KR19980702115A

KR19980702115A - 자기면역 질환 및 동종이식 거부 치료를 위한 ｌｃｋｓｈ２ 특이성 화합물의 용도

Info

Publication number: KR19980702115A
Application number: KR1019970705510A
Authority: KR
Inventors: 다미엔 존 듀닝턴
Original assignee: 스튜어트 알. 스터; 스미스클라인 비참 코포레이션
Priority date: 1995-02-10
Filing date: 1996-02-09
Publication date: 1998-07-15
Also published as: HUP9802078A3; CA2212645A1; NO973659L; FI973259A; FI973259A0; HUP9802078A2; JPH10513474A; EP0809490A4; EP0809490A1; BR9607614A; JPH10513564A; EP0811159A1; WO1996024343A1; AU4923796A; NO973659D0

Abstract

본 발명은 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며, 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인, 사람의 Grb2 SH2 도메인, 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인 및 사람의 p85 SH2 도메인과 결합하는 화합물의 치료상 효과적인 양을 투여하여, 자기면역 질환을 치료하는 방법이다.

Description

자기면역 질환 및 동종이식 거부 치료를 위한 ＬＣＫＳＨ２ 특이성 화합물의 용도

발명의 배경

src-관련, 임파구 특이성 단백질 티로신 키나아제인 p56^lck(lck)는 자신의 고유한 아미노 말단 도메인을 통해 T 임파구의 CD4의 세포질 말단 (cytoplasmic tail)에 물리적으로 결합한다. CD4 결합된 lck는 T 세포 활성화 케스케이드에서 필수적인 성분이며, 본래의 lck SH2 도메인/CD4 복합체는 항원에 대한 T 세포의 기능적 면역반응 (functional immune response)에 필요하다. lck SH2 도메인/CD4 복합체를 저해시키면 T-세포 특이적 면역억제를 낳는다.

많은 폴리펩티드 성장 인자 및 호르몬이 신호 전달 경로 (signal transduction pathway)를 통해 이들이 세포에 미치는 효과를 매개한다. 이러한 리간드에 대해 세포 표면 수용체로부터 세포내 작용인자로의 신호 전달은 자주, 조절 단백질 티로신 키나아제 (PTK) 및 포스파타아제에 의한 특이 단백질 기질의 인산화 또는 탈인산화를 포함한다. 티로신 인산화는 다세포 유기체에서 제1차, 또는 아마도 단독일 때조차도 신호 전달의 지표가 될 수 있다. 수용체에 결합된 세포내 PTK는 세포 증식, 세포 분화 및 면역체계 세포 내의 신호전달 과정을 조절한다.

단백질 티로신 키나아제의 비정상적인 활성은 당뇨병, 죽상동맥경화증, 건선, 폐혈증성 쇼크, 뼈 손실, 빈혈증, 많은 암 및 기타 증식성 질병 등의 많은 병리에 연루되어 있음이 밝혀졌으며 질병의 원인으로 짐작된다. 따라서 티로신 키나아제 및 이들이 포함된 신호 전달 경로는 약제 설계에 있어서 가능한 표적이다. 개관을 위해서는 문헌 {Levitzki 등,Science 267, 1782-1788 (1995)}을 참조한다.

신호 전달 경로를 구성하는 많은 단백질은 낮은 농도로 존재하며, 종종 반대 활성을 갖는다. 이런 신호전달 분자의 성질은 활성화와 억제 사이의 균형을 이뤄 신호 전달 경로에서 작은 변화로도 개폐 효과를 달성할 뿐만 아니라 작용인자의 세포 억제 위치 및 병렬을 이용하여 세포가 신호전달을 통제하도록 한다.

단백질-단백질 상호작용을 통한 신호전달 분자의 병렬에 의해 신호전달 복합체가 형성되는 것은 특이 도킹 도메인 서열 모티프에 의해 매개된다. Src 동종 2 (SH2) 도메인은 비수용체 PTK 및 키나아제 표적 작용인자 분자 등의 각종 신호전달 분자에서 및 발암성 단백질에서 발견된 약 100 개의 아미노산으로 이루어진 보존된 (conserved) 비촉매적 서열로서, 결정적인 역할을 한다. SH2 도메인은 자기인산화 PTK 수용체 또는 세포내 티로신 키나아제에서 발견되는 짧은 인산화티로신-함유 펩티드 서열에 고도로 특이적이다.

상이한 촉매 도메인 또는 다른 기능 도메인을 갖고 있지만, 약 100 개의 아미노산으로 구성된 보존된 서열인 보존된 SH2 도메인을 공통적으로 가지고 있는 약 60 개의 단백질이 밝혀졌다. 체내에서 이들 SH2 도메인 각각에 의해 조절되는 생리적 반응이 정확하게 밝혀진 것은 아니다. 추가로 SH2 도메인-리간드/화합물 상호작용은 고도로 특이적이어서 리간드/화합물 구조의 작은 변형이라도 리간드/화합물이 각종 SH2 도메인에 결합하는 선택도를 상당히 변화시킬 것이다.

SH2 도메인의 비선택적 길항작용의 결과는 매우 심각할 수 있다. 예를 들면, src SH2 도메인, lck SH2 도메인 및 fyn SH2 도메인은 구조적으로 유사하고 도메인 사이에 보존도가 높다. lck SH2 도메인 (하기에 논의) 또는 fyn SH2 도메인의 길항작용이 면역억제를 유도하는 반면 src SH2 도메인의 길항작용은 뼈 재흡수를 수행하는 것으로 생각된다. 뼈 재흡수의 저해는 면역억제의 유도를 필요로하는 장기간 치료에서 바람직하지 않을 것이다.

더욱이, 알려진 총 60 개의 SH2 도메인에 대한 가능한 lck SH2 도메인 길항제를 분석하는 것은 결합 연구에서는 실행이 불가능할 것이다. 현재, lck SH2 도메인과 선택적으로 상호작용하는 공지된 화합물은 없다.

lck SH2 도메인에 길항작용함으로써 자기면역 질환 및 동종이식 거부 치료를 가능하게 하지만 비선택적 SH2 도메인 길항제에서 관찰되는 부작용이 일어나는 것을 피하는 화합물 및 방법을 제공할 필요가 있을 것이다.

본 명세서에서 개시된 바와 같이, 선택적 lck SH2 도메인 길항제는 src SH2 도메인, lck SH2 도메인, fyn SH2 도메인, SHPTP2 SH2 도메인, p85 도메인, Grb2 SH2 도메인 및 hcp SH2 도메인으로 이루어진 SH2 도메인의 부분집합에 대한 결합 분석법 (binding assay)에 의해 식별될 수 있다는 것이 뜻밖에 밝혀졌다.

하기한 정보를 결합시켜서, (a) 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 특이적이며, (b) 이러한 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인, 사람의 Grb2 SH2 도메인, 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인 및 사람의 p85 SH2 도메인과 결합하는 화합물이 자기면역 질환 및 동종이식 거부 치료에 효과적이라는 것을 밝혀냈다.

발명의 요약

본 발명은 (a) 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며, (b) 이러한 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인, 사람의 Grb2 SH2 도메인, 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인 및 사람의 p85 SH2 도메인과 결합하는 화합물의 치료상 효과적인 양을 투여하는 것으로 이루어지는, 자기면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 (a) 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며, (b) 이러한 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인, 사람의 Grb2 SH2 도메인, 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인 및 사람의 p85 SH2 도메인과 결합하는 화합물의 동종이식 거부 억제량을 투여하는 것으로 이루어지는, 동종이식 거부 억제 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 (a) 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며, (b) 이러한 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인, 사람의 Grb2 SH2 도메인, 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인 및 사람의 p85 SH2 도메인과 결합하는 화합물의 면역억제 유도량을 투여하는 것으로 이루어지는, 면역억제 유도 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 자기면역 질환 (autoimmune disease)란 자기 항원에 대한 잘못 지시된 면역반응 또는 과도하게 활성화된 면역반응에 의해 특징지을 수 있는 모든 장애이다. 잘 알려진 자기면역 질환은 류마티즘성 관절염이다. 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루프스 및 I형 당뇨병 등의 기타 질병도 포함된다.

본 명세서에서 사용된 용어 치료 (treating) 및 그의 파생어는 예방요법 또는 치료요법을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 화합물은 비펩티드 화학적 화합물을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 lck SH2 도메인 길항제는 달리 정의되지 않는다면, (a) 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며, (b) 이러한 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인, 사람의 Grb2 SH2 도메인, 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인 및 사람의 p85 SH2 도메인과 결합하는 화합물을 의미한다.

본 발명은 (a) 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며, (b) 이러한 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인, 사람의 Grb2 SH2 도메인, 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인 및 사람의 p85 SH2 도메인과 결합하는 화합물의 치료상 효과적인 양을 투여하는 것으로 이루어지는 자기면역 질환 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 측면은 (a) 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 화합물의 치료상 효과적인 양을 투여하는 것으로 이루어지는 자기면역 질환의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 측면은 (a) 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며, (b) 이러한 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인, 사람의 Grb2 SH2 도메인, 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인 및 사람의 p85 SH2 도메인과 결합하는 화합물의 치료상 효과적인 양을 투여하는 것으로 이루어지는 자기면역 질환 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 측면은 (a) 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 화합물의 치료상 효과적인 양을 투여하는 것으로 이루어지는 자기면역 질환의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 (a) 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상, 바람직하게는 100 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며, (b) 이러한 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은, 바람직하게는 1/100 보다는 큰 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인, 사람의 Grb2 SH2 도메인, 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인 및 사람의 p85 SH2 도메인과 결합하는 화합물의 동종이식 거부 억제량을 투여하는 것으로 이루어지는 동종이식 거부 억제 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 측면은 (a) 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상, 바람직하게는 100 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 화합물의 동종이식 거부 억제량을 투여하는 것으로 이루어지는 동종이식 거부 억제 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 (a) 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상, 바람직하게는 100 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며, (b) 이러한 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은, 바람직하게는 1/100 보다는 큰 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인, 사람의 Grb2 SH2 도메인, 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인 및 사람의 p85 SH2 도메인과 결합하는 화합물의 면역억제 유도량을 투여하는 것으로 이루어지는 면역억제 유도 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 측면은 (a) 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 화합물의 면역억제 유도량을 투여하는 것으로 이루어지는 면역억제 유도 방법을 제공한다.

상이한 사람 SH2 도메인에서 화합물의 저해 활성을, 하기의 실시예 11에서 상세하게 추가 설명한 것과 같이 E. coli에서 융합 단백질로 발현된 SH2 도메인을 사용하여 생체외부에서 결정했다.

하기의 표 1 및 2에서 보인 데이터는 lck SH2 도메인에 길항작용하는 상기한 화합물의 성능을 나타낸다. 실시예 11의 분석으로 선택적 lck SH2 도메인 길항제로 나타난 화합물을 면역억제 활성을 유도하는 이들의 성능에 대해 공지된 분석법으로 시험했다. 바람직한 분석은 하기의 방법을 포함한다.

1)IL2 제조 분석- 각종 자극에 대해 T 세포에서 일어나는 IL2 제조를 측정한다. 가장 일반적으로 사용되는 T 세포는 Jurkat 사람 T 세포계이다. Jurkat은 a) 분열촉진성 렉틴 (식물성혈구응집소 또는 PHA) + 칼슘 이오노포어 (ionophore) 또는 + 포르볼 에스테르, 또는 b) T 세포 수용체 항체 + 포르볼 에스테르로 자극된다. 사람의 IL2에 특이적인 ELISA에 의한 IL2의 측정은 활성도를 나타낸다.

2) 3 가지 사람의 임파구혼합반응 (MLR) - 외부의 항원에 대한 반응과 유사하다. 이 분석법은 다른 개인의 혈액 세포 내에 존재하는 외부 항원에 대한 한 개인의 임파구의 반응을 측정한다. 3개의 다른 공여자 (3 가지 반응)의 혈액으로부터 얻은 임파구를 함께 혼합하여 4 내지 5일 동안 완전 성장 배지에서 인큐베이션시켰다. 티미딘 삽입을 측정하여 세포 증식 반응 결정은 활성도를 나타낸다.

이 분석에서 활성도는 자기면역 질환을 생체내에서 치료하는데 있어서의 효능과 관련해 당분야에 인지되어 있다. 이 분석에서 활성도는 생체내에서 동종이식 거부를 저해하는데 있어서의 효능과 관련하여 당분야에 인지되어 있다. 이 분석에서 활성도는 또한 생체내에서 면역억제를 유도하는데 있어서의 효능과 관련하여 당분야에 인지되어 있다.

따라서 본 발명은 본 명세서에서 정의한 바와 같은 lck SH2 도메인 길항제의 양을 면역억제를 유도하기 위해 효과적인 양만큼 투여하는 것으로 이루어지는 면역억제를 유도하는 방법을 제공한다. 약물은 면역억제를 필요로하는 환자에게 정맥내, 근육내, 경구, 피하, 피내, 및 비경구로 제한되는 것은 아니지만 이들을 포함하는 종래의 모든 투여 경로로 투여할 수 있다. 면역억제를 유도하기 위한 효과적인 양은 환자 체중 1 kg을 기준으로 약 0.001 mg/kg 내지 약 10.0 mg/kg 이다. 선택된 용량은 환자 체중 1 kg을 기준으로 약 0.001 mg/kg 내지 약 10.0 mg/kg으로부터 선택되는 효능이 있고 비독성인 양이다. 선택된 용량을 1일 1 내지 6회 투여할 것이다.

본 발명에서 개시된 면역억제 유도 방법은 또한 본 명세서에서 정의된 lck SH2 도메인 길항제 및 제약적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 사용하여 수행할 수 있다. 조성물은 lck SH2 도메인 길항제 0.05 mg 내지 500 mg을 포함할 수 있으며, 선택된 투여 형태에 적당한 모든 형태로 제조될 수 있다. 경구 투여에 적당한 조성물은 환, 캡슐, 과립, 정제 및 분말과 같은 고상 형태 및 용액, 시럽, 일릭서 (elixer), 및 현탁액과 같은 액상 형태를 포함한다. 비경구 투여에 유용한 형태는 무균 용액, 에멀젼 및 현탁액을 포함한다.

