JPH10512585A

JPH10512585A - 赤血球形成を増強するためのｓｔａｔ５ｓｈ２領域特異性化合物の使用

Info

Publication number: JPH10512585A
Application number: JP9505268A
Authority: JP
Inventors: ダニントン，ダミアン・ジョン
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-06-28
Publication date: 1998-12-02
Also published as: EP0835104A1; AU6405596A; CA2225666A1; EP0835104A4; WO1997002024A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、患者における赤血球形成の増強方法であって、患者に治療上有効量の、ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し、該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域、ヒトＧrb２ＳＨ２領域、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域およびヒトp８５ＳＨ２領域と結合し、該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域、ヒトlck ＳＨ２領域およびヒトfyn ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することからなる方法である。

Description

【発明の詳細な説明】赤血球形成を増強するためのＳＴＡＴ５ＳＨ２領域特異性化合物の使用発明の背景多くのポリペプチド成長因子およびホルモンがシグナル変換経路を通してその細胞効果を媒介する。細胞内エフェクターに対するこれらのリガンドに関する細胞表面レセプターからのシグナルの変換は、しばしば、調節タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）およびホスファターゼによる特定のタンパク質基質のリン酸化または脱リン酸化を含む。チロシンリン酸化は主要な、あるいは唯一の多細胞生物におけるシグナル変換の指標である。レセプター結合および細胞内ＰＴＫは、免疫系細胞における細胞増殖、細胞分化およびシグナル発生プロセスを調節する。異常なタンパク質チロシンキナーゼ活性は、多くの病状、例えば糖尿病、アテローム性動脈硬化症、乾癬、敗血症性ショック、骨損失、貧血、多くの癌および他の増殖性疾患に関与するかまたは関与する疑いがある。したがって、チロシンキナーゼおよびこれらが包含されるシグナル変換経路は、薬物設計の潜在的な目的である。総論については、Levitzkiら、Science 267，1782-1788（1995）を参照。シグナル変換経路を含むタンパク質の多くは、低レベルで存在し、相反する活性を有することが多い。これらのシグナル発生分子の性質により、細胞下位置およびエフェクターの近位によってならびに活性化と抑制のバランスをとることにより一経路における小さな変化がスイッチング効果を起こすことができることによって細胞が転換を制御できるようになる。タンパク質間相互作用によるシグナル発生分子の近位による変換複合体の形成は、特異的結合領域配列モチーフにより媒介される。Ｓrc相同性２（ＳＨ２）領域は、非−レセプターＰＴＫおよびキナーゼ攻撃エフェクター分子などの種々のシグナル発生分子および腫瘍タンパク質においてみられる約１００アミノ酸の保存非触媒配列であり、重要な役割を果たす。ＳＨ２領域は、自己リン酸化ＰＴＫレセプターまたは細胞内チロシンキナーゼにおいてみられる短ホスホチロシン含有ペプチド配列に対して高度に特異的である。別の触媒的または他の機能的領域を有するが、さらに保存されたＳＨ２領域、約１００個のアミノ酸の保存配列も共有する約６０のタンパク質が同定された。体内においてどの生理学的応答がこれらのＳＨ２領域のそれぞれにより制御されているかはっきりとは解っていない。さらに、ＳＨ２領域−リガンド／化合物相互作用は、リガンド／化合物の構造における小さな修正によりリガンド／化合物が種々のＳＨ２領域と結合する選択性が著しく変更されるように高度に特異性である。Ｓtat（シグナル変換および転写の活性化）タンパク質は、シグナルをサイトカインレセプターから核に伝達し、特異的標的遺伝子の転写を活性化するＳＨ２含有細胞内タンパク質である[Darnell J.ら，Science 264，1415-1421(1994)]。これらのタンパク質は、そのＳＨ２領域によりレセプター上のリン酸化部位に補充され、それ自身チロシン残基上でレセプター関連ヤヌス（ＪＡＫ）チロシンキナーゼによりリン酸化される。Ｓtatチロシン残基のリン酸化により、レセプターと置き変わった、Ｓtatホスホチロシンモチーフ形成ダイマーと結合するＳtat ＳＨ２領域についての追加的結合リガンドが提供される。ダイマーＳtatは、核に移動する（ここで、これらはＤＮＡおよび他の補助タンパク質と結合し、標的遺伝子の転写を活性化する）。各ＳtatまたはＳtatヘテロダイマーは、種々のサイトカインレセプターからのシグナルを変換する。例えば、Ｓtat ６は、インターロイキン４シグナル発生を媒介し、一方、Ｓtat ５は、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）レセプターからのシグナルを変換する［Hou J.ら，Science 265，1701- 1706(1994)；Penta K.ら，J.Biol ．Chem. 270，31282-31287(1995)］。サイトカイン活性の調節不全を含む症状において、Ｓtatタンパク質を活性化または抑制する化合物は、治療薬として有用である。例えば、Ｓtat ５の活性化は、ＥＰＯの効果を模倣し、赤血球形成を増強する。反対に、Ｓtat ６の抑制は、ＩＬ−４またはＩＬ−１３に媒介されるＩgＥレセプターの上方調節をブロックし［Izuhara K.，J ．Biol．Chem. 271，619-22(1996)］、アレルギー反応の治療において有用である。Ｓtatタンパク質のＳＨ２領域は、これらの機能を活性化または抑制する手段を提供する。活性化は、適切なＳＨ２領域についての二分染色体−対称性リガンドによるダイマー形成を誘発することにより達成でき、一方、モノマーリガンドは、Ｓtat機能を抑制する。このようなリガンドの発見により、特定のＳtatタンパク質のＳＨ２領域を攻撃して所望のホモまたはヘテロダイマー形成を誘発または抑制する必要がある。ＳＨ２領域の非選択性拮抗作用の結果はかなり重大であり得る。例えば、Ｓta t ５ＳＨ２領域およびＳtat ６ＳＨ２領域は、構造的に類似し、領域間に高度の保存性を有する。Ｓtat ５ＳＨ２領域の活性化（本明細書において議論する）は、赤血球産生を増加させるとされる。一方、Ｓtat ６ＳＨ２領域の活性化は、アレルギー反応を治療するとされ、したがって、Ｓtat ６交差反応性を有するＳtat ５の活性化因子は、アレルギー反応を増悪させ、一方、Ｓtat ５と交差反応するＳtat ６抑制物質は、赤血球産生を抑制する。さらにまた、全ての６０個の公知ＳＨ２領域に対する結合研究における潜在的なＳtat ５ＳＨ２領域活性化因子を調べることは実行不可能である。現在のところ、Ｓtat ５ＳＨ２領域と選択的に相互作用する化合物は知られていない。Ｓtat ５ＳＨ２領域を活性化することにより赤血球形成の増強を可能にするが、非選択的ＳＨ２領域相互作用においてみられる副作用の発生を避ける方法および化合物を提供することが望ましい。本明細書において開示するように、意外にもＳtat ５ＳＨ２領域の選択的活性化因子は、src ＳＨ２領域、Ｓtat ６ＳＨ２領域、lck ＳＨ２領域、Ｓtat ５ＳＨ２領域、fyn ＳＨ２領域、ＳＨＰＴＰ２ＳＨ２領域、p８５領域、Ｇrb ２ＳＨ２領域およびhcp ＳＨ２領域からなるＳＨ２領域の小群に対する結合検定により同定できることが見いだされた。以下に記載する情報から、意外にも、化合物がヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域について特異的であり、（ｂ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域、ヒトＧrb２ＳＨ２領域、ヒトp８５ＳＨ２領域およびヒトＳＨＰＴＰ２ＳＨ２領域と結合し、（ｃ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域、ヒトlck ＳＨ２領域およびヒトfyn ＳＨ２領域と結合する化合物が赤血球形成の増強に有効であることが見いだされた。発明の概要本発明は、患者における赤血球形成の増強方法であって、患者に治療上有効量の、（ａ）ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し、（ｂ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域、ヒトＧrb２ＳＨ２領域、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域およびヒトp８５ＳＨ２領域と結合し、（ｃ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域、ヒトlck ＳＨ２領域およびヒトfyn ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することを特徴とする治療方法を提供するものである。本発明は、患者における貧血の治療方法であって、患者に治療上有効量の、（ａ）ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し、（ｂ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域、ヒトＧrb２ＳＨ２領域、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域およびヒトp８５ＳＨ２領域と結合し、（ｃ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域、ヒトlck ＳＨ２領域およびヒトfy n ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することを特徴とする治療方法を提供するものである。本発明は、患者における造血の増強方法であって、患者に治療上有効量の、（ａ）ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し、（ｂ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域、ヒトＧrb２ＳＨ２領域、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域およびヒトp８５ＳＨ２領域と結合し、（ｃ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域、ヒトlck ＳＨ２領域およびヒト fyn ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することを特徴とする治療方法を提供するものである。発明の詳細な記載本明細書において用いる場合、「赤血球形成の増強」なる用語は、赤血球の生産を増加させることを意味する。本明細書において用いる場合、「治療する」なる用語およびその派生語は、予防的または治療的療法を意味する。本明細書において用いる場合、「化合物」なる用語は、非ペプチド化合物を意味する。本明細書において用いる場合、Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する化合物を記載する場合、Ｓtat ５ＳＨ２領域活性化を意味する。本明細書において用いる場合、Ｓtat ５意外のＳＨ２領域と結合する化合物を記載する場合、拮抗作用を意味する。本明細書において用いる場合、特記しない限り、「Ｓtat ５ＳＨ２領域活性化因子」なる用語およびその派生語は、（ａ）ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い、好ましくは１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し、（ｂ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い、好ましくは１００倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域、ヒトＧrb２ＳＨ２領域、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域およびヒトp８５ＳＨ２領域と結合し、（ｃ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い、好ましくは１００倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域、ヒトlck ＳＨ２領域およびヒトfyn ＳＨ２領域と結合する二歯のＳＨ２リガンドを意味する。本明細書において用いる場合、「二歯のＳＨ２リガンド」なる用語は、同一分子中に２つの結合領域を有する化合物を意味する。本発明は、患者における赤血球形成の増強方法であって、患者に治療上有効量の、（ａ）ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し、（ｂ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域、ヒトＧrb２ＳＨ２領域、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域およびヒトp８５ＳＨ２領域と結合し、（ｃ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域、ヒトlck ＳＨ２領域およびヒト fyn ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することを特徴とする赤血球形成の増強方法を提供する。本発明の好ましい態様は、患者における赤血球形成の増強方法であって、患者に治療上有効量の、（ａ）ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することを特徴とする赤血球形成の増強方法を提供する。本発明の好ましい態様は、患者における赤血球形成の増強方法であって、患者に治療上有効量の、（ａ）ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し、（ｂ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域、ヒトＧrb２ＳＨ２領域、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域およびヒトp８５ＳＨ２領域と結合し、（ｃ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域、ヒトlck ＳＨ２領域およびヒトfyn ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することを特徴とする赤血球形成の増強方法を提供する。本発明の好ましい態様は、患者における赤血球形成の増強方法であって、患者に治療上有効量の、（ａ）ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することを特徴とする赤血球形成の増強方法を提供する。本発明の好ましい態様は、患者における貧血の治療方法であって、患者に治療上有効量の、（ａ）ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し、（ｂ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域、ヒトＧrb２ＳＨ２領域、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域およびヒトp ８５ＳＨ２領域と結合し、（ｃ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域、ヒトlck ＳＨ２領域およびヒトfyn ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することを特徴とする治療方法を提供する。本発明の好ましい態様は、患者における貧血の治療方法であって、患者に治療上有効量の、（ａ）ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することを特徴とする治療方法を提供する。