JPH10513474A

JPH10513474A - 自己免疫疾患および同種異系移植拒絶を治療するためのｌｃｋｓｈ２特異的化合物の使用

Info

Publication number: JPH10513474A
Application number: JP8524486A
Authority: JP
Inventors: ダニントン，ダミアン・ジョン
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1995-02-10
Filing date: 1996-02-09
Publication date: 1998-12-22
Also published as: FI973259A; EP0811159A1; CA2212645A1; AU4923796A; BR9607614A; EP0809490A1; EP0809490A4; NO973659D0; JPH10513564A; FI973259A0; KR19980702115A; WO1996024343A1; NO973659L; HUP9802078A3; HUP9802078A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、対象における自己免疫疾患の治療法であって、化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し、化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメイン、ヒトＧｒｂ２ＳＨ２ドメイン、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインおよびヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力で結合する治療上有効量の化合物を対象に投与することからなる方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】自己免疫疾患および同種異系移植拒絶を治療するためのＬＣＫＳＨ２特異的化合物の使用発明の背景ｓｒｃ−関連のリンパ球特異的蛋白質チロシンキナーゼ、ｐ５６^lck（ｌｃｋ）は、その独特なアミノ末端ドメインを介してＴリンパ球ＱＣＤ４の細胞質尾部に物理的に結合する。ｌｃｋの結合したＣＤ４はＴ細胞活性化カスケードにおける不可欠な成分であり、完全なｌｃｋＳＨ２ドメイン／ＣＤ４複合体がＴ細胞の抗原に対する機能的免疫応答に必要とされる。ｌｃｋＳＨ２ドメイン／ＣＤ４複合体の阻害は、Ｔ細胞特異的免疫抑制をもたらす。種々のポリペプチド成長因子およびホルモンがシグナル導入経路を介してその細胞作用を媒介している。これらリガンドの細胞表面レセプターから細胞内エフェクターへのシグナルの導入が調節蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）およびホスファターゼによる特異的蛋白質基質のホスホリル化または脱ホスホリル化に関与していることが度々ある。チロシンのホスホリル化は、多細胞生物におけるシグナル導入の、主たる、ことによると唯一のインジケーターである。レセプター結合および細胞内ＰＴＫは、免疫系細胞における細胞増殖、細胞分化およびシグナル化を調節する。異常な蛋白質チロシンキナーゼ活性は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、乾癬、敗血性ショック、骨喪失、貧血、多種の癌および他の増殖性疾患などの種々の病因に関連付けられるか、または関連すると考えられる。従って、それらの病因の一部であるチロシンキナーゼおよびシグナル導入経路が薬剤設計の標的となる可能性がある。報文として、Levitzkiら、Science ２６７１７８２−１７８８（１９９５）を参照のこと。シグナル導入経路に関与する蛋白質の多くは低濃度で存在し、反対の活性を有することもしばしばである。これらシグナル化分子の特性により、エフェクターの細胞下配置および並置によって、ならびに一の経路での小さな変化が作用を切り替えうるように活性化と抑制を調和させることにより、細胞が導入を制御することができる。蛋白質−蛋白質相互作用を介するシグナル化分子の並置による導入複合体の形成は、特異的ドッキングドメイン配列モチーフによって媒介される。種々のシグナル化分子、例えば非レセプターＰＴＫおよびキナーゼ標的エフェクター分子、および癌遺伝子蛋白質に見られる約１００個のアミノ酸の保存された非触媒配列である、Ｓrc相同性２（ＳＨ２）ドメインは、臨界的役割を果たす。ＳＨ２ドメインは、自己ホスホリル化ＰＴＫレセプターまたは細胞内チロシンキナーゼに見られる短いホスホチロシン含有ペプチド配列に対して高度に特異的である。なお保存されたＳＨ２ドメイン、約１００アミノ酸の保存は配列を共有する種々の触媒的または他の機能的ドメインを有する約６０個の蛋白質が同定されている。体内のいずれの生理学的応答がこれらの各ＳＨ２ドメインにより制御されるかは正確には分かっていない。さらには、ＳＨ２ドメイン−リガンド／化合物の相互作用は、リガンド／化合物の構造における小さな修飾が、リガンド／化合物が種々のＳＨ２ドメインに結合する選択性を有意に変えるように、高度に特異的である。ＳＨ２ドメインの非選択的拮抗作用の結果は、本当に厳格であるとすることができる。例えば、ｓｒｃＳＨ２ドメイン、ｌｃｋＳＨ２ドメインおよびｆｙｎＳＨ２ドメインは、構造的に類似し、ドメイン間で高度な保存性を有する。ｓｒｃＳＨ２ドメインの拮抗作用は、ｌｃｋＳＨ２（本明細書にて検討）またはｆｙｎＳＨ２ドメインの拮抗作用が免疫抑制を誘発するのに対して、ｓｒｃＳＨ２ドメインの拮抗作用は骨吸収を行うと指示されている。骨吸収の阻害は、免疫抑制を誘発する必要のある長期間の治療には望ましくないであろう。さらには、６０種の公知ＳＨ２すべてに対して結合実験にてｌｃｋＳＨ２ドメイン拮抗作用の可能性を検定することは実践的ではない。現在のところ、ｌｃｋＳＨ２ドメインと選択的に相互作用する公知化合物はない。ｌｃｋＳＨ２ドメインを拮抗することにより自己免疫疾患および同種異系拒絶反応の治療を可能とするが、非選択的ＳＨ２ドメイン拮抗物質にて観察される副作用の形成を回避する方法および化合物を提供することが望ましい。本明細書に開示されるように、意外にも、ｓｒｃＳＨ２ドメイン、ｌｃｋＳＨ２ドメイン、ｆｙｎＳＨ２ドメイン、ＳＨＰＴＰ２ＳＨ２ドメイン、ｐ８５ドメイン、Ｇｒｂ２ＳＨ２ドメインおよびｈｃｐＳＨ２からなるサブセットのＳＨ２ドメインに対して結合検定を行うことにより、選択的ｌｃｋＳＨ２ドメイン拮抗物質を同定できることが見出された。以下に示す結合情報から、意外にも、化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力を有する、ヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに特異的な化合物であって、化合物がそのようなｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力を有するヒトｈｃｐＳＨ２、ヒトＧｒｂ２ＳＨ２ドメイン、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインおよびヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合する化合物が、自己免疫疾患および同種異系拒絶反応の治療に効果的であることが見いだされた。発明の要約本発明は、対象における自己免疫疾患の治療法であって、（ａ）化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し、（ｂ）化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメイン、ヒトＧｒｂ２ドメイン、ヒトＳＨ −ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインおよびヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合する、治療上有効量の化合物を対象に投与することからなる方法を提供する。本発明は、対象における同種異系拒絶反応の阻害方法であって、（ａ）化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し、（ｂ）化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメイン、ヒトＧｒｂ２ドメイン、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインおよびヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合する、同種異系拒絶反応阻害量の化合物を対象に投与することからなる方法を提供する。本発明はまた、対象における免疫抑制を誘発する方法であって、（ａ）化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し、（ｂ）化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメイン、ヒトＧｒｂ２ドメイン、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインおよびヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合する、免疫抑制誘発量の化合物を対象に投与することからなる方法を提供する。発明の詳細な記載本明細書にて用いる場合、「自己免疫疾患」なる語は、過度の活性免疫応答または自己抗原に誤って方向づけられる免疫応答により特徴づけられるいずれの障害も意味する。好ましい自己免疫疾患はリウマチ様関節炎である。多発性硬化症、全身性エリテマトーデスおよびＩ型糖尿病もまた含まれる。本明細書にて用いる場合、「治療」なる語およびその誘導語は、予防的または治療的療法を意味する。本明細書にて用いる場合、「化合物」なる語は、非ペプチド化学の化合物を意味する。本明細書にて用いる場合、特に限定しない限り、「ｌｃｋＳＨ２ドメインアンタゴニスト」なる語は、（ａ）化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな、好ましくは１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し、（ｂ）化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上、好ましくは１００倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメイン、ヒトＧｒｂ２ＳＨ２、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインおよびヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合する、化合物を意味する。本発明は、対象における自己免疫疾患の治療法であって、（ａ）化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し、（ｂ）化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメイン、ヒトＧｒｂ２ＳＨ２、ヒトＳＨ− ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインおよびヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合する、治療上有効量の化合物を対象に投与することからなる方法を提供する。本発明の好ましい態様は、対象における自己免疫疾患の治療法であって、（ａ）化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する、治療上有効量の化合物を対象に投与することからなる方法を提供することである。本発明の好ましい態様は、対象における自己免疫疾患の治療法であって、（ａ）化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し、（ｂ）化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメイン、ヒトＧｒｂ２ＳＨ２、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインおよびヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合する、治療上有効量の化合物を対象に投与することからなる方法を提供することである。本発明の好ましい態様は、対象における自己免疫疾患の治療法であって、（ａ）化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する、治療上有効量の化合物を対象に投与することからなる方法を提供することである。本発明はまた、対象における同種異系拒絶反応の阻害法であって、（ａ）化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上、好ましくは１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し、（ｂ）化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上、好ましくは１００倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメイン、ヒトＧｒｂ２ドメイン、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインおよびヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合する、同種異系拒絶反応阻害量の化合物を対象に投与することからなる方法を提供する。本発明の好ましい態様は、対象における同種異系拒絶反応の阻害法であって、（ａ）化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上、好ましくは１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する、同種異系拒絶反応阻害量の化合物を対象に投与することからなる方法を提供することである。本発明はまた、対象における免疫抑制の誘発法であって、（ａ）化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上、好ましくは１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し、（ｂ）化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上、好ましくは１００倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメイン、ヒトＧｒｂ２ドメイン、ヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインおよびヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合する、免疫抑制誘発量の化合物を対象に投与することからなる方法を提供する。