JPH0967388A

JPH0967388A - サイコサポニンの製造方法

Info

Publication number: JPH0967388A
Application number: JP24666495A
Authority: JP
Inventors: Shinji Inomata; 慎二猪股; Mineyuki Yokoyama; 峰幸横山; Takeshi Kusakari; 健草苅
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 1995-08-31
Filing date: 1995-08-31
Publication date: 1997-03-11

Abstract

(57)【要約】【課題】サイコサポニンを含有する植物体からサイコサ
ポニンを効率的に提供する手段の提供。【解決手段】サイコサポニンを含有する植物体の粗抽出
物を吸着剤に接触させてサイコサポニンを吸着剤に吸着
させ、サイコサポニン以外の上記粗抽出物中の成分をこ
の吸着剤から除去した後、そのままこの吸着剤に吸着し
たサイコサポニンを溶出した天然型サイコサポニンを採
取すること；及び上記の吸着剤に吸着したサイコサポニ
ンに鉄（III）イオンを接触させてジエン構造を有する
サイコサポニンに変換し、この変換済サイコサポニンを
溶出したジエン構造を有するサイコサポニンを採取する
こと。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明の技術分野は、広範な
薬理作用を有するサイコサポニンの製造方法に属する。
より詳細には、吸着剤にサイコサポニンを一旦吸着させ
ることで収率を飛躍的に向上させ、さらには天然型サイ
コサポニンから人工型サイコサポニンであるジエン構造
を有するサイコサポニンへの変換効率をも向上させた上
記製造方法に属する。

【０００２】

【従来の技術】サイコサポニンは、セリ科の多年生植物
であるミシマサイコの根を乾燥させたものであり、古来
より解熱、解毒、鎮痛、強壮、抗炎症の要薬として使用
されてきた重要な漢方原料の一つである柴胡（サイコ）
の主要な薬理成分として知られている。このサイコサポ
ニンは、オレアナン型トリテルペノイドサポニンで、こ
れまでにａ，ｃ，ｄ，ｂ１，ｂ２等１３種類が単離され
て構造が決定されている。

【０００３】これらのサイコサポニンは、それぞれが特
徴的な薬理作用を有することが知られている。例えば、
サイコサポニンａ及びサイコサポニンｄには血清コレス
テロールの低下作用や抗炎症作用があることが知られて
いる。また、サイコサポニンｂ１及びサイコサポニンｂ
２には抗アレルギー作用や慢性肝炎に対する効果を有す
ることが知られている。そしてさらに上記した５種類の
サイコサポニン（ａ，ｃ，ｄ，ｂ１，ｂ２）はいずれも
皮膚の創傷治療効果、肌荒れ防止効果、肌荒れ改善効果
及び皮膚のたるみやつやの消失等を防止する皮膚の老化
防止効果等を有することも知られている。すなわち、こ
れらのサイコサポニンは、内服薬のみならず、外用薬の
有効成分としても極めて重要な成分である。

【０００４】しかしながら、これらのサイコサポニン
は、上記ミシマサイコの天然根中に０．５〜１．５重量
％程度しか含有されておらず、非常に高価な成分であ
り、これがサイコサポニンの汎用化を妨げる大きな要因
の一つとなっている。このサイコサポニンの活用に際し
ての課題を解決するために、バイオテクノロジー的手法
で高価なサイコサポニンを安価で大量に入手する手段が
提供されつつある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、バイオ
テクノロジー的手法でサイコサポニンを含む原材料が大
量に提供されても、精製されたサイコサポニンを効率的
に提供する手段が確立されなければ、サイコサポニンを
より広い分野での積極的な利用を図ることは困難であ
る。そこで、本発明が解決すべき課題は、サイコサポニ
ンを含有する植物体からサイコサポニンを効率的に提供
する手段を確立することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決するために、サイコサポニンの効率的な生産方法
について鋭意検討を行った。その結果、ミシマサイコの
根等のサイコサポニンを含有する植物原料の抽出物を一
旦吸着剤に吸着させて、これに様々な手段を講ずること
で、上記課題を解決し得ることを見出した。

【０００７】すなわち、本発明者は以下の発明を本願に
おいて提供するものである。まず、サイコサポニンを含
有する植物体の粗抽出物を吸着剤に接触させてサイコサ
ポニンを吸着剤に吸着させ、サイコサポニン以外の上記
粗抽出物中の成分をこの吸着剤から除去した後、この吸
着剤に吸着したサイコサポニンを溶出させて精製したサ
イコサポニンを採取する天然型サイコサポニンの製造方
法を提供する。

【０００８】さらに、サイコサポニンを含有する植物体
の粗抽出物を吸着剤に接触させてサイコサポニンを吸着
剤に吸着させ、サイコサポニン以外の上記粗抽出物中の
成分をこの吸着剤から除去した後、この吸着剤に吸着し
たサイコサポニンに鉄（III）イオンを接触させてジエ
ン構造を有するサイコサポニンに変換し、この変換済サ
イコサポニンを溶出させて精製したこのサイコサポニン
を採取するジエン構造を有するサイコサポニンの製造方
法を提供する。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態につ
いて説明する。Ａ．本発明のサイコサポニンの製造方法等（以下、本発
明方法という）は、サイコサポニンを含有する植物体の
粗抽出物を原材料とする。サイコサポニンは、上述した
経緯を有するオレアナン型トリテルペノイドサポニンで
ある。

【００１０】ここに、主要なサイコサポニンの構造式を
示す。

【化１】これらの化学式に示すように、サイコサポニンには、上
段のサイコサポニン（サイコサポニンａ，サイコサポニ
ンｃ及びサイコサポニンｄ）のように二重結合が１３位
だけのものに代表される天然物中にそのまま存在するも
のと、下段のサイコサポニン（サイコサポニンｂ１，サ
イコサポニンｈ及びサイコサポニンｂ２）のように、１
３位のみならず、１４ａ位にも二重結合があるものとが
ある。