본 발명은 또한 본 명세서에서 정의한 lck SH2 도메인 길항제의 양을 동종이식 거부를 억제하는데 효과적인 양만큼 투여하는 것으로 이루어진, 동종이식 거부억제 방법을 제공한다. 약물은 최근 이식된 동종이식편을 갖고 있거나 또는 동종이식을 받을 예정인 환자에게 정맥내, 근육내, 경구, 피하, 피내, 및 비경구로 제한되는 것은 아니지만 이들을 포함하는 종래의 모든 투여 경로로 투여할 수 있다. 동종이식 거부를 저해하기 위한 효과적인 양은 환자 체중 1 kg을 기준으로 약 0.001 mg/kg 내지 약 10.0 mg/kg 이다. 선택된 용량은 환자 체중 1 kg을 기준으로 약 0.001 mg/kg 내지 약 10.0 mg/kg으로부터 선택되는 효능이 있고 비독성인 양이다. 선택된 용량을 1일 1 내지 6회 투여할 것이다.

본 발명에서 개시된 동종이식 거부 억제 방법은 또한 본 명세서에서 정의된 lck SH2 도메인 길항제 및 제약적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 사용하여 수행할 수 있다. 조성물은 lck SH2 도메인 길항제 0.05 mg 내지 500 mg을 포함할 수 있으며, 선택된 투여 형태를 위해 적당한 모든 형태로 구성될 수 있다. 경구 투여에 적당한 조성물은 환, 캡슐, 과립, 정제 및 분말과 같은 고상 형태 및 용액, 시럽, 일릭서제 (elixir), 및 현탁액과 같은 액상 형태를 포함한다. 비경구 투여에 유용한 형태는 무균 용액, 에멀젼 및 현탁액을 포함한다.

약물을 달리 무균수, 무균 식염수, 또는 다른 적당한 무균 주사가능한 매질을 사용하여 투여시에 용해시키거나 현탁시킬 수 있는 무균 고상 조성물로 제조할 수 있다. 담체는 필요한 불활성 결합제, 현탁제, 윤활제, 향료, 감미료, 방부제, 염료 및 코팅제를 포함하도록 고안된다.

투여되는 최적 용량은 당분야의 숙련가들이 용이하게 결정할 수 있으며 사용되는 특정 lck SH2 도메인 길항제, 제제의 강도, 투여 형태 및 질병 진전 상태에 따라 다양할 것이다. 치료받을 특정 환자에 따라 환자의 나이, 체중, 식이 및 투여 시간 등을 포함하는 추가의 요인이 용량을 조절하는데 필요할 것이다.

본 발명은 또한 자기면역 질환의 치료에 사용되는 의약의 제조에 있어서 lck SH2 도메인 길항제의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 동종이식 거부 억제에 사용되는 의약의 제조에 있어서 lck SH2 도메인 길항제의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 면역억제 유도에 사용되는 의약의 제조에 있어서 lck SH2 도메인 길항제의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 lck SH2 도메인 길항제를 포함하는, 자기면역 질환 치료에 사용되는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 lck SH2 도메인 길항제를 포함하는, 동종이식 거부 억제에 사용되는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 lck SH2 도메인 길항제를 포함하는, 면역억제 유도에 사용되는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 방법을 본 발명에 따라 사용할 경우 허용되지 않는 독물학상의 효과는 없을 것으로 예상된다.

추가의 노력없이도 당분야의 숙련가는 상기의 설명을 사용하여 본 발명을 충분히 이용할 수 있을 것으로 믿는다. 따라서 하기의 실시예는 어떤 경우에도 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니라 단지 예시하기 위한 것으로 이해되어야 한다.

실험의 세부 사항

본 명세서에 사용된 기호 。는 다른 지시가 없다면 ℃를 의미한다.

L-3,5-디브로모티로신은 예를 들면 문헌 [Thyoid Hormones and Analogues. I. Synthesis, Physical Properties and Theoretical Calculations, E. C. Jorgensen, Hormonal Protein and Peptides, 제4권, 1978, Academic Press, 뉴욕] 및 이 문헌에 인용된 참고문헌에 기재된, 당분야에 공지된 방법으로 제조할 수 있다.

L-3,5-디브로모-N-트리플루오로아세틸-티로신 메틸 에스테르 [실시예 2(e) 및 실시예 2B(b)에 사용]는 하기의 순서에 따라 제조할 수 있다.

L-3,5-디브로모티로신 (500 g)을 메탄올 (5 ℓ)에 현탁시키고 건조 염화수소를 교반된 현탁액을 통해 5 시간을 통과시켰다. 반응 혼합물을 증발시켜 건조상태인 물에 현탁된 잔류량 (4 ℓ)으로 만들고, 40 % 수산화나트륨으로 pH를 6으로 맞췄다. 침전물을 모으고 물로 세척하여 L-3,5-디브로모티로신 메틸 에스테르 (467 g, 90 %, 융점 210。 내지 203。)을 얻었다. 에스테르 (768 g)을 클로로포름 (2.7 ℓ) 및 에틸 아세테이트 (2.7 ℓ)에 현탁시킨 후, 트리플루오로아세트산 무수물 (565 g)을 35。 이하의 온도를 유지한 상태에서 0.5 시간에 걸쳐 첨가했다. 혼합물을 밤새 방치한 후, 물 (2 ℓ)를 첨가하고 pH를 중탄산나트륨 포화용액을 첨가하여 7로 맞췄다. 유기 층을 제거하고 물로 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 증류시켰다. 잔류물을 메탄올 수용액로부터 재결정화하여 L-3,5-디브로모-N-트리플루오로아세틸-티로신 메틸 에스테르 (786, 81 %, 융점 136。 내지 137。)를 얻었다.

하기 실시예 6에서 사용된 반응식 1

4-트랜스-아미노메틸-시클로헥실-카르복실산 (1)의 아미노기를 Boc기 (Boc 무수물, NaOH, H₂O, 디옥산)와 같은 표준 보호기로 보호시켜 2를 형성한 후 DCC와 같은 커플링제를 사용하여 카이저 옥심 수지 (Kaiser, E. T. 등; J Am Chem Soc, 1985, 107, 7087-7092)에 커플링시켜 (3)을 형성하였다. 이어서, 아민을 표준 조건 (25 % TFA, 염화메틸렌)하에서 탈보호시켜 (4)를 형성한 후, 표준 조건 (HBTU, DMF 중의 NMM 또는 DMF 또는 NMP 중의 DCC 또는 DIC를 사용하는 등)으로 아실화시켜 (5)를 형성하였다. 그 다음 화합물을 각종 아민으로 수지로부터 절단시켜 최종 목적 생성물 (6)을 형성하였다.

화합물 1 내지 10은 이어지는 실시예 1 내지 10에 따라 제조하였다.

실시예 1

7-[D,L-α-아미노-α-(4-카르복시페닐)아세트아미도]-3-[2-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸일)티오메틸]△³-세펨-4-카르복실산 (화합물 1)의 제조

a) 4-히드록시메틸벤즈알데히드

얼음 조에서 질소하에 건조 테트라히드로푸란 (200 ml) 중의 1,4-벤젠디카르복스알데히드 (50.0 g, 0.373 몰) 용액에 테트라히드로푸란 500 ml 중의 리튬 트리(tert-부톡시)알루미늄 수소화물 (104.0 g, 0.410 몰)을 적가하였다. 얼음 조에서 30분 동안 교반 후, 반응 혼합물을 얼음 냉각된 2 N 염산에 부었다. 수용액을 에테르 800 ml로 4회 추출하였다. 합한 에테르 층을 중탄산나트륨 용액 및 염수로 세척하고 건조하였다. 용매를 증발시켜 46 g의 조 물질을 얻고, 이를 크로마토그래피 (알루미나, 에테르 용출액)로 정제하여 융점이 44.5 - 46 ℃인 결정형 물질 (17.6 g, 35 %)로서 표제 화합물을 얻었다.

b) 5-(4-히드록시메틸페닐)히단토인

50 ℃로 가열된 60 % 에탄올 수용액 110 ml 중의 4-히드록시메틸벤즈알데히드 (10.0 g, 73.5 mmol) 및 탄산암모늄 (17.1 g, 150 mmol)의 교반된 혼합물에 물 10 ml 중의 시안화나트륨 (4.0 g, 81 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 교반하고 3 시간 동안 50-60 ℃에서 가열한 후 1 시간 동안 85 ℃에서 가열하였다. 얼음 조에서 냉각 후에, 진한 염산을 첨가하여 용액의 pH를 6으로 조절했다. 밤새도록 냉각시켜, 침전된 고체를 여과하고, 물로 세척하고 건조하여 융점이 189 - 196 ℃인 표제 화합물 (11.0 g, 72 %)을 얻었다.

c) 4-히드록시메틸페닐글리신

물 125 ml 중의 실시예 1(b)의 화합물 (10.9 g, 53 mmol) 및 수산화바륨 팔수화물 (25.5 g, 81 mmol)의 혼합물을 18 시간 동안 환류하에 교반시켰다. 반응 혼합물을 냉각하고 진한 황산을 사용하여 pH 1로 산성화시키고, 황산바륨을 여과하고, 여액의 pH를 탄산납을 사용하여 6이 되게 하였다. 황산납을 여과한 후, 여액을 황화수소로 포화시키고 황화납을 여과하였다. 그 다음 수용액을 감압하에서 에탄올로 공비시켜 100 ml로 농축하고, 냉각한 후, 융점이 230 - 231 ℃인 표제 화합물 (5.2 g, 54 %)을 얻었다.

d) N-tert-부톡시카르보닐-4-히드록시메틸페닐글리신

물 160 ml 중의 4-히드록시메틸페닐글리신 (8.0 g, 44 mmol) 및 트리에틸아민 (8.8 g, 87 mmol)의 용액에 테트라히드로푸란 120 ml 중의 tert-부톡시카르보닐아지드 (6.95 g, 49 mmol)을 가하였다. 실온에서 밤새도록 교반한 후, 반응 혼합물을 1 회당 에테르 200 ml로 2회 세척하였다. 수층을 에테르로 보호하고, 얼음 조에서 3 N 염산을 사용하여 pH 3-3.5로 산성화시켰다. 산성 용액을 에테르로 추출하고 합한 유기 추출물을 염수로 세척하고 건조시키고 증발시켰다. 얻어진 오일을 클로로포름-헥산으로 저작시키고 고체를 여과하여 융점이 139 - 141.5 ℃인 표제 화합물 (7.7 g, 63 %)을 얻었다.

e) N-tert-부톡시카르보닐-4-히드록시메틸페닐글리신 메틸 에스테르

실시예 1(e)의 화합물 (5.6 g, 20 mmol)의 용액에 메탄올 (10 ml) 중의 디메틸 황산염 (3.1 g, 24 mmol) 및 디이소프로필 아민 (5.2 g, 40 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 20 분 동안 환류시킨 후, 2 N 염산 수용액으로 처리하였다. 수용액을 에틸 아세테이트로 3 회 추출하고, 합한 유기 추출물을 5 % 중탄산나트륨 수용액 및 염수로 세척하였다. 용매를 증발하여 오일로서 표제 화합물 (3.2 g, 55 %)을 얻었다.

f) N-tert-부톡시카르보닐-4-카르복시페닐글리신 메틸 에스테르

아세톤 50 ml 중의 실시예 1(e)의 화합물 (0.62 g, 2.1 mmol)의 용액을 25 ℃에서 과량의 존스 시약 (8 N 크롬산)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 2 시간 동안 실온에서 교반하였다. 녹색의 고체를 여과하고 과량의 CrO₃을 이소프로필 알코올을 사용하여 분해시켰다. 여액을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 활성 카코올 (activated charcoal)로 처리하였다. 고체를 여과시키고, 여액을 증발 건조시켜 백색 고체로서 융점이 126 - 128 ℃인 표제 화합물 0.38 g을 얻었다.

g) 1,1-디메틸에틸 N,N'-비스(1-메틸에틸)카르바미미데이트

산티니 (Santini) 등의 방법 (J. Org. Chem. 1994, 59, 2261)에 따라, 실온에서 1 일 동안 CuCl (0.01 당량)의 존재하에 순수한 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (1.0 당량)와 2-메틸-2-프로판올 (1.15 당량)의 반응에 의해 표제 화합물을 제조하였다.

h) N-tert-부톡시카르보닐-4-(tert-부톡시카르보닐)페닐글리신 메틸 에스테르

건조 디클로로메탄 중의 실시예 1(f)의 화합물 (1.0 g, 3.2 mmol) 및 1,1-디메틸에틸 N,N'-비스(1-메틸에틸)카르바미미데이트 (1.3 mg, 6.5 mmol)의 용액을 실온에서 밤새도록 교반시켰다. 디-이소프로필우레아를 여과하고, 과량의 1,1-디메틸에틸 N,N'-비스(1-메틸에틸)카르바미미데이트를 물로 분해시켰다. 층을 분리하고 디클로로메탄 용액을 5 % 중탄산나트륨 수용액 및 염수로 세척하고 무수 황산나르륨 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 디에틸 에테르로 세척하였다. 추가의 디-이소프로필우레아를 여과시키고 유기 여액을 증발시켜 오일로서 표제 화합물 (870 mg, 74 %)을 얻었다.

i) N-tert-부톡시카르보닐-4-(tert-부톡시카르보닐)페닐글리신

5 % 중탄산나트륨 수용액 18 ml, 5 % 탄산나트륨 수용액 18 ml 및 메탄올 36 ml 중의 실시예 1(h)의 화합물 (760 mg, 2.1 mmol)의 용액을 5 시간 동안 실온에서 밤새도록 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 세척하고, 수용액을 신선한 에틸 아세테이트로 보호하고 3 N HCl로 pH 2로 산성화시켰다. 층을 분리하고, 수용액을 에틸 아세테이트로 2회 이상 추출하였다. 에틸 아세테이트 용액을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 융점이 77 - 79 ℃인 백색 고체로서 표제 화합물 (600 mg, 82 %)을 얻었다.

j) tert-부틸-7-아미노-3-[2-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸일)티오메틸]△³-세펨-4-카르복실레이트

인산염 완충액 (pH 6.4) 중의 tert-부틸-7-아미노세파로스포라네이트 [블랙로크 (Blacklock) 등의 문헌 (J. Org. Chem. 1989, 54, 3907)의 과정에 따라, 1,2-디메톡시에탄에서 이소부틸렌 및 황산과의 반응에 의해 7-아미노세파로스포란산으로부터 제조됨], 중탄산나트륨 및 2-메트캅토-5-메틸-1,3,4-티아디아졸의 용액을 60 ℃에서 6 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 염산/에틸 아세테이트 수용액을 사용해 추출함으로써 후속 처리 후 표제 화합물을 얻었다.