本発明の好ましい態様は、対象における免疫抑制を誘発する方法であって、( ａ)化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上、好ましくは１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する、免疫抑制誘発量の化合物を対象に投与することからなる方法を提供することである。種々のヒトＳＨ２ドメインでの化合物の阻害活性は、以下の実施例１１にてさらに詳細に記載されているように、イー・コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）にて融合蛋白質として発現したＳＨ２ドメインを用いてｉｎｖｉｖｏにて測定した。添付した表１および２に示されるデータは、所定の化合物のｌｃｋＳＨ２ドメインに対する拮抗能を示す。実施例１１の検定から選択的ｌｃｋＳＨ２ドメインアンタゴニストと指摘された化合物を、免疫抑制活性を誘発するその能力について公知検定にて試験する。好ましい検定は、以下のものを包含する：１）ＩＬ２産生検定−該検定は種々の刺激に対する応答におけるＴ細胞のＩＬ２の産生を測定する。Ｊｕｒｋａｔを、ａ）マイトジェンレクチン（フィトヘマグルチニンまたはＰＨＡ）＋カルシウムイオノホアまたは＋ホルボールエステル、またはｂ）Ｔ細胞レセプター抗体＋ホルボールエステルで刺激する。ヒトＩＬ２に特異的なＥＬＩＳＡによるＩＬ２の測定結果は、その活性レベルを示す；および２）３通りのヒト混合リンパ球反応（ＭＬＲ）−該検定は、外来抗原に対する応答をまねている。この検定はある個体のリンパ球の別の個体の血球に存在する外来抗原に対する応答を測定する。３種類の異なるドナー（３通りの応答）の血液からのリンパ球を混合し、完全成長培地にて４−５日間インキュベートする。チミジンの取り込みを測定することによる細胞増殖応答の測定結果は、その活性レベルを示す。これら検定における活性が、ｉｎｖｉｖｏにおける自己免疫疾患の治療における効能と相関関係にあることは明らかである。これら検定における活性がまた、ｉｎｖｉｖｏにおける免疫抑制の誘発における効能と相関関係にあることも明らかである。したがって、本発明は、本明細書に定義する一定量のｌｃｋＳＨ２ドメインアンタゴニストを免疫抑制を誘発するのに効果的な量にて投与することからなる、免疫抑制を誘発する方法を提供する。薬物は、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、経口、皮下、皮内および非経口などのいずれの慣用的投与経路を介しても免疫抑制を必要とする患者に投与することができる。免疫抑制を誘発するのに効果的な量は、対象の体重１ｋｇ当たり、約０．００１ｍｇないし約１０．０ｍｇである。選択される投与量は、約０．００１ｍｇ／体重ｋｇないし約１０．０ｍｇ／体重ｋｇから、効果的でかつ毒性のない量である。その選択された投与量を一日に約１ないし６回投与する。本発明に開示されている免疫抑制の誘発法は、本明細書にて定義されているｌｃｋＳＨ２ドメインアンタゴニストおよび医薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物を用いて実施することができる。組成物は０．０５ｍｇおよび５００ｍｇの間のｌｃｋＳＨ２ドメインアンタゴニストを含有してもよく、選択された投与経路に適当ないずれの形態とすることもできる。経口投与に適する組成物は、ピル、カプセル、顆粒、錠剤および散剤などの固体形、および溶液、シロップ、エリキシルおよび懸濁液などの液体形を包含する。非経口投与に有用な形態は、滅菌溶液、エマルジョンおよび懸濁液を包含する。本発明はさらに、本明細書に定義する一定量のｌｃｋＳＨ２ドメインアンタゴニストを同種異系移植拒絶反応を阻害するのに効果的な量にて投与することからなる、同種異系移植拒絶反応の阻害方法を提供する。薬物は、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、経口、皮下、皮内および非経口などのいずれの慣用的投与経路を介しても最近に同種異系移植片を移植されたか、または同種異系移植を受ける予定の患者に投与することができる。同種異系移植拒絶反応を阻害するのに効果的な量は、対象の体重１ｋｇ当たり、約０．００１ｍｇないし約１０．０ｍｇである。選択される投与量は、約０．００１ｍｇ／体重ｋｇないし約１０．０ｍｇ／体重ｋｇから、効果的でかつ毒性のない量である。その選択された投与量を一日に約１ないし６回投与する。本発明に開示されている同種異系移植拒絶反応の阻害方法は、本明細書にて定義されているｌｃｋＳＨ２ドメインアンタゴニストおよび医薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物を用いて実施することができる。組成物は０．０５ｍｇおよび５００ｍｇの間のｌｃｋＳＨ２ドメインアンタゴニストを含有してもよく、選択された投与経路に適当ないずれの形態とすることもできる。経口投与に適する組成物は、ピル、カプセル、顆粒、錠剤および散剤などの固体形、および溶液、シロップ、エリキシルおよび懸濁液などの液体形を包含する。非経口投与に有用な形態は、滅菌溶液、エマルジョンおよび懸濁液を包含する。別法として、薬物を、投与時に滅菌水を用いて溶解または懸濁させる滅菌固体組成物として調製してもよい。担体は、不可欠かつ不活性な結合剤、沈殿防止剤、滑沢剤、フレーバー剤、甘味剤、保存剤、染料およびコーティング剤を包含することを意図とする。最適投与量は当業者であれば容易に決定することができ、使用する個々のｌｃｋＳＨ２ドメインアンタゴニスト、調製物の強度、投与方法および病状の進行状況で変化するであろう。患者の年齢、体重、ダイエットおよび投与回数を包含する、治療されるべき個々の患者に依存する付加的な因子により、投与量を調節する必要性が生じるであろう。本発明はまた、自己免疫疾患の治療用の医薬の製造におけるｌｃｋＳＨ２ドメインアンタゴニストの使用を提供する。発明はまた、同種異系移植拒絶反応の阻害に用いるための医薬の製造におけるｌｃｋＳＨ２ドメインアンタゴニストの使用を提供する。本発明はまた、免疫抑制の誘発に用いるための医薬の製造におけるｌｃｋＳＨ２ドメインアンタゴニストの使用を提供する。本発明はまた、ｌｃｋＳＨ２ドメインアンタゴニストを含有してなる自己免疫疾患の治療にて用いるための医薬組成物を提供する。本発明はまた、ｌｃｋＳＨ２ドメインアンタゴニストを含有してなる同種異系移植拒絶反応の阻害にて用いるための医薬組成物を提供する。本発明はまた、ｌｃｋＳＨ２ドメインアンタゴニストを含有してなる免疫抑制を誘発するのに用いるための医薬組成物を提供する。本発明の方法を本発明に従って利用した場合、許容されない毒物学的作用は考えられない。さらに工夫することなく、当業者は、記したとおりに、その最大限にまで本発明を利用することができるであろう。したがって、以下の実施例は、単なる例示にすぎず、何ら本発明の範囲を限定するものではないと解釈すべきである。実験例本明細書にて用いる場合、特記しない限り、符号°は℃を意味する。Ｌ−３,５−ジブロモチロシンは、例えば、“Tyroid Hormones and Analogues .I.Synthesis,Physical Properties and Theoretical Calculations”E.C.Jorge nsen, Hormonal Proteins and Peptides，Vol.ＶＩ，１９７８，Academic Press，N.Y. およびその中に記載の参考文献に記載されているように、当該分野における公知方法により製造することができる。Ｌ−３，５−ジブロモ−Ｎ−トリフルオロアセチル−チロシンメチルエステル（例えば、実施例２（ｅ）および実施例２Ｂ（ｂ）参照）は、以下の操作に従って調製できる。Ｌ−３，５−ジブロモチロシン（５００ｇ）をメタノール（５Ｌ）に懸濁させ、乾燥塩化水素をその攪拌懸濁液に５時間通気した。反応混合物を蒸発乾固させ、残さを水（４Ｌ）に懸濁させ、そのｐＨを４０％水酸化ナトリウムで６に調整した。沈殿物を収集し、水洗してＬ−３，５−ジブロモチロシンメチルエステル（４６７ｇ、９０％）；融点２０１−２０３℃を得た。該エステルをクロロホルム（２．７Ｌ）および酢酸エチル（２．７Ｌ）に懸濁させ、ついで無水トリフルオロ酢酸（５６５ｇ）を温度を３５℃以下に維持しながら０.５時間にわたって加えた。その混合物を一夜放置し、ついで水（２Ｌ）を加え、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加することによりそのｐＨを７に調整した。有機層を取り出し、水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させた。残さを水性メタノールから再結晶し、L−３,５−ブロモ−Ｎ−トリフルオロアセチルチロシンメチルエステル（７８６ｇ、８１％）；融点１３６−７°を得た。以下の実施例６にて用いるスキーム１４−トランス−アミノメチル−シクロヘキシル−カルボン酸１のアミノ基はＢ oc基のような標準的保護基で保護し（Ｂoc無水物、ＮａＯＨ、Ｈ₂Ｏ、ジオキサン）、２を形成させ、ついでＤＣＣなどのカップリング剤を用いてＫaiserオキシム樹脂にカップリングさせ（Ｋaiser、Ｅ.Ｔ.ら；ＪＡｍＣhem Ｓoc １９８５，１０７，７０８７−７０９２）、３を形成した。ついで、アミンを標準的条件（２５％ＴＦＡ、塩化メチレン）下で脱保護し、４を形成し、ついで標準的条件（ＨＢＴＵ、ＨＭＭ／ＤＭＦまたはＤＩＣ／ＤＭＦまたはＮＭＰ）でアシル化し、５を形成させた。ついで、その化合物を種々のアミンを用いて樹脂から切断し、最終の所望の性生物６を得た。化合物１ないし１０は、以下に示す実施例１ないし１０に従って製造される。実施例１７−［Ｄ，Ｌ−α−アミノ−α−（４−カルボキシフェニル）アセトアミド］− ３−［２−（５−メチル−１，３，４−チアジアゾリル）チオメチル］Δ³−セフェム−４−カルボン酸（化合物１）の調製ａ）４−ヒドロキシメチルベンズアルデヒド１，４−ベンゼンジカルボキシアルデヒド（５０．０ｇ、０．３７３モル）の乾燥テトラヒドロフラン（２００ｍＬ）中溶液に、窒素下、アイスバス中で、テトラヒドロフラン５００ｍＬ中のトリ（ｔｅｒｔ−ブトキシ）水素化アルミニウムリチウム（１０４．０ｇ、０．４１０モル）を滴下した。１時間半アイスバス中で撹拌後、反応混合物を２Ｌの氷冷２Ｎ塩酸中に注いだ。水溶液を８００ｍＬのエーテルで４回抽出した。合したエーテル層を重炭酸ナトリウム溶液、ブラインで洗浄し、乾燥した。溶媒を蒸発させて得られた４６ｇの粗物質を、クロマトグラフィー（アルミナ、エーテル溶出）で精製して、標記化合物を結晶性物質（１７．６ｇ、３５％）として得た。融点４４．５−４６℃ ｂ）５−（４−ヒドロキシメチルフェニル）ヒダントイン４−ヒドロキシメチルベンズアルデヒド（１０．０ｇ、７３．５ミリモル）および炭酸アンモニウム（１７．１ｇ、１５０ミリモル）の５０℃に加熱した６０％エタノール水溶液１１０ｍＬ中撹拌混合物に、、水１０ｍＬ中シアン化ナトリウム（４．０ｇ、８１ミリモル）を加えた。混合物を撹拌し、５０−６０℃で３時間、次いで８５℃で１時間加熱した。アイスバス中で冷却後、溶液のｐＨを濃塩酸を加えることによって６に調整した。一晩冷却した後、沈殿した固体を濾過して、水で洗浄し、乾燥して、標記化合物（１１．０ｇ、７２％）を得た。融点１８９−１９６℃ ｃ）４−ヒドロキシメチルフェニルグリシン実施例１（ｂ）の化合物（１０．９ｇ、５３ミリモル）および水酸化バリウム八水和物（２５．５ｇ、８１ミリモル）の水１２５ｍＬ中混合物を、１８時間還流下で撹拌した。反応混合物を冷却し、濃硫酸でｐＨ１に酸性化し；硫酸バリウムを濾過して、濾液のｐＨを炭酸鉛で６にした。硫酸鉛の濾過後、濾液を硫化水素で飽和して、硫化鉛を濾過した。次いで、水溶液を減圧下で、エタノールとの共沸によって１００ｍＬに濃縮し、冷却後、標記化合物（５．２ｇ、５４％）を得た。融点２３０−２３１℃ ｄ）Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−ヒドロキシメチルフェニルグリシン４−ヒドロキシメチルフェニルグリシン（８．０ｇ、４４ミリモル）およびトリエチルアミン（８．８ｇ、８７ミリモル）の水１６０ｍＬ中溶液に、テトラヒドロフラン１２０ｍＬ中のｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアジド（６．９５ｇ、４９ミリモル）を加えた。室温で一晩撹拌後、反応混合物をエーテル２００ｍＬで２回洗浄した。水層をエーテルでカバーし、アイスバス中で、３Ｎ塩酸でｐＨ３−３．５に酸性化した。酸性溶液をエーテルで抽出し、合した有機抽出液をブラインで洗浄し、乾燥し、蒸発させた。得られた油をクロロホルム−ヘキサンでトリチュレートし、固体を濾過して、標記化合物（７．７ｇ、６３％）を得た。融点１３９−１４１．５℃ ｅ）Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−ヒドロキシメチルフェニルグリシンメチルエステル実施例１（ｅ）の化合物（５．６ｇ、２０ミリモル）の溶液に、メタノール（１０ｍＬ）中の硫酸ジメチル（３．１ｇ、２４ミリモル）およびジイソプロピルアミン（５．２ｇ、４０ミリモル）を加えた。混合物を２０分間還流し、次いで、２Ｎ塩酸水溶液で処理した。水溶液を酢酸エチルで３回抽出し、合した有機抽出液を５％重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで洗浄した。溶媒を蒸発させて、標記化合物を油（３．２ｇ、５５％）として得た。ｆ）Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−カルボキシフェニルグリシンメチルエステル実施例１（ｅ）の化合物（０．６２ｇ、２．１ミリモル）のアセトン５０ｍＬ中溶液を、２５℃で、過剰なジョーンズ試薬（８Ｎクロム酸）で処理した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。緑色固体を濾過し、過剰なＣｒＯ₃をイソプロピルアルコールで分解した。濾液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、活性炭で処理した。固体を濾過し、濾液を蒸発させて乾固させ、０．３８ｇの標記化合物を白色固体として得た。融点１２６−１２８℃ ｇ）１，１−ジメチルエチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（１−メチルエチル）カルバミミデート（carbamimidate）標記化合物を、Santiniらの方法（J．Org．Chem．1994，59，2261）に従って、純粋なＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（１．０当量）と２−メチル −２−プロパノール（１．