JPH09288080A - 遺伝子の電気化学的検出法およびその装置 - Google Patents
遺伝子の電気化学的検出法およびその装置Info
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- JPH09288080A JPH09288080A JP8102957A JP10295796A JPH09288080A JP H09288080 A JPH09288080 A JP H09288080A JP 8102957 A JP8102957 A JP 8102957A JP 10295796 A JP10295796 A JP 10295796A JP H09288080 A JPH09288080 A JP H09288080A
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Abstract
と 【解決手段】導電性の物質で修飾されたDNAプローブ
が固定された電極と、DNAを含む試料とをインターカ
レータ存在下に反応させ、該DNAプローブとDNAと
のハイブリッドDNAを形成させる、該反応後の電極の
電流を検出および/または測定する。
Description
置、および検出方法に関する。
ては、特定の配列を有するDNAを検出する手段とし
て、ハイブリダイゼーション方法が用いられている。
リダイゼーションが一般的に用いられている。このサザ
ンハイブリダイゼーションは一般的には、まず、被験D
NAを1種類以上の制限酵素でフラグメントとした後、
ゲル電気泳動にかけてサイズによって分離する。次に被
験DNAを一本鎖DNAに変性した後、ナイロン・フィ
ルターまたはニトロセルロース・ぺーパーに固定化す
る。そして、この変性された一本鎖DNAと、放射性同
位元素(以下、RIという)でラベルされた塩基対を形
成する相補的な一本鎖DNA(以下、DNAプローブと
いう)とをハイブリダイズさせて、フィルター(ニトロ
セルロースペーパー)を洗浄する。洗浄後、上記フィル
ター(ニトロセルロースペーパー)をオートラジオグラ
フにかけ、現像することによって、プローブDNAとハ
イブリダイズする特定の配列を有するDNAが検出され
る。
ダイゼーションなどの従来法は、標識として放射性同位
元素用いるため、放射性物質取扱施設とその維持管理に
多大な費用と労力を要するばかりでなく、研究者の健康
上の安全も保証されない。またオートラジオグラフィー
でバンドとして検出するためには24時間以上の時間を要
する。さらに、被験DNA量が少ない場合には、フィル
ムを感光させるためには長時間の曝露が必要であり、ま
たバンドの輪郭が不明瞭となる問題点がある。
て、RIの代わりに蛍光物質をプローブの標識とする方
法も提案されている。この方法は安全性と迅速さにおい
ては、RIに優るが、励起光による褪色が起こること、
測定には専用の蛍光測定装置が必要であること、さらに
蛍光の内部消光のために一定量以上の蛍光物質をプロー
ブとして導入することは困難であること、などの欠点を
有している。また、近年、発光にてDNAを検出する方
法も実用化されてきたが蛍光法と同様に専用測定装置が
必要である。
ているが、いずれも、特定の遺伝子配列の有無を検出す
るためには、検体から取り出したDNAを制限酵素でフ
ラグメント化したのち、電気泳動等の手法により、サイ
ズにより分画し、被験DNAをニトロセルロースペーパ
ー等に固定化せねばならず煩雑であるという問題点は、
未解決である。
点を解決することを目的としてなされたものであり、検
体のDNAを断片化することなく、特定の配列を有する
DNA配列を検出する方法および装置を提供することに
ある。
極表面に固定化し、溶液系でインターカレータの存在
下、被験DNAとプローブDNAとの相補的二本鎖DN
Aを形成させ、形成された二本鎖DNAの検出を、電極
の電流変化を電気化学的シグナルとして検出および/ま
たは測定する発明に関する。
DNAを検出する方法であって、導電性の物質で修飾さ
れたDNAプローブが固定された電極と、DNAを含む