k) tert-부틸-7-[D,L-α-(tert-부톡시카르보닐아미노)-α-[4-(tert-부톡시카르보닐)페닐]아세트아미도-3-[2-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸일)티오메틸]△³-세펨-4-카르복실레이트

건조 디클로로메탄 중의 실시예 1(i)의 N-tert-부톡시카르보닐-4-(tert-부톡시카르보닐)페닐글리신 (351 mg, 1 mmol), 실시예 1(j)의 tert-부틸-7-아미노-3-[2-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸일)티오메틸]△³-세펨-4-카르복실레이트 (368 mg, 1 mmol) 및 DCC (212 mg, 1 mmol)을 3 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 디시클로헥실우레아를 여과하고 여액을 증발 건조시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해시키고, 에틸 아세테이트 용액을 5 % 중탄산나트륨 수용액, 2.5 % 황산, 5 % 중탄산나트륨 수용액, 염수로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시켜 조 생성물 0.6 g을 얻었다. 실리카 겔 크로마토그래피 (에틸 아세테이트/벤젠 30:70으로 용출)로 정제하여 융점이 110 - 112 ℃인 표제 화합물 (430 mg, 61 %)을 얻었다.

l) 7-[D,L-α-아미노-α-(4-카르복시페닐)아세트아미도]-3-[2-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸일)티오메틸]△³-세펨-4-카르복실산

실시예 l(k)의 화합물 (400 mg, 0.57 mmol)의 용액을 트리플루오로아세트산 7.2 ml 및 티오페놀 0.8 ml 중에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 30분 동안, 실온에서 1 시간 동안 교반시켰다. 용매를 40 ℃ 수조에서 증발시키고 잔류물을 디에틸 에테르로 3회 저작시킨 후, 고상 생성물을 소량의 메탄올에 용해시키고, 디에틸 에테르를 첨가하여 생성물을 침전시켜 융점이 170 - 175 ℃인 표제 화합물 (300 mg)을 얻었다.

실시예 2

L-3,5-디브로모-3'-(6-옥소-3(1H)-피리다지닐메틸)-티로닌 (화합물 2)의 제조

(a) o-메톡시페닐아세토니트릴 (23.64 g) 및 3,6-디클로로피리다진 (23.93 g)을 건조 디메틸포름아미드 (50 ml)에 용해시키고, 수소화나트륨 (오일 중의 50 % 분산액 16.23 g)을 교반된 용액에 2 시간에 걸쳐 분할하여 천천히 가하였다. 혼합물을 과량의 분쇄된 얼음에 붓고 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 상을 제거하고 물로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 카코올 (charcoal)시키고 증발 건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄/석유 알코올로부터 결정화하여 융점이 91 - 92 ℃인 1-(6-클로로-3-피리다지닐)-1-(2-메톡시페닐)-아세토니트릴 (35.5 g, 85 %)를 얻었다.

(b) 상기 니트릴 (33.5 g)을 진한 염산 (200 ml), 아세트산 (100 ml) 및 물 (100 ml)에 용해시키고, 용액을 교반하면서 환류시켰다. 6 시간 후에, 용매를 증발시키고 잔류물을 에틸 아세테이트/석유 알코올로 재결정하여 융점이 142 - 143 ℃인 2-(6-옥소-3(1H)-피리다지닐메틸)-아니졸 (21.4 g, 77 %)을 얻었다.

(c) 상기 피리다지논 (15.7 g)을 산염화 인 (22 ml)에 용해시키고, 용액을 55 ℃에서 (오일 조) 1 시간 동안 교반시키면서 가열시켰다. 냉각된 혼합물을 분쇄된 얼음 상에 천천히 붓고 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 분리하고 중탄산나트륨 포화용액으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 보다 작은 배치로 (피리다지논 2.16 g으로부터) 합하고 비등하는 석유 알코올 (60 - 80 ℃)로 수회 추출하였다. 합한 추출물을 카코올시키고 증발시켜 융점이 63 ℃인 2-(6-클로로-3-피리다지닐메틸)-아니졸 (16.95 g, 87 %)을 얻었다.

(d) -15 ℃에서 트리플루오로아세트산 무수물 (25 ml) 중의 요오드 트리스트리플루오로아세테이트 (아세트산 무수물 및 트리플루오로아세트산 중에서 발연 질산 (5 ml)으로 요오드 (2.54 g)을 처리하여 제조됨)의 교반된 현탁액에 트리플루오로아세트산 (20 ml) 및 트리플루오로아세트산 무수물 (25 ml) 중의 상기 클로로피리다진 (9.39 g)을 온도를 -15 ℃ 이하로 유지시키면서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반시키고, 농축한 후, 물 (200 ml) 중의 아세트산나트륨 (25 g) 및 과염소산나트륨 (15 g)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 클로로포름으로 추출하고, 유기 용액을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 50 ml로 농축하고 교반된 에테르 (250 ml)에 부었다. 침전물을 모으고 건조하여 조 4,4'-디메톡시-3,3'-비스-(6-클로로-3-피리다지닐-메틸)-디페닐 요오드늄 과염소산염 (14 g)을 얻었다.¹H NMR δ(DMSO-d₆) 3.80 (3H, s, -OCH ₃), 4.20 (2H, s, -CH ₂Ar), 7.05 (1H, m, Ar-5H), 7.65 (2H, m, PyH) 및 8.00 (2H, m, Ar-2, 6H).

(e) 상기 요오드늄 염 (12.45 g), L-3,5-디브로모-N-트리플루오로아세틸 티로신 메틸 에스테르 (8.98 g), 트리에틸아민 (4.05 g) 및 청동구리 (1.0 g)을 디클로로메탄 (50 ml)에서 18 시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 여과하고, 아세트산 수용액, 2 N 수산화나트륨, 이어 물로 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 보다 작은 배치 (요오드늄 염 0.72 g으로부터)로 합하고, 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (400 g). 에틸 아세테이트/석유 알코올 (60 - 80 ℃) [1:3]로 용출하여 황갈색 포말로서 L-3,5-디브로모-3'-(6-클로로-3-피리다지닐메틸)-O-메틸-N-트리플루오로아세틸-1-티로닌 메틸 에스테르 (4.0 g)을 얻었다.¹H NMR δ(CDCl₃) 3.06 (2H, m, ArCH ₂CH), 3.84 및 3.93 (6H, 2s, -OCH ₃ ), 4.19 (2H, s, ArCH ₂Py), 4.75 (1H, m, ArCH ₂CH), 6.62 (3H, m, ArH), 7.17 (2H, m, PyH) 및 7.23 (2H, s, ArH).

(f) 상기 이브롬화 화합물 (3.27 g)을 아세트산나트륨 (0.79 g) 함유 아세트산 (20 ml)에 용해시켰다. 용액을 1.25 시간 동안 환류시키고, 충분한 물 (약 2 ml)을 가하여 침전된 염화나트륨을 용해시키고, 용액을 증발 건조시켰다. 잔류물을 물과 에틸 아세테이트 사이에 분배시키고, 유기층을 제거하고 중탄산나트륨 포화용액으로 세척한 후 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 증발 건조시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트/석유 알코올 (60-80 ℃)으로부터 결정화시켜 융점이 176 - 178 ℃인 L-3,5-디브로모-O-메틸-3'-(6-옥소-3(1H)-피리다지닐메틸)-N-트리플루오로-아세틸티로닌 메틸 에스테르 (2.52 g, 79 %)를 얻었다.

(g) 상기 피리다지논 (2.45 g)을 건조 디클로로메탄 (40 ml) 중에 용해시키고, 교반하면서 0 ℃로 냉각시켰다. 디클로로메탄 (3 ml) 중의 삼브롬화 붕소 (6.46 g)를 첨가하였다. 적갈색 침전물이 형성되었다. 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 교반한 후 분쇄된 얼음을 첨가하였다. 혼합물을 여과하고, 침전물을 모아 2 N 수산화나트륨 (30 ml)에 용해시켰다. 용액을 15 분 동안 증기 조 상에서 가열한 후, 아세트산을 첨가하여 pH 5로 만들고, 혼합물을 냉각시켰다. 얻어진 침전물을 모으고, 세척, 건조하여 융점이 278 - 279 ℃인 L-3,5-디브로모-3'-(6-옥소-3(1H)-피리다지닐메틸)-티로닌 (1.74 g, 88 %)을 얻었다.

별법으로, 반응 단계 (e)를 위하여 단계 (d)에서 제조된 과염소산염을 사용하는 대신, 하기와 같이 제조되는 요오드늄 트리플루오로아세테이트 염이 사용될 수 있다: 요오드 (159 g)를 트리플루오로아세트산 무수물 (1 리터)에 현탁시키고, 질소하에서 교반시키는 동안 온도를 36 내지 40 ℃에서 유지시키면서 발연 질산 (350 ml)을 1.5 시간에 걸쳐 첨가하였다. 이어서 트리플루오로아세트산 무수물 (300 ml)를 첨가하고, 혼합물을 모든 질소 산화물이 제거될 때까지 질소 스트림하에서 40 ℃로 유지시킨 후, 실온에서 밤새도록 방치했다. 그 다음 용매를 감압하에서 제거하고, 잔류 용매를 트리플루오로아세트산 무수물 (2 x 300 ml)로 공비시켜 제거하였다. 이어서 엷은 황색 잔류 고체를 교반시키면서 트리플루오로아세트산 무수물 (1.2 리터)에 현탁시키고, -20 ℃로 냉각시켰다. 이어서 온도를 -10 ℃ 내지 -20 ℃ 사이로 유지하면서, 트리플루오로아세트산 (1.2 리터) 중에 2-(6-클로로-3-피리다지닐메틸)아니졸 (600 g) 용액을 적가하였다. 혼합물을 1 시간 동안 -10 ℃에서 교반시키고 실온에서 밤새도록 교반시킨 후, 용매를 감압하에서 제거하고, 잔류물을 교반시키면서 물 (20 리터) 중의 황산나트륨 (3.5 kg)의 용액에 부었다. 이 혼합물의 pH는 묽은 수산화나트륨 수용액을 사용하여 대략 pH 2로 맞춘 후, 디클로로메탄 (2 x 3 리터, 1 x 2 리터)로 추출시키고, 유기 추출물을 합하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시키고, 2 리터로 부피를 감소시킨 후, 격렬하게 교반된 디에틸 에테르 (12 리터)로 첨가시켰다. 짙은 회색의 침전된 고체를 여과시키고, 에테르로 세척하고, 6 시간 동안 40 ℃에서 진공 오븐에서 건조시켜 융점이 145 - 147 ℃인 4,4'-디메톡시-3,3'-비스-(6-클로로-3-피리다지닐메틸)디페닐 요오드늄 트리플루오로아세테이트 (8.14 g, 90 %)를 얻었다.

실시예 2(e), (f) 및 (g)에서 전술한 과정과 유사한 과정을 사용하는 상기 염의 추가의 반응은 필요한 L-3,5-디브로모-3'-(6-옥소-3(1H)-피리다지닐-메틸)티로닌을 제공하였다.

실시예 2A

L-3,5-디브로모-3'-(6-옥소-3(1H)-피리다지닐메틸)티로닌 (화합물 2)의 제조

(a) 2-(6-클로로-3-피리다지닐메틸)아니졸 (실시예 2(c)에서 기술한 바와 같이 제조) (2.35 g)을 건조 디클로로메탄 (20 ml)에 용해시키고, 교반하면서 -50 ℃로 냉각시켰다. 그 후 삼브롬화 붕소 (3 ml)를 적가하고, 용액을 실온으로 가온하였다. 0.5 시간 후에, 오렌지색 반응 혼합물을 얼음/물 (200 ml)에 붓고, 아세톤을 첨가하여 침전된 고체를 용해시켰다. 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기 추출물을 분리하고, 물로 세척, 건조하고 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 및 석유 알코올로부터 재결정시켜 융점이 132 - 132.5 ℃인 2-(6-클로로-3-피리다지닐메틸)-페놀 (1.75 g, 80 %)을 얻었다. 원소 분석: 실측치: C, 59.61; H, 4.13; N, 12.47; Cl, 16.09; C₁₁H₉ClN₂O 요구치: C, 59.87; H, 4.11; N, 12.70; Cl, 16.07 %.

(b) 75 % 황산 수용액 (100 ml) 중의 상기 페놀 (2.4 g) 및 우레아 (14 g)의 교반된 용액에 t-부탄올 (17 ml)을 서서히 가하였다. 혼합물을 충분히 교반시키고, t-부탄올의 추가양을 4 시간 (18 ml), 24 시간 (5 ml) 및 28 시간 (20 ml) 후 첨가하였다. 120 시간 후에 혼합물을 물에 붓고, 유기 상을 분리시켜 폐기하고, 수상을 에테르로 철저히 추출하였다. 합한 에테르 추출물을 포화 염수로 세척한 후 건조하고 증발시켰다. 잔류물을 에테르 및 석유 알코올로부터 재결정하여 융점이 143.0 - 143.5 ℃인 2,4-디-t-부틸-6-(6-클로로-3-피리다지닐메틸)페놀 (3.43 g, 94 %)을 얻었다. 원소 분석: 실측치: C, 68.32; H, 7.51; N, 8.36; Cl, 10.89; C₁₉H₂₅ClN₂O 요구치: C, 68.56; H, 7.57; N, 8.41; Cl, 10.65 %.

(c) 디에틸 에테르 (100 ml)의 상기 페놀 (1.95 g), L-3,5-디브로모-N-트리플루오로아세틸 티로신 메틸 에스테르 (3.24 g)의 용액을 실온에서 아르곤하에서 교반시킨 후 활성 이산화마그네슘 (3 x 5 g)으로 처리하였다. 4 시간 후에, 혼합물을 여과시키고, 사염화티탄 (5 ml)을 첨가하였다. 2 분 후 짙은 용액을 물로 처리하고 에틸 아세테이트로 충분히 추출하였다. 유기 추출물을 합하여 포화 염수로 세척하고, 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 용출액으로서 석유 알코올과 에테르를 사용하여 실리카 겔 상에 크로마토그래피시켜 융점이 84 - 86 ℃인 L-3,5-디브로모-5'-t-부틸-3'-(6-클로로-3-피리다지닐메틸)-N-트리플루오로아세틸 티로닌 메틸 에스테르 (2.31 g, 55 %)를 얻었다.