本発明の好ましい態様は、患者における貧血の治療方法であって、患者に治療上有効量の、（ａ）ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し、（ｂ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトhc p ＳＨ２領域、ヒトＧrb２ＳＨ２領域、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域およびヒトp８５ＳＨ２領域と結合し、（ｃ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域、ヒトlck ＳＨ２領域およびヒトfyn ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することを特徴とする治療方法を提供する。本発明の好ましい態様は、患者における貧血の治療方法であって、患者に治療上有効量の、（ａ）ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することを特徴とする治療方法を提供する。本発明の好ましい態様は、患者における造血の増強方法であって、患者に治療上有効量の、（ａ）ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し、（ｂ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域、ヒトＧrb２ＳＨ２領域、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域およびヒト p８５ＳＨ２領域と結合し、（ｃ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域、ヒトlck ＳＨ２領域およびヒトfyn ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することを特徴とする造血の増強方法を提供する。本発明の好ましい態様は、患者における造血の増強方法であって、患者に治療上有効量の、（ａ）ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することを特徴とする造血の増強方法を提供する。本発明の好ましい態様は、患者における造血の増強方法であって、患者に治療上有効量の、（ａ）ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し、（ｂ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトhc p ＳＨ２領域、ヒトＧrb２ＳＨ２領域、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域およびヒトp８５ＳＨ２領域と結合し、（ｃ）かかるＳtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域、ヒトlck ＳＨ２領域およびヒトfyn ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することを特徴とする造血の増強方法を提供する。本発明の好ましい態様は、患者における造血の増強方法であって、患者に治療上有効量の、（ａ）ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することを特徴とする造血の増強方法を提供する。異なるヒトＳＨ２領域での化合物の結合活性は、以下の実施例１１においてさらに詳細に記載するようにイー・コリ（Ｅ. coli）またはバキュロウイルスのいずれかにおいて融合タンパク質として発現されるＳＨ２領域を用いてin vitroで測定される。添付の表１および２に示したデータは、前記化合物の種々のＳＨ２領域と相互に作用する能力を示す。実施例１１に記載した検定からＳtat ５ＳＨ２領域に対して選択性があるとして示される化合物を、当該技術分野においてはin vivo での赤血球形成の増強における効力と相関すると認識されている公知検定で試験する。好ましい検定は、以下のものを包含する：１）Hayakawa Tら，Biologicals 20，(1992)253、および２）Hayakawa Tら，Biologicals 20，(1992)243。これらの検定における活性は、当該技術分野においては、in vivoでの赤血球形成の増強における効力と相関すると認識されている。これらの検定における活性はまた、当該技術分野において、in vivoでの貧血の治療における効力と相関すると認識されている。これらの検定における活性はまた、当該技術分野において、in vivoでの造血の増強における効力と相関すると認識されている。したがって、本発明は、赤血球形成の増強方法であって、本明細書において定義するようなＳtat ５ＳＨ２領域活性化因子を、赤血球形成を増強させるのに有効な量で投与することを特徴とする赤血球形成の増強方法を提供する。該薬物は、増強した赤血球形成を必要とする患者に、静脈内、筋肉内、経口、皮下、皮内、および非経口を含む（これに限定されない）いずれかの慣用的な投与経路により投与される。赤血球形成を増強させるのに有効な量は、患者の体重１kgあたり約０.００１mgないし約１０.０mgである。選択された用量は、患者の体重１kg あたり約０.００１mgないし約１０.０mgから選択される有効な非毒性量である。選択された用量を毎日約１ないし６回投与する。本発明において記載する赤血球形成の増強方法はまた、本発明において定義するようなＳtat ５ＳＨ２領域活性化因子および医薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物を用いて行う。組成物は、Ｓtat ５ＳＨ２領域活性化因子０. ０５mg〜５００mgを含有し、選択された投与様式に適したいずれかの形態に構成される。経口投与に適した組成物としては、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤および散剤などの固体形態、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁液剤などの液体形態が挙げられる。非経口投与に有用な形態としては、無菌溶液剤、乳剤、および懸濁液剤が挙げられる。さらに、本発明は、貧血の治療方法であって、本明細書において定義するようなＳtat ５ＳＨ２領域活性化因子を、貧血に対して有効な量で投与することを特徴とする治療方法を提供する。該薬物は、貧血の治療を必要とする患者に、静脈内、筋肉内、経口、皮下、皮内、および非経口を含む（これに限定されない）いずれかの慣用的な投与経路により投与される。貧血を治療するのに有効な量は、患者の体重１kgあたり約０.００１mgないし約１０.０mgである。選択された用量は、患者の体重１kgあたり約０.００１mgないし約１０.０mgから選択される有効な非毒性量である。選択された用量を毎日約１ないし６回投与する。本発明において記載する貧血の治療方法はまた、本発明において定義するようなＳtat ５ＳＨ２領域活性化因子および医薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物を用いて行う。組成物は、Ｓtat ５ＳＨ２領域活性化因子０.０５mg 〜５００mgを含有し、選択された投与様式に適したいずれかの形態に構成される。経口投与に適した組成物としては、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤および散剤などの固体形態、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁液剤などの液体形態が挙げられる。非経口投与に有用な形態としては、無菌溶液剤、乳剤、および懸濁液剤が挙げられる。さらに、本発明は、造血の増強方法であって、本明細書において定義するようなＳtat ５ＳＨ２領域活性化因子を、造血を増強させるのに有効な量で投与することを特徴とする造血の増強方法を提供する。該薬物は、増強した造血を必要とする患者に、静脈内、筋肉内、経口、皮下、皮内、および非経口を含む（これに限定されない）いずれかの慣用的な投与経路により投与される。造血を増強させるのに有効な量は、患者の体重１kgあたり約０.００１mgないし約１０.０mgである。選択された用量は、患者の体重１kgあたり約０.００１mgないし約１０.０ mgから選択される有効な非毒性量である。選択された用量を毎日約１ないし６回投与する。本発明において記載する造血の増強方法はまた、本発明において定義するようなＳtat ５ＳＨ２領域活性化因子および医薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物を用いて行う。組成物は、Ｓtat ５ＳＨ２領域活性化因子０.０５mg 〜５００mgを含有し、選択された投与様式に適したいずれかの形態に構成される。経口投与に適した組成物としては、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤および散剤などの固体形態、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁液剤などの液体形態が挙げられる。非経口投与に有用な形態としては、無菌溶液剤、乳剤、および懸濁液剤が挙げられる。別法として、薬物は、無菌水、生理食塩水、または他の適当な無菌注射用媒体を用いて投与時に溶解または懸濁される無菌固体組成物として調製される。担体としては、必要な不活性結合剤、懸濁化剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、甘味料、保存剤、染料およびコーティングが挙げられる。投与される最適用量は、当業者により容易に決定され、用いる特定のＳtat ５ＳＨ２領域活性化因子、調製物の強度、投与様式、およびこれらの疾患の進行によって変わる。患者の年齢、体重、食事、および投与時を含む、治療される特定の患者に依存するその他の要因の結果、用量を調節する必要が生じる。本発明はまた、貧血の治療薬の製造におけるＳtat ５ＳＨ２領域活性化因子の使用を提供するものである。本発明はまた、造血の増強薬の製造におけるＳtat ５ＳＨ２領域活性化因子の使用を提供するものである。本発明はまた、赤血球形成の増強薬の製造におけるＳtat ＳＨ２領域活性化因子の使用を提供するものである。本発明はまた、Ｓtat ＳＨ２領域活性化因子を含有してなる貧血治療用医薬組成物を提供するものである。本発明はまた、Ｓtat ＳＨ２領域活性化因子を含有してなる造血増強用医薬組成物を提供するものである。本発明はまた、Ｓtat ＳＨ２領域活性化因子を含有してなる赤血球形成増強用医薬組成物を提供するものである。本発明の方法を本発明に従って用いた場合に許容できない毒性は考えられない。さらに努力することなく、当業者は、前記載事項を用いて、本発明を最大限に活用できると考えられる。したがって、以下の実施例は、単に例示的であって、如何なる場合も本発明の範囲を制限するものではないと考えられる。実験の詳細本発明において用いる場合、特記しない限り、記号°は℃を意味する。Ｌ−３,５−ジブロモチロシンは、例えば、「甲状腺ホルモンおよび類似体Ｉ. 合成、物理的性質および理論的計算値」（E．C．Jorgensen，Hormonal Proteins and Peptides，第VI巻，1978，Academic Press，N．Y.）およびその引用文献に記載されているような当該技術分野で知られている方法により調製できる。Ｌ−３,５−ジブロモ−Ｎ−トリフルオロアセチル−チロシンメチルエステル（実施例２（ｅ）および実施例２Ｂ（ｂ）における使用について）は、以下の手順に従って調製できる。Ｌ−３,５−ジブロモチロシン（５００g）をメタノール（５リットル）に懸濁させ、該撹拌懸濁液に乾燥塩化水素を５時間通した。該反応混合物を蒸発乾固させ、残留物を水（４リットル）中に懸濁させ、４０％水酸化ナトリウムでpＨを６に調節した。沈殿物を回収し、水で洗浄して、Ｌ−３,５−ジブロモチロシンメチルエステルを得た（４６７g、９０％）、融点２０１°−２０３°。該エステル（７６８g）をクロロホルム（２.７リットル）および酢酸エチル（２.７リットル）に懸濁させ、次いで、温度を３５°以下に保ちつつ無水トリフルオロ酢酸（５６５g）を０.５時間かけて添加した。該混合物を一夜静置し、次いで、水（２リットル）を添加し、重炭酸ナトリウム飽和溶液の添加によりpＨを７に調節した。有機層を取り出し、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、蒸発させた。該残留物を水性メタノールから再結晶して、Ｌ−３,５−ジブロモ− Ｎ−トリフルオロアセチル−チロシンメチルエステルを得た(７８６g、８１％) 、融点１３６°−７°。下記実施例６で用いるスキーム１４−トランス−アミノメチル−シクロヘキシル−カルボン酸１のアミノ基をＢ oc基（Ｂoc無水物、ＮaＯＨ、Ｈ₂Ｏ、ジオキサン）などの標準的保護基で保護して２を形成し、次いで、ＤＣＣなどのカップリング試薬を用いてカイザーオキシム樹脂［Kaizer，E．T．らJ Am Chem Soc 1985，107，7087-7092］とカップリングして３を形成する。次いで、該アミンを標準的条件下（２５％ＴＦＡ、塩化メチレン）で脱保護して４を形成し、次いで、標準的条件下（ＨＢＴＵ、ＤＭＦ中ＮＭＭ、またはＤＭＦまたはＮＭＰ中ＤＣＣもしくはＤＩＣなど）アシル化して５を形成する。次いで、該化合物を種々のアミンで樹脂から開裂させて望ましい最終生成物６を形成する。化合物１ないし１０を以下の実施例１ないし１０に従って調製する。実施例１７−[Ｄ,Ｌ−α−アミノ−α−(４−カルボキシフェニル)アセトアミド]−３ −[２−(５−メチル−１,３,４−チアジアゾリル)チオメチル]△³−セフェム− ４−カルボン酸（化合物１）の調製ａ）４−ヒドロキシメチルベンズアルデヒド窒素下、氷浴中で１,４−ベンゼンジカルボキシアルデヒド（５０.０g、０.３７３モル）の乾燥テトラヒドロフラン（２００mＬ）中溶液にテトラヒドロフラン５００mＬ中水素化トリ(tert−ブトキシ)アルミニウムリチウム（１０４.０g 、０.４１０モル）を滴下した。氷浴中で１.５時間撹拌後、該反応混合物を氷冷２Ｎ塩酸２Ｌ中に注いだ。該水溶液をエーテル８００mＬずつで４回抽出した。合したエーテル層を重炭酸ナトリウム溶液、食塩水で洗浄し、乾燥させた。溶媒を蒸発させて粗製物質４６gを得、これをクロマトグラフィー（アルミナ、エーテル溶離）に付すことより精製して、結晶性物質として標記化合物を得た（１７ .６g、３５％）：融点４４.５−４６℃。ｂ）５−(４−ヒドロキシメチルフェニル)ヒダントイン５０℃に加熱した６０％水性エタノール１１０mＬ中の４−ヒドロキシメチルベンズアルデヒド（１０.０g、７３.５ミリモル）および炭酸アンモニウム（１７.１g、１５０ミリモル）の撹拌混合物に水１０mＬ中のシアン化ナトリウム（４.０g、８１ミリモル）を添加した。該混合物を撹拌し、５０−６０℃で３時間加熱し、次いで、８５℃で１時間加熱した。氷浴中で冷却した後、濃塩酸の添加により該溶液のpＨを６に調節した。一夜冷却して、沈殿した固体を濾過し、水で洗浄し、乾燥させて、標記化合物を得た（１１.０g、７２％）：融点１８９− １９６℃。ｃ）４−ヒドロキシメチルフェニルグリシン実施例１（ｂ）の化合物（１０.９g、５３ミリモル）および水酸化バリウム・八水和物（２５.５g、８１ミリモル）の水１２５mＬ中混合物を還流下で１８時間撹拌した。反応混合物を冷却し、濃硫酸でpＨ１に酸性化した；硫酸バリウムを濾過し、濾液のpＨを炭酸鉛で６にした。硫酸鉛の濾過後、濾液を硫化水素で飽和させ、硫化鉛を濾過した。減圧下でエタノールと共沸させることにより、該水溶液を１００mＬに濃縮し、冷却後、標記化合物を得た（５.２g、５４％）:融点２３０−２３１℃。ｄ）Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−４−ヒドロキシメチルフェニルグリシン４−ヒドロキシメチルフェニルグリシン（８.０g、４４ミリモル）およびトリエチルアミン（８.８g、８７ミリモル）の水１６０mＬ中溶液に、テトラヒドロフラン１２０mＬ中tert-ブトキシカルボニルアジド（６.９５g、４９ミリモル）を添加した。室温で一夜撹拌した後、該反応混合物をエーテル２００mＬずつで２回洗浄した。水性相をエーテルで覆い、氷浴中、３Ｎ塩酸でpＨ３−３.５に酸性化した。該酸性溶液をエーテルで抽出し、合した有機抽出物を食塩水で洗浄し、乾燥させ、蒸発させた。得られた油状物をクロロホルム−ヘキサンと一緒に摩砕し、固体を濾過して、標記化合物を得た（７.７g、６３％）：融点１３９−１４１.５℃。）Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−４−ヒドロキシメチルフェニルグリシンメチルエステル実施例１（ｅ）の化合物（５.６g、２０ミリモル）の溶液にメタノール（１０ mＬ）中の硫酸ジメチル（３.１g、２４ミリモル）およびジイソプロピルアミン（５.２g、４０ミリモル）を添加した。該混合物を２０分間還流し、次いで、２Ｎ塩酸水溶液で処理した。該水溶液を酢酸エチルで３回抽出し、合した有機抽出物を５％重炭酸ナトリウム水溶液および食塩水で洗浄した。溶媒を蒸発させて、油状物として標記化合物を得た（３.２g、５５％）。ｆ）Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−４−カルボキシフェニルフェニルグリシンメチルエステル実施例１（ｅ）の化合物（０.６２g、２.１ミリモル）のアセトン５０ml中溶液を過剰のジョーンズ試薬（８Ｎクロム酸）で２５℃で処理した。該反応混合物を室温で２時間撹拌した。緑色固体を濾過し、イソプロピルアルコールにより過剰のＣrＯ₃を分解した。濾液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、活性炭で処理した。固体を濾過し、濾液を蒸発乾固させて、白色固体として標記化合物０.３８gを得た（融点１２６−１２８℃）。ｇ）Ｎ,Ｎ'−ビス(１−メチルエチル)カルバミミジン酸１,１-ジメチルエチル Santiniらの手順［J．Org．Chem．1994，59，2261］に従って、ＣuＣl（０.０１当量）の存在下、室温で１日間、純粋なＮ,Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド（１.０当量）と２−メチル−２−プロパノール（１.１５当量）とを反応させることによって標記化合物を調製した。乾燥ジクロロメタン中の実施例１のチアジアゾリル)チオメチル]△³−セフェム −４−カルボン酸tert-ブチル（３６８mg、１ミリモル）およびＤＣＣ（２１２m g、１ミリモル）を室温で３時間撹拌した。ジシクロヘキシル尿素を濾過し、濾液を蒸発乾固させた。残留物を酢酸エチルに溶解させ、該酢酸エチル溶液を５％重炭酸ナトリウム水溶液、２.５％硫酸、５％重炭酸ナトリウム水溶液、食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させて、粗製生成物０ .６gを得た。シリカゲルクロマトグラフィー（３０：７０酢酸エチル／ベンゼンで溶離）に付すことにより精製して標記化合物を得た（４３０mg、６１％）：融点１１０−１１２℃。ｌ）７−[Ｄ,Ｌ−α−アミノ−α−(４−カルボキシフェニル)アセトアミド] −３−[２−(５−メチル−１,３,４−チアジアゾリル)チオメチル]△³−セフェム−４−カルボン酸実施例１（ｋ）の化合物（４００mg、０.５７ミリモル）の溶液をトリフルオロ酢酸７.２mＬおよびチオフェノール０.８mＬ中で撹拌した。該反応混合物を０ ℃で３０分間、次いで、室温で１時間撹拌した。溶媒を４０℃の水浴中で蒸発させて除去し、残留物をジエチルエーテルと一緒に３回摩砕した；固体生成物を少量のメタノールに溶解させ、ジエチルエーテルの添加により生成物を沈殿させて標記化合物を得た（３００mg）：融点１７０−１７５℃。実施例２Ｌ−３,５−ジブロモ−３'−(６−オキソ−３(１Ｈ)−ピリダジニルメチル)− チロニン（化合物２）の調製（ａ）ｏ−メトキシフェニルアセトニトリル（２３.６４ｇ）および３,６−ジクロロピリダジン（２３.９３g）を乾燥ジメチルホルムアミド（５０ml）に溶解させ、該撹拌溶液に水素化ナトリウム（５０％油中分散液１６.２３g）を数回にわけてゆっくりと２時間かけて添加した。該混合物を過剰の砕氷上に注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を除去し、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、木炭処理し、蒸発乾固させた。残留物をジクロロメタン／石油スピリットから結晶化して、１−(６−クロロ−３−ピリダジニル)−１−(２−メトキシフェニル)−アセトニトリルを得た（３５.５g、８５％）；融点９１°−９２ °。（ｂ）このニトリル（３３.５g）を濃塩酸（２００ml）、酢酸（１００ml）および水（１００ml）に溶解させ、該溶液を撹拌しつつ還流させた。６時間後、溶媒を蒸発させ、残留物を酢酸エチル／石油スピリットから再結晶して、２−(６ −オキソ−３(１Ｈ)−ピリダジニルメチル)アニソールを得た（２１.４g、７７％）；融点１４２°−３°。（ｃ）このピリダジノン（１５.７g）をオキシ塩化リン（２２ml）中に溶解させ、該溶液を撹拌しつつ５５°（油浴）で１時間加熱した。冷却した混合物を砕氷上にゆっくり注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を分離し、重炭酸ナトリウム飽和溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、蒸発させた。残留物をより小さなバッチ（ピリダジノン２.１６gから調製）と合し、沸騰石油スピリット（６０−８０°）で数回抽出した。合した抽出物を木炭処理し、蒸発させて、２−(６−クロロ−３−ピリダジニルメチル)アニソールを得た（１６.９５g 、８７％）；融点６３°。（ｄ）−１５°でトリストリフルオロ酢酸ヨウ素（無水酢酸およびトリフルオロ酢酸中、ヨウ素（２.５４g）の発煙硝酸（５ml）での処理により調製）の無水トリフルオロ酢酸（２５ml）中撹拌懸濁液に、温度を−１５°以下に保ちつつ、トリフルオロ酢酸（２０ml）および無水トリフルオロ酢酸（２５ml）中の前記クロロピリダジン（９.３９g）を添加した。混合物を室温で一夜撹拌し、濃縮し、次いで、酢酸ナトリウム（２５g）および過塩素酸ナトリウム（１５g）の水（２００ml）中溶液を添加した。該混合物をクロロホルムで抽出し、有機溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、次いで、５０mlに濃縮し、撹拌エーテル（２５０ ml）中に注いだ。沈殿物を回収し、乾燥させて、粗製４,４'−ジメトキシ−３, ３'−ビス−(６−クロロ−３−ピリダジニル−メチル)−ジフェニルヨードニウムパークロレート（１４g）を得た。¹ＨＮＭＲδ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）３.８０(３Ｈ,ｓ,−ＯＣＨ ₃)、４.２０(２Ｈ,ｓ,−ＣＨ ₂Ａr)、７.５０(１Ｈ,ｍ,Ａr−５Ｈ )、７.６５(２Ｈ,ｍ,ＰyＨ)および８.００(２Ｈ,ｍ,Ａr−２,６Ｈ)。（ｅ）前記ヨードニウム塩（１２.４５g）、Ｌ−３,５−ジブロモ−Ｎ−トリフルオロアセチルチロシンメチルエステル（８.９８g）、トリエチルアミン（４ .０５g）および青銅（１.０g）をジクロロメタン（５０ml）中で１８時間撹拌した。該混合物を濾過し、酢酸水溶液、２Ｎ水酸化ナトリウム、次いで、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、蒸発させた。残留物をより小さなバッチ（ヨードニウム塩０.７２gから調製）と合し、シリカゲル（４００g）上カラムクロマトグラフィーに付すことにより精製した。酢酸エチル／石油スピリット（６０°−８０°）［１：３］で溶離して、黄褐色泡状物としてＬ−３,５−ジブロモ−３'−(６−クロロ−３−ピリダジニルメチル)−Ｏ−メチル−Ｎ−トリフルオロアセチル−１−チロニンメチルエステル（４.０g）を得た。¹ＨＮＭＲδ （ＣＤＣl₃）３.０６(２Ｈ,ｍ,ＡrＣＨ ₂ＣＨ)、３.８４および３.９３(６Ｈ,２ｓ,−ＯＣＨ ₃)、４.１９(２Ｈ,ｓ,ＡrＣＨ ₂Ｐy)、４.７５(１Ｈ,ｍ,ＡrＣＨ ₂ＣＨ )、６.６２(３Ｈ,ｍ,ＡrＨ)、７.１７(２Ｈ,ｍ,ＰyＨ)および７.２３(２Ｈ,ｓ ,ＡrＨ)。（ｆ）前記ジブロモ化合物（３.２７g）を酢酸ナトリウム（０.７９g）を含有する酢酸（２０ml）に溶解させた。該溶液を１.２５時間還流させ、充分な水（約２ml）を添加して、沈殿した塩化ナトリウムを溶解させ、該溶液を蒸発乾固させた。残留物を水および酢酸エチルに分配させ、有機層を除去し、飽和重炭酸ナトリウムで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、蒸発乾固させた。残留物を酢酸エチル／石油スピリット（６０°−８０°）から結晶化して、Ｌ−３,５ −ジブロモ−Ｏ−メチル−３'−(６−オキソ−３(１Ｈ)−ピリダジニルメチル) −Ｎ−トリフルオロアセチルチロニンメチルエステル（２.５２g、７９％）を得た；融点１７６°−８°。（ｇ）このピリダジノン（２.４５g）を乾燥ジクロロメタン（４０ml）に溶解させ、０°で撹拌しつつ冷却した。ジクロロメタン（３ml）中の三臭化ホウ素（６.４６g）を添加した。赤褐色沈殿物が形成された。該混合物を室温で１.５時間撹拌し、次いで、砕氷を添加した。該混合物を濾過し、沈殿物を回収し、２Ｎ水酸化ナトリウム（３０ml）に溶解させた。該溶液を蒸気浴上で１５分間加熱し、次いで、酢酸を添加してpＨ５にし、該混合物を冷却した。得られた沈殿物を回収し、洗浄し、乾燥させて、Ｌ−３,５−ジブロモ−３'−(６−オキソ−３(１Ｈ)−ピリダジニルメチル)−チロニンを得た（１.７４g、８８％）；融点２７８ °−９°（分解）。別法として、反応段階（ｅ）について（ｄ）で調製した過塩素酸塩を用いる代わりに、以下のようにして調製されるヨードニウムトリフルオロ酢酸塩を用いることができる：ヨウ素（１５９g）を無水トリフルオロ酢酸（１リットル）に懸濁させ、窒素雰囲気下で撹拌しつつ、かつ、温度を３６°〜４０°に保ちつつ、１.５時間かけて発煙硝酸（３５０ml）を添加した。次いで、無水トリフルオロ酢酸（３００ ml）を添加し、全ての酸化窒素が除去されるまで該混合物を窒素気流下で４０° に維持し、次いで、一夜室温で静置した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残留溶媒を無水トリフルオロ酢酸（２×３００ml）との共沸により除去した。次いで、薄黄色の残留固体を無水トリフルオロ酢酸（１.２リットル）に撹拌しつつ懸濁させ、−２０°に冷却した。次いで、温度を−１０°〜−２０°に保ちつつ、２−(６−クロロ−３−ピリダジニルメチル)アニソール（６００g）のトリフルオロ酢酸（１.２リットル）中溶液を滴下した。該混合物を−１０°で１時間、次いで、室温で一夜撹拌し、次いで、溶媒を減圧下で除去し、残留物を硫酸ナトリウム（３.５kg）の水（２０リットル）中溶液に撹拌しつつ注いだ。この混合物のpＨを、稀水酸化ナトリウム水溶液を用いて約pＨ２に調節し、次いで、ジクロロメタン（２×３リットル、１×２リットル）で抽出し、有機抽出物を合し、乾燥させ（ＭgＳＯ₄）、濾過し、体積を２リットルに減じ、次いで、激しく撹拌したジエチルエーテル（１２リットル）に添加した。濃灰色の沈殿固体を濾去し、エーテルで洗浄し、４０°の真空オーブン中で６時間乾燥させて、４,４'−ジメトキシ−３,３'−ビス−(６−クロロ−３−ピリダジニルメチル)ジフェニルヨードニウムトリフルオロアセテートを得た（８.１４g、９０％）；融点１４５° −１４７°。前記の２（ｅ）、（ｆ）および（g）に記載したと類似の手順を用いたこの塩のさらなる反応により、所望のＬ−３,５−ジブロモ−３'−(６−オキソ−３(１Ｈ)−ピリダジニルメチル)チロニンを得る。実施例２ＡＬ−３,５−ジブロモ−３'−(６−オキソ−３(１Ｈ)−ピリダジニルメチル)− チロニン（化合物２）の調製（ａ）２−(６−クロロ−３−ピリダジニルメチル)アニソール（実施例２（ｃ）に記載したように調製）（２.３５g）を乾燥ジクロロメタン（２０ml）に溶解させ、撹拌しつつ−５０°に冷却した。次いで、三臭化ホウ素（３ml）を滴下し、該溶液を室温に加温した。０.５時間後、オレンジ色の反応混合物を氷／水（２００ml）中に注ぎ、アセトンを添加して沈殿固体を溶解させた。該混合物をジクロロメタンで抽出し、有機抽出物を分離し、水で洗浄し、乾燥させ、蒸発させた。残留物を酢酸エチルおよび石油スピリットから再結晶して、２−(６−クロロ−３−ピリダジニルメチル)−フェノールを得た（１.７５g、８０％）；融点１３２°−１３２.５°。元素分析：測定値：Ｃ,５９.６１；Ｈ,４.１３；Ｎ,１２.４７；Ｃl,１６.０９；Ｃ₁₁Ｈ₉ＣlＮ₂Ｏの理論値：Ｃ,５９.８７；Ｈ,４.１１；Ｎ,１２.７０；Ｃl,１６.０７％。（ｂ）このフェノール（２.４g）および尿素（１４g）の７５％硫酸水溶液（１００ml）中撹拌溶液に、ｔ−ブタノール（１７ml）をゆっくり添加した。該混合物をよく撹拌し、ｔ−ブタノールを、４時間後（１８ml）、２４時間後（５ml ）および２８時間後（２０ml）にさらに添加した。１２０時間後、該混合物を水中に注ぎ、有機相を分離して捨て、水性相をエーテルで完全に抽出した。合したエーテル抽出物を飽和食塩水で洗浄し、乾燥させ、蒸発させた。残留物をエーテルおよび石油スピリットから再結晶して、２,４−ジ−ｔ−ブチル-６−(６−クロロ−３−ピリダジニルメチル)フェノールを得た（３.４３g、９４％）；融点１４３.０°−１４３.５°。元素分析：測定値：Ｃ,６８.３２；Ｈ,７.５１；Ｎ ,８.３６；Ｃl,１０.８９；Ｃ₁₉Ｈ₂₅ＣlＮ₂Ｏの理論値：Ｃ,６８.５６；Ｈ,７. ５７；Ｎ,８.４１；Ｃl,１０.６５％。（ｃ）アルゴン下、室温で、このフェノール（１.９５g）、Ｌ−３,５−ジブロモ−Ｎ−トリフルオロアセチルチロシンメチルエステル（３.２４g）のジエチルエーテル（１００ml）中溶液を撹拌し、活性二酸化マンガン（３×５g）で処理した。４時間後、該混合物を濾過し、四塩化チタン（５ml）を添加した。２分後、黒ずんだ溶液を水で処理し、酢酸エチルでよく抽出した。有機抽出物を合し、飽和食塩水で洗浄し、乾燥させ、蒸発させた。残留物を、溶離液として石油スピリットおよびエーテルを用いてシリカゲル上クロマトグラフィーに付して、Ｌ− ３,５−ジブロモ−５'−ｔ−ブチル−３'−(６−クロロ−３−ピリダジニルメチル)−Ｎ−トリフルオロアセチルチロニンメチルエステルを得た（２.３１g、５５％）；融点８４°−８６°。（ｄ）このジブロモチロニン（２.７６g）および無水酢酸ナトリウム（０.７８g）の酢酸（２５ml）中溶液を還流させながら１０時間加熱し、次いで、冷却し、氷水中に注いだ。沈殿固体を濾過し、酢酸エチルに溶解させ、乾燥させ、蒸発させて、Ｌ−３,５−ジブロモ−５'−ｔ−ブチル−３'−(６−オキソ−３(１Ｈ)−ピリダジニルメチル)−Ｎ−トリフルオロアセチルチロニンメチルエステルを得た（２.４g、５５％）；融点１１２−１１５°。（ｅ）このピリダジノン（０.２００g）およびＨＢr（１ml）の氷酢酸（２０m l）中溶液を還流させながら３日間加熱した。次いで、該溶液を冷却し、水で希釈し、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で塩基性化し、酢酸の添加によりpＨ６にした。沈殿固体を濾過し、洗浄し、乾燥させて、すでに単離されたもの（実施例２（ｇ））と分光学的に同一の、Ｌ−３,５−ジブロモ−３'−(６−オキソ−３(１Ｈ)−ピリダジニルメチル)チロニンを得た（０.１００g、６５％）；融点２４５ °−２４７°（分解）。実施例２ＢＬ−３,５−ジブロモ−３'−(６−オキソ−３(１Ｈ−ピリダジニルメチル)− チロニン（化合物２）の調製（ａ）−１０°に冷却した、トリストリフルオロ酢酸ヨウ素（無水酢酸およびトリフルオロ酢酸中、ヨウ素（１０.０g）の発煙硝酸（２０.９５ml）での処理により調製）の無水酢酸（５０ml）中溶液に、２−メトキシベンジルシアニド（３０.０g）のトリフルオロ酢酸（６０ml）および無水酢酸（３０ml）中溶液を滴下した。添加中、混合物の温度を０°以下に維持し、次いで、室温で一夜静置した。該混合物を、水（６００ml）中で酢酸ナトリウム（１００g）および過塩素酸ナトリウム（１３.０g）をよく撹拌し氷冷した溶液に注いだ。沈殿した固体を濾過し、水およびジエチルエーテルで洗浄して、微細な淡黄褐色固体の３,３' −ジシアノメチル−４,４'−ジメトキシ−ジフェニルヨードニウムパークロレートを得た（２３.６g、５７％）；融点１８３°−４°（メタノール／ジエチルエーテルから）。（ｂ）このヨードニウム塩（２２.６g）、Ｌ−３,５−ジブロモ−Ｎ−トリフルオロアセチル−チロシンメチルエステル、トリエチルアミン（６.１g）のジクロロメタン（３００ml）中溶液を青銅（１g）で処理し、該混合物を室温で２０時間撹拌した。該混合物を濾過し、濾液を２Ｎ塩酸水溶液（２×２００ml）、水（２×２００ml）、および２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（３×２００ml）で洗浄し、次いで、有機溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で蒸発させた。油状残留物をジクロロメタン（３０ml）に溶解させ、石油スピリット中に注いだ。