１５当量）の、ＣｕＣｌ（０．０１当量）存在下、室温で１日間の反応によって調製した。ｈ）Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニルグリシンメチルエステル実施例１（ｆ）の化合物（１．０ｇ、３．２ミリモル）および１，１−ジメチルエチルＮ，Ｎ’−ビス（１−メチルエチル）カルバミミデート（１．３ｍｇ、６．５ミリモル）の乾燥ジクロロメタン中溶液を、室温で一晩撹拌した。ジ−イソプロピル尿素を濾過して、過剰な１，１−ジメチルＮ，Ｎ’−ビス（１−メチルエチル）カルバミミデートを水で分解した。層を分離して、ジクロロメタン溶液を５％重炭酸ナトリウム水溶液およびブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発させて、残渣をジエチルエーテルで処理した。追加のジ −イソプロピル尿素を濾過して、有機性濾液を蒸発させて、標記化合物を油（８７０ｍｇ、７４％）として得た。ｉ）Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニルグリシン実施例１（ｈ）の化合物（７６０ｍｇ、２．１ミリモル）の５％重炭酸ナトリウム水溶液１８ｍＬ、５％炭酸ナトリウム水溶液１８ｍＬおよびメタノール３６ｍＬ中溶液を、室温で一晩撹拌した。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで洗浄して、水溶液を新しい酢酸エチルでカバーして、３ＮＨＣｌでｐＨ２に酸性化した。層を分離して、水溶液を酢酸エチルで２回以上抽出した。酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させて、標記化合物を白色固体（６００ｍｇ、８２％）として得た。融点７７−７９℃ ｊ）ｔｅｒｔ−ブチル７−アミノ−３−［２−（５−メチル−１，３，４− チアジアゾリル）チオメチル］Δ³−セフェム−４−カルボキシレートｔｅｒｔ−ブチル７−アミノセファロスポラネート（Blacklockら、J．Org．C hem．1989，54，3907の手順に従って、７−アミノセファロスポラン酸から、１，２−ジメトキシエタン中でのイソブチレンおよび硫酸の反応によって調製した）、重炭酸ナトリウムおよび２−メルカプト−５−メチル−１，３，４−チアジアゾールのリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）中溶液を、６０℃で６時間撹拌した。反応混合物を塩酸水溶液／酢酸エチルで抽出処理して、標記化合物を得た。ｋ）ｔｅｒｔ−ブチル７−［Ｄ，Ｌ−α−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−α−［４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニル］］アセトアミド−３−［２−（５−メチル−１，３，４−チアジアゾリル）チオメチル］Δ³ −セフェム−４−カルボキシレート実施例１（ｉ）のＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニルグリシン（３５１ｍｇ、１ミリモル）、実施例１（ｊ）のｔｅｒｔ−ブチル７−アミノ−３−［２−（５−メチル−１，３，４−チアジアゾリル）チオメチル］Δ³−セフェム−４−カルボキシレート（３６８ｍｇ、１ミリモル）およびＤＣＣ（２１２ｍｇ、１ミリモル）の乾燥ジクロロメタン中混合物を、室温で３時間撹拌した。ジシクロヘキシル尿素を濾過して、濾液を蒸発させて乾固させた。残渣を酢酸エチルに溶解し、酢酸エチル溶液を５％重炭酸ナトリウム水溶液、２．５％硫酸、５％重炭酸ナトリウム水溶液、ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発させて、粗生成物０．６ｇを得た。シリカゲルクロマトグラフィー（３０：７０酢酸エチル／ベンゼンで溶出）によって精製して、標記化合物（４３０ｍｇ、６１％）を得た。融点１１０− １１２℃ ｌ）７−［Ｄ，Ｌ−α−アミノ−α−（４−カルボキシフェニル）アセトアミド］−３−［２−（５−メチル−１，３，４−チアジアゾリル）チオメチル］ Δ³−セフェム−４−カルボン酸実施例１（ｋ）の化合物（４００ｍｇ、０．５７ミリモル）の溶液を、トリフルオロ酢酸７．２ｍＬおよびチオフェノール０．８ｍＬ中で撹拌した。反応混合物を０℃で３０分間、室温で１時間撹拌した。溶媒を４０℃のウォーターバス中で蒸発させて、残渣をジエチルエーテルで３回トリチュレートし；固体生成物を少量のメタノール中に溶解し、生成物をジエチルエーテルを加えることによって沈澱させて、標記化合物（３００ｍｇ）を得た。融点１７０−１７５℃ 実施例２Ｌ−３，５−ジブロモ−３’−（６−オキソ−３（１Ｈ）−ピリダジニルメチル）−チロニン（化合物２）の調製（ａ）ｏ−メトキシフェニルアセトニトリル（２３．６４ｇ）および３，６ −ジクロロピリダジン（２３．９３ｇ）を乾燥ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）中に溶解して、水素化ナトリウム（油中５０％分散物の１６．２３ｇ）をゆっくりと徐々に２時間にわたって、撹拌溶液中にに加えた。混合物を過剰の粉砕した氷に注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を除去し、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、木炭処理し、蒸発させて乾固させた。残渣をジクロロメタン／石油スピリットから結晶化して、１−（６−クロロ−３−ピリダジニル）−１−（２−メトキシフェニル）−アセトニトリル（３５．５ｇ、８５％）、融点９１−９２℃を得た。（ｂ）該ニトリル（３３．５ｇ）を濃塩酸（２００ｍＬ）、酢酸（１００ｍＬ）および水（１００ｍＬ）中に溶解し、溶液を撹拌しながら還流した。６時間後、溶媒を蒸発させて、残渣を酢酸エチル／石油スピリットから再結晶化して、２−（６−オキソ−３（１Ｈ）−ピリダジニルメチル）−アニソール（２１．４ｇ、７７％）、融点１４２−３℃を得た。（ｃ）該ピリダジノン（１５．７ｇ）をオキシ塩化リン（２２ｍＬ）中に溶解し、撹拌しながら５５℃（オイルバス）で１時間加熱した。冷却した混合物をゆっくりと、粉砕した氷上に注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を分離し、飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させた。残渣をより小さなバッチで合し（ピリダジノン２．１６ｇから）、何回か沸騰石油スピリット（６０−８０℃）で抽出した。合した抽出溶液を木炭処理し、蒸発させて、２−（６−クロロ−３−ピリダジニルメチル）−アニソール（１６．９５ｇ、８７％）、融点６３℃を得た。（ｄ）トリフルオロ酢酸ヨウ素（ヨウ素（２．５４ｇ）を無水酢酸およびトリフルオロ酢酸中で発煙硝酸で処理することによって調製した）のトリフルオロ無水酢酸（２５ｍＬ）中撹拌懸濁液に、−１５℃で、トリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）およびトリフルオロ無水酢酸（２５ｍＬ）中の前記のクロロピリダジン（９．３９ｇ）を加え、温度を−１５℃以下に維持した。混合物を室温で一晩撹拌し、濃縮し、次いで酢酸ナトリウム（２５ｇ）および過塩素酸ナトリウム（１５ｇ）の水（２００ｍＬ）中溶液を加えた。混合物をクロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで５０ｍＬまで濃縮して、撹拌したエーテル（２５０ｍＬ）中に注いだ。沈澱を回収し、乾燥して、粗４，４’−ジメトキシ−３，３’−ビス−（６−クロロ−３−ピリダジニル−メチル）−ジフェニルヨードニウム過塩素酸塩（１４ｇ）を得た。¹ ＨＮＭＲδ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）3.80(3H,s,-OCH ₃)、4.20(2H,s,-CH ₂Ar)、7.05(1H,m ,Ar-5H)、7.65(2H,m,-PyH)、8.00(2H,m,Ar-2,6H) （ｅ）前記のヨードニウム塩（１２．４５ｇ）、Ｌ−３，５−ジブロモ−Ｎ −トリフルオロアセチルチロシンメチルエステル（８．９８ｇ）、トリエチルアミン（４．０５ｇ）および青銅（copper bronze）（１．０ｇ）を、ジクロロメタン（５０ｍＬ）中で１８時間撹拌した。混合物を濾過して、酢酸水溶液、２Ｎ水酸化ナトリウム、次いで水で洗浄し、次に、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させた。残渣をより小さなバッチ（ヨードニウム塩０．７２ｇから）で合して、シリカゲル（４００ｇ）上のカラムクロマトグラフィーによって精製した。酢酸エチル／石油スピリット（６０−８０℃）［１：３］で溶出して、Ｌ−３，５−ジブロモ−３’−（６−クロロ−３−ピリダジニルメチル）−Ｏ−メチル− Ｎ−トリフルオロアセチル−１−チロニンメチルエステ（４．０ｇ）を黄褐色泡として得た。¹ ＨＮＭＲδ（ＣＤＣｌ₃）3.06(2H,m,ArCH ₂CH)、3.84および3.93(6H,2s,-OCH ³)、4 .19(2H,s,ArCH ₂Py)、4.75(1H,m,ArCH ₂CH)、6.62(3H,m,ArH)、7.17(2H,m,PyH)、7.23( 2H,s,ArH) （ｆ）前記のジブロモ化合物（３．２７ｇ）を酢酸ナトリウム（０．７９ｇ）を含有する酢酸（２０ｍＬ）中に溶解した。溶液を１．２５時間還流し、十分量の水（約２ｍＬ）を加えて、沈澱した塩化ナトリウムを溶解し、溶液を蒸発させて乾固させた。残渣を水および酢酸エチルの間に分配し、有機層を除去して、飽和重炭酸ナトリウムで洗浄し、次いで無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させて乾固させた。残渣を酢酸エチル／石油スピリット（６０−８０℃）から結晶化して、Ｌ−３．５−ジブロモ−Ｏ−メチル−３’−（６−オキソ−３（１Ｈ） −ピリダジニルメチル）−Ｎ−トリフルオロ−アセチルチロニンメチルエステル（２．５２ｇ、７９％）、融点１７６−８℃を得た。（ｇ）該ピリダジノン（２．４５ｇ）を乾燥ジクロロメタン（４０ｍＬ）中に溶解し、０℃で撹拌しながら冷却した。ジクロロメタン（３ｍＬ）中の三臭化ホウ素（６．４６ｇ）を加えた。赤褐色沈澱が形成した。混合物を室温で１．５時間撹拌し、次いで、粉砕した氷を加えた。混合物を濾過して、沈澱を回収し、２Ｎ水酸化ナトリウム（３０ｍＬ）中に溶解した。溶液をスチームバス上で１５分間加熱し、次に酢酸を加えてｐＨ５にし、混合物を冷却した。得られた沈澱を回収し、洗浄し、乾燥して、Ｌ−３，５−ジブロモ−３’−（６−オキソ−３（１Ｈ）−ピリダジニルメチル）−チロニン（１．７４ｇ、８８％）、融点２７８ −９℃（分解）を得た。別法で、反応段階（ｅ）の場合、（ｄ）で調製した過塩素酸塩を用いる代わりに、トリフルオロ酢酸ヨードニウム塩を使用でき、それは以下のように調製される：ヨウ素（１５９ｇ）をトリフルオロ無水酢酸（１Ｌ）中に懸濁し、１．５時間にわたって発煙硝酸（３５０ｍＬ）を加える間、窒素下で撹拌し、温度を３６℃ および４０℃の間に維持した。次に、トリフルオロ無水酢酸（３００ｍＬ）を加え、全ての酸化窒素が除去されるまで、混合物を窒素気流下で４０℃に維持し、次に、室温で一晩静置した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残留溶媒をトリフルオロ無水酢酸（２ｘ３００ｍＬ）で共沸することによって除去した。次に、淡黄色固体をトリフルオロ無水酢酸（１．２Ｌ）中に撹拌しながら懸濁し、−２０ ℃に冷却した。次に、２−（６−クロロ−３−ピリダジニルメチル）アニソール（６００ｇ）のトリフルオロ酢酸（１．２Ｌ）中溶液を滴下し、温度を−１０℃ および−２０℃の間に維持した。混合物を−１０℃で１時間、室温で一晩撹拌し、次いで溶媒を減圧下で除去し、残渣を硫酸ナトリウム（３．５ｋｇ）の水（２０Ｌ）中溶液中に、撹拌しながら注いだ。該混合物のｐＨを、希水酸化ナトリウム水溶液を用いて約ｐＨ２に調整し、次いで、ジクロロメタン（２ｘ３Ｌ、１ｘ２Ｌ）で抽出し、有機抽出液を合して、乾燥して（ＭｇＳＯ₄）、容量を２Ｌまで減らし、次に、勢いよく撹拌したジエチルエーテル（１２Ｌ）に加えた。暗灰色沈澱固体を濾過して、エーテルで洗浄し、真空乾燥機で４０℃６時間乾燥して、４，４’−ジメトキシ−３，３’−ビス−（６−クロロ−３−ピリダジニルメチル）ジフェニルヨードニウムトリフルオロアセテート（８．１４ｇ、９０％）、融点１４５−１４７℃を得た。２（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）において前記したのと類似した方法を用いる該塩のさらなる反応によって、目的のＬ−３，５−ジブロモ−３’−（６−オキソ −３（１Ｈ）−ピリダジニル−メチル）チロニンが得られる。実施例２ＡＬ−３，５−ジブロモ−３’−（６−オキソ−３（１Ｈ）−ピリダジニルメチル）チロニン（化合物２）の調製（ａ）２−（６−クロロ−３−ピリダジニルメチル）アニソール（実施例２（ｃ）において記載されたように調製された）（２．３５ｇ）を乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）中に溶解し、撹拌しながら−５０℃に冷却した。次に、三臭化ホウ素（３ｍＬ）を滴下し、溶液を室温に加温した。０．５時間後、オレンジ色の反応混合物を氷／水（２００ｍＬ）中に注ぎ、アセトンを加えて、沈澱した固体を溶解した。混合物をジクロロメタンで抽出し、有機層を分離して、水で洗浄し、乾燥し、蒸発させた。残渣を酢酸エチルおよび石油スピリットから再結晶化して、２−（６−クロロ−３−ピリダジニルメチル）−フェノール（１．７５ｇ、８０％）、融点１３２−１３２．５℃を得た。分析実測値：Ｃ，５９．６１；Ｈ，４．１３；Ｎ，１２．４７；Ｃｌ，１６．０９；Ｃ₁₁Ｈ₉ＣｌＮ₂Ｏ計算値：Ｃ，５９．８７；Ｎ，４．１１；Ｎ，１２．７０；Ｃｌ，１６．０７％（ｂ）該フェノール（２．４ｇ）および尿素（１４ｇ）の７５％硫酸水溶液（１００ｍＬ）中溶液に、ｔ−ブタノール（１７ｍＬ）をゆっくりと加えた。混合物をよく撹拌し、さらにｔ−ブタノールを４時間後（１８ｍＬ）、２４時間後（５ｍＬ）および２８時間後（２０ｍＬ）加えた。１２０時間後、混合物を水に注ぎ、有機層を分離して捨て、水層をエーテルで徹底的に抽出した。合したエーテル抽出液を飽和ブラインで洗浄し、次いで乾燥し、蒸発させた。残渣をエーテルおよび石油スピリットから再結晶化して、２，４−ジ−ｔ−ブチル−６−（６ −クロロ−３−ピリダジニルメチル）フェノール（３．４３ｇ、９４％）、融点１４３．０−１４３．５℃を得た。分析実測値：Ｃ，６８．３２；Ｈ，７．５１；Ｎ，８．３６；Ｃｌ，１０．８９；Ｃ₁₉Ｈ₂₅ＣｌＮ₂Ｏ計算値：Ｃ，６８．５６；Ｈ，７．５７；Ｎ，８．４１；Ｃｌ，１０．６５％（ｃ）該フェノール（１．９５ｇ）、Ｌ−３，５−ジブロモ−Ｎ−トリフルオロアセチルチロシンメチルエステル（３．２４ｇ）のジエチルエステル（１００ｍＬ）中溶液を、アルゴン下、室温で撹拌し、次いで、活性二酸化マンガン（３ｘ５ｇ）で処理した。