(d) 아세트산 (25 ml) 중의 상기 디브로모티로닌 (2.76 g) 및 무수 아세트산 나트륨 (0.78 g) 용액을 10 시간 동안 환류하에 가열한 후, 냉각시키고, 빙수에 부었다. 침전된 고체를 여과시키고, 에틸 아세테이트에 용해시키고, 건조시키고, 증발시켜 융점이 112 - 115 ℃인 L-3,5-디브로모-5'-t-부틸-3'-(6-옥소-3(1H)-피리다지닐메틸)-N-트리플루오로아세틸티로닌 메틸 에스테르 (2.4 g, 55 %)를 얻었다.

(e) 빙초산 (20 ml) 중의 상기 피리다지논 (0.200 g) 및 HBr (1 ml)의 용액을 3일 동안 환류하면서 가열하였다. 이후, 용액을 냉각시키고, 물로 희석시키고, 2 N 수산화나트륨 수용액으로 염기화하고 아세트산을 첨가하여 pH 6으로 만들었다. 침전된 고체를 여과시키고, 세척하고 건조하여 이전에 단리된 (실시예 2(g)) 것과 분광학적으로 동일한, 융점이 245 - 247 ℃인 L-3,5-디브로모-3'-(6-옥소-3(1H)-피리다지닐메틸)티로닌 (0.100 g, 65 %)를 얻었다.

실시예 2B

L-3,5-디브로모-3'-(6-옥소-3(1H-피리다지닐메틸)-티로닌 (화합물 2)의 제조

(a) -10 ℃로 냉각된 아세트산 무수물 (50 ml) 중의 요오드 트리스트리플루오로아세테이트 (아세트산 무수물 및 트리플루오로아세트산 중의 발연 질산 (20.95 ml)으로 요오드 (10.0 g)을 처리하여 제조함)의 용액에 트리플루오로아세트산 (60 ml) 및 아세트산 무수물 (30 ml) 중의 2-메톡시벤질 시아나이드 (30.0 g)의 용액을 적가하였다. 첨가 동안 혼합물의 온도를 0 ℃ 이하로 유지시킨 후 실온에서 밤새도록 정치시켰다. 이어서 혼합물을 물 (600 ml) 중의 아세트산나트륨 (100 g) 및 과염소산나트륨 (13.0 g)의 충분히 교반중인 얼음 냉각 용액에 부었다. 침전된 고체를 여과시키고, 물 및 디에틸 에테르로 세척시켜 융점이 183 - 184 ℃ (메탄올/디에틸 에테르로부터)인 밝은 담황색 고체 (23.6 g, 57 %)로서 3,3'-디시아노메틸-4,4'-디메톡시-디페닐 요오드늄 과염소산염을 얻었다.

(b) 디클로로메탄 (300 ml) 중의 상기 요오드늄 염 (22.6 g), L-3,5-디브로모-N-트리플루오로아세틸-티로신 메틸 에스테르, 트리에틸아민 (6.1 g)의 용액을 청동구리 (1 g)으로 처리하고, 혼합물을 20 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 이어서 혼합물을 여과하고 여액을 2 N 염산 수용액 (2 x 200 ml), 물 (2 x 200 ml), 및 2 N 수산화나트륨 수용액 (3 x 200 ml)로 세척한 후, 유기 용액을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고, 감압하에서 증발시켰다. 오일성 잔류물을 디클로로메탄 (30 ml) 중에 용해시키고, 석유 알코올에 부었다. 침전된 고체를 여과시키고 디클로로메탄/석유 알코올로부터 재결정하여 융점이 148 - 149 ℃인 무색의 결정성 고체로서 L-3,5-디브로모-3'-시아노메틸-O-메틸-N-트리플루오로아세틸티로닌 메틸 에스테르를 얻었다. 모액을 실리카 겔 상에 크로마토그래피시켜 상기 화합물의 추가량을 얻었다 (전체=8.05 g, 31 %).

(c) 건조 디메틸포름아미드 (2 ml) 중의 상기 디브로모티로닌 (120 mg) 및 3,6-디클로로피리다진 (31 mg)의 용액에 수소화나트륨 (오일 중의 50 % 현탁액 30 mg)을 첨가하고, 반응 혼합물을 50 분 동안 실온에서 정치시켰다. 그 후, 이를 얼음으로 처리하고, 수성 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기 용액을 포화 염수로 세척한 후 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 예비의 실리카 겔 크로마토그래피 판 상에 크로마토그래피시켜 3,5-디브로모-3'-(1-(6-클로로-3-피리다지닐)-1-시아노메틸)-O-메틸-N-트리플루오로아세틸티로닌 메틸 에스테르 (5 mg)를 단리시켰다.¹H NMR δ(CDCl₃) 3.12 (1H, m), 3.27 (1H, m), 3.79 (3H, s), 3.86 (3H, s), 4.86 (1H, m), 5.80 (1H, s), 6.72 (1H, dd), 6.83 (1H, d), 7.04 (1H, d), 7.15 (1H, 브로드 m), 7.37 (2H, s), 7.50 (2H, dd).

표준 방법에 의한 상기 중간체의 합성은 표제 화합물을 제공한다.

실시예 3

8,8-에틸렌디옥시-2,3,7,8,9,10-헥사히드로-4-메틸-1H-벤조[b]-티에노[2,3-b]피라졸로[3,4-d]피리딘-3-온 (화합물 3)의 제조

a) 에틸 2-시아노-2-(4,4-에틸렌디옥시시클로헥실리덴)아세테이트

톨루엔 (400 mL) 중의 1,4 시클로헥산디온 모노에틸렌 케탈 (25 g, 0.160 몰)과 에틸 시아노아세테이트 (18 g, 0.160 몰)의 혼합물에 디에틸아민 (25 g, 0.337 몰)을 실온에서 적가했다. 반응 혼합물을 환류시키면서 밤새도록 가열했다 (딘 스타르크 (Dean Stark) 장치 사용). 혼합물을 냉각시켜 에틸 아세테이트 및 중탄산나트륨 포화 수용액으로 3회 분할시켰다. 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시켰고, 여과시키고, 진공 상태에서 농축시켰고, 에탄올로부터 재결정시켜 흰색 고체로서 표제 화합물을 수득했다 (15.8 g, 45%): 융점 80 - 81℃;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ4.28 (q, J=7.2 Hz, 2H), 4.00 (s, 4H), 3.18 (t, J=6.5 Hz, 2H), 2.85 (t, J=6.5 Hz, 2H), 1.89 (t, J=6.5 Hz, 2H), 1.82 (t, J=6.5 Hz, 2H), 1.35 (t, J=7.1 Hz, 3H).

b) 에틸 2-아미노-6,6-에틸렌디옥시-4,5,6,7-테트라히드로벤조[b]티오펜-3-카르복실레이트

0℃에서 에탄올 (164 mL) 중의 실시예 3(a)의 화합물 (10 g, 45.6 mmol), 황 (1.6 g, 50.2 mmol) 현탁액에, 에탄올 (26 mL) 중의 디에틸아민 (3.6 g, 50.2 mmol) 용액을 적가했다. 그 결과 생성된 용액을 0℃에서 1시간, 이어서 실온에서 3.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 억제하였으며 염화 암모니아 포화 수용액으로 분할하였다. 수상을 에틸 아세테이트로 추출하였으며, 유기 추출물을 염수로 세척했다. 합한 유기 추출물을 황산 나트륨 상에서 건조시켜 여과하였으며, 진공 상태에서 농축키고 크로마토그래피하여 (실리카 겔, 농도 구배 5 내지 10% CH₂Cl₂:EtOAc) 오일로서 표제 화합물을 수득하였다 (11.3 g, 87%).¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ4.25 (q, J=7.1 Hz, 2H), 4.02 (s, 4H), 2.92 (t, J=6.5 Hz, 2H), 2.74 (s, 2H), 1.90 (t, J=6.6 Hz, 2H), 1.33 (t, J=7.1, 3H).

c) 에틸 7,7-에틸렌디옥시-4-히드록시-2-메틸-5,6,7,8-테트라히드로벤조[b]티에노[2,3-b]피리딘-2-카르복실레이트

실온에서 톨루엔 (307 mL) 중의 실시예 3(b)의 화합물 (11.2 g, 39.5 mmol) 용액에 에틸 3-에톡시크로토네이트 (12.4 g, 78.6 mmol) 및 캄포르술폰산 (0.78 g, 3.4 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 딘 스타르크 트랩을 사용하여 환류시키면서 3.5시간 동안 가열하였다. 이어서 혼합물을 냉각시켰으며, 상기 혼합물에 새로 제조된 1 M 나트륨 에톡시드 (49 mL) 용액을 적가하였다. 첨가가 완료되면 반응 혼합물을 환류시키면서 3시간 동안 가열하였다. 혼합물을 냉각시켜 침전물을 여과하였다. 염을 메탄올 (60 mL)에 용해시켜, 상기에 물 (500 mL) 및 아세트산 (2 mL)을 첨가하여 황색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다 (10.4 g, 76%): 융점 94 - 95℃;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ4.48 (q, J=7.1 Hz, 2H), 4.06 (s, 4H), 3.26 (t, J=6.5 Hz, 2H), 3.02 (s, 2H), 2.81 (s, 3H), 2.02 (t, J=6.5, 2H), 1.47 (t, J=7.1 Hz, 3H); MS (ESI) m/z 350 [M＋H]^＋; C₁₇H₁₉NO₅S 이론치; C, 58.44; H, 5.48; N, 4.01; 실측치: C, 58.34; H, 5.46; N, 3.86.

d) 에틸 7,7-에틸렌디옥시-4-트리플루오로메틸술포닐옥시-2-메틸-5,6,7,8-테트라히드로벤조[b]티에노[2,3-b]피리딘-3-카르복실레이트

피리딘 (50 mL) 중의 실시예 3(c)의 화합물 (5.0 g, 14.3 mmol) 용액에 트리플릭 무수물 (4.0 g, 14.2 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 4시간 동안 교반시켜 완료하였다. 반응 혼합물을 황산 구리 수용액으로 3회, 이어서 물로 2회, 및 염수로 2회 세척하였다. 유기 층을 증발시키고 무수 황산 나트륨 상에서 건조시켰고 진공 상태에서 농축시켰다. 플래쉬 (flash) 크로마토그래피 (실리카 겔, 헥산:에틸 아세테이트가 1:1)로 정제하여 밝은 황색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다 (3.7 g, 54%): 융점 133 - 134℃;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ4.43 (q, J=7.2 Hz, 2H), 4.06 (s, 4H), 3.16 (t, J=6.5 Hz, 2H), 3.10 (s, 2H), 2.77 (s, 3H), 2.03 (t, J=6.8 Hz, 2H), 1.41 (t, J=7.1 Hz, 3H); MS (ESI) m/z 482 [M＋H]^＋; C₁₈H₁₈F₃NO₇S₂이론치; C, 44.90; H, 3.77; N, 2.91; 실측치: C, 45.03; H, 3.62; N, 2.89.

e) 8,8-에틸렌디옥시-2,3,7,8,9,10-헥사히드로-4-메틸-1H-벤조[b]티에노[2,3-b]피라졸로[3,4-d]피리딘-3-온

실온에서 메탄올 (40 mL) 중의 실시예 3(d)의 화합물 (2.4 g, 5.0 mmol) 용액에 히드라진 일수화물 (4.1 g, 82.3 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류시키면서 3시간 동안 가열하였다. 이어서 혼합물을 냉각시켰으며 pH 7인 수 완충액과 에틸 아세테이트 사이에서 분할시켰다. 유기층을 무수 황산 나트륨 상에서 건조시켰으며, 여과하고, 진공 상태에서 농축하여 메탄올/에틸 아세테이트로부터 재결정화하여 밝은 황색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다 (0.99 g, 60%).¹H NMR (400 MHz, d₄-MeOH)δ4.05 (s, 4H), 3.15 (t, J=6.5 Hz, 2H), 3.04 (s, 2H), 2.82 (s, 3H), 2.06 (t, J=6.5 Hz, 2H); MS (ESI) m/z 318 [M＋H]^＋; C₁₅H₁₅N₃O₃S.0.25H₂O 이론치: C, 55.97; H, 4.85; N, 13.05; 실측치: C, 55.85; H, 4.75; N, 13.30.