固体が沈殿し、これを濾過し、ジクロロメタン／石油スピリットから再結晶して、無色結晶性固体としてＬ−３,５−ジブロモ−３'−シアノメチル−Ｏ−メチル −Ｎ−トリフルオロアセチルチロニンメチルエステル（融点１４８°−１４９° ）を得た。母液をシリカゲル上クロマトグラフィーに付して、さらにこの化合物を得た（合計＝８.０５g、３１％）。（ｃ）このジブロモチロニン（１２０mg）および３,６−ジクロロピリダジン（３１mg）の乾燥ジメチルホルムアミド（２ml）中溶液に、水素化ナトリウム（５０％油中懸濁液３０mg）を添加し、反応混合物を室温で５０分間静置した。次いで、これを氷で処理し、水性混合物をジクロロメタンで抽出し、有機溶液を飽和食塩水で洗浄し、乾燥させ、蒸発させた。該残留物を分取用シリカゲルクロマトグラフィープレート上でクロマトグラフィーに付し、これから３,５−ジブロモ−３'−(１−(６−クロロ−３−ピリダジニル)−１−シアノメチル)−Ｏ−メチル−Ｎ−トリフルオロアセチルチロニンメチルエステル（５mg）を単離した。¹ ＨＮＭＲδ（ＣＤＣl₃）３.１２(１Ｈ,ｍ)、３.２７(１Ｈ,ｍ)、３.７９(３Ｈ ,ｓ)、３.８６(３Ｈ,ｓ)、４.８６(１Ｈ,ｍ)、５.８０(１Ｈ,ｓ)、６.７２(１Ｈ ,ｄｄ)、６.８３(１Ｈ,ｄ)、７.０４(１Ｈ,ｄ)、７.１５(１Ｈ,ブロードｍ)、７ .３７(２Ｈ,ｓ)、７.５０(２Ｈ,ｄｄ)。この中間体を標準法により処理して、標記化合物を得る。実施例３８,８−エチレンジオキシ−２,３,７,８,９,１０−ヘキサヒドロ−４−メチル −１Ｈ−ベンゾ[ｂ]チエノ[２,３−ｂ]ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリジン−３−オン（化合物３）の調製ａ）２−シアノ−２−(４,４−エチレンジオキシシクロヘキシリデン)酢酸エチル室温で、１,４−シクロヘキサンジオンモノエチレンケタール（２５g、０.１６０モル）およびシアノ酢酸エチル（１８g、０.１６０モル）のトルエン（４００mＬ）中混合物にジエチルアミン（２５g、０.３３７モル）を滴下した。該反応混合物を還流させながら一夜加熱した（ディーン・スターク装置を使用）。該混合物を冷却し、酢酸エチルおよび重炭酸ナトリウム飽和水溶液に分配させた（３回）。有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空濃縮し、エタノールから再結晶して、白色固体として標記化合物を得た（１５.８g、４５％）：融点８０−８１℃；¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨz、ＣＤＣl₃）δ４.２８(ｑ,Ｊ＝７ .２Ｈz,２Ｈ)、４.００(ｓ,４Ｈ)、３.１８(ｔ,Ｊ＝６.５Ｈz,２Ｈ)、２.８５( ｔ,Ｊ＝６.５Ｈz,２Ｈ)、１.８９(ｔ,Ｊ＝６.５Ｈz,２Ｈ)、１.８２(ｔ,Ｊ＝６. ５Ｈz,２Ｈ)、１.３５(ｔ,Ｊ＝７.１Ｈz,３Ｈ)。ｂ）２−アミノ−６,６−エチレンジオキシ−４,５,６,７−テトラヒドロベンゾ[ｂ]チオフェン−３−カルボン酸エチル０℃での実施例３（ａ）の化合物（１０g、４５.６ミリモル）、硫黄（１.６g 、５０.２ミリモル）のエタノール（１６４mＬ）中懸濁液にジエチルアミン（３ .６g、５０.２ミリモル）のエタノール（２６mＬ）中溶液を滴下した。得られた溶液を０℃で１時間、次いで、室温で３.５時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで急冷し、塩化アンモニウム飽和水溶液で分配させた。水性相を酢酸エチルで抽出し、有機抽出物を食塩水で洗浄した。合した有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮し、クロマトグラフィーに付して（シリカゲル、５〜１０％ＣＨ₂Ｃl₂：ＥtＯＡcの勾配液）、油状物として標記化合物を得た（１１.３g、８７％）。¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨz、ＣＤＣl₃）δ４.２５(ｑ, Ｊ＝７.１Ｈz,２Ｈ)、４.０２(ｓ,４Ｈ)、２.９２(ｔ,Ｊ＝６.５Ｈz,２Ｈ)、２. ７４(ｓ,２Ｈ)、１.９０(ｔ,Ｊ＝６.６Ｈz,２Ｈ)、１.３３(ｔ,Ｊ＝７.１Ｈz,３Ｈ)。ｃ）７,７−エチレンジオキシ−４−ヒドロキシ−２−メチル−５,６,７,８− テトラヒドロベンゾ[ｂ]チエノ[２,３−ｂ]ピリジン−２−カルボン酸エチル室温での実施例３（ｂ）の化合物（１１.２g、３９.５ミリモル）のトルエン（３０７mＬ）中溶液に３−エトキシクロトン酸エチル（１２.４g、７８.６ミリモル）および樟脳スルホン酸（０.７８g、３.４ミリモル）を添加した。該反応混合物を、ディーン・スタークトラップを用いて還流させながら３.５時間加熱した。次いで、該混合物を冷却し、これに新たに調製した１Ｍナトリウムエトキシド（４９mＬ）の溶液を滴下した。添加完了後、反応混合物を還流させながら３時間加熱した。該混合物を冷却し、沈殿物を濾過した。該塩をメタノール（６０mＬ）に溶解させ、これに水（５００mＬ）および酢酸（２mＬ）を添加して、黄色固体として標記化合物を得た（１０.４g、７６％）：融点９４−９５℃。¹ ＨＮＭＲ（４００ＭＨz、ＣＤＣl₃）δ４.４８(ｑ,Ｊ＝７.１Ｈz,２Ｈ)、４.０６(ｓ,４Ｈ)、３.２６(ｔ,Ｊ＝６.５Ｈz,２Ｈ)、３.０２(ｓ,２Ｈ)、２.８１(ｓ ,３Ｈ)、２.０２(ｔ,Ｊ＝６.５Ｈz,２Ｈ)、１.４７(ｔ,Ｊ＝７.１Ｈz,３Ｈ)；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３５０[Ｍ＋Ｈ]⁺；元素分析：Ｃ₁₇Ｈ₁₉ＮＯ₅Ｓについての理論値；Ｃ,５８.４４；Ｈ,５.４８；Ｎ,４.０１；測定値：Ｃ,５８.３４；Ｈ, ５.４６；Ｎ,３.８６。ｄ）７,７−エチレンジオキシ−４−トリフルオロメチルスルホニルオキシ− ２−メチル−５,６,７,８−テトラヒドロベンゾ[ｂ]チエノ[２,３−ｂ]ピリジン −３−カルボン酸エチル実施例３（ｃ）の化合物（５.０g、１４.３ミリモル）のピリジン（５０mＬ）中溶液に、無水トリフルオロメタンスルホン酸（４.０g、１４.２ミリモル）を滴下した。該反応混合物を０℃で４時間、完了するまで撹拌した。該反応混合物を硫酸銅水溶液（３回）、次いで、水（２回）、および食塩水（２回）で洗浄した。有機層を蒸発させ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーに付すことによって（シリカゲル、１：１ヘキサン：酢酸エチル）精製して、淡黄色固体として標記化合物を得た（３.７g、５４％）；融点１３３−１３４℃。¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨz、ＣＤＣl₃）δ４.４３( ｑ,Ｊ＝７.２Ｈz,２Ｈ)、４.０６(ｓ,４Ｈ)、３.１６(ｔ,Ｊ＝６.５Ｈz,２Ｈ)、３.１０(ｓ,２Ｈ)、２.７７(ｓ,３Ｈ)、２.０３(ｔ,Ｊ＝６.８Ｈz,２Ｈ)、１.４１(ｔ,Ｊ＝７.１Ｈz,３Ｈ)；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ４８２[Ｍ＋Ｈ]⁺；元素分析：Ｃ₁₈Ｈ₁₈Ｆ₃ＮＯ₇Ｓ₂についての理論値；Ｃ,４４.９０；Ｈ,３.７７；Ｎ,２. ９１；測定値：Ｃ,４５.０３；Ｈ,３.６２；Ｎ,２.８９。ｅ）８,８−エチレンジオキシ−２,３,７,８,９,１０−ヘキサヒドロ−４−メチル−１Ｈ−ベンゾ[ｂ]チエノ[２,３−ｂ]ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリジン−３− オン室温での実施例３（ｄ）の化合物（２.４g、５.０ミリモル）のメタノール（４０mＬ）中溶液にヒドラジン・一水和物（４.１g、８２.３ミリモル）を添加した。該反応混合物を還流させながら３時間加熱した。該混合物を冷却し、次いで、pＨ７水性緩衝液および酢酸エチルに分配させた。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空濃縮し、メタノール／酢酸エチルから再結晶して、淡黄色固体として標記化合物を得た（０.９９g、６０％）。¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨz、ｄ₄−ＭeＯＨ）δ４.０５(ｓ,４Ｈ)、３.１５(ｔ,Ｊ＝６.５Ｈz,２Ｈ)、３.０４(ｓ,２Ｈ)、２.８２(ｓ,３Ｈ)、２.０６(ｔ,Ｊ＝６.５Ｈz,２Ｈ)；ＭＳ( ＥＳＩ)ｍ／ｚ３１８[Ｍ＋Ｈ]⁺；元素分析：Ｃ₁₅Ｈ₁₅Ｎ₃Ｏ₃Ｓ.０.２５Ｈ₂Ｏについての理論値；Ｃ,５５.９７；Ｈ,４.８５；Ｎ,１３.０５；測定値：Ｃ,５５. ８５；Ｈ,４.７５；Ｎ,１３.３０。実施例４４−[４−(４−メチルベンゾイル)ベンゾイル]フェニルアセトアルデヒド（化合物４）の調製ａ）４−(４−メチルベンゾイル)安息香酸メチルアルゴン雰囲気下、０℃で、メチルテレフタロイルクロリド（６.２g、３１ミリモル）のトルエン２５０mＬ中溶液を塩化アルミニウム（８.０g、６０ミリモル）で処理した。該撹拌混合物を３５℃に０.５時間加温し、次いで、氷１００g にゆっくり添加し、次いで、酢酸エチル５０mL、濃ＨＣl ５０mＬおよび水５０m Ｌを添加した。相を分離し、水性部分を酢酸エチル１００mＬで２回抽出した。合した有機部分を水（２×７５mＬ）および食塩水（１×７５mＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して白色固体を得た。酢酸エチルおよびヘキサンから再結晶して、白色針状結晶として標記化合物６.０gを得た（７９％）：融点１１７−１１８℃；¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨz、ＣＤＣl₃）δ８.１５ (ｄ,Ｊ＝８.３５Ｈz,２Ｈ)、７.８３(ｄ,Ｊ＝８.３０Ｈz,２Ｈ)、７.７３(ｄ,Ｊ＝８.１８Ｈz,２Ｈ)、７.３１(ｄ,Ｊ＝８.０４Ｈz,２Ｈ)、３.９８(ｓ,３Ｈ)、２.４６(ｓ,３Ｈ)；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２５５(Ｍ＋Ｈ)⁺。ｂ）４−(４−メチルベンゾイル)安息香酸６５℃での４−(４−メチルベンゾイル)安息香酸メチル（５.００g、２０.０ミリモル）の２：１ＴＨＦ：水１５０mＬ中撹拌溶液を水酸化リチウム・一水和物（２.０g、４８ミリモル）で処理した。０.５時間後、該白濁反応混合物を室温に冷却し、酢酸エチル（３００mＬ）および１０％ＨＣl（水溶液）で処理した。有機相を分離し、水（２×５０mＬ）および食塩水（１×５０mＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して白色泡状物を得た。¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨz、ＣＤＣl₃）δ８.２２(ｄ,Ｊ＝８.３４Ｈz,２Ｈ)、７.８１(ｄ, Ｊ＝８.３１Ｈz,２Ｈ)、７.７３(ｄ,Ｊ＝８.１５Ｈz,２Ｈ)、７.３１(ｄ,Ｊ＝８ .００Ｈz,２Ｈ)、２.４６(ｓ,３Ｈ)。ｃ）４−[４−(４−メチルベンゾイル)ベンゾイル]アニソール実施例４（ｂ）の化合物のトルエン２５０mＬ中溶液を塩化オキサリル（２１. ８g、０.１７モル）で処理した。得られた混合物を２時間加熱還流させ、次いで、濃縮し、０.５mmＨgおよび２５℃で一夜静置した。次いで、この固体をアニソール１００mＬに溶解させ、０℃で塩化アルミニウム（１１.２g、８４ミリモル）で処理した。該混合物を７０℃に１時間加熱し、次いで、氷１００gにゆっくり添加し、次いで、酢酸エチル１５０mＬ、濃ＨＣl ５０mＬ、および水５０mＬを添加した。相を分離し、水性部分を酢酸エチル１００mＬで抽出した。合した有機抽出物を水（２×７５mＬ）および食塩水（１×７５mＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、白色固体を得た。酢酸エチルおよびヘキサンから再結晶して、標記化合物４.６g（７０％）を得た。融点１６７−１６９℃；¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨz、ＣＤＣl₃）δ７.８−７.９(ｍ,６Ｈ)、７. ７７(ｄ,Ｊ＝８.０６Ｈz,２Ｈ)、７.３２(ｄ,Ｊ＝８.０１Ｈz,２Ｈ)、７.０(ｄ, Ｊ＝８.７４Ｈz,２Ｈ)、３.９２(ｓ,３Ｈ)、２.４７(ｓ,３Ｈ)；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３３１(Ｍ＋Ｈ)⁺。ｄ）４−[４−(４−メチルベンゾイル)ベンゾイル]フェノール実施例４（ｃ）の化合物（７００mg、２.１２ミリモル）のジクロロメタン２０mＬ中溶液を塩化アルミニウム（１.０g、７.５ミリモル）およびジクロロメタン中１.０Ｍ三塩化ホウ素溶液７.０mＬで処理し、１時間加熱還流させた。該混合物をジクロロメタン１００mＬで希釈し、１０％ＨＣl（水溶液）（１×２５m Ｌ）、水（１×２５mＬ）および食塩水（１×２５mＬ）で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、黒ずんだ残留物を得、これをフラッシュクロマトグラフィーに付して（シリカゲル、１：１酢酸エチル：ヘキサンで溶離）、標記化合物５５０mg（８２％）を得た。¹ＨＮＭＲ(４００ＭＨz、ＣＤＣl₃)δ７.８−７.９(ｍ,６Ｈ)、７.７７(ｄ,Ｊ＝８.０５Ｈz,２Ｈ)、７. ３２(ｄ,Ｊ＝８.０１Ｈz,２Ｈ)、６.９３(ｄ,Ｊ＝８.６Ｈz,２Ｈ)、２.４７(ｓ, ３Ｈ)。ｅ）トリフルオロメチルスルホン酸４−[４−(４−メチルベンゾイル)ベンゾイル]フェニル０℃で、実施例４（ｄ）の化合物（３２０mg、１.０ミリモル）のＴＨＦ（２０mＬ）中溶液を水素化ナトリウム（４０mg、１.６７ミリモル）およびＮ−フェニルトリフルォロメタンスルホンイミド（５００mg、１.４０ミリモル）で処理した。該反応混合物を室温に加温し、次いで、室温で１８時間撹拌した。次いで、該反応物を酢酸エチルおよび食塩水に分配させた；層が分離され、有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィーに付すことにより（シリカゲル、８０：２０ヘキサン：酢酸エチル）精製して標記化合物を得た（３００mg、６６％）。融点１８０−１８１℃；¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨz、ＣＤＣl₃）δ７.９６(ｄ,Ｊ＝８.６Ｈz,２Ｈ)、７.８９(ｓ,４Ｈ)、７. ７６(ｄ,Ｊ＝８.１Ｈz,２Ｈ)、７.４５(ｄ,Ｊ＝８.６Ｈz,２Ｈ)、７.３３(ｄ,Ｊ＝８.１Ｈz,２Ｈ)、２.４７(ｓ,３Ｈ)。ｆ）４−[４−(４−メチルベンゾイル)ベンゾイル]フェニルアセトアルデヒド実施例４（ｅ）の化合物（４４５mg、１.０ミリモル）のＤＭＦ（１０mＬ）中溶液にアリルトリブチルスズ（０.３５mＬ、１.１２ミリモル）、ビス（トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)クロリド（５５mg、０.０７７ミリモル）および塩化リチウム（１２５mg、２.９５ミリモル）を添加した。該反応混合物を９０℃に１時間加熱し、室温に冷却した後、酢酸エチルおよび食塩水に分配させた。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して、所望の生成物３−[４−[４ −(４−メチルベンゾイル)ベンゾイル]フェニル]−１−プロパンおよびスズ含有副生成物からなる残留物を得た。この物質をフラッシュクロマトグラフィーに付し（シリカゲル、９５：５ヘキサン：酢酸エチルで溶離）、これにより、全てではないがほとんどのスズ不純物を除去した。第二のクロマトグラフィーに付すことにより（ヘキサン中５％〜１０％酢酸エチルの勾配液）、純粋なオレフィン１００mg（３０％）を得、次いで、これを−７８℃でジクロロメタン／メタノール（３：１、１６mＬ）に溶解させた。この溶液に５分間オゾンを吹き込んだ。ジメチルスルフィド５滴で該反応を停止させ、−７８℃で３０分間、撹拌し続けた。溶媒を蒸発させ、得られた物質をフラッシュクロマトグラフィーに付すことにより（シリカゲル、８５：１５〜７５：２５ヘキサン：酢酸エチルの勾配液で溶離）精製して、標記化合物を得た（４０mg、４０％）。融点１８８−１９０℃；¹ ＨＮＭＲ（４００ＭＨz、ＣＤＣl₃）δ９.８３(ｓ,１Ｈ)、７.８８(ｓ,４Ｈ) 、７.８６(ｄ,Ｊ＝８.１Ｈz,２Ｈ)、４.０３(ｓ,４Ｈ)、３.７３(ｓ,３Ｈ)、３. ７６(ｄ,Ｊ＝６.０Ｈz,２Ｈ)、３.００(ｓ,２Ｈ)、２.８０(ｓ,３Ｈ)、２.０３( ｄ,Ｊ＝６.０Ｈz,２Ｈ)；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３４３(Ｍ＋Ｈ)⁺。