４時間後、混合物を濾過し、四塩化チタン（５ｍＬ）を加えた。２分後、暗色の溶液を水で処理し、酢酸エチルでよく抽出した。有機抽出液を合して、飽和ブラインで洗浄し、乾燥し、蒸発させた。残渣を石油スピリットおよびエーテルで溶出するシリカゲル上のクロマトグラフィーに付して、Ｌ −３，５−ジブロモ−５’−ｔ−ブチル−３’−（６−クロロ−３−ピリダジニルメチル）−Ｎ−トリフルオロアセチルチロニンメチルエステル（２．３１ｇ、５５％）、融点８４−８６℃を得た。（ｄ）該ジブロモチロニン（２．７６ｇ）および無水酢酸ナトリウム（０．７８ｇ）の酢酸（２５ｍＬ）中溶液を、１０時間熱還流し、次いで、冷却し、氷 −水に注いだ。沈殿した固体を濾過して、酢酸エチル中に溶解し、乾燥し、蒸発させて、Ｌ−３，５−ジブロモ−５’−ｔ−ブチル−３’−（６−オキソ−３（１Ｈ）−ピリダジニルメチル）−Ｎ−トリフルオロアセチルチロニンメチルエステル（２．４ｇ、５５％）、融点１１２−１１５℃を得た。（ｅ）該ピリダジノン（０．２００ｇ）およびＨｂｒ（１ｍＬ）の氷酢酸（２０ｍＬ）中溶液を、３日間熱還流した。次いで、溶液を冷却し、水で希釈し、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で塩基化し、酢酸を加えることによってｐＨ６にした。沈殿した固体を濾過し、洗浄し、乾燥して、Ｌ−３，５−ジブロモ−３’− （６−オキソ−３（１Ｈ）ピリダジニルメチル）チロニン（０．１００ｇ、６５％）、融点２４５−２４７℃（分解）を得た。先に分離したもの（実施例２（ｇ））と分光学的に一致した。実施例２ＢＬ−３，５−ジブロモ−３’−（６−オキソ−３（１Ｈ−ピリダジニルメチル） −チロニン（化合物２）の調製（ａ） −１０℃にまで冷却したトリストリフルオロ酢酸ヨウ素（ヨウ素（１０．０ｇ）を無水酢酸およびトリフルオロ酢酸中において発煙硝酸（２０．９５ｍＬ）で処理することによって、調製した）の無水酢酸（５０ｍＬ）中溶液に、２−メトキシベンジルシアニド（３０．０ｇ）のトリフルオロ酢酸（６０ｍＬ）および無水酢酸（３０ｍＬ）中溶液を滴下した。滴下中、混合物の温度を０℃以下に維持し、次に、室温で一晩静置した。次いで混合物を、よく撹拌した酢酸ナトリウム（１００ｍＬ）および過塩素酸ナトリウム（１３．０ｇ）の水（６００ｍＬ）中氷冷溶液に注いだ。沈殿した固体を濾過し、水およびジエチルエーテルで洗浄して、３，３’−ジシアノメチル−４，４’−ジメトキシ−ジフェニルヨードニウム過塩素酸塩を微細な淡黄褐色固体（２３．６ｇ、５７％）、融点１８３−４℃として得た（メタノール／ジエチルエーテルから）。（ｂ）該ヨードニウム塩（２２．６ｇ）、Ｌ−３，５−ジブロモ−Ｎ−トリフルオロアセチル−チロシンメチルエステル、トリエチルアミン（６．１ｇ）のジクロロメタン（３００ｍＬ）中溶液を、青銅（１ｇ）で処理し、混合物を室温で２０時間撹拌した。次いで、混合物を濾過して、濾液を２Ｎ塩酸水溶液（２ｘ２００ｍＬ）、水（２ｘ２００ｍＬ）および２Ｎ水酸化ナトリウム（３ｘ２００ｍＬ）で洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で蒸発させた。油状残渣をジクロロメタン（３０ｍＬ）中に溶解し、石油スピリットに注いだ。固体沈殿物を濾過し、ジクロロメタン／石油スピリットから再結晶化して、Ｌ−３，５−ジブロモ−３’−シアノメチル−Ｏ−メチル−Ｎ−トリフルオロアセチルチロニンメチルエステルを無色結晶性固体、融点１４８−１４９℃として得た。母液をシリカゲル上のクロマトグラフィーに付して、該化合物をさらに得た（全量＝８．０５ｇ、３１％）。（ｃ）該ジブロモチロニン（１２０ｍｇ）および３，６−ジクロロピリダジン（３１ｍｇ）の乾燥ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中溶液に、水素化ナトリウム（５０％油中懸濁液の３０ｍｇ）を加え、反応混合物を室温で５０分間静置した。次に、氷で処理し、水性混合物をジクロロメタンで抽出し、有機性溶液を飽和ブラインで洗浄し、次いで乾燥し、蒸発させた。残渣を分取シリカゲルクロマトグラフィーに付して、３，５−ジブロモ−３’−（１−（６−クロロ−３− ピリダジニル）−１−シアノメチル）−Ｏ−メチル−Ｎ−トリフルオロアセチルチロニンメチルエステル（５ｍｇ）を分離した。¹ ＨＮＭＲδ（ＣＤＣｌ₃）3.12(1H,m)、3.27(1H,m)、3.79(3H,s)、3.86(3H,s)、4.86 (1H,m)、5.80(1H,s)、6.72(1H,dd)、6.83(1H,d)、7.04(1H,d)、7.15(1H,広いm)、7.37( 2H,s)、7.50(2H,dd) 該中間物質の標準法による合成で、標記化合物が得られる。実施例３８，８−エチレンジオキシ−２，３，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］チエノ［２，３−ｂ］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリジン−３−オン（化合物３）の調製ａ）エチル２−シアノ−２−（４，４−エチレンジオキシシクロヘキシリデン）アセテート１，４シクロヘキサンジオンモノエチレンケタール（２５ｇ、０．１６０モル）およびシアノ酢酸エチル（１８ｇ、０．１６０モル）のトルエン（４００ｍＬ）中混合物に、室温でジエチルアミン（２５ｇ、０．３３７モル）を滴下した。反応混合物を一晩熱還流した（ディーン・スターク装置を用いて）。混合物を冷却し、酢酸エチルおよび飽和重炭酸ナトリウム水溶液（３回）で分配した。有機抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、真空下で濃縮し、エタノールから再結晶化して、標記化合物を白色固体（１５．８ｇ、４５％）として得た。融点：８０−８１℃；¹ＨＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ4.28(q,J=7.2 Hz,2H)、4.00(s,4H)、3.18(t,J=6.5Hz,2H)、2.85(t,J=6.5Hz,2H)、1.89(t,J=6.5Hz,2 H)、1.82(t,J=6.5Hz,2H)、1.35(t,J=7.1Hz,3H) ｂ）エチル２−アミノ−６，６−エチレンジオキシ−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレート実施例３（ａ）の化合物（１０ｇ、４５．６ミリモル）、硫黄（１．６ｇ、５０．２ミリモル）のエタノール（１６４ｍＬ）中懸濁液に、０℃で、ジエチルアミン（３．６ｇ、５０．２ミリモル）のエタノール（２６ｍＬ）中溶液を滴下した。得られた溶液を０℃で１時間、次いで室温で３．５時間撹拌した。反応混合部を酢酸エチルでクエンチし、飽和塩化アンモニウム水溶液で分配した。水層を酢酸エチルで抽出し、有機抽出液をブラインで洗浄した。合した有機抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、真空下で濃縮し、クロマトグラフィー（シリカゲル、５ないし１０％濃度勾配ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＥｔＯＡｃ）に付して、標記化合物を油（１１．３ｇ、８７％）として得た。¹ ＨＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ4.25(q,J=7.1Hz,2H)、4.02(s,4H)、2. 92(t,J=6.5Hz,2H)、2.74(s,2H)、1.90(t,J=6.6Hz,2H)、1.33(t,J=7.1Hz,3H) ｃ）エチル７，７−エチレンジオキシ−４−ヒドロキシ−２−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チエノ［２，３−ｂ］ピリジン−２−カルボキシレート実施例３（ｂ）の化合物（１１．２ｇ、３９．５ミリモル）のトルエン（３０７ｍＬ）中溶液に、室温で、エチル３−エトキシクロトネート（１２．４ｇ、７８．６ミリモル）およびショウノウスルホン酸（０．７８ｇ、３．４ミリモル）を加えた。反応混合物をディーン・スターク装置を用いて３．５時間熱還流した。次いで、混合物を冷却し、新たに調製した１Ｍナトリウムエトキシド（４９ｍＬ）を滴下した。添加が完了するとすぐに、反応混合物を３時間熱還流した。混合物を冷却し、沈殿物を濾過した。塩をメタノール（６０ｍＬ）中に溶解し、水（５００ｍＬ）および酢酸（２ｍＬ）を加えて、標記化合物を黄色固体（１０．４ｇ、７６％）として得た。融点：９４−９５℃；¹ＨＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ4.48(q,J=7.1 Hz,2H)、4.06(s,4H)、3.26(t,J=6.5Hz,2H)、3.02(s,2H)、2.81(s,3H)、2.02(t,J=6.5H z,2H)、1.47(t,J=7.1Hz,3H);ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３５０［Ｍ＋Ｈ］⁺；分析Ｃ₁₇Ｈ₁₉ＮＯ₅Ｓの計算値：；Ｃ，５８．４４；Ｈ，５．４８；Ｎ，４．０１；実測値：Ｃ，５８．３４；Ｈ，５．４６；Ｎ，３．８６ｄ）エチル７，７−エチレンジオキシ−４−トリフルオロエチルスルホニルオキシ−２−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チエノ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボキシレート実施例３（ｃ）の化合物（５．０ｇ、１４．３ミリモル）のピリジン（５０ｍＬ）中溶液に、トリフルオロ酢酸無水物（４．０ｇ、１４．２ミリモル）を滴下した。完了するまで、反応混合物を０℃で４時間撹拌した。反応混合物を硫酸銅水溶液（３回）、次いで水（２回）およびブライン（２回）で洗浄した。有機層を蒸発させ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１：１ヘキサン：酢酸エチル）によって精製して、標記化合物を明黄色固体（３．７ｇ、５４％）として得た。融点：１３３−１３４℃；¹ＨＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ4.43(q,J =7.2Hz,2H)、4.06(s,4H)、3.16(t,J=6.5Hz,2H)、3.10(s,2H)、2.77(s,3H)、2.03(t,J= 6.8Hz,2H)、1.41(t,J=7.1Hz,3H);ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ４８２［Ｍ＋Ｈ］⁺；分析Ｃ₁₈Ｈ₁₈Ｆ₃ＮＯ₇Ｓ₂の計算値：Ｃ，４４．９０；Ｈ，３．７７；Ｎ，２．９１；実測値：Ｃ，４５．０３；Ｈ，３．６２；Ｎ，２．８９ｅ）８，８−エチレンジオキシ−２，３，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ −４−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］チエノ［２，３−ｂ］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリジン−３−オン実施例３（ｄ）の化合物（２．４ｇ、５．０ミリモル）のメタノール（４０ｍＬ）中溶液に、室温で、ヒドラジン一水和物（４．１ｇ、８２．３ミリモル）を加えた。反応混合物を３時間熱還流した。混合物を冷却し、次いでｐＨ７水性緩衝液および酢酸エチルの間に分配した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、真空下で濃縮し、メタノール／酢酸エチルから再結晶化して、標記化合物を明黄色固体（０．９９ｇ、６０％）として得た。¹ ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ₄−ＭｅＯＨ）δ4.05(s,4H)、3.15(t,J=6.5Hz,2H)、 3.04(s,2H)、2.82(s,3H)、2.06(t,J=6.5Hz,2H);ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３１８［Ｍ＋Ｈ］⁺；分析Ｃ₁₅Ｈ₁₅Ｎ₃Ｏ₃Ｓ.０．２５Ｈ₂Ｏの計算値：Ｃ，５５．９７；Ｈ，４．８５；Ｎ，１３．０５；実測値：Ｃ，５５．８５；Ｈ，４．７５；Ｎ，１３．３０実施例４４−［４−（４−メチルベンゾイル）ベンゾイル］フェニルアセトアルデヒド（化合物４）の調製ａ）メチル４−（４−メチルベンゾイル）ベンゾエートメチルテレフタロイルクロリド（６．２ｇ、３１ミリモル）の２５０ｍＬトルエン中溶液を、０℃アルゴン雰囲気下で、塩化アルミニウム（８．０ｇ、６０ミリモル）で処理した。撹拌混合物を３５℃に０．５時間加温し、次に、ゆっくりと氷１００ｇ、次いで酢酸エチル１５０ｍＬ、濃ＨＣｌ５０ｍＬおよび水５０ｍＬに加えた。層を分離し、水層を１００ｍＬの酢酸エチルで２回抽出した。合した有機層を水（２ｘ７５ｍＬ）およびブライン（１ｘ７５ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮して白色固体を得た。酢酸エチルおよびヘキサンから再結晶化して、標記化合物６．０ｇ（７９％）を白色針状結晶として得た。融点１１７−１１８℃；¹ＨＮＭＲδ(４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ₃)δ8.15(d,J=8.35 Hz,2H)、7.83(d,J=8.30Hz,2H)、7.73(d,J=8.18Hz,2H)、7.31(d,J=8.04Hz,2H)、3.98( s,3H)、2.46(s,3H);ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２２５（Ｍ＋Ｈ）⁺；ｂ）４−（４−メチルベンゾイル）安息香酸メチル４−（４−メチルベンゾイル）ベンゾエート（５．００ｇ、２０．０ミリモル）の１５０ｍＬ２：１ＴＨＦ：水中撹拌溶液を、６５℃で、水酸化リチウム一水和物（２．０ｇ、４８ミリモル）で処理した。０．５時間後、濁った反応混合物を室温に冷却し、酢酸エチル（３００ｍＬ）および１０％ＨＣｌ（水溶液）で処理した。有機層を分離し、水（２ｘ５０ｍＬ）およびブライン（１ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して、白色泡にまで濃縮した。¹ ＨＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ8.22(d,J=8.34Hz,2H)、7.81(d,J=8.3 1Hz,2H)、7.73(d,J=8.15Hz,2H)、7.31(d,J=8.00Hz,2H)、2.46(s,3H) ｃ）４−［４−（４−メチルベンゾイル）ベンゾイル］アニソール実施例４（ｂ）の化合物の２５０ｍＬトルエン中溶液を、塩化オキサリル（２１．８ｇ、０．１７モル）で処理した。得られた混合物を２時間熱還流し、次いで濃縮して、一晩０．５ｍｍＨｇおよび２５℃で放置した。