【００１１】本発明においては、二重結合が１３位及び
１４ａ位にある型のサイコサポニンをジエン構造を有す
るサイコサポニンと呼び、このジエン構造を有するサイ
コサポニン以外のサイコサポニンを天然型サイコサポニ
ンと呼ぶ。天然型サイコサポニンは文字通り天然物中に
そのまま存在するものであるが、ジエン構造を有するサ
イコサポニンは、天然物中には存在せず、上記天然型サ
イコサポニンを人為的に変換して得られるものである。
なお、天然型のサイコサポニンａを変換して得られるジ
エン構造を有するサイコサポニンは、サイコサポニンｂ
１であり、同じくサイコサポニンｃに対してはサイコサ
ポニンｈが対応し、サイコサポニンｄに対してはサイコ
サポニンｂ２が対応する。

【００１２】本発明方法における原材料の粗抽出物を提
供する植物体は、サイコサポニンを含有し得る限りにお
いて特に限定されるものではない。例えば、ブプレウル
ム属（Bupleurum ）に属する植物、例えばミシマサイコ
（ブプレウルム・ファルカタム（Bupleurum falcatu
m Ｌ．），北柴胡（ブプレウルム・チャイニーズ（Bu
pleurum chinese ＤＣ．），ブプレウルム・コマロ
ビアナム（Bupleurum komarovianum Lincz.），狭葉
柴胡（ブプレウルム・スコルツォネラフォリウム（Bupl
eurum scorzocracfollum Willd.）等を本発明方法に
おける原材料の粗抽出物を提供する植物体として挙げる
ことができる。

【００１３】また、上記植物体において選択されるべき
部位も、サイコサポニンを含有し得る部位である限り特
に限定されない。例えば、上記ミシマサイコの場合に
は、サイコサポニンが含有されていることが知られてい
る根部を選択することが好ましい。

【００１４】さらに、これらの植物体として、天然の植
物体を選択することが可能であることは勿論であるが、
人工的に培養した植物体、例えばサイコサポニンの生成
効率を向上させるために上記植物体の特定部位を培養し
て誘導したカルスやこのカルスをさらに分化させて特定
部位の器官培養を行った植物体を用いることができる。

【００１５】また、遺伝子工学的手法、例えばサイコサ
ポニンを大量に生成させることを目的として作出した遺
伝子導入株や細胞融合株を用いることも可能である。な
お、サイコサポニンを生成する植物として好ましく用い
られるミシマサイコについて、上記植物培養に供するプ
ロトプラストは、ニコチン酸，塩酸ピリドキシン，Ｄ−
パントテン酸カルシウム，ｐ−アミノ安息香酸，塩化コ
リン，アスコルビン酸，ビタミンＡ，ビタミンＤ₃，ビ
タミンＢ₁₂，ピルビン酸ナトリウム，クエン酸，リンゴ
酸ナトリウム，フマル酸又はカザミノ酸のうち少なくと
も１種類のビタミン又は有機酸を含む培養培地中で培養
することが好ましい（特開平２−２４５１８０号公報参
照）。

【００１６】また、ミシマサイコの根の器官培養に際し
ては、この器官培養を継続してももはや実質的に側根の
数が増加しない状態になるまで、この器官培養培地の糖
類成分（シュークロース，グルコース又はフラクトース
等）の濃度を培地全体に対して２重量％未満に制限して
培養することが、この器官培養におけるサイコサポニン
の生産効率を向上させ得るという点で好ましい（特開平
５−２３０６９号公報参照）。さらに、培養培地中に、
クマリン，ｍ−ハイドロキシ安息香酸，ｏ−ハイドロキ
シフェニル酢酸，ｐ−ハイドロキシフェニル酢酸，ｏ−
クマリン酸，クロロゲン酸，フロログルシノール又はウ
ンベリフェノン等のフェノール誘導体を添加すること
も、この器官培養におけるサイコサポニンの生産効率を
向上させ得るという点において好ましい（特開平５−１
８４３７９号公報参照）。

【００１７】そして、ミシマサイコに代表されるセリ科
植物への、例えばサイコサポニン合成遺伝子等のサイコ
サポニンの生成を向上させ得る遺伝子の導入に際して
は、かかる遺伝子暗号を含むＤＮＡを遺伝子導入対象で
あるセリ科植物のプロトプラストと共存させ、電気パル
スを与えるか又は細胞融合剤を添加させることが効率的
に所望する遺伝子導入を実現し得るという点において好
ましい（特開平６−９０７７１号公報参照）。

【００１８】このようにして提供されるサイコサポニン
を含有する植物体の粗抽出物の調製は、この抽出物を得
るための通常公知の方法、例えばアルコール抽出等を用
いて行うことが可能である。なお、ここでいう粗抽出物
には植物体の破砕物由来である場合は勿論、器官培養等
の植物組織培養を行った培地由来である場合をも包含す
る。

【００１９】Ｂ．次に、調製したサイコサポニンを含有
する植物体の粗抽出物を吸着剤に接触させてサイコサポ
ニンを吸着剤に吸着させる。本発明方法において用い得
る吸着剤は、粗抽出物中のサイコサポニンをこの吸着剤
に吸着させることのみでは変質させずに、ある程度特異
的にサイコサポニンを吸着させることができる限りにお
いて特に限定されるものではない。

【００２０】なお、ここで「ある程度特異的に」という
のは、溶出条件を調節することによってサイコサポニン
を特異的に単離できる程度を意味するものである。この
条件を満たす限りサイコサポニン以外の成分をも吸着し
得る吸着剤であっても許容され得る。ただし、可能な限
り特異的にサイコサポニンを吸着し得る吸着剤であるこ
とが好ましいのは勿論である。