実施例５１,４−ジメチル−８,８−エチレンジオキシ−２,３,７,８,９,１０−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ベンゾ[ｂ]チエノ[２,３−ｂ]ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリジン−３ −オン（化合物５）の調製１,４−ジメチル−８,８−エチレンジオキシ−２,３,７,８,９,１０−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ベンゾ[ｂ]チエノ[２,３−ｂ]ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリジン−３ −オン室温での実施例３（ｄ）の化合物（０.４g、０.８３ミリモル）のメタノール（６.７mＬ）中溶液をメチルヒドラジン（０.１６g、３.４５ミリモル）で処理し、混合物を還流させながら２時間加熱した。該混合物を冷却し、２,４−ジメチルレジオ異性体１５０mgを含有する沈殿物を濾過した。濾液を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィーに付すことにより（シリカゲル、８０：２０：５酢酸エチル：メタノール：酢酸で溶離）精製して、黄色固体として標記化合物を得た（２２mg）。¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨz、ＣＤＣl₃）δ４.０３(ｓ,４Ｈ)、３.７３(ｓ,３Ｈ)、３.７６(ｔ,Ｊ＝６.０Ｈz,２Ｈ)、３.００(ｓ,２Ｈ)、２.８０(ｓ ,３Ｈ)、２.０３(ｔ,Ｊ＝６.０Ｈz,２Ｈ)；ＭＳ(ＥＳＩ)ｍ／ｚ３３２(Ｍ＋Ｈ)⁺ 。実施例６４−カルボキシ−ベンゾフェノン−４−カルボキシアミド−トランス−４−メチル−シクロヘキシル-Ｎ−ヘキシルカルボキサミド（化合物６）の調製ａ）Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−トランス−４−アミノメチルシクロヘキシルカルボン酸０℃で、水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ、１００ml、１００ミリモル）を４− トランス−アミノメチル−シクロヘキシル−カルボン酸（９.０g、６０ミリモル）のジオキサン（１００ml）、水（１００ml）中溶液に添加した。Ｂoc無水物（１５.９g、６６ミリモル）を添加し、該反応物を室温に加温し、一夜撹拌した。該溶液を５０mlに濃縮し、ＥtＯＡc（１００ml）で希釈し、ＫＨＳＯ₄水溶液（１Ｎ）でpＨ２に酸性化した。有機層を水（１００ml）で２回抽出し、有機物を真空下で濃縮した。固体をＥtＯＡc／ヘキサンから再結晶して、白色固体９.２g ＋３.４g（第二収量）を得た（収率８０％）。ＭＳ(ＥＳ)ｍ／ｚ２４２[Ｍ＋Ｈ ]⁺。ｂ）Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−トランス−４−アミノメチルシクロヘキシル(カイザーオキシム樹脂)カルボキシレートカイザーオキシム樹脂（２０g、０.７ミリモル／g装填、アドバンスト・ケム・テク（Ａdvanced Ｃhem Ｔech））をＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−トランス−４−アミノメチルシクロヘキシルカルボン酸（５.０g、２０ミリモル）およびＤＣＣ（４.４g、２０ミリモル）の塩化メチレン（２００ml）中溶液に添加し、室温で一夜穏やかに混合した。固体を濾過し、回収し、次いで、塩化メチレン（５×１００ml）で洗浄した。次いで、該樹脂を塩化メチレン（２００ml）に再懸濁させ、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−トランス−４−アミノメチルシクロヘキシルカルボン酸（５.０g、２０ミリモル）およびＤＣＣ（４.４g、２０ミリモル）を添加し、該反応物を一夜室温で穏やかに混合した。固体を濾過し、回収し、次いで、塩化メチレン（５×１００ml）で洗浄し、次いで、真空下で一夜乾燥させた。ＩＲ（ＫＢr、cm^-1）＝１８２０、１７７１、１５２０。ｃ）トランス−４−アミノメチルシクロヘキシル(カイザーオキシム樹脂)カルボキシレートＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−トランス−４−アミノメチルシクロヘキシル(カイザーオキシム樹脂)カルボキシレート（２０g）を塩化メチレン（１００m l）に懸濁させ、ＴＦＡ（２５ml）を添加した。該反応物を０.５時間穏やかに混合し、次いで、固体を濾過し、回収し、次いで、塩化メチレン（５×１００ml）で洗浄し、真空下で一夜乾燥した。ＩＲ（ＫＢr、cm^-1）＝３１５０、１７７０、１５２６。ｄ）４−カルボキシ−ベンゾフェノン−４−カルボキシアミド−トランス−４ −メチル−シクロヘキシル−(カイザーオキシム樹脂)カルボキシレートトランス−４−アミノメチルシクロヘキシル(カイザーオキシム樹脂)カルボキシレート（２００mg）をＤＭＦ（３.０ml）およびＮ−メチルモルホリン（０.２ ml）に懸濁させ、４,４'−ベンゾフェノンジカルボン酸（１９０mg、０.７ミリモル）およびＨＢＴＵ（２６５mg、０.７ミリモル）を添加し、該反応物を３時間穏やかに混合した。固体を濾過し、回収し、ＤＭＦ（３×２０ml）、次いで、水（３×２０ml）で洗浄し、次いで、ＤＭＦ（３.０ml）およびＮ−メチルモルホリン（０.１ml）に再懸濁させ、４,４'−ベンゾフェノンジカルボン酸（０.３５ミリモル）およびＨＢＴＵ（０.３５ミリモル）を添加し、該反応物を穏やかに３時間混合した。固体を濾過し、回収し、ＤＭＦ（３×２０ml）、次いで、水（３×２０ml）、次いで、塩化メチレン（５×２０ml）で洗浄し、次いで、真空乾燥させた。ｅ）４−カルボキシ−ベンゾフェノン−４−カルボキシアミド−トランス−４ −メチル−シクロヘキシル−Ｎ−ヘキシルカルボキシアミド４−カルボキシ−ベンゾフェノン−４−カルボキシアミド−トランス−４−メチル−シクロヘキシル−(カイザーオキシム樹脂)カルボキシレート（２００mg）を塩化メチレン（３.０ml）に懸濁させ、ヘキシルアミン（０.３ミリモル）を添加した。該反応物を３時間穏やかに混合し、次いで、濾過し、濾液を真空濃縮して、標記化合物を得た：ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ４９３[Ｍ＋Ｈ]⁺。実施例７４−ニトロ−ベンズアミド−トランス−４−メチル−シクロヘキシル−Ｎ−ヘキシルカルボキシアミド（化合物７）の調製４−ニトロ−ベンズアミド−トランス−４−メチル−シクロヘキシル−Ｎ−ヘキシルカルボキシアミド４,４'−ベンゾフェノンジカルボン酸の代わりに４−ニトロ安息香酸を用いる以外は実施例６（ａ）−（ｅ）の手順に従って、標記化合物を調製した：ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ３９０[Ｍ＋Ｈ]⁺。実施例８４−アセトアミド−ベンズアミド−トランス−４−メチル−シクロヘキシル− Ｎ−１−(アミノ−Ｒ−２−(メトキシメチル)−ピロリジン)カルボキシアミド（化合物８）の調製４,４'−ベンゾフェノンジカルボン酸の代わりに４−アセトアミド安息香酸を用い、ヘキシルアミンの代わりにＲ−１−アミノ−２−(メトキシメチル)−ピロリジン（ＲＡＭＰ）を用いる以外は実施例６（ａ）−（ｅ）の手順に従って、標記化合物を調製した：ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ３３１[Ｍ＋Ｈ]⁺。実施例９４−ホルミル−Ｅ−シンナミド−トランス−４−メチル−シクロヘキシル−Ｎ −(プロピル)カルボキシアミド（化合物９）の調製４,４'−ベンゾフェノンジカルボン酸の代わりに４−ホルミルシンナミン酸を用い、ヘキシルアミンの代わりにプロピルアミンを用いる以外は実施例６（ａ） −（ｅ）の手順に従って、標記化合物を調製した：ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ３５７[ Ｍ＋Ｈ]⁺。実施例１０２,３,７,８,９,１０−ヘキサヒドロ−４−メチル−１Ｈ−ベンゾ[ｂ]チエノ[ ２,３−ｂ]ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリジン−３−オン（化合物１０）の調製ａ）４−ヒドロキシ−２−メチル−５,６,７,８−テトラヒドロベンゾ[ｂ]チエノ[２,３−ｂ]ピリジン−２−カルボン酸エチル２−アミノ−４,５,６,７−テトラヒドロベンゾ[ｂ]チオフェン−３−カルボン酸エチル（８.９g、３９ミリモル）および３−エトキシクロトン酸エチル（１２.４g、７８ミリモル）のトルエン（３００mＬ）中溶液を樟脳スルホン酸（０. ７８g、３.４モル）で処理し、該反応混合物を、ディーン・スタークトラップを用いて還流させながら３時間加熱した。次いで、次いで、該反応混合物を室温に冷却し、次いで、新たに調製したナトリウムエトキシド（４８mＬ、４８ミリモル）の１Ｍ溶液で処理した。添加完了後、該反応混合物を還流させながら３時間加熱した。該混合物を冷却し、濃縮し、残留物を酢酸エチルに溶解させた。酢酸（２mＬ）を添加し、溶媒を蒸発させ、得られた固体をメタノールと一緒に摩砕して、オフホワイト色固体として標記化合物を得た（８.４g、７４％）：融点１４０℃；¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨz、ＣＤＣl₃）δ４.４８(ｑ,Ｊ＝７.２Ｈz,２Ｈ)、３.０４(ｂｒｓ,２Ｈ)、２.８１(ｓ,３Ｈ)、２.８０(ｂｒｓ,２Ｈ)、１. ８７(ｂｒｓ,４Ｈ)、１.４７(ｔ,Ｊ＝７.２Ｈz,３Ｈ)；元素分析：Ｃ₁₅Ｈ₁₇ＮＯ₃Ｓについての理論値:Ｃ,６１.８３；Ｈ,５.８８；Ｎ,４.８１；測定値：Ｃ, ６１.６９；Ｈ,５.８１；Ｎ,４.７３ｂ）４−クロロ−２−メチル−５,６,７,８−テトラヒドロベンゾ[ｂ]チエノ[ ２,３−ｂ]ピリジン−２−カルボン酸エチル実施例１０（ａ）の化合物（８.０g、２７.４ミリモル）のオキシ塩化リン（１００mＬ）中溶液を３.５時間還流した。オキシ塩化リンを真空下で除去し、残留油状物を酢酸エチルに溶解させ、５％重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させて、結晶性固体として標記化合物を得た（８.５g、９５％）：融点６５−６６℃；¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨz、ＣＤＣl₃）δ４.４７(ｑ,Ｊ＝７.１Ｈz,２Ｈ)、３.１０(ｂｒｓ,２Ｈ)、２.８５(ｂｒｓ,２Ｈ)、２.６０(ｓ,３Ｈ)、１.８９(ｂｒｓ,４Ｈ)、１.４３(ｔ,Ｊ＝７.１Ｈz,３Ｈ)；元素分析：Ｃ₁₅Ｈ₁₆ＣlＮＯ₂Ｓ.０.１２５Ｈ₂Ｏについての理論値；Ｃ,５７.７３；Ｈ,５.２５；Ｎ,４.４９；測定値：Ｃ,５７.６９；Ｈ, ５.０８；Ｎ,４.３０。ｃ）２,３,７,８,９,１０−ヘキサヒドロ−４−メチル−１Ｈ−ベンゾ[ｂ]チエノ[２,３−ｂ]ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリジン−３−オン実施例１０（ｂ）の化合物（２.０g、６.４ミリモル）のメタノール（５０mＬ）中溶液をヒドラジン・一水和物（１０mＬ）で処理し、得られた混合物を還流させながら１６時間加熱した。該反応物を稀塩酸水溶液上に注ぎ、黄色固体として標記化合物を沈殿させた（１.８g）。¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨz、ｄ₄−ＭeＯＨ）δ３.０１(ｂｒｓ,２Ｈ)、３.００(ｓ,２Ｈ)、２.９２(ｂｒｓ,２Ｈ)、２ .００(ｂｒｓ,４Ｈ)；元素分析Ｃ₁₃Ｈ₁₃Ｎ₃ＯＳ.ＨＣl.０.２５Ｈ₂Ｏについての理論値；Ｃ,５２.００；Ｈ,４.８７；Ｎ,１３.９９；測定値：Ｃ,５１.９２；Ｈ, ５.０１；Ｎ,１３.７０。実施例１１−ヒトＳＨ２領域での化合物の活性の測定法異なるヒトＳＨ２領域での化合物の活性は、イー・コリまたはバキュロウイルスのいずれかにおいて融合タンパク質として発現されたＳＨ２領域を用いてin v itroで測定される。本発明において用いるＳＨ２領域は、Ｓtat ６ＳＨ２領域、src ＳＨ２領域、Ｇrb２ＳＨ２領域、lck ＳＨ２領域、Ｓtat ５ＳＨ２領域、fyn ＳＨ２領域、ＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域、p８５ＳＨ２領域およびhcp ＳＨ２領域のヒト形態であった。 src ＳＨ２領域、Ｓtat ６ＳＨ２領域、lck ＳＨ２領域、Ｓtat ５ＳＨ２領域およびhcp ＳＨ２領域を含有する融合タンパク質は、一般配列：ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek-ＳＨ２（ここで、ＤＥＴ１、ＤＥＴ２、スペーサー、e kおよびＳＨ２は、以下に記載する通りである）として発現された。ＤＥＴ１（「規定エピトープ標識１」）（配列番号１）は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）エンベロープタンパク質gp１２０（またはgp１６０）においてみられる１１アミノ酸配列である。ＨＩＶ−１ gp１２０（またはgp１６０）の種々のエピトープに対するモノクローナル抗体は、当該技術分野で知られており、例えば、US特許5,166,050を参照。好ましい一例は、モノクローナル抗体１７８.１［例えば、Thiriartら，J ．Immunol.，143: 1832-1836（1989）を参照］であって、これは、ＢＨ１０株からの酵母発現ＨＩＶ−１ gp１６０分子でのマウスの免疫化により調製した［Ratnerら，Nature，313: 277-284(1985)］。この標識を発現の検出のため（ウェスタンブロットによる）、タンパク質の精製のため（アフィニティークロマトグラフィーによる）、および融合タンパク質を１７８.１抗体を用いて捕捉または固定化する配置分析のために用いた。ＤＥＴ２は、ニッケル含有樹脂と結合し、精製目的に用いたヘキサヒスチジン配列標識（配列番号２）である。構築物の所定の位置にＢamＨＩ制限部位を設計するために、スペーサー（配列番号３）を用いた。−ek−なる用語は、ＳＨ２領域から標識を所望により除去し、したがって外来アミノ酸を含まないＳＨ２領域を生じるエンテロキナーゼプロテアーゼについての認識配列（配列番号４）を意味する。外来アミノ酸を含まないＳＨ２領域は、結晶学的研究のためには標識タンパク質よりも好ましい。ＳＨ２は、種々のタンパク質のＳＨ２領域を意味する。各ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−ＳＨ２をコードするＤＮＡ配列を、所定の制限部位（BamＨＩおよびＸbaＩ）がスペーサー−ek−ＳＨ２領域と並び、これにより種々のスペーサー−ek−ＳＨ２構築物がＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−ＳＨ２標識タンパク質を生成するために以下の手順２、３、５または６において記載したベクターのいずれか１つに容易に置換できるようになるように設計した。各ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−ＳＨ２構築物をコードするＤＮＡ配列もまた、全標識ＳＨ２領域がＮdeＩ−ＸbaＩフラグメントとして、イー・コリまたはバキュロウイルス転写および翻訳調節配列の適度に離れた下流およびＸbaＩと適合するクローニング部位の下流にＮdeＩ部位を含有するいずれかの発現ベクター中に移動できるように設計した。いずれの適当なベクターでも同じような結果が得られるが（例えば、pＥＴ−１１a；ノバゲン・インコーポレイテッド（Ｎovagen，Ｉnc.））、本実験において用いたベクターは、イー・コリ発現ベクターpＥＡ１ＫnＲＢＳ３である。このベクターは、「ファージラムダ調節配列を有するベクターを用いた発現」（Shatzman，A，Gross，M，およびR osenberg，M，1990，Current Protocols in Molecular Biology(F．A．Ausubel ら編)，第16.3.1-16.3.11頁，Greene Publishing and Wiley-Interscience，N． Y.）［以下、F．A．Ausubelらと記す］に開示されている一連のベクターの誘導体である。特定のベクターpＥＡ１ＫnＲＢＳ３は、Bergsmaら，1991，J．Biol． Chem．266: 23204-23214 に開示されている。以下に、ニワトリsrc ＳＨ２領域、ヒトsrc ＳＨ２領域、ヒトＳtat ６ＳＨ２領域、ヒトlck ＳＨ２領域、ヒトＳtat ５ＳＨ２領域およびヒトhcp ＳＨ２領域の発現を説明する。まず、ニワトリsrc ＳＨ２領域をＤＥＴ１−ＤＥＴ２− スペーサー-ＳＨ２として発現した。