次に、該固体を１００ｍＬアニソール中に溶解し、０℃にて塩化アルミニウム（１１．２ｇ、８４ミリモル）で処理した。混合物を７０℃に１時間加熱し、次に、ゆっくりと１００ｇの氷、次いで１５０ｍＬの酢酸エチル、５０ｍＬの濃ＨＣｌおよび５０ｍＬの水に加えた。層を分離し、水層を１００ｍＬの酢酸エチルで抽出した。合した有機抽出液を水（２ｘ７５ｍＬ）およびブライン（１ｘ７５ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮して白色固体を得た。酢酸エチルおよびヘキサンから再結晶化して、標記化合物を４．６ｇ（７０％）得た。融点１６７−１６９℃；¹ＨＮＭＲδ(４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ₃)δ7.8-7.9(m,6H)、 7.77(d,J=8.06Hz,2H)、7.32(d,J=8.01Hz,2H)、7.0(d,J=8.74Hz,2H)、3.92(s,3H)、2 .47(s,3H)；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３３１（Ｍ＋Ｈ）⁺ ｄ）４−［４−（４−メチルベンゾイル）ベンゾイル］フェノール実施例４（ｃ）の化合物（７００ｍｇ、２．１２ミリモル）の２０ｍＬジクロロメタン中溶液を、塩化アルミニウム（１．０ｇ、７．５ミリモル）および７．０ｍＬ１．０Ｍ三塩化ホウ素のジクロロメタン中溶液で処理し、１時間熱還流した。次に、混合物を１００ｍＬジクロロメタンで希釈し、１０％ＨＣｌ（水溶液）（１ｘ２５ｍＬ）、水（１ｘ２５ｍＬ）およびブライン（１ｘ２５ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して、暗色の残渣に濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１：１酢酸エチル／ヘキサンで溶出）に付して、５５０ｍｇ（８２％）の標記化合物を得た。¹ ＨＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ7.8-7.9(m,6H)、7.77(d,J=8.05Hz,2H )、7.32(d,J=8.01Hz,2H)、6.93(d,J=8.6Hz,2H)、2.47(s,3H) ｅ）４−［４（４−メチルベンゾイル）ベンゾイル］フェニルトリフルオロメチルスルホネート実施例４（ｄ）の化合物（３２０ｍｇ、１．０ミリモル）のＴＨＦ（２０ｍＬ）中溶液を、０℃で、水素化ナトリウム（４０ｍｇ、１．６７ミリモル）およびＮ −フェニルトリフルオロメタンスルホンイミド（５００ｍｇ、１．４０ミリモル）で処理した。反応混合物を室温に加温し、次いで室温で１８時間撹拌した。次に反応物を酢酸エチルおよびブラインの間に分配し；層を分離して、有機抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、８０：２０ヘキサン：酢酸エチル）によって精製して、標記化合物（３００ｍｇ、６６％）を得た。融点１８０−１８１℃；¹ＨＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ7.96(d,J=8 .6Hz,2H)、7.89(s,4H)、7.76(d,J=8.1Hz,2H)、7.45(d,J=8.6Hz,2H)、7.33(d,J=8.1Hz ,2H)、2.47(s,3H) ｆ）４−［４−（４−メチルベンゾイル）ベンゾイル］フェニルアセトアルデヒド実施例４（ｅ）の化合物（４４５ｍｇ、１．０ミリモル）のＤＭＦ（１０ｍＬ）中溶液に、アリルトリブチルスズ（０．３５ｍＬ、１．１２ミリモル）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）クロリド（５５ｍｇ、０．０７７ミリモル）および塩化リチウム（１２５ｍｇ、２．９５ミリモル）を加えた。反応混合物を９０℃に１時間加熱し、次いで、室温に冷却し、酢酸エチルおよびブラインの間に分配した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して、目的の生成物、３−［４−［４−（４−メチルベンゾイル）ベンゾイル］フェニル］− １−プロペン、および生成物によって含有されるスズから成る残渣を得た。該物質をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、９５：５ヘキサン：酢酸エチルで溶出）に付して、不純物の全てではないが大部分を除去した。二度目のクロマトグラフィー（５％ないし１０％濃度勾配ヘキサン中における酢酸エチル）によって、純粋なオレフィン１００ｍｇ（３０％）を得、次いで、−７８℃でジクロロメタン／メタノール（３：１、１６ｍＬ）中に溶解した。オゾンを該溶液に５分間バブルした。反応を５滴のジメチルスルフィドでクエンチし、−７８℃で３０分間撹拌し続けた。溶媒を蒸発させて、得られた物質をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、８５：１５ないし７５：２５ヘキサン：酢酸エチルで溶出）によって精製して、標記化合物（４０ｍｇ、４０％）を得た。融点１８８−１９０℃；¹ＨＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ9.83(s,1H)、 7.88(s,4H)、7.86(d,J=8.1Hz,2H)、4.03(s,4H)、3.73(s,3H)、3.76(t,J=6.0Hz,2H)、 3.00(s,2H)、2.80(s,3H)、2.03(t,J=6.0Hz,2H)；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３４３（Ｍ＋Ｈ）⁺ 実施例５１，４−ジメチル−８，８−エチレンジオキシ−２，３，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］チエノ［２，３−ｂ］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリジン−３−オン（化合物５）の調製１，４−ジメチル−８，８−エチレンジオキシ−２，３，７，８，９，１０− ヘキサヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］チエノ［２，３−ｂ］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリジン−３−オン実施例３（ｄ）の化合物（０．４ｇ、０．８３ミリモル）のメタノール（６．７ｍＬ）中溶液を、室温で、メチルヒドラジン（０．１６ｇ、３．４５ミリモル）で処理し、混合物を２時間熱還流した。混合物を冷却し、１５０ｍｇの２，４ −ジメチル位置異性体を含有する沈殿を濾過した。濾液を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、８０：２０：５酢酸エチル：メタノール：酢酸で溶出）によって精製して、標記化合物を黄色固体（２２ｍｇ）として得た。¹ ＨＮＭＲδ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ4.03(s,4H)、3.73(s,3H)、3.76(t,J=6 .0Hz,2H)、3.00(s,2H)、2.80(s,3H)、2.03(t,J=6.0Hz,2H)；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３３２（Ｍ＋Ｈ）⁺ 実施例６４−カルボキシ−ベンゾフェノン−４−カルボキサミドートランス−４−メチル −シクロヘキシル−Ｎ−ヘキシルカルボキサミド（化合物６）の調製ａ）Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−トランス−４−アミノメチルシクロヘキシルカルボン酸水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ、１００ｍＬ、１００ミリモル）を４−トランス−アミノメチル−シクロヘキシル−カルボン酸（９．０ｇ、６０ミリモル）のジオキサン（１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）中溶液に加えた。Ｂｏｃ無水物（１５．９ｇ、６６ミリモル）を加え、反応物を室温に加温し、一晩撹拌した。溶液を５０ｍＬに濃縮し、次いで、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、ＫＨＳＯ₄ （１Ｎ）水溶液でｐＨ２に酸性化した。次に、有機層を水（１００ｍＬ）で２回抽出し、有機抽出液を真空下で濃縮した。固体をＥｔＯＡｃ／ヘキサンから再結晶化して、９．２ｇ＋３．４ｇ（第二収量）の白色固体を得た（収率８０％）。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ２４２［Ｍ＋Ｈ］⁺ ｂ）Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−トランス−４−アミノメチルシクロヘキシル（カイザーオキシム樹脂）カルボキシレートカイザーオキシム樹脂（２０ｇ、０．７ミリモル／ｇ充填、Advanced Chem Te ch）をＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−トランス−４−アミノメチルシクロヘキシルカルボン酸（５．０ｇ、２０ミリモル）およびＤＣＣ（４．４ｇ、２０ミリモル）の塩化メチレン（２００ｍＬ）中溶液に加え、室温で一晩、静かに混合した。固体を濾過して回収し、次いで、塩化メチレン（５ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。次に、樹脂を塩化メチレン（２００ｍＬ）中に再懸濁し、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−トランス−４−アミノメチルシクロヘキシルカルボン酸（５．０ｇ、２０ミリモル）およびＤＣＣ（４．４ｇ、２０ミリモル）を加え、反応溶液を室温で一晩静かに混合した。固体を濾過して回収し、次いで、塩化メチレン（５ｘ１００ｍＬ）で洗浄し、次に一晩真空下で乾燥した。ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ^-1）＝１８２０、１７７１、１５２０ｃ）トランス−４−アミノメチルシクロヘキシル（カイザーオキシム樹脂）カルボキシレートＮ−ｔ−ブチルオキシ−トランス−４−アミノメチルシクロヘキシル（カイザーオキシム樹脂）カルボキレート（２０ｇ）を塩化メチレン（１００ｍＬ）中に懸濁し、ＴＦＡ（２５ｍＬ）を加えた。反応液を０．５時間静かに混合し、次いで固体を濾過して回収し、次に、塩化メチレン（５ｘ１００ｍＬ）で洗浄し、次に真空下で一晩乾燥した。ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ^-1）＝３１５０、１７７０、１５２６ｄ）４−カルボキシ−ベンゾフェノン−４−カルボキサミド−トランス−４ −メチル−シクロヘキシル−（カイザーオキシム樹脂）カルボキシレートトランス−４−アミノメチルシクロヘキシル（カイザーオキシム樹脂）カルボキシレート（２００ｍｇ）をＤＭＦ（３．０ｍＬ）中に懸濁し、Ｎ−メチルモルホリン（０．２ｍＬ）および４，４’−ベンゾフェノンジカルボン酸（１９０ｍｇ、０．７ミリモル）およびＨＢＴＵ（２６５ｍｇ、０．７ミリモル）を加え、反応溶液を３時間静かに混合した。固体を濾過して回収し、次に、ＤＭＦ（３ｘ２０ｍＬ）、次いで水（３ｘ２０ｍＬ）で洗浄し、次に、ＤＭＦ（３．０ｍＬ）中に再懸濁し、Ｎ−メチルモルホリン（０．１ｍＬ）および４，４’−ベンゾフェノジカルボン酸（０．３５ミリモル）およびＨＢＴＵ（０．３５ミリモル）を加え、反応液を３時間静かに混合した。固体を濾過して回収し、次に、ＤＭＦ（３ｘ２０ｍＬ）、次いで水（３ｘ２０ｍＬ）、次いで塩化メチレン（５ｘ２０ｍＬ）で洗浄し、次に、真空下で乾燥した。ｅ）４−カルボキシ−ベンゾフェノン−４−カルボキサミド−トランス−４ −メチル−シクロヘキシル−Ｎ−ヘキシルカルボキサミド４−カルボキシ−ベンゾフェノン−４−カルボキサミド−トランス−４−メチル−シクロヘキシル−（カイザーオキシム樹脂）カルボキシレート（２００ｍｇ）を塩化メチレン（３．０ｍＬ）中に懸濁し、ヘキシルアミン（０．３ミリモル）を加えた。反応液を３時間静かに混合し、次に、濾過して、濾液を真空下で濃縮して、標記化合物を得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ４９３［Ｍ＋Ｈ］⁺ 実施例７４−ニトロ−ベンズアミド−トランス−４−メチル−シクロヘキシル−Ｎ−ヘキシルカルボキサミド（化合物７）の調製４−ニトロ−ベンズアミド−トランス−４−メチル−シクロヘキシル−Ｎ−ヘキシルカルボキサミド４，４’−ベンゾフェノンジカルボン酸の代わりに４−ニトロ安息香酸を用いること以外は、実施例６（ａ）−（ｅ）の手順に従って、標記化合物を調製した。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ３９０［Ｍ＋Ｈ］⁺ 実施例８４−アセトアミド−ベンズアミド−トランス−４−メチル−シクロヘキシル−Ｎ −１−（アミノ−Ｒ−２−（メトキシメチル）−ピロリジン）カルボキサミド（化合物８）の調製４，４’−ベンゾフェノンジカルボン酸の代わりに４−アセトアミド−安息香酸、ヘキシルアミンの代わりにＲ−１−アミノ−２−（メトキシメチル）−ピロリジン（ＲＡＭＰ）を用いる以外は、実施例６（ａ）−（ｅ）の手順に従って、標記化合物を調製した。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ３３１［Ｍ＋Ｈ］⁺ 実施例９４−ホルミル−Ｅ−シンナミド−トランス−４−メチル−シクロヘキシル−Ｎ− （プロピル）カルボキサミド（化合物９）の調製４，４’−ベンゾフェノンジカルボン酸の代わりに４−ホルミルケイ皮酸、ヘキシルアミンの代わりにプロピルアミンを用いる以外は、実施例６（ａ）−（ｅ）の手順に従って、標記化合物を調製した。ＭＳ(ＥＳ)ｍ／ｅ３５７［Ｍ＋Ｈ］⁺ 実施例１０２，３，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］チエノ［２，３−ｂ］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリジン−３−オン（化合物１０）の調製ａ）エチル４−ヒドロキシ−２−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チエノ［２，３−ｂ］ピリジン−２−カルボキシレートエチル２−アミノ−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン− ３−カルボキシレート（８．９ｇ、３９ミリモル）およびエチル３−エトキシクロトネート（１２．４ｇ、７８ミリモル）のトルエン（３００ｍＬ）中溶液を、ショウノウスルホン酸（０．７８ｇ、３．４ミリモル）で処理し、ディーン・スターク装置を用いて反応混合物を、３時間熱還流した。