【００２１】前述したサイコサポニンの構造を考慮する
と、サイコサポニンはイオン的な性格が薄く、かつ比較
的極性の低い物質である。そして、このようなサイコサ
ポニンを吸着するのに好ましい吸着剤としては、イオン
結合力で物質を吸着するための官能基を持つイオン交換
樹脂ではなく、ファンデルワールス力によりサイコサポ
ニンを吸着し得る疎水性を有する素材及び構造の吸着剤
を選択することが自然であり、かつ好ましい。

【００２２】さらに、これらの吸着剤の中でも、吸着剤
表面の孔の数が少ない少孔性吸着剤よりも、この数が多
い多孔性吸着剤を選択することが、サイコサポニンの吸
着可能面積を広くすることができるという点において好
ましい。一方、サイコサポニンへの吸着力が強すぎると
溶出が困難となることから、適度なサイコサポニンへの
吸着力を示す吸着剤を選択することが肝要である。具体
的には、本発明において用い得る吸着剤としては、例え
ば、天然吸着剤であれば、活性炭等を挙げることができ
る。

【００２３】ただし、活性炭のサイコサポニンの吸着力
は非常に高いのであるが、反面サイコサポニンを溶出す
ることが困難になるという欠点がある。合成吸着剤であ
れば、例えばスチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着
剤やアクリル系の合成吸着剤を挙げることができる。ま
た、シリカゲルと疎水基を組み合わせた素材の合成吸着
剤、ポリアミドゲル、修飾デキストランゲル等を挙げる
こともできる。

【００２４】ここで、スチレン−ジビニルベンゼン系の
合成吸着剤の具体例としては、例えば三菱化学株式会社
製の芳香族系ダイヤイオンＨＰシリーズ（ＨＰ１０，Ｈ
Ｐ２０，ＨＰ２１，ＨＰ３０，ＨＰ４０，ＨＰ５０）や
オルガノ製のアンバーライトＸＡＤシリーズ（ＸＡＤ−
２，ＸＡＤ−４，ＸＡＤ−７，ＸＡＤ−８，ＸＡＤ−２
０００）を、さらに孔数が非常に多いことが特徴の三菱
化学株式会社製の芳香族系ダイヤイオンＳＰ８００シリ
ーズ（ＳＰ８００，ＳＰ８２５，ＳＰ８５０，ＳＰ８７
５）や疎水基を別途導入した同社製芳香族系修飾型ダイ
ヤイオンＳＰ２００シリーズ（ＳＰ２０５，ＳＰ２０
６，ＳＰ２０７）等を挙げることができる。

【００２５】具体的にこれらの中で、ダイヤイオンＨＰ
シリーズ、特に同ＨＰ２０が、疎水性の強度が適当であ
って、効率的にサイコサポニンを吸着することが可能で
あり、かつ溶出が容易である点で、さらに比較的安価で
多量のサイコサポニンの製造等に適するという点におい
て好ましい。なお、これらのスチレン−ジビニルベンゼ
ン系の合成吸着剤は、一般に非極性であり、溶剤の選択
により所望するサイコサポニンの溶出効率が大きく左右
される。

【００２６】アクリル系の合成吸着剤としては、例えば
三菱化学株式会社製のダイヤイオンＨＰＭＧシリーズを
挙げることができる。

【００２７】シリカゲルと疎水基を組み合わせた素材の
合成吸着剤としては、例えばミニカラムフェニル（フェ
ニル基導入：Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製）やオクタデシル
基を疎水基として導入したＯＤＳカラム等を挙げること
ができる。この種の吸着剤も、本発明に適用するに好ま
しい吸着剤ではあるが、現状では一般に高価な傾向があ
るので、サイコサポニンの大量生産を図るには困難な面
があることは否定できない。

【００２８】修飾デキストランゲルとしては、例えばセ
ファデックス（Sephadex）ＬＨ−２０（ファルマシア社
製）を挙げることができる。

【００２９】調製した粗抽出物と上記吸着剤の接触方法
は、特に限定されず、カラム式処理もバッチ式処理も共
に用いることが可能である。また、用いる吸着剤と上記
で調製した粗抽出物との量比も本発明方法において、非
常に大きな影響を与える。すなわち、吸着剤に対して接
触させる粗抽出物の量が過剰であれば、粗抽出物中のサ
イコサポニンが吸着剤に吸着されきれず、試料が無駄に
なることになる。また、吸着剤の量が過剰であれば、溶
出時間が必要以上に長くなり、所望するサイコサポニン
の製造効率上好ましくない。

【００３０】具体的な用いる吸着剤と上記で調製した粗
抽出物との量比の好適な範囲は、用いる吸着剤のサイコ
サポニンの吸着効率と粗抽出物中のサイコサポニンの含
有比率に応じて変わり得るものであり、一概に律するこ
とはできないが、例えば、前述のスチレン−ジビニルベ
ンゼン系の合成吸着剤（三菱化学株式会社製ダイヤイオ
ンＳＰ８００やＳＰ２００のような特別な処理なし）を
吸着剤として用いる場合には、この吸着剤とサイコサポ
ニンが容量対重量で５０：１〜５００：１程度であるこ
とが好ましい。

【００３１】Ｃ．次に、サイコサポニン以外の上記粗抽
出物中の成分をサイコサポニンを吸着させた吸着剤から
の除去を行う。かかる除去方法は、特に限定されず通常
公知の吸着剤の洗浄方法を用いることで行うことができ
る。なお、この洗浄過程に用いる洗浄液も、吸着したサ
イコサポニンを溶出し得るものでなく、かつこのサイコ
サポニンの構造を変質させ得るものでない限りは特に限
定されない。この洗浄液は、用いた吸着剤の種類に応じ
て適宜選択することができる。

【００３２】Ｄ．天然型サイコサポニンからジエン構造
を有するサイコサポニンへの変換を行う場合には、上記
の工程を経て吸着剤上に吸着した天然型サイコサポニン
に鉄（III）イオンを接触させて天然型からジエン構造
を有するに変換する。ここで、鉄（III）イオンを吸着
剤上に吸着した天然型サイコサポニンに接触させる手段
としては、鉄（III）塩溶液等の鉄（III）イオンの溶液
を直接この天然型サイコサポニンに接触させる方法を挙
げることができる。この鉄（III）塩としては、例えば
塩化鉄（ＦｅＣｌ₃）等を挙げることができる。