次いで、ニワトリsrcのかわりに他のものをこのベクター中に挿入して、以下の手順１ないし６に記載したようにＤＥＴ１− ＤＥＴ２−スペーサー−ek−スペーサー−ＳＨ２の形態でタンパク質を発現した。手順１：標識ＤＥＴ１およびＤＥＴ２を含むニワトリsrc ＳＨ２領域（ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２）のクローニングおよび発現以下のプライマーを用いて、当業者に周知の方法により、ニワトリsrc遺伝子を含むcＤＮＡクローン（p５Ｈ；Levyら，1986，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 3 : 4228）から標識したタンパク質ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅した：下線部は、ＮdeＩ認識部位（５'）およびＢamＨＩ認識部位（３'）である。下線部は、ＸbaＩ認識部位である。ＰＣＲ産物をＮdeＩおよびＸbaＩで消化し、次いで、消化したフラグメントをアガロースゲル上で単離した。該フラグメントを、６.５kbpフラグメントとしてアガロースゲル精製しておいたＮdeＩ−ＸbaＩ消化pＥＡ１ＫnＲＢＳ３ベクター（Bergsmaら、前掲）中にライゲートした。ライゲーション反応を用いて、イー・コリＭＭ２９４cＩ⁺（F．A．Ausubelら、前掲）を形質転換した。正しいフラグメントの挿入を含むプラスミドを同定し、ＤＮＡ配列化により確認した。得られたプラスミドは、ファージラムダＰ_Lプロモーターおよび調節系の制御下でＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２をコードする。プラスミドＤＮＡをＭＭ２９４cＩ⁺から精製し、これを用いて、イー・コリＡＲ１２０株を形質転換した。この宿主株において、ファージプロモーターの発現は、前掲のF．A．Ausubel らに開示されているようにナリジクス酸の増殖培地への添加により誘発できる。このプラスミドを含有するＡＲ１２０のナリジクス酸誘発、次いで、クーマシー・ブルーで染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での細胞タンパク質の分析（F．A．Ausubelら、前掲）により、１５０,０００の見掛けの分子量のタンパク質バンドが出現した；このバンドは、未誘発細胞またはＰＣＲ増幅フラグメントが欠失したpＥＡ１ＫnＲＢＳ３を含有する誘発細胞においてはみられなかった。ウェスタンブロッティングで誘発タンパク質バンドが抗−ＤＥＴ１モノクローナル抗体１７８.１と反応することを確認した。手順２：標識およびエンテロキナーゼタンパク質分解開裂部位を含むヒトsrc ＳＨ２領域（ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−src ＳＨ２）のクローニング、発現および精製以下のプライマーを用いて、タンパク質ek−src ＳＨ２をコードするＤＮＡ配列を、ヒトsrc遺伝子を含むcＤＮＡクローン［Takeya，T．および Hanafusa，H. ，1983 Cell 32: 881-890 に開示されていると同一のc-src ＳＨ２ＤＮＡ配列］からＰＣＲ増幅した：下線部分は、ＢamＨＩ認識部位である。下線部分は、ＸbaＩ認識部位である。ＰＣＲ産物をＢamＨＩおよびＸbaＩで消化し、次いで、消化したフラグメントをアガロースゲル上で単離した。該フラグメントを、前記手順１に記載した標識ニワトリsrc遺伝子ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２を含むＢamＨＩ− ＸbaＩ消化発現ベクター中にライゲートした。このベクターにおいて、ＢamＨＩ部位は、ＤＥＴ２およびＳＨ２についてのコード化領域間に位置し、ＸbaＩ部位は、ＳＨ２コード化領域の３'末端の後に位置する。ライゲーション反応を用いて、イー・コリＭＭ２９４cＩ⁺を形質転換した。構築物ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−src ＳＨ２をＤＮＡ配列決定により確認し（配列番号５）、前記手順１に記載したようにしてイー・コリＡＲ１２０株において誘発した。クーマシー・ブルーで染色した、ウェスタンブロット陽性の、見掛けの分子量が１６, ０００の誘発されたタンパク質を、ナリジクス酸誘発の後に観察した。リゾチームの存在下での音波処理により、中性pＨで細胞を溶解させた。遠心分離後、可溶性抽出物をＮi⁺⁺ＮＴＡカラム上でクロマトグラフィーに付した。該カラムを平衡緩衝液（０.５ＭＮａＣlを含有するトリス緩衝液pＨ８）および１５mＭイミダゾールを含む同じ緩衝液で洗浄した後、平衡緩衝液中２５mＭイミダゾールでタンパク質を高度に精製された形態で溶離した。このようにして精製したＳＨ２領域は、高親和力で、特定の飽和しうる方法で、以下の「結合アッセイ」において適当なpＹペプチドと結合することが見いだされ、標識は、機能を妨害しないことが判明した。ヒトsrc ＳＨ２領域を選択的に抑制する化合物の特異性を測定するために、発現された融合タンパク質ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−src ＳＨ２を以下の「結合アッセイ」において用いた。手順３：標識およびエンテロキナーゼタンパク質分解開裂部位を含むヒトlck ＳＨ２領域（ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−lck ＳＨ２）のクローニングおよび発現以下のプライマーを用いて、タンパク質ek−lck ＳＨ２をコードするＤＮＡ配列をヒトlck遺伝子を含むcDＮＡクローン（遺伝子銀行受入れ番号Ｍ３６８８１）からＰＣＲ増幅した：下線部分は、ＢamＨＩ認識部位である。下線部分は、ＸbaＩ認識部位である。ＰＣＲ産物をＢamＨＩおよびＸbaＩで消化し、次いで、消化したフラグメントをアガロースゲル上で単離した。該フラグメントを、前記手順１に記載した標識ニワトリsrc遺伝子ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２を含むＢamＨＩ− ＸbaＩ消化発現ベクター中にライゲートした。このベクターにおいて、ＢamＨＩ部位は、ＤＥＴ２およびＳＨ２についてのコード化領域間に位置し、ＸbaＩ部位は、ＳＨ２コード化領域の３'末端の後に位置する。ライゲーション反応を用いて、イー・コリＭＭ２９４cＩ⁺を形質転換した。ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−lck ＳＨ２を含有する構造をＤＮＡ配列決定により確認し(配列番号６) 、前記手順１に記載したようにしてイー・コリＡＲ１２０株において誘発した。クーマシー・ブルーで染色した、ウェスタンブロット陽性の、見掛けの分子量が１７,０００の誘発されたタンパク質を、ナリジクス酸誘発の後に観察した。リゾチームの存在下での音波処理により、中性pＨで細胞を溶解させた。遠心分離後、可溶性抽出物をＮi⁺⁺ＮＴＡカラム上でクロマトグラフィーに付した。該カラムを平衡緩衝液（０.５ＭＮａＣlを含有するトリス緩衝液pＨ８）および１５mＭイミダゾールを含む同じ緩衝液で洗浄し、平衡緩衝液中２５mＭイミダゾールでタンパク質を高度に精製された形態で溶離した。このようにして精製したＳＨ２領域は、高親和力で、特定の飽和しうる方法で、以下の「結合アッセイ」において適当なpＹペプチドと結合することが見いだされ、標識は、機能を妨害しないことが判明した。ヒトlck ＳＨ２領域を選択的に抑制する化合物の特異性を測定するために、この発現された融合タンパク質、ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−lck ＳＨ２を以下の「結合アッセイ」において用いた。手順４：標識およびエンテロキナーゼタンパク分解開裂部位を含むヒトhcp ＳＨ２領域（ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−hcp ＳＨ２）のクローニングおよび発現ヒト胎児肝臓ＲＮＡからタンパク質ek−hcp ＳＨ２をコードするＤＮＡ配列［ Shen，S-H．Nature（1991）352: 736-739に開示されたものと同一のhcp ＳＨ２ＤＮＡ配列］を逆転写酵素−ＰＣＲ増幅した。ＲＮＡ単離は、トリーリージェント（Ｔri−Ｒeagent）（モレキュラ・リサーチ・センター・インコーポレイテッド（Ｍolevular Ｒesearch Ｃenter Ｉnc.））およびリバース・トランスクリプターゼ・システム（ギブコ−ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ））を製造業者の指示に従って用いた。ＰＣＲを以下のプライマーを用いて行った：下線部分は、ＢglII認識部位である。下線部分は、ＸbaＩ認識部位である。ＰＣＲ産物をＢglIIおよびＸbaＩで消化し、次いで、消化したフラグメントをアガロースゲル上で単離した。該フラグメントを、前記手順２に記載した標識ヒトsrc遺伝子ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−scr ＳＨ２を含むＢamＨＩ −ＸbaＩ消化発現ベクター中にライゲートした。このベクターにおいて、ＢamＨＩ部位は、ＤＥＴ２およびekについてのコード化領域間に位置し、ＸbaＩ部位は、ＳＨ２コード化領域の３'末端の後に位置する。このように、ek−hcp ＳＨ２配列は、前記ベクターにおいてek−src ＳＨ２配列と置き変わっていた。ライゲーション反応を用いて、イー・コリＭＭ２９４cＩ⁺を形質転換した。ＤＥＴ１− ＤＥＴ２−スペーサー−ek−hcp ＳＨ２を含有する構造をＤＮＡ配列決定により確認し（配列番号７）、これを用いて、イー・コリＧＩ６９８（カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン・コーポレーション(Ｉnvitrogen Ｃorporatio n)）を形質転換した。ファージラムダプロモータの誘発を、製造業者の指示通りに、培地にトリプトファンを１０mg／mlまで添加することにより誘発した。クーマシー・ブルーで染色した、ウェスタンブロット陽性の、見掛けの分子量が１５ ,０００の誘発されたタンパク質を、３０℃で増殖する細胞のトリプトファン誘発の後に観察した。リゾチームの存在下での音波処理により、中性pＨで細胞を溶解させた。遠心分離後、可溶性抽出物をトリス緩衝液pＨ８中８Ｍ尿素で可溶化し、Ｎi⁺⁺ＮＴＡカラム上に結合させた。該樹脂を平衡緩衝液（０.５ＭＮaＣl、８Ｍ尿素および５mＭＢＭＥを含有するトリス緩衝液pＨ８）および１５mＭイミダゾールを含む同じ緩衝液で洗浄した。タンパク質は、５mＭＢＭＥの存在下で尿素の除去中にカラム上に再生され、精製された再生タンパク質をトリス緩衝液pＨ８中の３００mＭイミダゾールで溶離した。このようにして精製したＳＨ２領域は、高親和力で、特定の飽和しうる方法で、以下の「結合アッセイ」において適当なpＹペプチドと結合することが見いだされ、標識は、機能を妨害しないことが判明し、タンパク質は、うまく再生された。ヒトhcp ＳＨ２領域を選択的に抑制する化合物の特異性を測定するために、この発現された融合タンパク質、ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−hcp ＳＨ２を以下の「結合アッセイ」において用いた。手順５：標識およびエンテロキナーゼタンパク分解開裂部位を含むヒトＳtat ６ＳＨ２領域（ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−Ｓtat ６ＳＨ２）のクローニング、発現および精製以下のプライマーを用いて、タンパク質ek-Ｓtat ６−ＳＨ２をコードするＤＮＡ配列をヒトＳtat ６遺伝子を含むｃＤＮＡ［Science 265,（1994）1701に記載されているものと同一のＳtat ５ＳＨ２ＤＮＡ配列］からＰＣＲ増幅した：下線部分は、ＢamＨＩ認識部位である。下線部分は、ＸbaＩ認識部位である。ＰＣＲ産物をＢamＨＩおよびＸbaＩで消化し、次いで、消化したフラグメントをアガロースゲル上で単離した。該フラグメントを、前記手順２に記載した標識したヒトsrc遺伝子ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−src ＳＨ２を含む発現ベクターのＢamＨＩ−ＸbaＩ消化由来のベクターフラグメントとライゲートした。このベクターにおいて、ＢamＨＩ部位は、ＤＥＴ２およびＳＨ２についてのコード化領域間に位置し、ＸbaＩ部位はＳＨ２コード化領域の３'末端の後に位置する。ライゲーション反応を用いて、イー・コリＭＭ２９４cＩ⁺を形質転換した。構築物ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−Ｓtat ６ＳＨ２をＤＮＡ配列決定により確認し（配列番号２９）、イー・コリＧＩ６９８（カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン・コーポレイション）において誘発した。ファージラムダプロモーターの誘発は、手順４に記載しているように、製造業者の指示通りに、培地に１０mg／mlになるようにトリプトファンを添加することにより誘発した。クーマシー・ブルーで染色した、ウェスタンブロット陽性の、見掛けの分子量が１５,０００の誘発されたタンパク質を、２７℃で増殖する細胞のトリプトファン誘発の後に観察した。リゾチームの存在下での音波処理により、中性pＨで細胞を溶解させた。遠心分離後、可溶性抽出物をＮi⁺⁺ＮＴＡカラム上でクロマトグラフィーに付した。該樹脂を平衡緩衝液（０.５ＭＮａＣlを含有するトリス緩衝液pＨ８）および１５mＭイミダゾールを含む同じ緩衝液で洗浄した後、タンパク質を平衡緩衝液中の２５mＭイミダゾールで高度に精製された形態で溶離した。ヒトＳtat ６ＳＨ２領域を選択的に抑制する化合物の特異性を測定するために、以下の「結合アッセイ」において、この発現された融合タンパク質ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−Ｓtat ６ＳＨ２を用いた。手順６：標識およびエンテロキナーゼタンパク分解開裂部位を含むヒトＳtat ５ＳＨ２領域（ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−Ｓtat ５ＳＨ２）のクローニング、発現および精製 Rosenら，Bio．Techniques 9,（1990）298-300に記載されている公知の手順に従って、タンパク質ek-Ｓtat ５ −ＳＨ２をコードするＤＮＡ配列［Hou，Jら， Immunity 2,（1995）321-329 に記載されているものと同一のＳtat ５ＳＨ２ＤＮＡ配列］（配列番号３０）を合成した。得られた遺伝子のコード化鎖のＤＮＡ配列は以下の通りである：ＢamＨＩおよびＸbaＩの認識部位を前記配列において下線で示した。 ek-Ｓtat ５ −ＳＨ２遺伝子配列をＢamＨＩおよびＸbaＩで消化し、次いで、消化したフラグメントをアガロースゲル上で単離した。該フラグメントを、前記手順２に記載した標識ヒトsrc遺伝子ＤＥＴＩ−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−src ＳＨ２を含む発現ベクターのＢamＨＩ−ＸbaＩ消化により得られたベクターフラグメントとライゲートした。このベクターにおいて、ＢamＨＩ部位は、ＤＥＴ２およびＳＨ２についてのコード化領域間に位置し、ＸbaＩ部位は、ＳＨ２コード化領域の３'末端の後に位置する。ライゲーション反応を用いて、イー・コリＭＭ２９４cＩ⁺を形質転換した。構築物ＤＥＴＩ−ＤＥＴ２−スペーサー−ek− Ｓtat ５ＳＨ２をＤＮＡ配列決定により確認し（配列番号３２）、イー・コリＧＩ６９８（カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン・コーポレーション）において誘発させた。ファージラムダプロモータの誘発を、手順４に記載しているように、製造業者の指示通りに、培地にトリプトファンを１０mg／mlまで添加することにより誘発した。クーマシー・ブルーで染色した、ウェスタンブロット陽性の、見掛けの分子量が１５,０００の誘発されたタンパク質を、２７℃ で増殖する細胞のトリプトファン誘発の後に観察した。リゾチームの存在下での音波処理により、中性pHで細胞を溶解させた。遠心分離後、可溶性抽出物をＮi⁺⁺ＮＴＡカラム上でクロマトグラフィーに付した。カラムを平衡緩衝液（０.５ＭＮaＣlを含有するトリス緩衝液pＨ８）および１５mＭイミダゾールを含む同じ緩衝液で洗浄した後、タンパク質を平衡緩衝液中の２５mＭイミダゾールで高度に精製された形態で溶離した。