次に、混合物を室温に冷却し、その後、新たに調製した１Ｍナトリウムエトキシド溶液（４８ｍＬ、４８ミリモル）で処理した。添加完了後、反応混合物を３時間熱還流した。混合物を冷却し、濃縮して、残渣を酢酸エチルに溶解した。酢酸（２ｍＬ）を加え、溶媒を蒸発させて、得られた固体をメタノールで処理して、標記化合物をオフホワイトの固体（８．４ｇ、７４％）として得た。融点１４０℃；¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ4.48(q,J=7.2Hz,2H)、3 .04(brs,2H)、2.81(s,3H)、2.80(brs,2H)、1.87(brs,4H)、1.47(t,J=7.2Hz,3H); 分析Ｃ₁₅Ｈ₁₇ＮＯ₃Ｓの計算値：Ｃ，６１．８３；Ｈ，５．８８；Ｎ，４．８１；実測値：Ｃ，６１．６９；Ｈ，５．８１；Ｎ，４．７３ｂ）エチル４−クロロ−２−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チエノ［２，３−ｂ］ピリジン−２−カルボキシレート実施例１０（ａ）の化合物（８．０ｇ、２７．４ミリモル）のオキシ塩化リン（１００ｍＬ）中溶液を、３．５時間還流した。オキシ塩化リンを真空下で除去し、残油を酢酸エチル中に溶解し、５％重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発させて、標記化合物を結晶性固体（８．５ｇ、９５％）として得た。融点６５−６６℃；¹ＨＮＭＲ(４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ4.47(q,J=7.1Hz,2H )、3.10(brs,2H)、2.85(brs,2H)、2.60(s,3H)、1.89(brs,4H)、1.43(t,J=7.1Hz,3H); 分析Ｃ₁₅Ｈ₁₆ＣｌＮＯ₂Ｓ.０．１２５Ｈ₂Ｏの計算値：Ｃ，５７．７３；Ｈ，５．２５；Ｎ，４．４９；実測値：Ｃ，５７．６９；Ｈ，５．０８；Ｎ，４．３０ｃ）２，３，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］チエノ［２．３−ｂ］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリジン−３−オン実施例１０（ｂ）の化合物（２．０ｇ、６．４ミリモル）のメタノール（５０ｍＬ）中溶液を、ヒドラジン一水和物（１０ｍＬ）で処理し、得られた混合物を１６時間熱還流した。反応液を希塩酸水溶液に注いで、標記化合物を黄色固体（１．８ｇ）として沈澱させた。¹ ＨＮＭＲ(４００ＭＨｚ，ｄ₄−ＭｅＯＨ)δ3.01(brs,2H)、3.00(s,3H)、2.92(brs ,2H)、2.00(brs,4H);分析Ｃ₁₃Ｈ₁₃Ｎ₃ＯＳ.ＨＣｌ.０．２５Ｈ₂Ｏの計算値：Ｃ，５２．００；Ｈ，４．８７；Ｎ，１３．９９；実測値：Ｃ，５１．９２；Ｈ，５．０１；Ｎ，１３．７０実施例１１−ＳＨ２ドメインアンタゴニストの有効性の決定のためのプロトコール異なるヒト・ＳＨ２ドメインにおける化合物の阻害活性を、イー・コリにおいて融合蛋白として発現されたＳＨ２ドメインを用いてインビトロで決定した。ここに使用したＳＨ２ドメインは、ｓｒｃＳＨ２ドメイン、Ｇｒｂ２ＳＨ２ドメイン、ｌｃｋＳＨ２ドメイン、ｆｙｎＳＨ２ドメイン、ＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメイン、ｐ８５ＳＨ２ドメインおよびｈｃｐＳＨ２ドメインのヒト形態であった。ｓｒｃ、ｌｃｋおよびｈｃｐＳＨ２ドメインを含む融合蛋白は一般的配列として発現された。すなわち、ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ＳＨ２である。（ＤＥＴ１、ＤＥＴ２、スペーサー、ｅｋおよびＳＨ２は以下に説明する）ＤＥＴ１（定義されたエピトープタグ１）（配列番号：１）は、ヒト・免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）のエンベロープ蛋白ｇｐ１２０（またはｇｐ１６０）中に見いだされる１１個のアミノ酸配列である。ＨＩＶ−１のｇｐ１２０（またはｇｐ１６０）の種々のエピトープに対するモノクローナル抗体が当該分野において知られている。例えば、米国特許第５１６６０５０号参照。１の好ましい例はモノクローナル抗体１７８.１（例えば、Thiriart et al.,J.Immunol .,143:1832-1836(1989)参照）であり、酵母で発現されたＢＨ１０株由来のＨＩＶ−１のｇｐ１６０分子を用いてマウスを免疫することにより調製された（Ratn er et al.,Nature,313:277-284(1985)）。このタグを、発現の検出（ウェスタンブロットによる）、蛋白の精製（アフィニティークロマトグラフィーによる）、および融合蛋白が１７８.１抗体により捕捉され固定化される配置アッセイ（configuring assay）に使用した。ＤＥＴ２はヘキサヒスチジン配列タグ（配列番号：２）であり、ニッケル含有樹脂に結合するものであり、精製目的で使用した。スペーサー（配列番号：３）を用いて構築物の示された位置にＢａｍＨＩ制限部位を形成した。用語−ｅｋ−は、エンテロキナーゼプロテアーゼ用認識配列（配列番号：４）をいい、それによりＳＨ２ドメインからのタグの最適な除去が行われ、かくして、外来アミノ酸を含まないＳＨ２ドメインが得られる。外来アミノ酸を含まないＳＨ２ドメインは、結晶学的研究のためのタグ付き蛋白にとり好ましいものである。ＳＨ２は異なる蛋白のＳＨ２ドメインをいう。示された制限部位（ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ）がスペーサー−ｅｋ−ＳＨ２領域に隣接するように各ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ＳＨ２をコードしているＤＮＡ配列を設計し、そのことにより異なるスペーサー−ｅｋ−ＳＨ２構築物が下記手順２または３に説明するいずれかのベクター中に容易に置換されるようになり、ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ＳＨ２タグ付き蛋白が得られた。イー・コリの転写および翻訳調節配列ならびにＸｂａＩに適合する下流のクローニング部位の下流に適当間隔をおいてタグ付きＳＨ２ドメインの全体がＮｄｅＩ−ＸｂａＩフラグメントとして移動されうるように各ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ＳＨ２構築物をコードしているＤＮＡ配列を設計した。いずれのベクター（例えば、ｐＥＴ−１１ａ；Novagen,Inc.）であっても同様の結果が得られるであろうが、本実施例に使用したベクターはイー・コリの発現ベクターｐＥＡ１ＫｎＲＢＳ３であった。このベクターは、Current Protocol s in Molecular Biology(F.A.Ausbel et al.,eds.),1990,pp16.3.1-16.3.11,Gre ene Publishing and Wiley-Interscience,N.Y.（以後、Ausbelらという）中のSh atzman,A,Gross,M,and Rosenberg,M,の執筆部分"Expression usingvectors with phage lambda regulatory sequences"に記載された一連のベクターの誘導体である。特別なベクターｐＥＡ１ＫｎＲＢＳ３はBergsma et al.,1991,J.Biol.Che m.266:23204-23214に記載されている。下記手順はニワトリ・ｓｒｃ、ヒト・ｓｒｃ、ヒト・ｌｃｋおよびヒト・ｈｃｐＳＨ２ドメインの発現を説明する。まず、ヒワトリ・ｓｒｃＳＨ２ドメインをＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２として発現させた。次いで、他方をニワトリ・ｓｒｃのかわりにこのベクター中に挿入して、下記手順１および２記載のごとくＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−スペーサー−ＳＨ２形態の蛋白を発現させた。手順１：タグＤＥＴ１およびＤＥＴ２を含むニワトリ・ｓｒｃＳＨ２ドメイン（ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２）のクローニングおよび発現当業者によく知られた方法により下記プライマーを用いて、タグを付した蛋白ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２をコードしているＤＮＡ配列を、ニワトリ・ｓｒｃ遺伝子を含むｃＤＮＡクローン（p5H;Levy et al 1986.Proc.Natl. Acad.Sci.USA 83:4228）からＰＣＲ増幅した。下線を付した部位はＮｄｅＩ認識部位（５’）およびＢａｍＨＩ認識部位（３ ’）である。下線を付した領域はＸｂａＩ認識部位である。ＰＣＲ生成物をＮｄｅＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで、アガロースゲル上で消化フラグメントを単離した。前以てアガロースゲルで６.５ｋｂのフラグメントとして精製されているＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ｐＥＡ１ＫｎＲＢＳ３ベクター（Bergsmaら,上記文献）中にフラグメントを連結した。連結反応物を用いてイー・コリＭＭ２９４ｃＩ⁺（F.A.Ausbelら,上記文献）に形質転換した。正しいフラグメント挿入を有するプラスミドを同定し、ＤＮＲ配列決定により確認した。得られたプラスミドは、ファージラムダＰ_Lプロモーターおよび調節システムの制御下のＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２をコードしている。プラスミドＤＮＡをＭＭ２９４ｃＩ⁺から精製し、イー・コリＡＲ１２０株に形質転換した。この宿主株において、F.A.Ausbelらの上記文献記載のごとくナリジキシン酸を増殖中の培養に添加することによりファージプロモーターの発現を誘導することができる。このプラスミドを含むＡＲ１２０株のナリジキシン酸誘導、次いで、クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での細胞蛋白の分析（F.A.Ausbelら,上記文献）により、見かけの分子量１５０００の蛋白バンドが出現した。このバンドは、未誘導細胞またはＰＣＲ増幅フラグメント不含のｐＥＡ１ＫｎＲＢＳ３含有誘導細胞においては見られなかった。ウェスタンブロッティングにより、誘導蛋白バンドが抗−ＤＥＴ１モノクローナル抗体１７８.１と反応することが確認された。手順２：タグおよびエンテロキナーゼ蛋白分解開裂部位を含むヒト・ｓｒｃＳＨ２ドメイン（ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｓｒｃＳＨ２）のクローニング、発現および精製下記プライマーを用いて、ヒト・ｓｒｃ遺伝子を含むｃＤＮＡクローン（Take ya,T.およびHanafusa,H,1983 Cell 32:881-890記載のものと同じｃ−ｓｒｃＳＨ２ＤＮＡ配列）から、蛋白ｅｋ−ｓｒｃＳＨ２をコードしているＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅した。下線部位はＢａｍＨＩ認識部位である。下線領域はＸｂａＩ認識部位である。ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで、アガロースゲル上で消化フラグメントを単離した。上記手順１に記載のタグを付したニワトリ・ｓｒｃ遺伝子ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２を含むＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ消化発現ベクターフ中にラグメントを連結した。そのベクターにおいて、ＢａｍＨＩ部位はＤＥＴ２およびＳＨ２コーディング領域間に存在し、ＸｂａＩ部位はＳＨ２コーディング領域の３’末端の後に存在している。連結反応物を用いてイー・コリＭＭ２９４ｃＩ⁺を形質転換した。構築物ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｓｒｃＳＨ２をＤＮＡ配列決定により確認し（配列番号：５）、上記手順１記載のごとくイー・コリＡＲ１２０株中で誘導した。クーマシーブルーで染色され、ウェスタンブロット陽性の、見かけの分子量１６０００の誘導蛋白バンドがナリジキシン酸誘導後に観察された。リゾチーム存在下で超音波処理することにより、中性ｐＨにおいて細胞を溶解した。遠心分離後、可溶性抽出物をＮｉ⁺−ＮＴＡカラムによるクロマトグラフィーに供した。平衡化バッファー（０．５ＭＮａＣｌ含有ＴｒｉｓバッファーｐＨ８）および１５ｍＭのイミダゾールを含有する同じバッファーでカラムを洗浄後、平衡化バッファー中２５ｍＭイミダゾールにより蛋白ＤＥＴ１−ＤＥＴ２ −スペーサー−ｅｋ−ｓｒｃＳＨ２が高度に精製された形態で溶離した。下記「結合アッセイ」において、このやり方で精製されたＳＨ２ドメインは、特異的かつ飽和可能な様式で適当なｐＹペプチドに高アフィニティーで結合することがわかり、タグは機能を妨害しないことが示された。この発現された融合蛋白ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｓｒｃＳＨ２を下記「結合アッセイ」に用いて、ヒト・ｓｒｃＳＨ２ドメインを選択的に阻害する化合物の特異性を決定した。手順３タグおよびエンテロキナーゼ蛋白分解開裂部位を含むヒト・ｌｃｋＳＨ２ドメイン（ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｌｃｋＳＨ２）のクローニングおよび発現蛋白ｅｋ−ｌｃｋＳＨ２をコードしているＤＮＡ配列を、以下のプライマーを用いて、ヒト・ｌｃｋ遺伝子を含有するｃＤＮＡクローン（Genbank受託番号Ｍ３６８８１）からＰＣＲ増幅した。下線部位はＢａｍＨＩ認識部位である。下線領域はＸｂａＩ認識部位である。ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで、消化フラグメントをアガロースゲル上で単離した。上記手順１に記載したタグ付きニワトリ・ｓｒｃ遺伝子ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２を含有する、ＢａｍＨＩ− ＸｂａＩで消化した発現ベクター中にフラグメントを連結した。そのベクターにおいて、ＢａｍＨＩ部位は、ＤＥＴ２についてのコーディング配列およびＳＨ２についてのコーディング配列の間に位置しており、ＸｂａＩ部位はＳＨ２コーディング領域の３’末端の後に位置している。かくして、ｅｋ−ｌｃｋＳＨ２配列が上記ベクター中においてｓｒｃＳＨ２配列に取って変わった。連結反応物を用いてイー・コリＭＭ２９４ｃＩ⁺を形質転換した。ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｌｃｋＳＨ２を含有する構築物をＤＮＡ配列決定により確認し（配列番号：６）、上記手順１記載のごとくイー・コリＡＲ１２０株中で誘導した。クーマシーブルー染色され、ウェスタンブロット陽性の、見かけの分子量１７０００を有する誘導蛋白バンドがナリジキシン酸誘導後に観察された。リゾチーム存在下での超音波処理により細胞を中性ｐＨにて溶解した。遠心分離後、可溶性抽出物をＮｉ⁺⁺ＮＴＡカラムでクロマトグラフィーした。平衡化バッファー（０.５ＭＮａＣｌ含有ＴｒｉｓバッファーｐＨ８）および１５ｍＭイミダゾールを含有する同じバッファーでカラムを洗浄後、平衡化バッファー中２５ｍＭイミダゾールとともに蛋白が高度に精製された形態で溶離した。下記「結合アッセイ」において、このやり方で精製されたＳＨ２ドメインは、特異的で飽和可能な様式で適当なｐＹペプチドに高アフィニティーで結合することがわかり、タグが機能を妨害しないことが示された。この発現融合蛋白ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｌｃｋＳＨ２を下記「結合アッセイ」に用いて、ヒト・ｌｃｋＳＨ２ドメインを選択的に阻害する化合物の特異性を決定した。手順４：タグおよびエンテロキナーゼ蛋白分解開裂部位を含むヒト・ｈｃｐＳＨ２ドメイン（ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｈｃｐＳＨ２）のクローニングおよび発現蛋白ｅｋ−ｈｃｐＳＨ２をコードしているＤＮＡ配列（Shen,S-H,Nature(199 1)352:736-739に記載されたのと同じｈｃｐＳＨ２ＤＮＡ配列）を、ヒト胎児肝臓ＲＮＡから逆転写−ＰＣＲ増幅した。ＲＮＡ単離にはTri-Reagent（Molecul ar Research Center Inc.）および逆転写酵素システム（GIBCO-BRL）を製造者の指示に従って使用した。以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。下線部位はＢｇｌII認識部位である。下線領域はＸｂａＩ認識部位である。ＰＣＲ生成物をＢｇｌIIおよびＸｂａＩで消化し、次いで、消化フラグメントをアガロースゲル上で単離した。上記手順２に記載したタグ付きヒト・ｓｒｃ遺伝子ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｓｒｃＳＨ２を含有する、ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩで消化した発現ベクター中にフラグメントを連結した。そのベクターにおいて、ＢａｍＨＩ部位は、ＤＥＴ２についてのコーディング配列およびｅｋについてのコーディング配列の間に位置しており、ＸｂａＩ部位はＳＨ２コーディング領域の３’末端の後に位置している。かくして、ｅｋ−ｈｃｐＳＨ２配列が上記ベクター中においてｅｋ−ｓｒｃＳＨ２配列に取って変わった。連結反応物を用いてイー・コリＭＭ２９４ｃＩ⁺を形質転換した。ＤＥＴ１ −ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｈｃｐＳＨ２を含有する構築物をＤＮＡ配列決定により確認し（配列番号：７）、イー・コリＧＩ６９８（Invitrogen Corp oration,San Diego,CA）の形質転換に使用した。製造者の指示に従ってトリプトファンを１０ｍｇ／ｍｌとなるよう培地に添加することによりファージラムダのプロモーターの誘導を行った。クーマシーブルー染色され、ウェスタンブロット陽性の、見かけの分子量１５０００を有する誘導蛋白バンドがナリジキシン酸誘導後に観察された。リゾチーム存在下での超音波処理により細胞を中性ｐＨにて溶解した。遠心分離後、可溶性抽出物をＮｉ⁺⁺ＮＴＡカラムでクロマトグラフィーした。平衡化バッファー（０.５ＭＮａＣｌ、８Ｍ尿素および５ｍＭＢＭＥ含有Ｔｒｉｓバッファ−ｐＨ８）および１５ｍＭイミダゾールを含有する同じバッファーでカラムを洗浄した。５ｍＭＢＭＥ存在下で尿素を除去する間に蛋白はカラム上で再生し、精製再生蛋白はＴｒｉｓバッファーｐＨ８中３００ｍＭイミダゾールとともに溶離した。下記「結合アッセイ」において、このやり方で精製されたＳＨ２ドメインは、特異的で飽和可能な様式で適当なｐＹペプチドに高アフィニティーで結合することがわかり、タグが機能を妨害しないこと、および蛋白がうまく再生されたことが示された。この発現融合蛋白ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｈｃｐＳＨ２を下記「結合アッセイ」に用いて、ヒト・ｈｃｐＳＨ２ドメインを選択的に阻害する化合物の特異性を決定した。 Pharmacia（New Jersey）から入手できるＧＳＴ遺伝子融合キットシステムに記載されたようにして構造ＧＳＴ−Ｘ−ＳＨ２を有する融合蛋白を調製した。ＧＳＴは、ｆｙｎ、Ｇｒｂ２およびＳＨ−ＰＴＰ２のためのタグ付加配列グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼエピトープ（配列番号：８）であり、さらにｐ８５のためのタグ配列グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼエピトープ（配列番号：９）である。ＳＨ２とは、ｆｙｎ、Ｇｒｂ２、ｐ８５およびＳＨ−ＰＴＰ２のＳＨ２ドメインをいい、それらは、"Current Protocoles in Molecular B iology",ed.FM Ausbel et al.,pub John Wiley and Sons,Inc(1995),p 16.7.1に従って発現され、グルタチオンセファロース４Ｂ（Pharmacia）を用いて精製された。Ｘは適当なリンカーであり、好ましくは６ないし２１塩基対であり、ＳＨ２構築物を読み枠中に保ち、クローニングを完全にするために使用される。そのようなものとして、Ｘの配列は重要ではない。当業者は適当なリンカーを容易に構築することができる。示された制限部位（ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ）がＳＨ２領域に隣接するように、各ＧＳＴ−Ｘ−ＳＨ２融合蛋白をコードしているＤＮＡ配列を消化した。この実施例に使用したベクターは、ｆｙｎ、Ｇｒｂ２およびＳＨ−ＰＴＰ２に関してはイー・コリ発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（Pharmaci a）であり、ｐ８５についてはｐＧＥＸ−３Ｘ（Pharmacia）であった。これらの各ベクターは、下記のさらなるＣ末端アミノ酸を有するＳＨ２構築物を生じた。ヒト・ｆｙｎのＳＨ２ドメイン（アミノ酸１４３〜２５２）（Yamamoto,T.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,5459-5463(1986)）をコードしている配列を、発現ベクターｐＧＥＸ−２ＴのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位中にクローンした。さらなるＣ末端アミノ酸ロイシン−スレオニン−アスパラギン−セリン−セリン（配列番号：１０）を含むＳＨ２ドメインを、当業者に知られたＰＣＲ法によりクローンして発現融合蛋白ＧＳＴ−Ｘ−ｆｙｎを得た。次いで、この発現融合蛋白を下記「結合アッセイ」に使用して、ヒト・ｆｙｎＳＨ２ドメインを選択的に阻害する化合物の特異性を決定した。ヒト・ｐ８５ＳＨ２ドメイン：ヒト・ｐ８５のＳＨ２ドメイン（アミノ酸３２１〜４４０）（Skolnik,E.et al.,Cell 65,83-90(1991)）をコードしている配列を、発現ベクターｐＧＥＸ−３ＸのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位中にクローンした。さらなるＣ末端アミノ酸アスパラギン−セリン−セリン(配列番号：１１)を含むＳＨ２ドメインを、当業者に知られたＰＣＲ法によりクローンして発現融合蛋白ＧＳＴ−Ｘ−ｐ８５を得た。次いで、この発現融合蛋白を下記「結合アッセイ」に使用して、ヒト・ｐ８５ＳＨ２ドメインを選択的に阻害する化合物の特異性を決定した。ヒト・ＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメイン：ヒト・ＳＨ−ＰＴＰ２のＳＨ２ドメイン（アミノ酸１〜１０６）（Bastien,L.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.19 6,124-133(1993)）をコードしている配列を、発現ベクターｐＧＥＸ−２ＴのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位中にクローンした。さらなるＣ末端アミノ酸グルタミン−フェニルアラニン−イソロイシン−バリン−スレオニン−アスパラギン酸（配列番号：１２）を含むＳＨ２ドメインを、当業者に知られたＰＣＲ法によりクローンして発現融合蛋白ＧＳＴ−Ｘ−ＳＨ−ＰＴＰ２を得た。次いで、この発現融合蛋白を下記「結合アッセイ」に使用して、ヒト・ＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインを選択的に阻害する化合物の特異性を決定した。ヒト・Ｇｒｂ２ＳＨ２ドメイン：ヒト・Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメイン（アミノ酸５８〜１５９）（Lowenstein,E.et al.,Cell 70,431-442(1992)）をコードしている配列を、発現ベクターｐＧＥＸ−２ＴのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位中にクローンした。さらなるＣ末端アミノ酸イソロイシン−ヒスチジン−アルギニン−アスパラギン酸（配列番号：２５）を含むＳＨ２ドメインを、当業者に知られたＰＣＲ法によりクローンして発現融合蛋白ＧＳＴ−Ｘ−Ｇｒｂ２を得た。６ヌクレオチドリンカーを用い、ＧＳＴおよびＳＨ２ドメイン間にアミノ酸グリシンおよびセリンを生じさせた。次いで、この発現融合蛋白を下記「結合アッセイ」に使用して、ヒト・Ｇｒｂ２ＳＨ２ドメインを選択的に阻害する化合物の特異性を決定した。結合アッセイ：かかるＳＨ２ドメインと各特異的ｐＹペプチドとの結合を阻害するかかる化合物の能力に基づいて、ＳＨ２ドメインにおける化合物の潜在能力を調べた。ＳＨ２ドメインおよびｐＹペプチドに関する結合アッセイを、ＥＬＩＳＡに基づく９６ウェルプレートアッセイにおいて行った。Milliporeの９６ウェルフィ号ＭＡＤＶＮ６５５０）中に、２μｌ（５０％懸濁液）のプロテイン−Ｇセファロース（ニュージャージー州のPharmaciaから得られる、カタログ番号１７−０６１８−０１）および２μｌの２ｍｇ／ｍｌのＭＡＢ１７８.１（ｇｐ１２０／ＳＨ２ドメイン融合蛋白ｓｒｃ、ｌｃｋおよびhｃｐ用）または０.２５μｌの抗 −ＧＳＴポリクローナル抗血清（ニュージャージー州のPharmaciaから得られる）（ＧＳＴ／ＳＨ２ドメイン融合蛋白ｆｙｎ、Ｇｒｂ２、ｐ８５およびＳＨ− ＰＴＰ２用）のいずれかを添加した。１０ｐｍｏｌの対象ＳＨ２ドメイン融合蛋白を各ウェルに添加した。ＴＢＳ−Ｔ（トリス緩衝化セイライン＋０.０５％ツイン−２０）で体積を１００μｌとし、室温で振盪しながら１時間インキュベーションし、次いで、ＴＢＳ−Ｔで１回洗浄した（４℃にて）。次いで、９０μｌのＴＢＳ−Ｔを各ウェルに添加した。特異的ｐＹビオチン化ペプチドを希釈してＴＢＳ−Ｔ中濃度１.０μＭとした（これらのペプチドをペンシルベニア州のBac hem Bioscience、テキサス州のGenosys Biotechnologiesおよびカリフォルニア州のCalifornia Peptide Researchから得た）。ウェルあたり１０μｌを分取して最終濃度０.１μＭとし（各ＳＨ２ドメイン／ペプチドペアーについてのＫ_dとほぼ同じ）、最終体積を１００μｌとした。平衡結合が達成されるまでアッセイプレートをインキュベーションした(振盪しながら４℃で３時間)。アッセイプレートをＴＢＳ−Ｔでウェルあたり２回洗浄し（４℃にて）、次いで、ウェルあたり１００μｌのＳＡＢＣ（ストレプトアビジンビオチン化セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体、カリフォルニア州のZymed corporationから得られる、カタログ番号９３−００４３、１０ｍｌのＴＢＳ−Ｔあたり１滴の試薬Ａ（ストレプトアビジン）および１滴の試薬Ｂ（ＡＨ−ビオチン結合−セイヨウワサビペルオキシダーゼ）、３７℃で３０分インキュベーションし、次いで４℃まで冷却）を添加し、次いで、４℃で３０〜６０分インキュベーションした。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した（４℃にて）（１回の洗浄につき２５０μｌ／ウェル）。クエン酸バッファー中１ｍｇ／ｍｌＯＰＤ（ｏ−フェニルジアミン、ミズーリ州セントルイスのSigma Chemical Corporation）１００μｌを各ウェルに添加した。発色を停止するために、１００μｌの１０％硫酸を各ウェルに添加した。次いで、アッセイプレートの各ウェルから１５０μｌを取り、ＥＬＩＳＡプレートに入れた。次いで、各ＥＬＩＳＡプレートのＡ₄₉₀を測定した。表Ｉに関する（ＩＣ₅₀）の決定各対照または化合物を２系でアッセイした。２系を平均し、バックグラウンドを差し引いて阻害なしの場合の最大値をプレートから取り、次いで、他のすべてのデータ点を最大値に対するパーセント（または対照に対する％）で表した。これらの対照に対する％のデータ値を、Kaleidagraph for Macintosh（Synergy So ftware）においてグラフ化した。これらのグラフの曲線は、下記等式にあてはまる非線形曲線であった。Ｆ（ｘ）＝Ｅｍａｘ／（１＋（ｋｄ／濃度）∧勾配）、ここにＫｄは各曲線のＩＣ₅₀を表す。表ＩＩに関する（Ｋｉ）の決定以下の等式（文献参照）により各化合物についてのＫｉを計算した。ｐＹビオチン化ペプチドはＳＨ２ドメイン融合蛋白よりも大過剰濃度（１００）ではないという事実のため、このアッセイの条件下ではこの拡張された等式を使用しなければならない。ＩＣ₅₀は、Kaleidagraphを用いる非線形曲線適合からの外挿値である。Ｒ_totおよび*Ｄはアッセイに用いた試薬について知られている値である。一般的には、ＫＤはＳＨ２ドメイン融合蛋白およびｐＹビオチン化ペプチドの各組み合わせに関して実験的に決定される。ＫＩ＝競争物質のＫＤ（μＭ）ＩＣ₅₀＝阻害剤のＩＣ₅₀（μＭ）各ＳＨ２ドメインに関する競争選択アッセイデータの非線形曲線から得られるＲ_tot＝１アッセイ（マイクロタイタープレート）ウェル中の全ＳＨ２ドメイン濃度（μＭ） *Ｄ＝各ＳＨ２ドメインに対する特定のｐＹおよびビオチン化ペプチドの濃度（μＭ）ＫＤ＝各ＳＨ２ドメインに対する特定のｐＹおよびビオチン化ペプチドについてのＫＤ値（μＭ）ＩＣ₅₀は、応答またはシグナルが５０％抑制される阻害剤濃度である。ＫＤは、受容体／リガンド相互作用におけるリガンドに対する解離定数であり、通常には、飽和結合曲線上の１／２Ｖｍａｘであるリガンド濃度に等しい。