【００３３】なお、吸着剤として非極性の素材の吸着剤
を用いる場合には、鉄（III）イオンの水溶液を接触媒
体として用いても、この水溶液と吸着剤との馴染みが悪
く、効率的な変換を期待することができない。そこで、
この場合には、例えば水よりも極性の低いメタノール水
等を鉄（III）イオンのキャリアとして用いて鉄（III）
イオンと天然型サイコサポニンとの接触を図ることが好
ましい。

【００３４】また、鉄（III）イオンの溶液の濃度は、
概ね４０重量％程度が好ましく、また、この鉄（III）
イオンと吸着剤との接触時間は１０分〜２００分程度が
好ましく、３０分〜６０分程度が特に好ましい。この、
変換工程によって、上述したように、サイコサポニンａ
がサイコサポニンｂ１に変換され、サイコサポニンｃが
サイコサポニンｈに変換し、サイコサポニンｄがサイコ
サポニンｂ２に変換する。

【００３５】Ｅ．最後に、吸着剤に吸着した、天然型サ
イコサポニン又は上記の変換工程において変換したジエ
ン構造を有するサイコサポニンを吸着剤から溶出させ
る。この溶出条件は、吸着した上記サイコサポニンを変
質させずに効率的に溶出可能な限りにおいて特に限定さ
れず、用いた吸着剤の種類に応じて適宜選択することが
できる。

【００３６】例えば、非極性の素材の吸着剤を用いた場
合には、水よりも溶出力の強い溶出液、例えばエタノー
ル，２−プロパノール，アセトン，メタノール等の非極
性溶媒を主体にした溶出液を選択することが好ましい。
このように、上記溶出工程により、天然型サイコサポニ
ン又は上記の変換工程において変換したジエン構造を有
するサイコサポニンの粗精製物を得ることができる。か
かる粗精製物から所望する種類のサイコサポニンを製造
するには、通常公知の方法を採ることができる。

【００３７】例えば、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ），遠心液液分配クロマトグラフィー（ＣＰＣ）
等によって、所望する種類のサイコサポニンを精製単離
することが可能である。なお、各々のサイコサポニンの
検出は、ＵＶ２１０nmで行うことができる。また、各々
のサイコサポニンに分別せず、上記粗精製物を天然型サ
イコサポニン又はジエン構造を有するサイコサポニンと
して精製する場合においては、例えば再結晶法等のより
簡便な方法による精製で足る。具体的な手順について
は、後述の実施例２において記載する。

【００３８】

【実施例】以下、実施例等を用いて本発明をより具体的
に説明する。しかしながら、これらの実施例等が本発明
の技術的範囲を限定するものではないことは勿論であ
る。なお、本明細書に開示した実施例において、アルコ
ール等の溶媒は、市販の特級試薬の原液を１００％とし
て扱っている。すなわち、本明細書に開示した実施例に
おいて、例えば１００％エタノールとは、市販の特級エ
タノールの原液を意味するものであり、７０％メタノー
ルとは、市販の特級メタノールを７０％に希釈したメタ
ノール水のことを意味する。

【００３９】〔参考例〕ミシマサイコの根の器官培養ブプレウルム・ファルカタム（Bupleurum falcatum
）Ｌ．の種子を７０％エタノール中に３０秒、次いで
２％次亜塩素酸ナトリウム中に３０分間浸漬して滅菌を
行い、滅菌水で洗浄した後、０．２％ジェランガムで固
化したリンスマイヤー・スクーグ培地（ＬＳ培地：ＫＮ
Ｏ₃ 1900（mg／l 以下同様），Ｎａ₄ＮＯ₃ 1650，Ｍ
ｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 370 ，ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ 44
0 ，ＫＨ₂ＰＯ₄ 170，ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ 22.3,
ＫＩ 0.83, Ｈ₃ＢＯ₃6.2, ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
8.6, ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ 0.025, Ｎａ₂Ｍｏ₄・
２Ｈ₂Ｏ 0.25, ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ 0.025, Ｆｅ
ＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ₂ 27.86, Ｎａ₂ＥＤＴＡ 37.26,
ミオ-イノシトール 100, チアミン-ＨＣｌ 0.4, ショ
糖 30000, ｐＨ５．８）で発芽させて無菌的に生育させ
た。この無菌的に生育させた植物体の根部を切取り、こ
れをインドール酪酸を０．１mg／ml含む上記と同様の組
成のＬＳ固形培地上で培養したところ、カルスの増殖が
確認され、このカルスに不定根の分化が認められた。そ
こで、この不定根部分を切取り、インドール酪酸を８pp
m 添加しＧａｍｂｏｒｇの培地（Ｂ５培地：ＫＮＯ₃ 3
000（mg／l 以下同様），（Ｎａ₄)₂ＳＯ₄134, ＭｇＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ 500,ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ 150, Ｎ
ａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ 150, ＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ 10,
ＫＩ 0.75, Ｈ₃ＢＯ₃3, ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 2,
ＣｕＳＯ₄ 0.025, Ｎａ₂Ｍｏ₄・２Ｈ₂Ｏ 0.25, Ｃ
ｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ 0.025, セクエストレン３３０Ｆ'e
28, ミオ-イノシトール 100, チアミン-ＨＣｌ 1
0,ニコチン酸 1, ピリドキシン-ＨＣｌ，ショ糖 1000
0，ｐＨ５．５）を調製し、この調製培地を４００mlを
１l 容の三角フラスコ中に入れて、オートクレーブ滅菌
を行った後、上記培養根を２g この調製培地に接種し、
２６℃位暗所下で培養を行った。２週間目に５０％ショ
糖溶液を４８ml補充した。そして、培養開始から６週間
後に培養根を回収した。