ヒトＳtat ５ＳＨ２領域を選択的に抑制する化合物の特異性を測定するために、以下の「結合アッセイ」において、この発現された融合タンパク質、ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ek−Ｓtat ５ＳＨ２を用いた。構造ＧＳＴ−Ｘ−ＳＨ２を有する融合タンパク質をファルマシア（Ｐharmacia ）（ニュージャージー）より入手可能なＧＳＴ遺伝子融合キットにおいて記載されているようにして調製する。ＧＳＴは、fyn、Ｇrb２およびＳＨ−ＰＴＰ２に関する標識配列グルタチオンｓ−トランスフェラーゼエピトープ（配列番号８）であり、p８５についての標識配列グルタチオンｓ−トランスフェラーゼエピトープ（配列番号９）である。ＳＨ２は、「分子生物学における現行プロトコル」（FM Ausubelら編，John Wiley and Sons,Inc.発行，(1995)，第16.7.1頁）に従って、グルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシア）を用いて発現させ精製したfyn、Ｇrb２、p８５およびＳＨ−ＰＴＰ２のＳＨ２領域を意味する。Ｘは、フレーム内および補体クローニングにおいてＳＨ２構築物を維持するのに用いられる、好ましくは６ないし２１塩基対の、適当なリンカーである。このように、Ｘの配列は重要ではない。当業者は、容易に適当なリンカーを構築できる。各ＧＳＴ−Ｘ−ＳＨ２融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、所定の制限部位（Ｂ amＨＩおよびＥcoＲＩ）がＳＨ２領域に並ぶように設計した。本実験において用いたベクターは、fyn、Ｇrb２およびＳＨ−ＰＴＰ２についてはイー・コリ発現ベクターpＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシア）、ｐ８５についてはpＧＥＸ−３Ｘ（ファルマシア）であった。これらのベクターのそれぞれから、さらに以下に記載するＣ末端アミノ酸を有するＳＨ２構築物が得られる。ヒトfynのＳＨ２領域をコードする配列（アミノ酸１４３−２５２）［Yamamot o，T.ら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 83，5459-5463(1986)］を発現ベクターp ＧＥＸ−２ＴのＢamＨＩおよびＥcoＲＩサイト中にクローン化した。当業者に周知のＰＣＲ技術により、追加のＣ末端アミノ酸ロイシン−トレオニン−アスパラギン−セリン−セリンを含むＳＨ２領域（配列番号１０）をクローン化して、発現された融合タンパク質ＧＳＴ−Ｘ−fynを得た。次いで、化合物のヒトfyn ＳＨ２領域を選択的に抑制する特異性を測定するために、以下に記載する「結合アッセイ」において、この発現された融合タンパク質を用いた。ヒトp８５ＳＨ２領域：ヒトp８５のＳＨ２領域をコードする配列（アミノ酸３２１−４４０）［Skolnik，E.ら，Cell 65，83-90(1991)］を発現ベクターpＧＥＸ−３ＸのＢamＨＩおよびＥcoＲＩサイト中にクローン化した。当業者に周知のＰＣＲ技術により、追加のＣ末端アミノ酸アスパラギン−セリン−セリンを含むＳＨ２領域（配列番号１１）をクローン化して、発現された融合タンパク質ＧＳＴ−Ｘ−p８５を得た。ヒトp８５ＳＨ２領域を選択的に抑制する化合物の特異性を測定するために、以下に記載する「結合アッセイ」において、この発現された融合タンパク質を用いた。ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域：ヒトＳＨ−ＰＴＰ２のＳＨ２領域をコードする配列（アミノ酸１−１０６）［Bastien，L．ら，Biochem ．Biophys．Res．C ommun. 196，124-133(1993)］を発現ベクターpＧＥＸ−２ＴのＢamＨＩおよびＥ coＲＩサイト中にクローン化した。当業者に周知のＰＣＲ技術により、追加のＣ末端アミノ酸グルタミン−フェニルアラニン−イソロイシン−バリン−トレオニン−アスパラギン酸塩を含むＳＨ２領域（配列番号１２）をクローン化して、発現された融合タンパク質ＧＳＴ−Ｘ−ＳＨ−ＰＴＰ２を得た。次いで、ヒトＳＨ −ＰＴＰ２ＳＨ２領域を選択的に抑制する化合物の特異性を測定するために、以下に記載する「結合アッセイ」において、この発現された融合タンパク質を用いた。ヒトＧrb２ＳＨ２領域：ヒトＧrb２のＳＨ２領域をコードする配列（アミノ酸５８−１５９）［Lowenstein，E．ら，Cell 70，431-442(1992)］を発現ベクターpＧＥＸ−２ＴのＢamＨＩおよびＥcoＲＩサイト中にクローン化した。当業者に周知のＰＣＲ技術により、追加のＣ末端アミノ酸イソロイシン−ヒスチジン −アルギニン−アスパラギン酸塩を含むＳＨ２領域（配列番号２５）をクローン化して、発現された融合タンパク質ＧＳＴ−Ｘ−Ｇrb２を得た。６個のヌクレオチドリンカーを用い、その結果、ＧＳＴおよびＳＨ２領域の間にアミノ酸グリシンおよびセリンが得られた。ヒトＧrb２ＳＨ２領域を選択的に抑制する化合物の特異性を測定するために、以下に記載する「結合アッセイ」において、この発現された融合タンパク質を用いた。結合アッセイ：ＳＨ２領域での化合物の能力を、かかるＳＨ２領域がそのそれぞれの特異的pＹペプチドと結合するのを選択的に抑制するこのような化合物の能力に基づいて測定した。ＳＨ２領域およびpＹペプチドについての結合アッセイを、ＥＬＩＳＡベースの９６ウエルプレートアッセイにおいて行った。ミリポア（Ｍilipore）９６ウェ５um カタログ番号ＭＡＤＶＮ６５５０）にプロテイン−Ｇセファロース（Ｐro tein−ＧＳepharose）（ニューシャージー州のファルマシアから入手可能、カタログ番号１７−０６１８−０１）２ul（５０％懸濁液）および２mg／mlのＭＡＢ１７８.１（gp１２０／ＳＨ２領域融合タンパク質src、lck、Ｓtat ５、Ｓtat ６およびhcpについて）２ulまたは抗−ＧＳＴポリクローナル抗血清（ニューシャージー州のファルマシアから入手可能）（ＧＳＴ／ＳＨ２領域融合タンパク質 fyn、Ｇrb２、p８５およびＳＨ−ＰＴＰ２について）０.２５ulのいずれかを添加する。１０ピコモルの対象ＳＨ２領域融合タンパク質を各ウェルに添加する。体積をＴＢＳ−Ｔ（トリス緩衝生理食塩水＋０.０５％トゥイーン−２０）で１００ulにし、インキュベートし、室温で１時間振盪し、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（４ ℃）で１回洗浄する。次いで、ＴＢＳ−Ｔ９０ulのを各ウェルに添加する。特異的pＹビオチニル化ペプチドをＴＢＳ−Ｔ中１.０uＭの濃度に希釈する（これらのペプチドは、ペンシルベニア州のベイチェム・バイオサイエンス（Ｂachem Ｂ ioscience）、テキサス州のゲノシス・バイオテクロジーズ（Ｇenosys Ｂiotech nologies）およびカリフォルニア州のカリフォルニア・ペプタイド・リサーチ（Ｃalifornia Ｐeptide Ｒesearch）から入手できる）。各ウエル当たり１０ulのアリコットを採取し、最終濃度０.１uＭ（各ＳＨ２領域／ペプチド対についてのおよそのＫ_d）および最終体積１００ulを得る。アッセイプレートを、平衡結合が達成されるまでインキュベートする（振盪しながら４℃ で３時間）。アッセイプレートをウエルごとにＴＢＳ−Ｔ（４℃）で２回洗浄し、次いで、ウエルにつきＳＡＢＣ（ストレプトアビジンビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体、カリフォルニア州のツィムド・コーポレイション（Ｚymed Ｃorporation）から入手可能、カタログ番号９０−００４３、ＴＢＳ−Ｔ１０mlにつき試薬Ａ（ストレプトアビジン）１滴および試薬Ｂ（ＡＨ −ビオチンコンジュゲートホースラディッシュペルオキシダーゼ）１滴を３７℃ で３０分間インキュベートし、次いで、４℃に冷却した）１００ulを添加し、次いで、４℃で３０−６０分間インキュベートする。次いで、該プレートをＴＢＳ −Ｔ（４℃）（２５０ul／ウエル／洗浄）で洗浄する。ウエルにつきクエン酸緩衝液中１mg／mlのＯＰＤ（ｏ−フェニルジアミン、ミズーリ州セント・ルイスのシグマ・ケミカル・コーポレイション（Ｓigma Ｃhemical Ｃorporation））１００ulを添加する。増殖を停止させるために、ウエルにつき１０％硫酸１００ul を添加する。次いで、各ウエルから１５０ulをアッセイプレートから取り出し、ＥＬＩＳＡプレートに移す。次いで、各ＥＬＩＳＡプレートのＡ₄₉₀を測定する。表Ｉに関する（ＩＣ₅₀）の測定各対照または化合物を二重試験でアッセイする。二重試験値を平均し、バックグラウンドを差し引き、抑制のない最大値をプレートから取り出し、次いで、他の全データを最大値のパーセント（または対照％）として表す。これらの対照データ（％）をマッキントッシュのカレイダグラフ（Ｋaleidagraph）（シナージー・ソフトウェア（Ｓynergy Ｓoftware））でグラフ化する。これらのグラフの曲線を以下の式：Ｆ(ｘ)＝Ｅmax／(１＋(ｋ_d／濃度)＾勾配)(式中、ｋ_dは、各曲線のＩＣ₅₀をあらわす)で非線形曲線に適合させる。第II表に関する（Ｋi）の測定各化合物についてのＫiを以下の式（下記参照）により計算する。pＹビオチニル化ペプチドは、ＳＨ２領域融合タンパク質よりも非常に過剰濃度（１００Ｘ）でないので、この拡張公式は、このアッセイの条件下で用いなければならない。ＩＣ₅₀はカレイダグラフを用いた非線形曲線適合から外挿された値である。Ｒtotおよび*Ｄは、アッセイに使用した試薬について既知の値である。ＫＤは、一般に、ＳＨ２領域融合タンパク質とpＹビオチニル化ペプチドとの各組み合わせについて実験的に決定しなければならない。ＫＩ＝(ＩＣ₅₀−Ｒtot＋Ｒtot/２((*Ｄ/(ＫＤ＋*Ｄ))＋(ＫＤ/(ＫＤ＋*Ｄ＋Ｒto t/２)))/(１＋*Ｄ/ＫＤ＋Ｒtot/ＫＤ((ＫＤ＋*Ｄ/２)/(ＫＤ＋*Ｄ))) ＫＩ＝競争相手のＫＤ（uＭ）。ＩＣ₅₀＝抑制物質についてのＩＣ₅₀（uＭ）（各ＳＨ２領域についての競合選択性アッセイデータの非直線的曲線適合により得られる）。Ｒtot＝１アッセイ（マイクロタイタープレート）ウエル内の全ＳＨ２領域濃度（uＭ）。 *Ｄ＝各ＳＨ２領域についての特異的pＹおよびビオチニル化ペプチドの濃度（u Ｍ）。ＫＤ＝各ＳＨ２領域についての特異的pＹおよびビオチニル化ペプチドについてのＫＤ値（uＭ）。ＩＣ₅₀は、応答またはシグナルが５０％抑制される抑制物質の濃度である。ＫＤは、レセプター／リガンド相互作用におけるリガンドの解離定数であり、一般に、飽和結合曲線上の１／２Ｖmaxでのリガンドの濃度に等しい。前記結合アッセイにおいて用いるpＹペプチドリガンドは、以下の通りである：src、lck、およびfyn ＳＨ２領域について使用したアミノカプロン酸（Ａca）リンカーを含むビオチニル化pＹペプチドリガンド p８５ＳＨ２領域について使用したアミノカプロン酸（Ａca）リンカーを含むビオチニル化pＹペプチドリガンドＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域について使用したアミノカプロン酸（Ａca）リンカーを含むビオチニル化pＹペプチドリガンド hcp ＳＨ２領域について使用したアミノカプロン酸（Ａca）リンカーを含むビオチニル化pＹペプチドリガンドＧrb２ＳＨ２領域について使用したアミノカプロン酸（Ａca）リンカーを含むビオチニル化pＹペプチドリガンドＳtat ６について使用したアミノカプロン酸（Ａca）リンカーを含むビオチニル化pＹペプチドリガンド：Ｓtat ５について使用したアミノカプロン酸（Ａca）リンカーを含むビオチニル化pＹペプチドリガンド：結合アッセイの結果：表ＩおよびIIは、所定のＳＨ２領域でのＳＨ２拮抗物質の交差反応性を表す。これらの表に示した結果から、Ｓtat ５ＳＨ２領域で、他のＳＨ２領域での結合親和力よりも５０倍以上高い結合親和力を有する化合物を容易に同定できることが明らかになった。Ｓtat ５についての適切な選択性リガンドを同定した後、当業者によく知られている方法により二官能性スペーサー１分子にリガンド２分子を結合させることによって、ダイマー形態を調製する。該スペーサーのサイズを変え、刺激されない細胞抽出物を化合物と一緒にインキュベートし、Houら，Immunity 2，(1995) ，321〜329に開示されているＤＮＡゲルシフトアッセイにおいてＳtat ５活性化についてアッセイすることによって測定した場合のＳtat ５の活性化を最適化する。二歯のリガンドとのダイマー活性化によって、他のＳtat ＳＨ２領域（詳細には、Ｓtat １、Ｓtat ２、Ｓtat ３、Ｓtat ４およびＳtat ６）を活性化する方法も本明細書において考慮される。本発明の好ましい具体例を前記記載事項により説明したが、本発明は、本明細書中の内容に制限されるものではなく、以下の請求の範囲内のあらゆる変更もその範囲に含まれると考えられる。

【手続補正書】【提出日】１９９７年１２月２６日【補正内容】ｈ）Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−４−(tert−ブトキシカルボニル)フェニルグリシンメチルエステル実施例１（ｆ）の化合物（１.０g、３.２ミリモル）およびＮ,Ｎ'−ビス(１− メチルエチル)カルバミミジン酸１,１−ジメチルエチル（１.３mg、６.５ミリモル）の乾燥ジクロロメタン中溶液を室温で一夜撹拌した。ジイソプロピル尿素を濾過し、過剰のＮ,Ｎ'−ビス(１−メチルエチル)カルバミミジン酸１,１−ジメチルエチルを水で分解した。層を分離し、ジクロロメタン溶液を５％重炭酸ナトリウム水溶液および食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させ、残留物をジエチルエーテルで処理した。さらにジイソプロピル尿素を濾過し、有機濾液を蒸発させて、油状物として標記化合物を得た（８７０mg、７４％）。ｉ）Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−４−(tert−ブトキシカルボニル)フェニルグリシン実施例１（ｈ）の化合物（７６０mg、２.１ミリモル）の５％重炭酸ナトリウム水溶液１８mＬ、５％炭酸ナトリウム水溶液１８mＬおよびメタノール３６mＬ中溶液を室温で一夜５時間撹拌した。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで洗浄し、該水溶液を新しい酢酸エチルで覆い、３ＮＨＣlでpＨ２に酸性化した。層を分離し、水溶液を酢酸エチルでさらに２回抽出した。酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて、白色固体として標記化合物を得た（６００mg、８２％）：融点７７−７９℃。ｊ）７−アミノ−３−[２−(５−メチル−１,３,４−チアジアゾリル)チオメチル]△³−セフェム−４−カルボン酸tert−ブチル７−アミノセファロスポラン酸tert−ブチル（Blacklockらの手順（J．Org．C hem．1989，54，3907）に従って、７−アミノセファロスポラン酸から、１,２− ジメトキシエタン中のイソブチレンおよび硫酸との反応によって調製した）、重炭酸ナトリウムおよび２−メルカプト−５−メチル−１,３,４−チアジアゾールのリン酸緩衝液（pＨ６.４）中溶液を６０℃で６時間撹拌した。塩酸水溶液／酢酸エチルでの抽出により反応混合物を処理して標記化合物を得た。ｋ）７−[Ｄ,Ｌ−α−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)−α−[４−(tert− ブトキシカルボニル)フェニル]]アセトアミド−３−[２−(５−メチル−１,３, ４−チアジアゾリル)チオメチル]△³−セフェム−４−カルボン酸tert−ブチル実施例１（ｉ）のＮ−tert−ブトキシカルボニル−４−(tert−ブトキシカルボニル)フェニルグリシン（３５１mg、１ミリモル）、実施例１（ｊ）の７−アミノ−３−[２−(５−メチル−１,３,４−チアジアゾリル)チオメチル]△³−セフェム−４−カルボン酸tert−ブチル（３６８mg、１ミリモル）およびＤＣＣ（２１２mg、１ミリモル）の乾燥ジクロロメタン中混合物を