上記結合アッセイに用いたｐＹペプチドリガンドは以下のごとし：アミノカプロン酸（Ａｃａ）リンカーを含むビオチン化ｐＹペプチドリガンドをｓｒｃ、ｌｃｋ、およびｆｙｎＳＨ２ドメインに用いた。Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−ｐＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（配列番号：１３）アミノカプロン酸（Ａｃａ）リンカーを含むビオチン化ｐＹペプチドリガンドをｐ８５ＳＨ２に用いた。Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｐＴｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−ＬｙＳ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ（配列番号：１４）アミノカプロン酸（Ａｃａ）リンカーを含むビオチン化ｐＹペプチドリガンドをＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２に用いた。Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ｐＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ（配列番号：１５）アミノカプロン酸（Ａｃａ）リンカーを含むビオチン化ｐＹペプチドリガンドをｈｃｐＳＨ２に用いた。Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＴｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号：１６）アミノカプロン酸（Ａｃａ）リンカーを含むビオチン化ｐＹペプチドリガンドをＧｒｂ２ＳＨ２に用いた。Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ｐＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号：２６）結合アッセイの結果：表ＩおよびＩＩは、示されたＳＨ２ドメインにおけるＳＨ２アンタゴニストの交差反応性を説明する。これらの表に開示した結果から、他のＳＨ２ドメインにおける結合アフィニティー／阻害濃度よりもｌｃｋＳＨ２ドメインにおける結合アフィニティー／阻害濃度が５０倍以上高い化合物を容易に確認することができる。本発明の好ましい具体例を上で説明したが、本発明は本明細書開示の内容のみに限定されるのではなく、以下の請求の範囲内のすべての修飾に対する権利が保有されることを理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ｃ０７Ｄ 207/50 Ｃ０７Ｄ 207/50 495/14 495/14 Ｄ 495/22 495/22 (31)優先権主張番号０８／４９７，３５７ (32)優先日 1995年６月30日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．対象における自己免疫疾患の治療法であって、ａ．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し；ｂ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメインに結合し；ｃ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインに結合し；ｄ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合し；およびｅ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトＧｒｂ２ＳＨ２ドメインに結合する；治療上有効量の化合物を対象に投与することからなる方法。２．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する、治療上有効量の化合物を対象に投与することからなる請求項１記載の方法。３．ａ．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し；ｂ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメインに結合し；ｃ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインに結合し；ｄ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合し；およびｅ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトＧｒｂ２ＳＨ２ドメインに結合する；治療上有効量の化合物を対象に投与することからなる請求項１記載の方法。４．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する、治療上有効量の化合物を対象に投与することからなる請求項３記載の方法。５．対象における同種異系移植拒絶反応の阻害方法であって、ａ．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し；ｂ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメインに結合し；ｃ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインに結合し；ｄ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合し；およびｅ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトＧｒｂ２ＳＨ２ドメインに結合する；同種異系移植拒絶反応を阻害する量の化合物を対象に投与することからなる方法。６．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する、同種異系移植拒絶反応の阻害量の化合物を対象に投与することからなる請求項５記載の方法。７．ａ．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し；ｂ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメインに結合し；ｃ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインに結合し；ｄ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合し；およびｅ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトＧｒｂ２ＳＨ２ドメインに結合する；同種異系移植拒絶反応の阻害量の化合物を対象に投与することからなる請求項５記載の方法。８．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する、同種異系拒絶反応の阻害量の化合物を対象に投与することからなる請求項７記載の方法。９．対象における免疫抑制を誘発する方法であって、ａ．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し；ｂ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメインに結合し；ｃ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインに結合し；ｄ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合し；およびｅ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトＧｒｂ２ＳＨ２ドメインに結合する；免疫抑制を誘発する量の化合物を対象に投与することからなる方法。１０．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する、免疫抑制誘発量の化合物を対象に投与することからなる請求項９記載の方法。１１．ａ．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し；ｂ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメインに結合し；ｃ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインに結合し；ｄ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合し：およびｅ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトＧｒｂ２ＳＨ２ドメインに結合する；免疫抑制誘発量の化合物を対象に投与することからなる請求項９記載の方法。１２．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する、免疫抑制誘発量の化合物を対象に投与することからなる請求項１１記載の方法。１３．ａ．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し；ｂ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメインに結合し；ｃ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインに結合し；ｄ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合し；およびｅ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトＧｒｂ２ＳＨ２ドメインに結合する；自己免疫疾患の治療用医薬の製造における使用。１４．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する請求項１３記載の使用。１５．ａ．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し；ｂ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメインに結合し；ｃ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインに結合し；ｄ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合し；およびｅ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトＧｒｂ２ＳＨ２ドメインに結合する；請求項１３記載の使用。１６．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する請求項１５記載の使用。１７．ａ．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し；ｂ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメインに結合し；ｃ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインに結合し；ｄ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合し；およびｅ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトＧｒｂ２ＳＨ２ドメインに結合する；同種異系移植拒絶反応の阻害用医薬の製造における使用。１８．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する請求項１７記載の使用。１９．ａ．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し；ｂ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメインに結合し；ｃ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインに結合し；ｄ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合し；およびｅ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトＧｒｂ２ＳＨ２ドメインに結合する；請求項１８記載の使用。２０．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する請求項１９記載の使用。２１．ａ．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し；ｂ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメインに結合し；ｃ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインに結合し；ｄ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合し；およびｅ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上小さな結合親和力でヒトＧｒｂ２ＳＨ２ドメインに結合する；免疫抑制誘発用医薬の製造における使用。２２．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも５０倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する請求項２１記載の使用。２３．ａ．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合し；ｂ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトｈｃｐＳＨ２ドメインに結合し；ｃ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトＳＨ−ＰＴＰ２ＳＨ２ドメインに結合し；ｄ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトｐ８５ＳＨ２ドメインに結合し；およびｅ．化合物がかかるｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上小さな結合親和力でヒトＧｒｂ２ＳＨ２ドメインに結合する；請求項２１記載の使用。２４．化合物がヒトｓｒｃＳＨ２ドメインおよびヒトｆｙｎＳＨ２ドメインに結合する結合親和力よりも１００倍以上大きな結合親和力でヒトｌｃｋＳＨ２ドメインに結合する請求項２３記載の使用。