【００４０】〔実施例１〕天然型サイコサポニンの製造（１）上記参考例において器官培養を行った培養根を凍
結乾燥し、この凍結乾燥した培養根４０g をミルで粉砕
した。この粉砕試料に３０倍量（ｖ／ｗ）の０．５％Ｋ
ＯＨ含有の７５％のメタノールを加えて２４時間室温で
抽出を行い、ナイロンメッシュ（80μm)で抽出物を濾過
して、サイコサポニンを含有する植物体の粗抽出物とし
て上記培養根の抽出液を調製した。

【００４１】（２）本発明方法を実施する前提として、
上記参考例において器官培養を行った培養根中のサイコ
サポニンの定量を行った。すなわち、上記（１）冒頭に
記載した培養根の凍結乾燥粉砕物０．１g に対して０．
５％ＫＯＨを含む９０％メタノール３mlを添加して４８
時間振とう抽出し、遠心分離（１００００rpm ）後、上
清をＨＰＬＣ（ＬＣ１００Ｗ／Ｆ，横河電気株式会社
製）で定量した。このＨＰＬＣ分析においては、カプセ
ルパックＣ１８（４Φ×２５０mm）カラム（株式会社資
生堂製）を用い、アセトニトリル水（アセトニトリル：
水＝４：６）を流速１ml／分で流し、ＵＶ２１０nmでの
サイコサポニンの検出を行った。

【００４２】その結果、０．１g の上記凍結乾燥粉砕物
中には、サイコサポニンａが１．０mg，サイコサポニン
ｄが１．２mg，サイコサポニンｃが０．３mg含有されて
いることが判明した。

【００４３】（３）次に、吸着剤として、ダイヤイオン
ＨＰ−２０（三菱化学株式会社製）のオープンカラム又
はバッチを用いて天然型サイコサポニンの製造を行っ
た。すなわち、ダイヤイオンＨＰ−２０を１００ml容の
オープンカラムに充填し、これに上記（１）で調製した
抽出液１．２l に水２．４l を添加したものをＳＶ６
（１時間に吸着剤の６倍の体積量）の速度でアプライし
てサイコサポニンのカラムにおける吸着を行った。さら
に、抽出液（上記と同様に、抽出液１．２l に水２．４
l を添加した溶液）にＨＰ−２０を３００ml添加して攪
拌し、バッチにおける吸着を行った。次に、抽出液を接
触させてサイコサポニンを吸着させた吸着剤を、２５％
メタノールで洗浄して、未吸着物を除去した。

【００４４】次に、洗浄済吸着剤にサイコサポニンの溶
出液を接触させて、所望する天然型サイコサポニンの溶
出を行った。溶出液としては、カラムにおいては、１０
０％メタノール，１００％エタノールを用い、バッチに
おいては、１００％メタノール，１００％エタノール，
１００％２−プロパノール，７０％アセトンを用いた。
各々の方法で得られた溶出液（サイコサポニン粗精製
物）を減圧乾固したものについてＨＰＬＣでサイコサポ
ニンを定量したところ、カラム法による場合において
は、サイコサポニンａ，サイコサポニンｄ，サイコサポ
ニンｃがそれぞれ３８０mg，４７０mg，１００mg分取さ
れた。

【００４５】また、バッチ法による場合においては、サ
イコサポニンａ，サイコサポニンｄ，サイコサポニンｃ
がそれぞれ３２０mg，４００mg，８４mg分取された。な
お、溶出液として、１００％メタノールを用いた場合と
１００％エタノールを用いた場合とでは回収率（サイコ
サポニン粗精製物中のサイコサポニン量／サイコサポニ
ン含有植物の粗抽出物中のサイコサポニン量）の差は見
られなかった。この実施例１において、本発明方法によ
れば効率的にサイコサポニンを含有する植物体から効率
的に精製されたサイコサポニンを得ることが可能である
ことが明らかになった。

【００４６】〔実施例２〕ジエン構造を有するサイコサ
ポニンの製造（１）実施例１と同じく洗浄工程まで行ったカラムに吸
着させたサイコサポニンを天然型からジエン構造を有す
るサイコサポニンへの変換を行った。なお、この実施例
においては、天然型サイコサポニンからジエン構造を有
するサイコサポニンへの変換効率をより明らかにするた
めに、実施例１で用いたミシマサイコの根の抽出液の他
に、サイコサポニンａの標準品を単独で１０mg、並びに
サイコサポニンａ及びサイコサポニンｄ（共にナカライ
テスク社製）の標準品をそれぞれ１０mgずつ、実施例１
と同様の工程を経て吸着剤に吸着後（吸着剤とサイコサ
ポニンの量比は、抽出液の場合と同一に設定した）、洗
浄を行って、これらについても天然型からジエン構造を
有するサイコサポニンへの変換を行った。

【００４７】すなわち、これらの洗浄サイコサポニン吸
着済吸着剤にこの吸着剤の２倍容量の４０％のＦｅＣｌ
₃水溶液を、ＳＶ３で添加して、室温下４０分間放置し
て接触させた。また、蒸留水並びに２０％，４０％及び
５０％のメタノール水溶液をもとに調製した４０％のＦ
ｅＣｌ₃溶液（以下、メタノール水溶液にＦｅＣｌ₃を
溶解させた溶液を、ＦｅＣｌ₃メタノール溶液という）
についても、同様に室温下４０分間のサイコサポニン吸
着済吸着剤との接触を行った。なお、ＦｅＣｌ₃メタノ
ール溶液中のメタノール含量を５０％まで上げた場合
は、目的とするサイコサポニンがＦｅＣｌ₃と共に一部
脱着溶出することが観察された。

【００４８】次に、これらの４０％のＦｅＣｌ₃溶液で
天然型サイコサポニンからジエン構造を有するサイコサ
ポニンへの変換を行った吸着剤において、２５％メタノ
ール水溶液で吸着剤上に残ったＦｅＣｌ₃を洗い流した
後に、様々な溶出液と接触させることにより、所望する
ジエン構造を有するサイコサポニンの溶出を行った。