실시예 4

4-[4-(4-메틸벤조일)벤조일]페닐아세트알데히드 (화합물 4)의 제조

a) 메틸 4-(4-메틸벤조일)벤조에이트

톨루엔 250 mL 중의 메틸 염화 테레프탈오일 (6.2 g, 31 mmol) 용액을 아르곤 대기하 0 ℃에서 염화 알루미늄 (8.0 g, 60 mmol)으로 처리하였다. 교반 혼합물을 30 분 동안 35 ℃로 되게 한 후 얼음 100 g, 이어서 에틸 아세테이트 150 mL, 진한 HCl 50 mL 및 물 50 mL에 서서히 첨가하였다. 상을 분리하였으며, 수성 부분을 에틸 아세테이트 100 mL로 2회 추출하였다. 합한 유기 부분을 물 75 mL로 2회 및 염수 75 mL로 1회 세척하였으며, 황산 마그네슘 상에서 건조시켰고, 여과하였으며, 흰색 고체가 될 때까지 농축하였다. 에틸 아세테이트 및 헥산으로부터 재결정화하여 흰색 바늘형으로서 표제 화합물 6.0 g (79 %)을 수득할 수 있었다. 융점 117 - 118℃;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ8.15 (d, J=8.35 Hz, 2H), 7.83 (d, J=8.30 Hz, 2H), 7.73 (d, J=8.18 Hz, 2H), 7.31 (d, J=8.04 Hz, 2H), 3.98 (s, 3H), 2.46 (s, 3H); MS (ESI) m/z 255 (M＋H)^＋.

b) 4-(4-메틸벤조일)벤조산

65℃에서 2:1의 THF:물 150 mL 중의 메틸 4-(4-메틸벤조일)벤조에이트 (5.00 g, 20.0 mmol)의 교반 용액을 수산화리튬 일수화물 (2.0 g, 48 mmol)로 처리하였다. 30 분 후에 흐린 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰으며 에틸 아세테이트 (300 mL) 및 10% HCl (수용액)로 처리하였다. 유기 상을 분리하여 물 50 mL로 2회, 염수 50 mL로 1회 세척하였고, 황산 마그네슘 상에서 건조시켰으며, 여과하였고, 흰색 발포체가 될 때까지 농축시켰다.¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ8.22 (d, J=8.34 Hz, 2H), 7.81 (d, J=8.31 Hz, 2H), 7.73 (d, J=8.15 Hz, 2H), 7.31 (d, J=8.00 Hz, 2H), 2.46 (s, 3H).

c) 4-[4-(4-메틸벤조일)벤조일]아니졸

톨루엔 250 mL 중의 실시예 4(b)의 화합물 용액을 염화 옥살릴 (21.8 g, 0.17 몰)로 처리하였다. 그 결과 생성된 혼합물을 환류시키면서 2시간 동안 가열하였고, 이어서 농축시켜 0.5 mm Hg 및 25℃에서 밤새도록 방치하였다. 이어서 아니졸 100 mL에 상기 고체를 용해시켰고 0℃에서 염화 알루미늄 (11.2 g, 84 mmol)으로 처리하였다. 혼합물을 70℃에서 1시간 동안 가열하였으며 이어서 얼음 100 g, 이어서 에틸 아세테이트 150 mL, 진한 HCl 50 mL 및 물 50 mL에 서서히 첨가하였다. 상을 분리하였으며 수성 부분을 에틸 아세테이트 100 mL로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물 75 mL로 2회 및 염수 75 mL로 1회 세척하였으며, 황산 마그네슘 상에서 건조시켰고, 여과하였으며, 흰색 고체가 될 때까지 농축시켰다. 에틸 아세테이트 및 헥산으로부터 재결정화시켜 표제 화합물 4.6 g (70 %)을 수득하였다. 융점 167 - 169℃;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ7.8-7.9 (m, 6H), 7.77 (d, J=8.06 Hz, 2H), 7.32 (d, J=8.01 Hz, 2H), 7.0 (d, J=8.74 Hz, 2H), 3.92 (s, 3H), 2.47 (s, 3H); MS (ESI) m/z 331 (M＋H)^＋.

d) 4-[4-(4-메틸벤조일)벤조일]페놀

디클로로메탄 20 mL에 존재하는 실시예 4(c)의 화합물 (700 mg, 2.12 mmol) 용액을 염화 알루미늄 (1.0 g, 7.5 mmol) 및 디클로로메탄 중에 1.0 M 삼염화 붕소 용액 7.0 mL로 처리하였으며 환류시키면서 1시간 동안 가열하였다. 이어서 혼합물을 디클로로메탄 100 mL로 희석시켰으며 10 % HCl (수용액) 25 mL로 1회, 물 25 mL로 1회 및 염수 25 mL로 1회 세척하였다. 유기 상을 황산 마그네슘 상에서 건조시켰으며, 여과시켰고, 짙은 잔류물이 될 때까지 농축시켜 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 1:1의 에틸 아세테이트:헥산으로 용출)를 실시, 표제 화합물 550 mg (82 %)을 수득하였다.¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ7.8-7.9 (m, 6H), 7.77 (d, J=8.05 Hz, 2H), 7.32 (d, J=8.01 Hz, 2H), 6.93 (d, J=8.6 Hz, 2H), 2.47 (s, 3H).

e) 4-[4-(4-메틸벤조일)벤조일]페닐 트리플루오로메틸술포네이트

THF (20 mL)에 존재하는 실시예 4(d)의 화합물 (320 mg, 1.0 mmol) 용액을 수소화 나트륨 (40 mg, 1.67 mmol) 및 N-페닐트리플루오로메탄술폰이미드 (500 mg, 1.40 mmol)로 0℃에서 처리하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온한 후 18시간 동안 실온에서 교반하였다. 이어서 반응물을 에틸 아세테이트와 염수 사이에서 분배하여 층을 분리하였으며, 유기 추출물을 황산 마그네슘 상에서 건조 증발시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 헥산:에틸 아세테이트가 80:20)로 정제하여 표제 화합물을 수득할 수 있었다 (300 mg, 66 %). 융점 180 - 181 ℃;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ7.96 (d, J=8.6 Hz, 2H), 7.89 (s, 4H), 7.76 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.45 (d, J=8.6 Hz, 2H), 7.33 (d, J=8.1 Hz, 2H), 2.47 (s, 3H).

f) 4-[4-(4-메틸벤조일)벤조일]페닐아세트알데히드

DMF (10 mL) 중의 실시예 4(e)의 화합물 (445 mg, 1.0 mmol) 용액에 알릴트리부틸주석 (0.35 mL, 1.12 mmol), 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 클로라이드 (55 mg, 0.077 mmol) 및 염화리튬 (125 mg, 2.95 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 90℃까지 1시간 동안 가열하였으며, 이어서 실온으로 냉각시킨 후 에틸 아세테이트 및 염수 사이에서 분할시켰다. 유기층을 황산 마그네슘 상에서 건조시켰으며 원하는 생성물인 3-[4-[4-(4-메틸벤조일)벤조일]페닐]-1-프로펜 및 주석 함유 부산물로 이루어지는 잔류물로 농축하였다. 상기 물질을, 전부는 아니지만 대부분의 주석 불순물을 제거하는 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 95:5의 헥산:에틸 아세테이트로 용출)를 실시했다. 두번째 크로마토그래피 (헥산에 존재하는 농도 구배 5 내지 10%인 에틸 아세테이트)를 실시하여 투명 올레핀 100 mg (30%)을 수득하였으며, 이어서 올레핀을 디클로로메탄/메탄올 (3:1, 16 mL)에 -78℃에서 용해시켰다. 5분간 상기 용액에 오존에 의한 기포를 발생시켰다. 반응을 디메틸 설파이드 5 드롭으로 정지시켰으며 -78℃에서 30분간 교반을 계속하였다. 용매를 증발시켜 그 결과 생성된 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 85:15 내지 75:25의 농도구배로, 헥산:에틸 아세테이트로 용출)를 실시하여 표제 화합물을 수득하였다 (40 mg, 40%). 융점 188 - 190℃;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ9.83 (s, 1H), 7.88 (s, 4H), 7.86 (d, J=8.1 Hz, 2H), 4.03 (s, 4H), 3.73 (s, 3H), 3.76 (t, J=6.0 Hz, 2H), 3.00 (s, 2H), 2.80 (s, 3H), 2.03 (t, J=6.0 Hz, 2H); MS (ESI) m/z 343 (M＋H)^＋.

〈실시예 5〉

1,4-디메틸-8,8-에틸렌디옥시-2,3,7,8,9,10-헥사히드로-1H-벤조[b]티에노[2,3-b]-피라졸로[3,4-d]피리딘-3-온 (화합물 5)의 제조

1,4-디메틸-8,8-에틸렌디옥시-2,3,7,8,9,10-헥사히드로-1H-벤조[b]티에노[2,3-b]-피라졸로[3,4-d]피리딘-3-온

실온에서 메탄올 (6.7 mL)에 존재하는 실시예 3(d)의 화합물 (0.4 g, 0.83 mmol) 용액을 메틸히드라진 (0.16 g, 3.45 mmol)로 처리하였으며 혼합물을 환류시키면서 2시간 동안 가열하였다. 혼합물을 냉각시켰으며, 2,4-디메틸 위치 이성질체 150 mg을 함유하는 침전물을 여과하였다. 여액을 증발시켰으며 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 80:20:5의 에틸 아세테이트:메탄올:아세트산으로 용출)로 정제하여 황색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다 (22 mg).¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ4.03 (s, 4H), 3.73 (s, 3H), 3.76 (t, J=6.0 Hz, 2H), 3.00 (s, 2H), 2.80 (s, 3H), 2.03 (t, J=6.0 Hz, 2H); MS (ESI) m/z 332 (M＋H)^＋.

〈실시예 6〉

4-카르복시-벤조페논-4-카르복사미도-트랜스-4-메틸-시클로헥실-N-헥실-카르복사미드 (화합물 6)의 제조

a) N-t-부틸옥시 카르보닐-트랜스-4-아미노메틸 시클로헥실 카르복실산

수산화 나트륨 수용액 (1 N, 100 ml, 100 mmol)을 디옥산 (100 ml) 중의 4-트랜스-아미노메틸-시클로헥실-카르복실산 (9.0 g, 60 mmol) 용액, 물 (100 ml)에 0℃에서 첨가하였다. Boc 무수물 (15.9 g, 66 mmol)을 첨가하였으며 반응물을 실온으로 가온한 다음 밤새도록 교반하였다. 용액을 50 ml로 농축시킨 후 EtOAc (100 ml)로 희석시켰고, KHSO₄(1 N) 수용액으로 pH 2까지 산성화시켰다. 이어서 유기층을 물 (100 ml)로 2회 추출하였으며, 유기물을 진공 상태에서 농축시켰다. 고체를 EtOAc/헥산으로부터 재결정화시켜 흰색 고체 9.2 g ＋ 3.4 g (두 번째 크롭)을 수득하였다 (80% 수율). MS (ES) m/e 242 [M＋H]^＋.

b) N-t-부틸옥시 카르보닐-트랜스-4-아미노메틸 시클로헥실 (카이저 옥심 수지) 카르복실레이트

카이저 옥심 수지 (20 g, 0.7 mmol/g 로딩, Advanced Chem Tech제)를 염화메틸렌 (200 ml) 중의 N-t-부틸옥시 카르보닐-트랜스-4-아미노메틸 시클로헥실 카르복실산 (5.0 g, 20 mmol) 및 DCC (4.4 g, 20 mmol) 용액에 첨가하여 실온에서 밤새도록 느리게 혼합하였다. 고체를 여과시켜 모았으며, 이어서 염화메틸렌 100 ml로 5회 세척하였다. 이어서 수지를 염화메틸렌 (200 ml)에 재현탁시켰으며, N-t-부틸옥시 카르보닐-트랜스-4-아미노메틸 시클로헥실 카르복실산 (5.0 g, 20 mmol) 및 DCC (4.4 g, 20 mmol)을 첨가하였고 반응물을 실온에서 밤새도록 느리게 혼합하였다. 고체를 여과하여 모았으며, 이어서 염화메틸렌 100 ml로 5회 세척하였고, 이어서 진공 상태에서 밤새도록 건조시켰다. IR (KBr, cm^-1)=1820, 1771, 1520.

c) 트랜스-4-아미노메틸 시클로헥실 (카이저 옥심 수지) 카르복실레이트

N-t-부틸옥시 카르보닐-트랜스-4-아미노메틸 시클로헥실 (카이저 옥심 수지) 카르복실레이트 (20 g)을 염화메틸렌 (100 ml)에 현탁시켰으며 TFA (25 ml)를 첨가하였다. 반응물을 30 분 동안 느리게 혼합한 후 고체를 여과시켜 모았고, 이어서 염화메틸렌 100 ml로 5회 세척하였으며, 이어서 진공 상태에서 밤새도록 건조시켰다. IR (KBr, cm^-1)=3150, 1770, 1526.

d) 4-카르복시-벤조페논-4-카르복사미도-트랜스-4-메틸-시클로헥실-(카이저 옥심 수지) 카르복실레이트

트랜스-4-아미노메틸 시클로헥실 (카이저 옥심 수지) 카르복실레이트 (200 mg)를 DMF (3.0 ml) 및 N-메틸 모르폴린 (0.2 ml)에 현탁하였으며 4,4'-벤조페논 디카르복실산 (190 mg, 0.7 mmol) 및 HBTU (265 mg, 0.7 mmol)를 첨가하였고 반응물을 3시간 동안 느리게 혼합하였다. 고체를 여과시켜 모은 후 DMF 20 ml로 3회, 이어서 물 20 ml로 3회 세척하였으며, 이어서 DMF (3.0 ml) 및 N-메틸 모르폴린 (0.1 ml)에 재현탁시켰고 4,4'-벤조페논 디카르복실산 (0.35 mmol) 및 HBTU (0.35 mmol)를 첨가하였으며 반응물을 3시간 동안 느리게 혼합하였다. 고체를 여과시켜 모았으며, 이어서 DMF 20 ml로 3회, 이어서 물 20 ml로 3회, 이어서 염화메틸렌 20 ml로 5회 세척한 후 진공 상태에서 건조시켰다.

e) 4-카르복시-벤조페논-4-카르복사미도-트랜스-4-메틸-시클로헥실-N-헥실 카르복사미드

4-카르복시-벤조페논-4-카르복사미도-트랜스-4-메틸-시클로헥실-(카이저 옥심 수지) 카르복실레이트 (200 mg)를 염화메틸렌 (3.0 ml)에 현탁시켰으며 헥실 아민 (0.3 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안 느리게 혼합한 후 여과시키고, 여액을 진공 상태에서 농축하여 표제 화합물을 수득하였다: MS (ES) m/e 493 [M＋H]^＋.

〈실시예 7〉

4-니트로-벤자미도-트랜스-4-메틸-시클로헥실-N-헥실 카르복사미드 (화합물 7)의 제조

4-니트로-벤자미도-트랜스-4-메틸-시클로헥실-N-헥실 카르복사미드

4-니트로 벤조산을 치환하는 것과 4,4'-벤조페논 디카르복실산을 제외하고, 실시예 6(a) 내지 (e)와 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다: MS (ES) m/e 390 [M＋H]^＋.

〈실시예 8〉

4-아세트아미도-벤자미도-트랜스-4-메틸-시클로헥실-N-1-(아미노-R-2-(메톡시 메틸)-피롤리딘) 카르복사미드 (화합물 8)의 제조

4-아세트아미도-벤조산을 치환하는 것과 4,4'-벤조페논 디카르복실산 및 R-1-아미노-2-(메톡시 메틸)-피롤리딘 (RAMP)을 헥실 아민으로 치환하는 것을 제외하고, 실시예 6(a) 내지 (e)와 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다: MS (ES) m/e 331 [M＋H]^＋.

〈실시예 9〉

4-포르밀-E-신나미도-트랜스-4-메틸-시클로헥실-N-(프로필)카르복사미드 (화합물 9)의 제조

4-포르밀 신남산을 치환하는 것과 4,4'-벤조페논 디카르복실산 및 프로필 아민을 헥실 아민으로 치환하는 것을 제외하고, 실시예 6(a) 내지 (e)와 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다: MS (ES) m/e 357 [M＋H]^＋.

