル； R"'＝CONH₂、CONHMe、CONHアルキル、SONH₂、SONHMe、SONHアルキル、SO₂NH₂、S O₂NHMe、SO₂NHアルキル； n＝０、１、２； R＝H、CH₂CH(NHCOR"")CONHR""'、有機部分； R""＝glu-glu-ileu-glu-NH₂、ペプチド、ペプチド模倣物、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール； R'＝H、ペプチド模倣物；または R、R'＝Hもしくはペプチド模倣物で置換された縮合環系；またはその医薬上許容される塩、溶媒和物の水和物である請求項１記載の方法。５．化合物が以下の式Ｉ：Ｘ＝OR"、SR"、NR"R"'； X＝OR"、SR"、NR"R"'； R"＝H、メチル、アルキル； R"'＝CONH₂、CONHMe、CONHアルキル、SONH₂、SONHMe、SONHアルキル、SO₂NH₂、S O₂NHMe、SO₂NHアルキル； n＝０、１、２； R＝H、CH₂CH(NHCOR"")CONHR""'、有機部分； R""＝glu-glu-ileu-glu-NH₂、ペプチド、ペプチド模倣物、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール； R'＝H、ペプチド模倣物；または R、R'=Hもしくはペプチド模倣物で置換された縮合環系；またはその医薬上許容される塩、溶媒和物の水和物である請求項２記載の方法。６．化合物が以下の式Ｉ： X＝OR"、SR"、NR"R"'； R"＝H、メチル、アルキル； R"'＝CONH₂、CONHMe、CONHアルキル、SONH₂、SONHMe、SONHアルキル、SO₂NH₂、 SO₂NHMe、SO₂NHアルキル； n＝０、１、２； R＝H、CH₂CH(NHCOR"")CONHR""'、有機部分； R""＝glu-glu-ileu-glu-NH₂、ペプチド、ペプチド模倣物、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール； R'=H、ペプチド模倣物；または R、R'＝Hもしくはペプチド模倣物で置換された縮合環系、またはその医薬上許容される塩、溶媒和物の水和物である請求項３記載の方法。７．化合物がさらにarg175と水素結合を形成し、そしてlys203と疎水性相互作用を有する請求項１記載の方法。８．適切な医薬担体および請求項１において定義される化合物を含むことを特徴とする医薬組成物。