【００４９】その結果、４０％ＦｅＣｌ₃溶液を調製す
るための溶媒が水のときの回収率（サイコサポニンｂ₁
／サイコサポニンａ×１００）は、せいぜい６５％程度
であり、必ずしも優れたものではなかった（図１）。こ
れは、ダイヤイオンＨＰ−２０は樹脂表面の極性が低い
ために、ＦｅＣｌ₃水溶液との馴染みが悪く、このこと
が、例えばＦｅＣｌ₃と樹脂上の天然型サイコサポニン
とが十分に接触せず、未変換の天然型サイコサポニンが
残存し易くなる等により、天然型サイコサポニンからジ
エン構造を有するサイコサポニンへの変換効率に悪影響
を与えるものと推測される。

【００５０】これに対して、４０％ＦｅＣｌ₃溶液調製
用溶媒としてメタノール水を用いると回収率（同上）が
向上し、４０％メタノール水を溶液調製用溶媒として用
いた群では、８０％以上まで回収率（同上）が向上した
（図１）。なお、１００％エタノール又は１００％メタ
ノールを溶出液として用いた群が、サイコサポニンの回
収率が良好であることも判明した。このようにして、Ｈ
Ｐ−２０より溶出したサイコサポニンｂ１及びサイコサ
ポニンｂ２画分を、エバポレーターを用いて減圧乾固し
た。

【００５１】なお、吸着剤としてＯＤＳを用いた場合
は、上と同じ工程を経て４０％ＦｅＣｌ₃水溶液を用い
てもジエン構造を有するサイコサポニンの回収率（同
上）は約９０％であり良好であった（図示せず）が、現
時点では一般的にＯＤＳに代表されるシリカゲルと疎水
性基を組み合わせた吸着剤は高価であり、汎用性に問題
があることは否めない。

【００５２】また、アンバーライトＸＡＤ−２（オルガ
ノ社製）を吸着剤として同様の工程を行ったが、サイコ
サポニンを十分に吸着することが出来なかった。さら
に、活性炭を吸着剤として同様の工程を行ったが、この
場合は、サイコサポニンは十分吸着されたが、吸着力が
強すぎて溶出を十分に行うことが出来なかった。

【００５３】（２）さらに、吸着剤であるダイヤイオン
ＨＰ−２０を、上記（１）と同様のサイコサポニンの標
準品及び抽出液に対して、１．５倍に容量を増量変更し
て充填したオープンカラムで変換条件を検討した。図２
は、４０％ＦｅＣｌ₃溶液調製用溶媒としてのメタノー
ル水におけるメタノール濃度を３０％と４５％に設定し
てジエン構造を有するサイコサポニンへの変換効率を検
討した結果を示したグラフ（溶出液としては１００％メ
タノールを使用）である。この図から４０％ＦｅＣｌ₃
溶液調製用溶媒として４５％メタノール水を選択した群
が、サイコサポニンの標準品及び抽出液の両者に関し
て、ジエン構造を有するサイコサポニンの優れた回収率
を示すことが判明した（回収率は、サイコサポニンｂ
１：サイコサポニンｂ１／サイコサポニンａ×１００，
サイコサポニンｂ２：サイコサポニンｂ２／サイコサポ
ニンｄ×１００で計算）。

【００５４】（３）そして最後に、上記の工程（２）に
より得られた減圧乾固物をその倍量程度の１００％メタ
ノールで溶解後、これにイソプロピルエーテルを、添加
した１００％メタノールの１０〜５０倍量添加すること
により、ジエン構造を有するサイコサポニン（サイコサ
ポニンｂ１及びサイコサポニンｂ２）の再結晶を行っ
た。かかるサイコサポニンの結晶を濾過及び乾燥して所
望するジエン構造を有するサイコサポニンの精製品を得
た。

【００５５】上記実施例２に示したＦｅＣｌ₃による変
換法は、従来から天然型サイコサポニンからジエン構造
を有するサイコサポニンへの変換手段として知られてい
る、酸と天然型サイコサポニンとを接触させる方法に比
べて、所望するジエン構造を有するサイコサポニン以外
の副産物も生じにくく、さらに抽出物中のサイコサポニ
ンを吸着剤に一旦吸着させることにより、未吸着成分
（不純物）を予め反応系から容易に除去することができ
る。また、所望するジエン構造を有するサイコサポニン
を、抽出液に比べると３〜４倍濃縮して回収することが
可能であり、溶出液を容易に濃縮し易いエタノール又は
メタノール等の溶媒とすることが可能である等の利点を
有する。なお、ここに示した実施例について、経済性も
考慮した最適な本発明方法の一実施態様を図３のフロー
シートに示した。

【００５６】

【発明の効果】本発明により、サイコサポニンを含有す
る植物体からサイコサポニンを効率的に提供する手段が
提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＦｅＣｌ₃溶液としてＦｅＣｌ₃水溶液又は各
種濃度のメタノール溶液を用いた群におけるサイコサポ
ニンの回収率を示した図面である。

【図２】ＦｅＣｌ₃溶液調製用溶媒としてのメタノール
水におけるメタノール濃度を３０％と４５％に設定して
ジエン構造を有するサイコサポニンへの変換効率を検討
した結果を示した図面である。