〈실시예 10〉

2,3,7,8,9,10-헥사히드로-4-메틸-1H-벤조[b]티에노[2,3-b]피라졸로[3,4-d]피리딘-3-온 (화합물 10)의 제조

a) 에틸 4-히드록시-2-메틸-5,6,7,8-테트라히드로벤조[b]티에노[2,3-b]피리딘-2-카르복실레이트

톨루엔 (300 mL)에 존재하는 에틸 2-아미노-4,5,6,7-테트라히드로벤조[b]티오펜-3-카르복실레이트 (8.9 g, 39 mmol) 및 에틸 3-에톡시크로토네이트 (12.4 g, 78 mmol) 용액을 캄포르술폰산 (0.78 g, 3.4 mmol)으로 처리하였으며 반응 혼합물을 딘 스타르크 트랩을 사용하여 환류시키면서 3시간 동안 가열하였다. 이어서 혼합물을 실온으로 냉각시켰으며 그 후 신선 제조된 1 M 나트륨 에톡시드 용액 (48 mL, 48 mmol)으로 처리하였다. 첨가 완료 후 반응 혼합물을 환류시키면서 3시간 동안 가열하였다. 혼합물을 냉각시켰으며, 농축시켜 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 아세트산 (2 mL)을 첨가하였으며, 용매를 증발시켜 그 결과 생성된 고체를 메탄올로 가루로 만들어 황색이 도는 흰색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다 (8.4 g, 74%): 융점 140 ℃;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ4.48 (q, J=7.2 Hz, 2H), 3.04 (br s, 2H), 2.81 (s, 3H), 2.80 (br s, 2H), 1.87 (br s, 4H), 1.47 (t, J=7.2 Hz, 3H); C₁₅H₁₇NO₃S 이론치: C, 61.83; H, 5.88; N, 4.81; 실측치: C, 61.69; H, 5.81; N, 4.73.

b) 에틸 4-클로로-2-메틸-5,6,7,8-테트라히드로벤조[b]티에노[2,3-b]피리딘-2-카르복실레이트

산염화 인 (100 mL)에 존재하는 실시예 10(a)의 화합물 (8.0 g, 27.4 mmol) 용액을 3.5시간 동안 환류시켰다. 산염화 인을 진공 상태에서 제거하였으며 잔류 오일을 에틸 아세테이트에 용해시켰고, 5% 중탄산나트륨 수용액으로 세척하였으며 무수 황산 나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시켜 결정체 고체로서 표제 화합물을 수득하였다 (8.5 g, 95 %): 융점 65 - 66 ℃;¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ4.47 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.10 (br s, 2H), 2.85 (br s, 2H), 2.60 (s, 3H), 1.89 (br s, 4H), 1.43 (t, J=7.1 Hz, 3H); C₁₅H₁₆ClNO₂S.0.125H₂O 이론치: C, 57.73; H, 5.25; N, 4.49; 실측치: C, 57.69; H, 5.08; N, 4.30.

c) 2,3,7,8,9,10-헥사히드로-4-메틸-1H-벤조[b]티에노[2,3-b]피라졸로[3,4-d]피리딘-3-온

메탄올 (50 mL)에 존재하는 실시예 10(b)의 화합물 (2.0 g, 6.4 mmol) 용액을 히드라진 모노히드레이트 (10 mL)로 처리하였으며 그 결과 생성된 혼합물을 환류시키면서 16시간 동안 가열하였다. 반응물을, 희석시킨 염산 수용액에 쏟아 황색 고체로서 표제 화합물을 침전시켰다 (1.8 g).¹H NMR (400 MHz, d₄-MeOH)δ3.01 (br s, 2H), 3.00 (s, 3H), 2.92 (br s, 2H), 2.00 (br s, 4H); C₁₃H₁₃N₃OS.HCl.0.25H₂O 이론치: C, 52.00; H, 4.87; N, 13.99; 실측치: C, 51.92; H, 5.01; N, 13.70.

실시예 11

SH2 도메인 길항제의 효능 측정용 프로토콜

서로 다른 사람 SH2 도메인에서 화합물의 저해 활성을, 대장균에서 융합 단백질로 발현시킨 SH2 도메인을 사용하여 생체외부에서 측정하였다. 본원에서 사용된 SH2 도메인은 사람 src SH2 도메인, Grb2 SH2 도메인, lck SH2 도메인, fyn SH2 도메인, SH-PTP2 SH2 도메인, p85 SH2 도메인 및 hcp SH2 도메인이었다.

src, lck 및 hcp SH2 도메인을 포함하는 융합 단백질을, DET1-DET2-스페이서-ek-SH2 (여기서, DET1, DET2, 스페이서, ek 및 SH2는 하기에서 설명함)와 같은 일반적인 순서로 발현시켰다. DET1 (정의된 에피토프 태그 1, defined epitope tag 1, 서열 1)은 사람 면역결핍 바이러스 1형 (Human Immunodeficiency Virus Type 1, HIV-1) 엔벨롭 단백질인 gp 120 (또는 gp 160)에서 발견되는 11개의 아미노산 서열이다. HIV-1 gp120(또는 gp160)의 다양한 에피토프에 대한 단일 항체는 당 업계, 예를 들어, 미국 특허 제 5,166,050호에 공지되어 있다. 바람직한 일례로는 단일 항체 178.1이 있는데 [예를 들어, Thiriart 등, J. Immunol., 143: 1832-1836 (1989) 참조], 효모에서 발현시킨 주 BH10으로부터의 HIV-1 gp160 분자를 생쥐에 면역조치함으로써 상기 항체를 제조하였다 [Ratner 등, Nature, 313: 277-284 (1985) 참조]. 상기 태그를, 발현의 검출(웨스턴 블롯), 단백질 정제 (친화 크로마토그래피 이용)와, 178.1 항체를 사용하여 융합 단백질을 포획하거나 고정시키는 것인 배열 분석을 위하여 사용한다. DET2는 니켈 함유 수지에 결합하고 정제 목적으로 사용되는 헥사-히스티딘 서열 태그 (서열 2)이다. 스페이서 (서열 3)는 제작물의 지시된 위치에서 BamH1 제한 효소 부위를 디자인하기 위하여 사용되었다. ek라는 용어는, SH2 도메인으로부터 태그를 임위로 제거함으로써 외래 아미노산 불포함 SH2 도메인의 생성을 제공하는 엔테로키나제 프로테아제의 인식 서열 (서열 4)이다. 외래 아미노산을 포함하지 않는 SH2 도메인은 결정학 연구에서 태그된 단백질보다 더 바람직하다. SH2는 서로 다른 단백질의 SH2 도메인을 지칭한다.

각각의 DET1-DET2-스페이서-ek-SH2를 암호화하는 DNA 서열을, 지시된 제한 부위 (BamH1 및 XbaI)가 스페이서-ek-SH2 부위의 측면에 위치하도록 하여 서로 다른 스페이서-ek-SH2 제작물이 하기 방법 2 또는 3에 기술된 벡터의 어느 하나 내에서 쉽게 치환되어 DET1-DET2-스페이서-ek-SH2로 태그된 단백질을 창조하도록 디자인되었다. 또한 각각의 DET1-DET2-스페이서-ek-SH2 제작물을 암호화하는 DNA 서열을, 대장균 전사 조절 서열 및 번역 조절 서열의 하향과, XbaI과 양립할 수 있는 클로닝 위치의 하향으로 적당한 간격에 NdeI 부위를 포함하고 있는 발현 벡터의 어느 하나 내로 태그된 전체 SH2 도메인을 NdeI-XbaI 단편으로서 옮길 수 있도록 디자인하였다. 몇몇 적당한 벡터가 유사한 결과를 나타낸다 하더라도 (예를 들어, 노바젠, 인크 (Novagen, Inc) 제조의 pET-11a), 본 실험에서 사용된 벡터는 대장균 발현용 벡터인 pEA1KnRBS3이다. 상기 벡터는, 미국 뉴욕주 소재의 그린 퍼블리슁 앤드 윌리-인터사이언스 (Green Publishing and Wiley-Interscience, 하기 F.A. Ausubel 등)에서 출판한 Current Protocols in Molecular Biology (편집 발행인 F.A. Ausubel 등)에 수록되어 있는, [Shatzman, A., Gross, M., 및 Rosenberg, M., 1990, Expression using vectors with phage lambda regulatory sequences, 페이지 16.3.1-16.3.11]에 기술되어 있는 벡터 시리즈의 파생 벡터이다. 특이 벡터 pEA1KnRBS3은 [Bergsma 등, 1991, J. Biol. Chem. 266: 23204-23214]에 설명되어 있다.

하기 방법에서는 닭 src, 사람 src, 사람 lck 및 사람 hcp SH2 도메인의 발현을 설명한다. 첫째, 닭 src SH2 도메인을 DET1-DET2-스페이서-SH2로서 발현시켰다. 이어서, 다른 것들을 닭 src 대신에 상기 벡터 내로 삽입시켜 DET1-DET2-스페이서-ek-스페이서-SH2 형태의 단백질을 발현시켰다.

방법 1: DET1 및 DET2 태그를 포함하는 닭 src SH2 도메인 (DET1-DET2-스페이서-SH2)의 클로닝 및 발현 .

하기 프라이머를 사용하여 당 업계의 숙련자들에게 잘 공지되어 있는 방법으로, 태그된 단백질인 DET1-DET2-스페이서-SH2를 암호화하는 DNA 서열을, 닭 src 유전자를 포함하는 cDNA 클론으로부터 PCR 증폭시켰다 [p5H; Levy 등, 1986. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4228].

서열 17

밑줄친 부위는 NdeI 인식 부위 (5') 및 BamHI 인식 부위 (3')이다.

서열 18

밑줄친 부위는 XbaI 인식 부위이다.

PCR 생성물을 NdeI 및 XbaI으로 자른 후 잘려진 단편을 아가로스 겔 상에서 단리시켰다. 아가로스 겔 상에서 6.5 kbp 단편으로 정제하였던 NdeI-XbaI으로 자른 pEA1KnRBS3 벡터 내로 단편을 라이게이션시켰다 [상기 Bergsma 등]. 라이게이션 반응물을 사용하여 대장균 MM294cI^＋를 형질전환시켰다 [상기 F.A. Ausubel 등]. 올바른 단편 삽입물을 포함하는 플라스미드를 동정하였으며 DNA 염기 서열 결정으로 확인하였다. 그 결과물인 플라스미드는 파지 람다 P_L프로모터 및 조절 시스템의 제어 하에 있는 DET1-DET2-스페이서-SH2를 암호화한다. 플라스미드 DNA를 MM294cI^＋로부터 정제하여 대장균 주 AR120을 형질전환시키는 데 사용하였다. 상기 F.A. Ausubel 등에서 설명된 바와 같이, 상기 숙주 주에서, 파지 프로모터의 발현을, 성장 배양물에 날리딕신산을 첨가함으로써 유도할 수 있다. 상기 플라스미드를 포함하는 AR120을 날리딕신산으로 유도한 후 세포 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 쿠마지 블루 (Coomassie Blue)로 염색하여 분석해 보면 [상기 F.A. Ausubel 등 참조], 외견상 분자량이 15,000인 단백질 밴드가 나타나는데, 상기 밴드는 비유도 세포 또는 PCR 증폭 단편이 없는 pEA1KnRBS3을 포함하는 유도 세포에서는 관찰되지 않았다. 유도 단백질 밴드가 항-DET1 단일 항체 178.1과 반응한다는 것을 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

방법 2: 태그 및 엔테로키나제 단백질 가수 분해 절단 부위를 포함하는 사람 src SH2 도메인 (DET1-DET2-스페이서-ek-src SH2)의 클로닝, 발현 및 정제

ek-src SH2 단백질을 암호화하는 DNA 서열을, 사람 src 유전자를 포함하는 cDNA 클론 ([Takeya, T. 및 Hanafusa, H., 1983 Cell 32: 881-890]에 기술된 것과 동일한 c-src SH2 DNA)으로부터 하기 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다.

서열 19

밑줄친 부위는 BamHI 인식 부위이다.

서열 20

밑줄친 부위는 XbaI 인식 부위이다.

PCR 생성물을 BamHI 및 XbaI으로 자른 후 잘려진 단편을 아가로스 겔 상에서 단리시켰다. 상기 방법 1에서 기술된, 태그된 닭 src 유전자인 DET1-DET2-스페이서-SH2를 포함하는, BamHI-XbaI으로 잘려진 발현용 벡터 내로 단편을 라이게이션시켰다. 상기 벡터에서 BamHI 부위는 DET2와 SH2의 코딩 부위 사이에 위치하며, XbaI 부위는 SH2 코딩 부위의 3' 말단 뒤에 위치한다. 라이게이션 반응물을 사용하여 대장균 MM294cI^＋를 형질전환시켰다. 제작물 DET1-DET2-스페이서-ek-src SH2를 DNA 염기 서열 결정으로 확인하였으며 (서열 5) 상기 방법 1에 설명된 바와 같이 대장균 주 AR120에서 유도하였다. 쿠마지 블루 염색, 웨스턴 블롯-양성인, 외견상 분자량이 16,000인 유도 단백질 밴드가 날리딕신산 유도 후에 관찰되었다.

세포를 중성 pH, 라이소자임 존재 하에서 초음파 처리하여 용해시켰다. 원심 분리 후, 용해성 추출물을 Ni^＋＋NTA 컬럼 상에서 크로마토그래피하였다. 평형 완충액 (0.5 M NaCl을 함유하는 pH가 8인 Tris 완충액)과, 15 mM 이미다졸을 함유하는 동일 완충액으로 컬럼을 세척한 후, 평형 완충액에 존재하는 25 mM 이미다졸로 고도로 정제된 형태의 단배질을 용출시켰다. 상기 방식으로 정제된 SH2 도메인은 하기에 기술된 결합 분석법에서 적절한 pY 펩티드에 특이적이고 포화될 수 있는 방식으로 고도의 친화성을 가지고 결합한다는 것이 밝혀졌는데, 이는 태그가 기능을 손상시키지 않았음을 나타낸다. 상기 발현된 융합 단백질인 DET1-DET2-스페이서-ek-src SH2를 하기에 기술된 결합 분석에 사용하여 사람 src SH2 도메인을 선택적으로 저해하는 화합물의 특이성을 측정하였다.