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/435 Ａ６１Ｋ 31/435 // Ｃ０７Ｄ 207/50 Ｃ０７Ｄ 207/50 495/14 495/14 Ｄ 495/22 495/22 501/36 １０７ 501/36 １０７ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．治療上有効量の、ａ．ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し；ｂ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域と結合し；ｃ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域と結合し；ｄ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトp８５ＳＨ２領域と結合し；ｅ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトＧrb２ＳＨ２領域と結合し；ｆ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域と結合し；ｇ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトlck ＳＨ２領域と結合し；ｈ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトfyn ＳＨ２領域と結合する化合物を患者に投与することを特徴とする、患者における赤血球形成の増強方法。２．患者に治療上有効量の、ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することからなる請求項１記載の方法。３．治療上有効量の、ａ．ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し；ｂ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域と結合し；ｃ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域と結合し；ｄ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトp８５ＳＨ２領域と結合し；ｅ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトＧrb２ＳＨ２領域と結合し；ｆ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域と結合し；ｇ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトlck ＳＨ２領域と結合し；ｈ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトfyn ＳＨ２領域と結合する化合物を患者に投与することからなる請求項１記載の方法。４．患者に治療上有効量の、ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することからなる請求項３記載の方法。５．治療上有効量の、ａ．ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し；ｂ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域と結合し；ｃ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域と結合し；ｄ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトp８５ＳＨ２領域と結合し；ｅ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトＧrb２ＳＨ２領域と結合し；ｆ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域と結合し；ｇ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトlck ＳＨ２領域と結合し；ｈ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトfyn ＳＨ２領域と結合する化合物を患者に投与することを特徴とする、患者における貧血の治療方法。６．患者に治療上有効量の、ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することからなる請求項５記載の方法。７．治療上有効量の、ａ．ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し；ｂ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域と結合し；ｃ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域と結合し；ｄ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトp８５ＳＨ２領域と結合し；ｅ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトＧrb２ＳＨ２領域と結合し；ｆ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域と結合し；ｇ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトlck ＳＨ２領域と結合し；ｈ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトfyn ＳＨ２領域と結合する化合物を患者に投与することからなる請求項５記載の方法。８．患者に治療上有効量の、ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することからなる請求項７記載の方法。９．治療上有効量の、ａ．ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し；ｂ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域と結合し；ｃ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域と結合し；ｄ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトp８５ＳＨ２領域と結合し；ｅ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトＧrb２ＳＨ２領域と結合し；ｆ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域と結合し；ｇ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトlck ＳＨ２領域と結合し；ｈ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトfyn ＳＨ２領域と結合する化合物を患者に投与することを特徴とする、患者における造血の増強方法。１０．患者に治療上有効量の、ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することからなる請求項９記載の方法。１１．治療上有効量の、ａ．ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し；ｂ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域と結合し；ｃ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域と結合し；ｄ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトp８５ＳＨ２領域と結合し；ｅ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトＧrb２ＳＨ２領域と結合し；ｆ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域と結合し；ｇ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトlck ＳＨ２領域と結合し；ｈ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトfyn ＳＨ２領域と結合する化合物を患者に投与することからなる請求項９記載の方法。１２．患者に治療上有効量の、ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する化合物を投与することからなる請求項１１記載の方法。１３．ａ．ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し；ｂ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域と結合し；ｃ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域と結合し；ｄ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトp８５ＳＨ２領域と結合し；ｅ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトＧrb２ＳＨ２領域と結合し；ｆ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域と結合し；ｇ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトlck ＳＨ２領域と結合し；ｈ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトfyn ＳＨ２領域と結合する化合物の赤血球形成の増強薬の製造における使用。１４．化合物が、ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する請求項１３記載の使用。１５．化合物が、ａ．ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し；ｂ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域と結合し；ｃ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域と結合し；ｄ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトp８５ＳＨ２領域と結合し；ｅ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトＧrb２ＳＨ２領域と結合し；ｆ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域と結合し；ｇ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトlck ＳＨ２領域と結合し；ｈ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトfyn ＳＨ２領域と結合する請求項１３記載の使用。１６．化合物が、ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する請求項１５に記載の使用。１７．ａ．ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し；ｂ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域と結合し；ｃ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域と結合し；ｄ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトp８５ＳＨ２領域と結合し；ｅ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトＧrb２ＳＨ２領域と結合し；ｆ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域と結合し；ｇ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトlck ＳＨ２領域と結合し；ｈ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトfyn ＳＨ２領域と結合する化合物の貧血の治療薬の製造における使用。１８．化合物が、ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する請求項１７記載の使用。１９．化合物が、ａ．ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し；ｂ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域と結合し；ｃ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域と結合し；ｄ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトp８５ＳＨ２領域と結合し；ｅ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトＧrb２ＳＨ２領域と結合し；ｆ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域と結合し；ｇ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトlck ＳＨ２領域と結合し；ｈ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトfyn ＳＨ２領域と結合する請求項１７記載の使用。２０．化合物が、ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する請求項１９記載の使用。２１．ａ．ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し；ｂ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域と結合し；ｃ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域と結合し；ｄ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトp８５ＳＨ２領域と結合し；ｅ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトＧrb２ＳＨ２領域と結合し；ｆ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域と結合し；ｇ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトlck ＳＨ２領域と結合し；ｈ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上低い結合親和力でヒトfyn ＳＨ２領域と結合する化合物の造血の増強薬の製造における使用。２２．化合物が、ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より５０倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する請求項２１記載の使用。２３．化合物が、ａ．ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合し；ｂ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトhcp ＳＨ２領域と結合し；ｃ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２領域と結合し；ｄ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトp８５ＳＨ２領域と結合し；ｅ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトＧrb２ＳＨ２領域と結合し；ｆ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトsrc ＳＨ２領域と結合し；ｇ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトlck ＳＨ２領域と結合し；ｈ．該Ｓtat ５ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上低い結合親和力でヒトfyn ＳＨ２領域と結合する請求項２１記載の使用。２４．化合物が、ヒトＳtat ６ＳＨ２領域と結合する結合親和力より１００倍以上高い結合親和力でヒトＳtat ５ＳＨ２領域と結合する請求項２３記載の使用。