【図３】本発明方法の一実施態様を示すフローシート図
面である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サイコサポニンを含有する植物体の粗抽出
物を吸着剤に接触させてサイコサポニンを吸着剤に吸着
させ、サイコサポニン以外の上記粗抽出物中の成分をこ
の吸着剤から除去した後、この吸着剤に吸着したサイコ
サポニンを溶出させて採取する天然型サイコサポニンの
製造方法。
【請求項２】サイコサポニンを含有する植物体の粗抽出
物を吸着剤に接触させてサイコサポニンを吸着剤に吸着
させ、サイコサポニン以外の上記粗抽出物中の成分をこ
の吸着剤から除去した後、この吸着剤に吸着したサイコ
サポニンに鉄（III）イオンを接触させてジエン構造を
有するサイコサポニンに変換し、この変換済サイコサポ
ニンを溶出させて採取するジエン構造を有するサイコサ
ポニンの製造方法。
【請求項３】鉄（III）イオンが鉄（III）塩由来のイオ
ンである請求項２記載のサイコサポニンの製造方法。
【請求項４】鉄（III）塩がＦｅＣｌ₃である請求項３
記載のサイコサポニンの製造方法。
【請求項５】鉄（III）イオンを水又はメタノール水を
キャリアとして用いて、吸着剤に吸着したサイコサポニ
ンに接触させる請求項２乃至請求項４記載のサイコサポ
ニンの製造方法。
【請求項６】メタノール水が４０％メタノール水である
請求項５記載のサイコサポニンの製造方法。
【請求項７】鉄（III）イオンとサイコサポニンとの接
触時間が、１０分乃至２００分である請求項２乃至請求
項６のいずれかの請求項記載のサイコサポニンの製造方
法。
【請求項８】鉄（III）イオンとサイコサポニンとの接
触時間が、３０分乃至６０分である請求項２乃至請求項
６のいずれかの請求項記載のサイコサポニンの製造方
法。
【請求項９】鉄（III）イオンとサイコサポニンとの接
触を、ＳＶ３で４０分行う請求項２乃至請求項８のいず
れかの請求項記載のサイコサポニンの製造方法。
【請求項１０】サイコサポニンの吸着剤への吸着条件が
ＳＶ６である請求項１又は請求項２記載のサイコサポニ
ンの製造方法。
【請求項１１】吸着剤に吸着したサイコサポニンを溶出
させるサイコサポニンの溶出液が、エタノール、２−プ
ロパノール、アセトン及びメタノールからなる群のアル
コールのうち１種又は２種以上を含む請求項１乃至請求
項１０記載のサイコサポニンの製造方法。
【請求項１２】吸着剤に吸着したサイコサポニンを溶出
させるサイコサポニンの溶出液が、１００％メタノール
又は１００％エタノールである請求項１１記載のサイコ
サポニンの製造方法。
【請求項１３】サイコサポニンを含有する植物体が、ブ
プレウルム属（Bupleurum ）に属する植物の植物体であ
る請求項１乃至請求項１２のいずれかの請求項記載のサ
イコサポニンの製造方法。
【請求項１４】ブプレウルム属に属する植物が、ミシマ
サイコ（ブプレウルム・ファルカタム（Bupleurum f
alcatum Ｌ．））、北柴胡（ブプレウルム・チャイニ
ーズ（Bupleurum chinese ＤＣ．））、ブプレウル
ム・コマロビアナム（Bupleurum komarovianum Linc
z.）及び狭葉柴胡（ブプレウルム・スコルツォネラフォ
リウム（Bupleurum scorzocracfollum Willd.））か
らなる群から選ばれるブプレウルム属に属する植物であ
る請求項１３記載のサイコサポニンの製造方法。
【請求項１５】サイコサポニンを含有する植物体が、ミ
シマサイコ（ブプレウルム・ファルカタム（Bupleurum
falcatum Ｌ．））の根部である請求項１３記載の
サイコサポニンの製造方法。
【請求項１６】サイコサポニンを含有する植物体が、天
然の植物体である請求項１乃至請求項１２のいずれかの
請求項記載のサイコサポニンの製造方法。
【請求項１７】サイコサポニンを含有する植物体が、人
工的に培養した植物体である請求項１乃至請求項１２の
いずれかの請求項記載のサイコサポニンの製造方法。
【請求項１８】サイコサポニンを含有する植物体が、遺
伝子工学的手法を用いて得た植物体である請求項１乃至
請求項１２のいずれかの請求項記載のサイコサポニンの
製造方法。
【請求項１９】人工的に培養した植物体が、植物体の特
定部位を培養して誘導したカルス又はこのカルスをさら
に分化させて器官培養を行って得た植物体である請求項
１７記載のサイコサポニンの製造方法。
【請求項２０】遺伝子工学的手法を用いて得た植物体
が、遺伝子導入株又は細胞融合株である請求項１８記載
のサイコサポニンの製造方法。
【請求項２１】請求項１７又は請求項１９記載のサイコ
サポニンの製造方法において、サイコサポニンを含有す
る植物体がミシマサイコ（ブプレウルム・ファルカタム
（Bupleurum falcatum Ｌ．））の植物体であり、
かつこの植物体のプロトプラストの培養に供する培地
が、ニコチン酸，塩酸ピリドキシン，Ｄ−パントテン酸
カルシウム，ｐ−アミノ安息香酸，塩化コリン，アスコ
ルビン酸，ビタミンＡ，ビタミンＤ₃，ビタミンＢ₁₂，
ピルビン酸ナトリウム，クエン酸，リンゴ酸ナトリウ
ム，フマル酸又はカザミノ酸のうち少なくとも１種類の
ビタミン又は有機酸を含むサイコサポニンの製造方法。
【請求項２２】請求項１７又は請求項１９記載のサイコ
サポニンの製造方法において、クマリン，ｍ−ハイドロ
キシ安息香酸，ｏ−ハイドロキシフェニル酢酸，ｐ−ハ
イドロキシフェニル酢酸，ｏ−クマリン酸，クロロゲン
酸，フロログルシノール及びウンベリフェノンからなる
群のフェノール誘導体を１種又は２種以上添加した培養
培地を用いるサイコサポニンの製造方法。
【請求項２３】請求項１８又は請求項２０記載のサイコ
サポニンの製造方法において、サイコサポニンの生成を
向上させ得る遺伝子の導入に際して、かかる遺伝子暗号