방법 3: 표지 및 엔테로키나제 단백질 분해성 절단 부위 (DET1-DET2-스페이서-ek-lck SH2)를 함유하는 사람 lck SH2 도메인의 클로닝 및 발현

단백질 ek-lck SH2를 코딩하는 DNA 서열을 하기 프라이머를 사용하여 사람 lck 유전자 함유 cDNA 클론으로부터(진뱅크 기탁 번호 M36881) PCR 증폭시켰다.

서열 21

밑줄은 BamHI 인지 부위이다.

서열 22

밑줄은 XbaI 인지 부위이다.

PCR 생성물을 BamHI 및 XbaI로 소화시킨 후, 아가로스 겔 상에서 소화된 단편을 단리하였다. 단편을 방법 1에 기재된 표지된 닭의 src 유전자 DET1-DET2-스페이서-SH2를 함유하는 BamHI-XbaI 소화된 발현 벡터 내로 라이게이션하였다. 상기 벡터에서, BamHI 부위는 DET2와 SH2의 코팅 영역 간에 위치하고, XbaI 부위는 SH2 코딩 영역의 3' 말단 후에 존재한다. 따라서, ek-lck SH2 서열이 사기 벡터 중 src SH2 서열을 대신하였다. 라이게이션 반응을 사용하여 이. 콜리 MM294cI⁺를 형질전환하였다. DET1-DET2-스페이서-ek-lck SH2 함유 제작물을 DNA 서열결정으로 확인하였고(서열 6), 방법 1에 기재된 바와 같이 이. 콜리 균주 AR120에서 유도하였다. 쿠마시 블루로 염색되고, 웨스턴 블롯 양성으로 유도된 단백질 밴드는 날리딕신산 유도 후 17,000의 겉보기 분자량을 지닌 것으로 관찰되었다.

세포를 중성 pH에서 라이소자임의 존재 하에 초음파 처리로 용균시켰다. 원심분리한 후, 가용성 추출물을 Ni↔NTA 컬럼 상에서 크로마토그래피하였다. 평형 완충액 (0.5M NaCl 함유 트리스 완충액 pH 8) 및 15 mM 이미다졸 함유 동일 완충액으로 컬럼을 세척한 후, 단백질을 25 mM 이미다졸 함유 평형 완충액을 사용하여 매우 정제된 형태로 유출하였다. 이렇게 정제된 SH2 도메인은 하기의 결합 분석법에서 특이적이고 포화적 방식으로 적절한 pY 펩티드에 높은 친화도로 결합하는 것으로 밝혀졌고, 표지가 기능을 저해시키지 않는 것으로 관찰되었다. 이 발현된 융합 단백질, DET1-DET2-스페이서-eK-lck SH2를 하기 결합 분석법에 사용하여 사람의 lck SH2 도메인을 선택적으로 억제하는 화합물의 특이성을 측정하였다.

방법 4: 표지 및 엔테로키나제 단백질 분해성 절단 부위(DET1-DET2-스페이서-eK-lck SH2)를 함유하는 사람 hcp SH2 도메인의 클로닝 및 발현 .

단백질 ek-hcp SH2를 코딩하는 DNA 서열 (hcp SH2 DNA 서열은 쉔(Shen, S-H),Nature(1991)352: 736-739에서 기재된 바와 동일함)을 사람 태아의 간 RNA로부터 역전사효소-PCR 증폭시켰다. RNA 단리는 트리-레젼트(Tri-Reagent) (Molecular Research Center, Inc.) 및 역전사효소계(기브코)를 제조자의 지침에 따라 사용하였다. PCR을 하기 프라이머를 사용하여 수행하였다.

서열 23

밑줄은 BglII 인지 부위이다.

서열 24

밑줄은 XbaI 인지 부위이다.

PCR 생성물을 BglII 및 XbaI를 사용하여 소화시킨 후, 소화된 단편을 아가로스 겔 상에서 단리하였다. 단편을 방법 2에 기재된 표지된 사람의 src 유전자 DET1-DET2-스페이서-eK-src SH2를 함유하는 BamHI-XbaI 소화된 발현 벡터 내로 라이게이션하였다. 상기 벡터에서, BamHI 부위는 DET2와 ek의 코딩 영역 간에 위치하고, XbaI 부위는 SH2 코딩 영역의 3' 말단 후에 위치하였다. 따라서, ek-hcp SH2 서열이 상기 벡터 내에서 ek-src SH2 서열을 대신하였다. 라이게이션 반응을 사용하여 이. 콜리 MM294cI⁺를 형질전환하였다. DET1-DET2-스페이서-ek-hcp SH2 함유 제작물을 DNA 서열결정으로 확인하였고(서열 7), 이. 콜리 GI698 (인비트로겐사, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)을 형질전환하는데 사용하였다. 트립토판을 배양액에, 제조자의 지시에 따라, 10 ㎎/㎖로 첨가하여서 파아지 람다 프로모터를 유도하였다. 쿠마시 블루로 염색되고, 웨스턴 블롯 양성으로 유도된 단백질 밴드는 30℃에서 증식하는 세포의 트립토판 유도 후 15,000의 겉보기 분자량을 지닌 것으로 관찰되었다.

세포를 중성 pH에서 라이소자임의 존재 하에 초음파 처리로 용균시켰다. 원심분리한 후, 가용성 펠릿을 트리스 완충액 pH 8에서 8 M 우레아로 용해시키고, Ni↔NTA 컬럼에 결합시켰다. 수지를 평형 완충액 (0.5 M NaCl, 8 M 우레아 및 5 mM BME 함유 트리스 완충액 pH 8) 및 15 mM 이미다졸 함유 동일 완충액으로 컬럼을 세척하였다. 단백질은 5 mM BME의 존재 하에 우레아를 제거하는 동안 컬럼 상에서 재폴딩되었고, 정제된 재폴딩된 단백질을 300 mM 이미다졸 함유 트리스 완충액 pH 8을 사용하여 유출하였다. 이렇게 정제된 SH2 도메인은 하기 결합 분석법에서 특이적이고 포화적 방식으로 적절한 pY 펩티드에 높은 친화도로 결합하는 것으로 밝혀졌고, 표지가 기능을 저해시키지 않는 것으로 관찰되었고, 단백질이 연속적으로 재폴딩되었다. 이 발현된 융합 단백질, DET1-DET2-스페이서-eK-hcp SH2를 하기 결합 분석법에 사용하여 사람의 hcp SH2 도메인을 선택적으로 억제하는 화합물의 특이성을 측정하였다.

구조 GST-X-SH2를 갖는 융합 단백질을 파르마시아(뉴저지주 소재)로부터 시판되는 GST 유전자 융합 장치계에서와 같이 제조하였다. GST는 fyn, Grb2 및 SH-PTP2에 대한 글루타치온 s-트랜스퍼라제 에피토프 (서열 8) 표지 서열이고, p85에 대한 글루타치온 s-트랜스퍼라제 에피토프 (서열 9) 표지 서열이다. SH2는 fyn, Grb2, p85 및 SH-PTP2의 SH2 도메인에 속하고, 발현된 후 글루타치온 세파로스 4B (파르마시아사)를 사용하여 아우스벨(FM Ausubel) 등의 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, pub. John Wiley and Sons, Inc. (1995), p. 16.7.1]에 따라 정제하였다. X는 적절한 링커이고, 바람직하게는 6 내지 21개의 염기쌍이고, SH2 제작물을 프레임 내에서 유지하고 클로닝을 보완하도록 사용된다. 이와 같이, X의 서열은 결정적이지 않다. 당 업계의 숙련가들은 쉽게 적절한 링커를 제작할 수 있다. 각 GST-X-SH2 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 표시된 제한 부위 (BamHI 및 EcoRI)가 SH2 영역에 인접하도록 고안하였다. 본 실험에 사용된 벡터는 이. 콜리 발현 벡터 fyn에 대한 pGEX-2T (파르마시아사), Grb2 및 SH-PTP2, 및 p85에 대한 pGEX-3X (파르마시아사)이었다. 상기 벡터들은 하기와 같이 추가의 C-말단 아미노산을 갖는 SH2 제작물을 초래한다.

사람 fyn의 SH2 도메인 코딩 서열 (아미노산 143-252) (야마모또 (Yamamoto, T.)등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5459-5463 (1986))을 발현 벡터 pGEX-2T의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝하였다. 추가의 C-말단 아미노산 루신-트레오닌-아스파라긴-세린을 포함하는 SH2 도메인(서열 10)을 당업계의 숙련가에게 공지된 PCR 기술로 클로닝하여서 발현된 융합 단백질 GST-X-fyn을 얻었다. 이어서, 이 발현된 융합 단백질을 하기 결합 분석법에 사용하여서 사람 fyn SH2 도메인을 선택적으로 억제하는 화합물의 특이성을 측정하였다.

사람 p85 SH2 도메인: 사람 p85의 SH2 도메인 코딩 서열 (아미노산 321-440)(스콜닉 (Skolnik, E.) 등,Cell 65, 83-90 (1991))을 발현 벡터 pGEX-3X의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝하였다. 추가의 C-말단 아미노산 아스파라긴-세린-세린을 포함하는 SH2 도메인(서열 11)을 당업계의 숙련가에게 공지된 PCR 기술로 클로닝하여서 발현된 융합 단백질 GST-X-p85를 얻었다. 이 발현된 융합 단백질을 하기 결합 분석법에 사용하여서 사람 p85 SH2 도메인을 선택적으로 억제하는 화합물의 특이성을 측정하였다.

사람 SH-PTP2 SH2 도메인: 사람 SH-PTP2의 SH2 도메인 코딩 서열 (아미노산 1-106) (바스티엔(Bastien, L.) 등,Biochem. Biophys. Res. Commun. 196, 124-133 (1993))를 발현 벡터 pGEX-2T의 BamHI 및 EcoRI 부위 내로 클로닝하였다. 추가의 C-말단 아미노산 글루타민-페닐알라닌-이소루신-발린-트레오닌-아스파레이트를 포함하는 SH2 도메인(서열 12)을 당업계의 숙련가에게 공지된 PCR 기술로 클로닝하여서 발현된 융합 단백질 GST-X-SH-PTP2를 얻었다. 이어서, 이 발현된 융합 단백질을 결합 분석법에 사용하여서 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인을 선택적으로 억제하는 화합물의 특이성을 측정하였다.

사람 Grb2 SH2 도메인: 사람 Grb2의 SH2 도메인 코딩 서열 (아미노산 58-159) (로벤스타인(Lowenstein, E.) 등,Cell 70, 431-442 (1992))를 발현 벡터 pGEX-2T의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝하였다. 추가의 C-말단 아미노산 이소루신-히스티딘-아르긴-아스파레이트를 포함하는 SH2 도메인(서열 25)를 당업계의 숙련가에게 공지된 PCR 기술로 클로닝하여서 발현된 융합 단백질 GST-X-Grb2를 얻었다. 6개의 뉴클레오티드 링커를 사용하여서 GST와 SH2 도메인 간에 아미노산 글리신 및 세린을 초래하였다. 이어서, 이 발현된 융합 단백질을 하기 결합 분석법에 사용하여서 사람의 Grb2 SH2 도메인을 선택적으로 억제하는 화합물의 특이성을 측정하였다.

결합 분석법: SH2 도메인에서 화합물의 잠재능은 SH2 도메인이 그의 각각의 특이적 pY 펩티드에 결합하는 것을 선택적으로 억제하는 화합물의 능력을 기준으로 측정하였다.

SH2 도메인 및 pY 펩티드에 대한 결합 분석을 ELISA-기재 96 웰 플레이트 분석법으로 수행하였다. 밀리포어 96 웰 필터 플레이트에서, 친수성 듀라포어(Durapore) (등록 상표) (기공 크기 0.65 ㎛ 목록 번호 MADVN6550)에 2 ㎕ (50% 현탁액)의 단백질-G 세파로스 (뉴저지주 소재의 파르마시아로부터 구입, 목록 번호 17-0618-01) 및 2 ㎕의 2 ㎎/㎖의 MAB178.1 (gp120/SH2 도메인 융합 단백질 src, lck 및 hcp에 있어서) 또는 0.25 ㎕의 항-GST 다클론 항혈청 (뉴저지주 소재의 파르마시아로부터 구입) (GST/SH2 도메인 융합 단백질 fyn, Grb2, p85 및 SH-PTP2에 있어서). 10 pmol의 SH2 도메인 융합 단백질을 각각의 웰에 가하였다. 부피를 TBS-T (트리스 완충 염수에 0.05% 트윈 20을 가함)를 사용하여 100 ㎕로 맞추고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 진탕시킨 후, TBS-T로 1회 세척하였다 (4℃). 이어서, 90 ㎕의 TBS-T를 각 웰에 가하였다. 특이적 pY 비오티닐화 펩티드를 TBS-T에서 1.0 μM의 농도가 되도록 희석하였다 (이 펩티드는 펜실바니아주 소재의 바켐 바이오사이언스, 텍사스주 소재의 제노시스 바이오테크놀로지 및 캘리포니아주 소재의 캘리포니아 펩티드 리써치로부터 구입가능함). 10 ㎕를 각 웰에 분액하여서 0.1 μM의 최종 농도 (각 SH2 도메인/펩티드쌍에 대한 Kd의 근사치) 및 100 ㎕의 최종 부피를 얻었다. 분석 플레이트를 평형 결합이 얻어질 때까지 인큐베이션하였다(4℃에서 3시간 동안 진탕함). 분석 플레이트를 웰 당 TBS-T로 2회 세척한 후(4℃), 100 ㎕의 SABC [스트렙아비딘 비오티닐화 양고추냉이 퍼옥시다제 복합체, 캘리포니아주 소재의 짐드(Zymed) 사로 부터 목록 번호 93-0043로 구입, 10 ㎖의 TBS-T 당 1 방울의 시약 A (스트렙아비딘) 및 1 방울의 시약 B (AH-비오틴 컨쥬게이트된 양고추냉이 퍼옥시다제)를 4℃에서 30-60분 동안 인큐베이션함]를 웰 당 가한 후, 4℃에서 30-60분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 TBS-T로 4회 세척하였다(4℃) (250 ㎕/웰)/세척). 시트레이트 완충액 중 100 ㎕의 1 ㎎/㎖의 OPD (o-페닐디아민, 성 루이스 미주리 소재의 시그마 케미칼사)를 웰 당 가하였다. 더 진행되는 것을 중단하기 위하여, 100 ㎕의 10% 황산을 웰 당 가하였다. 분석 플레이트의 각 웰로부터 150 ㎕를 제거한 후, ELISA 플레이트에 놓았다. 이어서, 각 ELISA 플레이트의 A₄₉₀을 측정하였다.