を含むＤＮＡを遺伝子導入対象である植物体のプロトプ
ラストと共存させ、電気パルスを与えるか又は細胞融合
剤を添加させるサイコサポニンの製造方法。
【請求項２４】請求項１９記載のサイコサポニンの製造
方法において、植物体の特定部位がミシマサイコ（ブプ
レウルム・ファルカタム（Bupleurum falcatum
Ｌ．））の根部であり、かつ器官培養培地のシュークロ
ース、グルコース若しくはフラクトースの濃度を、器官
培養を継続してももはや実質的に根部の数が増加しない
状態になるまで、上記培地全体に対して２重量％未満と
するサイコサポニンの製造方法。
【請求項２５】サイコサポニンを含有する植物体の粗抽
出物が、この植物体をアルコール抽出して得られる粗抽
出物及び／又はこの植物体の組織培養を行った培地由来
の粗抽出物である請求項１乃至請求項２４のいずれかの
請求項記載のサイコサポニンの製造方法。
【請求項２６】請求項２５記載のサイコサポニンの製造
方法において、サイコサポニンを含有する植物体の粗抽
出物の抽出用溶媒がメタノールを含むサイコサポニンの
製造方法。
【請求項２７】吸着剤が、ある程度特異的にサイコサポ
ニンを吸着することができる吸着剤である請求項１乃至
請求項２６のいずれかの請求項記載のサイコサポニンの
製造方法。
【請求項２８】吸着剤がファンデルワールス力によりサ
イコサポニンを吸着させることのできる吸着剤である請
求項２７記載のサイコサポニンの製造方法。
【請求項２９】吸着剤が多孔性吸着剤である請求項２７
又は請求項２８記載のサイコサポニンの製造方法。
【請求項３０】吸着剤が活性炭である請求項１７又は請
求項１８記載のサイコサポニンの製造方法。
【請求項３１】吸着剤が、スチレン−ジビニルベンゼン
系の合成吸着剤、アクリル系の合成吸着剤、シリカゲル
と疎水基を組み合わせた素材の合成吸着剤、ポリアミド
ゲル及び修飾デキストランゲルからなる群の合成吸着剤
のいずれかの吸着剤である請求項２７乃至請求項２９の
いずれかの請求項記載のサイコサポニンの製造方法。
【請求項３２】スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸
着剤が、三菱化学株式会社製の芳香族系ダイヤイオンＨ
Ｐシリーズ（ＨＰ１０，ＨＰ２０，ＨＰ２１，ＨＰ３
０，ＨＰ４０，ＨＰ５０）、オルガノ製のアンバーライ
トＸＡＤシリーズ（ＸＡＤ−２，ＸＡＤ−４，ＸＡＤ−
７，ＸＡＤ−８，ＸＡＤ−２０００）、三菱化学株式会
社製の芳香族系ダイヤイオンＳＰ８００シリーズ（ＳＰ
８００，ＳＰ８２５，ＳＰ８５０，ＳＰ８７５）、三菱
化学株式会社製の芳香族系修飾型ダイヤイオンＳＰ２０
０シリーズ（ＳＰ２０５，ＳＰ２０６，ＳＰ２０７）か
らなる群のスチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着剤
のいずれかの合成吸着剤である請求項３１記載のサイコ
サポニンの製造方法。
【請求項３３】アクリル系の合成吸着剤が、三菱化学株
式会社製のダイヤイオンＨＰＭＧシリーズである請求項
３１記載のサイコサポニンの製造方法。
【請求項３４】シリカゲルと疎水基を組み合わせた素材
の合成吸着剤が、ミニカラムフェニル（フェニル基導
入：Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製）又はオクタデシル基を疎
水基として導入したＯＤＳである請求項３１記載のサイ
コサポニンの製造方法。
【請求項３５】修飾デキストランゲルが、ファルマシア
社製のセファデックスＬＨ−２０である請求項３１記載
のサイコサポニンの製造方法。
【請求項３６】請求項２７乃至請求項３５のいずれかの
請求項記載のサイコサポニンの製造方法において、サイ
コサポニンを含有する植物体の粗抽出物の吸着剤への吸
着方法がカラム式であるサイコサポニンの製造方法。
【請求項３７】請求項２７乃至請求項３５のいずれかの
請求項記載のサイコサポニンの製造方法において、サイ
コサポニンを含有する植物体の粗抽出物の吸着剤への吸
着方法がバッチ式であるサイコサポニンの製造方法。
【請求項３８】吸着剤が、多孔性処理が行われていない
スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着剤である場合
において、この吸着剤とサイコサポニンを、容量対重量
比で５０対１乃至５００対１（サイコサポニン対吸着
剤）の割合で接触させる請求項３１記載のサイコサポニ
ンの製造方法。
【請求項３９】請求項１乃至請求項３８のいずれかの請
求項記載のサイコサポニンの製造方法において、サイコ
サポニンを含有する植物体の粗抽出物中のサイコサポニ
ン以外の成分の吸着剤からの除去手段が、洗浄液による
洗浄であるサイコサポニンの製造方法。
【請求項４０】洗浄液が、２５％メタノールである請求
項３９記載のサイコサポニンの製造方法。
【請求項４１】請求項１乃至請求項４０記載のサイコサ
ポニンの製造方法において、吸着剤から溶出させたサイ
コサポニンの粗精製液を高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）若しくは遠心液液分配クロマトグラフィー
（ＣＰＣ）によって、サイコサポニンを分別して採取す
るサイコサポニンの製造方法。
【請求項４２】請求項１乃至請求項４０記載のサイコサ
ポニンの製造方法において、吸着剤から溶出させたサイ
コサポニンの粗精製液を再結晶させて、天然型サイコサ
ポニン又はジエン構造を有するサイコサポニンを分別し
て採取するサイコサポニンの製造方法。
【請求項４３】サイコサポニンの粗精製液の減圧乾固物
をその倍量程度の１００％メタノールで溶解後、これに
イソプロピルエーテルを、添加した１００％メタノール
の１０〜５０倍量添加して、ジエン構造を有するサイコ
サポニンの再結晶を行う請求項４２記載のサイコサポニ
ンの製造方法。