표 I에 대한 (IC₅₀)의 측정

각 대조구 또는 화합물을 2회 분석하였다. 2회 분석치를 평균하여서 배경값을 제하고, 억제가 없는 최대치를 플레이트로부터 취한 후, 모든 다른 자료값을 최대값의 백분율 (또는 % 대조값)로 표시하였다. 이 % 대조 자료값은 매킨토쉬의 칼레이다그래프(씨너지 소프트웨어사)에서 그래프화하였다. 이 그래프 상의 곡선은 하기 식에 따른 비선형 곡선이었다. F(x)=Emax/(1+(k_d/농도)^기울기) (여기서, k_d는 각 곡선에 대한 IC₅₀를 나타냄).

표 II에 대한 (Ki)의 측정

각 화합물에 대한 Ki를 하기 식에 따라 계산하였다 (문헌 참조). 이 확장된 식은 pY 비오티닐화 펩티드가 SH2 도메인 융합 단백질에 대해 과잉 농도 (100X)로 존재하지 않는다는 사실에 기인한 이 분석법의 조건 하에서 사용되야 한다. IC₅₀은 칼레이다그래프를 사용하여 작성된 비선형 곡선으로부터 외삽된 값이다. Rtot 및^*D는 분석에 사용된 시약에 대한 공지된 값이다. KD는 일반적으로 SH2 도메인 융합 단백질 및 pY 비오티닐화 펩티드의 각각의 조합에 대해 실험적으로 측정되야 한다.

KI=(IC50-Rtot+Rtot/2((^*D/(KD+^*D))+(KD/(KD+^*D+Rtot/2)))/(1+^*D/KD+Rtot/KD((KD+^*D/2)/(KD+^*D)))

KI = 경쟁자의 KD (μM)

IC₅₀= 억제제의 IC₅₀, 각 SH2 도메인에 대한 경쟁 선별성 분석 자료의 비선형 곡선으로부터 유도됨 (μM)

Rtot = 1개의 분석 (마이크로티터 플레이트) 웰 내의 총 SH2 도메인 농도 (μM)

^*D = 각 SH2 도메인에 대한 특이적 pY 및 비오티닐화 펩티드의 농도 (μM)

KD = 각 SH2 도메인에 대한 특이적 pY 및 비오티닐화 펩티드에 대한 KD 값 (μM)

IC₅₀은 50%로 억제되는 반응 또는 신호에서 억제제의 농도

KD는 수용체/리간드 상호 작용에 대한 해리상수이고, 일반적으로 포화 결합 곡선 상에서 1/2 Vmax에서 리간드의 농도는 평형상태임.

상기 결합 분석법에 사용되는 pY 펩티드 리간드는 하기와 같다.

src, lck 및 fyn SH2 도메인에 대해 사용된 아미노카프르산 (Aca) 링커 함유 비오티닐화 pY 펩티드 리간드.

서열 13

p85 SH2에 대해 사용된 아미노카프르산 (Aca) 링커 함유 비오티닐화 pY 펩티드 리간드.

서열 14

SH-PTP2 SH2에 대해 사용된 아미노카프르산 (Aca) 링커 함유 비오티닐화 pY 펩티드 리간드.

서열 15

hcp SH2에 대해 사용된 아미노카프르산 (Aca) 링커 함유 비오티닐화 pY 펩티드 리간드.

서열 16

Grb2 SH2에 대해 사용된 아미노카프르산 (Aca) 링커 함유 비오티닐화 pY 펩티드 리간드.

서열 26

결합 분석의 결과:

표 I 및 II는 표시된 SH2 도메인에서 SH2 길항제의 교차 반응성을 나타내었다. 이 표에 개시된 결과로부터, 결합 친화도/억제 농도가 SH2의 다른 도메인에서 보다 lck SH2 도메인에서 50 배 더 큰 화합물을 쉽게 확인할 수 있다.

클로닝된 사람 SH2 도메인에서 Src SH2 도메인 길항제의 교차 반응성 (IC₅₀)

화합물	src	Lck	Fyn	SH-PTP2	p85	Grb2	Hcp
1	6 μM	6 μM	NI	NI	NI	NI	X
2	NI	NI	NI	NI	NI	NI	0.9 μM
3	16.1 μM	22.9 μM	NI	NI	NI	NI	1.2 μM
4	40 μM	163 μM	NI	X	NI	NI	30 μM
5	63 μM	100 μM	NI	NI	NI	NI	0.1 μM
6	20 μM	NI	NI	X	NI	NI	X
7	7.4 μM	383 μM	NI	NI	NI	NI	NI
8	16 μM	126 μM	NI	NI	NI	NI	〉100 μM
9	131 μM	200 μM	NI	NI	NI	NI	12 μM
10	X	X	NI	NI	NI	NI	1.2 μM
NI-300 μM까지 억제가 관찰되지 않음
X-시험되지 않음

클로닝된 사람 SH2 도메인에서 Src SH2 도메인 길항제의 교차 반응성 (Ki)

화합물	src	Lck	Fyn	SH-PTP2	p85	Grb2	Hcp
1	7 μM	X	NI	NI	NI	NI	X
2	NI	NI	NI	NI	NI	NI	X
3	6 μM	11 μM	NI	NI	NI	NI	X
4	40 μM	163 μM	NI	XX	NI	NI	X
5	28 μM	149 μM	NI	NI	NI	NI	X
6	13 μM	50 μM	NI	NI	NI	NI	X
7	20 μM	320 μM	NI	NI	NI	NI	X
8	12 μM	360 μM	NI	NI	NI	330	X
9	55 μM	146 μM	NI	NI	NI	NI	X
10	XX	XX	NI	NI	NI	NI	X
NI-1000 μM 미만에서 억제가 관찰되지 않음
X-계산되지 않음
XX-시험되지 않음

본 발명의 바람직한 실시 태양이 상기와 같이 예시되지만, 이는 본 발명을 예시된 정확한 지침으로 한정하려는 것이 아니라, 하기 청구항의 영역 내에서 가능한 모든 변형이 보유되는 것으로 이해된다.

〈서열표〉

(1) 일반적 정보 :

(i) 출원인: 듀닝턴, 다미엔

(ii) 발명의 명칭: 자기면역 질환 및 동종이식 거부 치료를 위한 LCK SH2 특이성 화합물의 용도

(iii) 서열수: 26

(iv) 통신 주소:

(A) 수신인: 스미스클라인 비참 코포레이션

(B) 거리: 스웨드랜드 로드 709

(C) 도시: 킹 오브 프러시아

(D) 주: 펜실바니아주

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 19406

(v) 컴퓨터 판독 형태

(A) 매체 유형: 플로피 디스켓

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형

(C) 작동 시스템: DOS

(D) 소프트웨어: 패스트SEQ 버전 1.5

(vi) 본 출원 데이타 :

(A) 출원번호:

(B) 출원일:

(C) 분류:

(vii) 우선권 출원 데이타:

(A) 출원번호: 08/386,381

(B) 출원일: 1995년 2월 10일

(A) 출원번호: 08/400,220

(B) 출원일: 1995년 3월 7일

(A) 출원번호: 08/497,357

(B) 출원일: 1995년 6월 30일

(viii) 변호사/대리인 정보:

(A) 이름: 더스트만, 웨인 제이

(B) 등록 번호: 33,870

(C) 참조/관리 번호: P50323-2Ll

(ix) 전기통신 정보:

(A) 전화: 610-270-5023

(B) 텔레팩스:

(C) 텔렉스:

(2) 서열 1에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 11 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티트

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(ix) 특징:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 2에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 6 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티트

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(ix) 특징:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 3에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 3 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티트

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(ix) 특징:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 4에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 5 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티트

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(ix) 특징:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 5에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 130 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티트

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(ix) 특징:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 6에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 134 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티트

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(ix) 특징:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 7에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 133 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티트

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(ix) 특징:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 8에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 224 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티트

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(ix) 특징:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 9에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 225 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티트

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(ix) 특징:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 10에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 117 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티트

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(ix) 특징:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 11에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 123 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티트

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(ix) 특징:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 12에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 112 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티트

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(ix) 특징:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 13에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 19 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티트

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 기타

(B) 위치: 4...4

(C) 기타 정보: 인산화 티로신 잔기

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 14에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 19 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티트

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 기타

(B) 위치: 4...4

(C) 기타 정보: 인산화 티로신 잔기

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 15에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 19 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티트

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 기타

(B) 위치: 6...6

(C) 기타 정보: 인산화 티로신 잔기

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 16에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 23 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티트

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 기타

(B) 위치: 7...7

(C) 기타 정보: 인산화 티로신 잔기

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 17에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 87 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형:

(vi) 본래의 공급원:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 18에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 38 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형:

(vi) 본래의 공급원:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 19에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 46 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형:

(vi) 본래의 공급원:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 20에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 38 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형:

(vi) 본래의 공급원:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 21에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 48 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형:

(vi) 본래의 공급원:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 22에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 35 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형:

(vi) 본래의 공급원:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 23에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 46 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형:

(vi) 본래의 공급원:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 24에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 35 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형:

(vi) 본래의 공급원:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 25에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 106 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티드

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 26에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 11 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티드

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(v) 단편 유형: 내부

(vi) 본래의 공급원:

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 기타

(B) 위치: 6...6

(C) 기타 정보: 인산화 티로신 잔기

(xi) 서열 설명:

Claims

a. 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며,

b. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인에 결합하고,

c. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인에 결합하고,

d. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 p85 SH2 도메인에 결합하고,

e. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 Grb2 SH2 도메인에 결합하는 화합물의 치료상 효과적인 양을 투여하는 것으로 이루어지는 자기면역 질환의 치료 방법.
제1항에 있어서, 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 화합물의 치료상 효과적인 양을 투여하는 것으로 이루어지는 방법.
제1항에 있어서,

a. 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며,

b. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인에 결합하고,

c. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인에 결합하고,

d. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 p85 SH2 도메인에 결합하고,

e. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 Grb2 SH2 도메인에 결합하는 화합물의 치료상 효과적인 양을 투여하는 것으로 이루어지는 방법.
제3항에 있어서, 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 화합물의 치료상 효과적인 양을 투여하는 것으로 이루어진 방법.
a. 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며,

b. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인에 결합하고,

c. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인에 결합하고,

d. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 p85 SH2 도메인에 결합하고,

e. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 Grb2 SH2 도메인에 결합하는 화합물의 동종이식 거부 억제량을 투여하는 것으로 이루어지는 동종이식 거부 억제 방법.
제5항에 있어서, 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 동종이식 거부 억제량을 투여하는 것으로 이루어지는 방법.
제5항에 있어서,

a. 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며,

b. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인에 결합하고,

c. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인에 결합하고,

d. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 p85 SH2 도메인에 결합하고,

e. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 Grb2 SH2 도메인에 결합하는 화합물의 동종이식 거부 억제량을 투여하는 것으로 이루어지는 방법.
제7항에 있어서, 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 화합물의 동종이식 거부 억제량을 투여하는 것으로 이루어지는 방법.
a. 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며,

b. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인에 결합하고,

c. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인에 결합하고,

d. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 p85 SH2 도메인에 결합하고,

e. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 Grb2 SH2 도메인에 결합하는 화합물의 면역억제 유도량을 투여하는 것으로 이루어지는 면역억제 유도 방법.
제9항에 있어서, 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 화합물의 면역억제 유도량을 투여하는 것으로 이루어지는 방법.
제9항에 있어서,

a. 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며,

b. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인에 결합하고,

c. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인에 결합하고,

d. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 p85 SH2 도메인에 결합하고,

e. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 Grb2 SH2 도메인에 결합하는 화합물의 면역억제 유도량을 투여하는 것으로 이루어지는 방법.
제11항에 있어서, 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 화합물의 면역억제 유도량을 투여하는 것으로 이루어지는 방법.
a. 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며,

b. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인에 결합하고,

c. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인에 결합하고,

d. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 p85 SH2 도메인에 결합하고,

e. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 Grb2 SH2 도메인에 결합하는 화합물의, 자기면역 질환 치료에 사용되는 의약 제조에서의 용도.
제13항에 있어서, 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 화합물의 용도.
제13항에 있어서,

a. 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며,

b. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인에 결합하고,

c. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인에 결합하고,

d. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 p85 SH2 도메인에 결합하고,

e. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 Grb2 SH2 도메인에 결합하는 화합물의 용도.
제15항에 있어서, 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 화합물의 용도.
a. 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며,

b. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인에 결합하고,

c. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인에 결합하고,

d. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 p85 SH2 도메인에 결합하고,

e. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 Grb2 SH2 도메인에 결합하는 화합물의, 동종이식 거부 억제에 사용되는 의약 제조에서의 용도.
제17항에 있어서, 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 화합물의 용도.
제18항에 있어서,

a. 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며,

b. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인에 결합하고,

c. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인에 결합하고,

d. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 p85 SH2 도메인에 결합하고,

e. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 Grb2 SH2 도메인에 결합하는 화합물의 용도.
제19항에 있어서, 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 화합물의 용도.
a. 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며,

b. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인에 결합하고,

c. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인에 결합하고,

d. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 p85 SH2 도메인에 결합하고,

e. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 Grb2 SH2 도메인에 결합하는 화합물의, 면역억제 유도에 사용되는 의약 제조에서의 용도.
제21항에 있어서, 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 50 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 화합물의 용도.
제21항에 있어서,

a. 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하며,

b. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 hcp SH2 도메인에 결합하고,

c. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 SH-PTP2 SH2 도메인에 결합하고,

d. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 p85 SH2 도메인에 결합하고,

e. 이 lck SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 낮은 결합 친화도로 사람의 Grb2 SH2 도메인에 결합하는 화합물의 용도.
제23항에 있어서, 사람의 src SH2 도메인 및 사람의 fyn SH2 도메인에 결합하는 결합 친화도보다 100 배 이상 더 큰 결합 친화도로 사람의 lck SH2 도메인에 결합하는 화합물의 용도.