試料とをインターカレータ存在下に反応させ、該DNA
プローブとDNAとのハイブリッドDNAを形成させる
工程;および、該反応後の電極の電流を検出および/ま
たは測定する工程;を有する、方法に関する。
を洗浄する工程を含む。
質が酸化還元活性を有する化合物である。さらに好まし
くは、前記化合物がフェロセンである。
ンターカレータが、フェロセン修飾縫い込み型インター
カレータである。縫い込み型インターカレータとは、D
NAへのインターカレーション時に二つの置換基が主溝
にそれぞれ突き出した複合体を形成する薬剤である。従
って、縫い込み型インターカレータがDNAからはずれ
る時、置換基の一つがストッパーとして働く。これによ
って二本鎖核酸からの解離は極めて遅い。一本鎖ではこ
のようなことが起こらないため素早く解離する。従っ
て、縫い込み型インターカレータが好適に用いられ得
る。
DNAを検出する装置に関し、導電性の物質で修飾され
たDNAプローブが固定された電極;該電極に固定され
たDNAプローブとDNAを含む試料とをインターカレ
ータ存在下に反応させ、ハイブリッドDNAを形成させ
る手段;および、該反応後の電極の電流を検出および/
または測定する手段;とを有する、装置に関する。
を洗浄する手段を有する。
質が酸化還元活性を有する化合物であり、好ましくは、
酸化還元活性を有する化合物がフェロセンである。
カレータがフェロセン修飾縫い込み型インターカレータ
である。
いられる電極としては、核酸を固定できるものであれば
いづれをも使用し得る。好適には金、グラシーカーボ
ン、炭素などが挙げられる。
導電性を有する物質であればいずれもが用いられ得る。
特に酸化−還元活性を有する物質が好ましい。フェロセ
ン、カテコールアミン、金属ビピリジン錯体、金属フェ
ナンスリン錯体、ビオローゲンが好ましく、特にフェロ
センが好ましい。
出したDNAを制限酵素で切断し、電気泳動による分離
などで精製したDNA、あるいは化学合成したDNAの
いずれもが用いられ得る。プローブDNAの配列はあら
かじめ決定しておくことが好ましい。DNA配列決定法
は周知である。
せるために、5’あるいは3’末端が例えばアミノ基で
修飾され得る。導電性の物質とDNAとの結合は、当業
者に公知の方法が用いられ得る。5’末端にアミノ基が
導入されたDNAとフェロセンとを例に挙げて説明する
と、DNAを適当な緩衝液(例えば、炭酸ナトリウム−
炭酸水素ナトリウム緩衝液)に溶解し、これに例えば、
フェロセンカルボン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルを含む有機溶媒(例えば、DMSO)を加えて反応さ
せ、HPLCなどを用いて精製することにより、5’末
端側にフェロセンが結合したDNAが得られ得る。
極に固定する。固定化方法としては、公知の方法が用い
られ得る。例えば、電極が金である場合、DNAにチオ
ール基を導入し、金と硫黄との金−硫黄配位結合を介し
てDNAが電極に結合され得る。DNAにチオール基を
導入する方法は、Mizuo MAEDA, Koji NAKANO, Shinji U
CHIDA, and Makoto TAKAGI, Chemistry Letters, 1805-
1808 (1994) あるいはB.A.Connolly, Nucleic Acids Re
s.,13, 4484 (1985) に記載されている。上記の方法で
得られるチオール基を有するDNAを金電極に滴下し、
低温下(例えば4℃)で、数時間放置することにより、
フェロセンで修飾されたDNAが金電極に固定化され得
る。
ンガン酸カリウムで酸化することにより電極表面にカル
ボン酸を導入し、核酸のアミノ基とアミド結合形成させ
て固定化し得る。グラシーカーボンへの固定化は、Kell
y M. Millan and Susan R. Mikkelsen, Analitical Che
mistry 65, 2317-2323 (1993) に記載されている。
プローブDNAが結合した電極を、DNA試料を含む検
体溶液に導入することにより、プローブDNAと相補的
な配列を有するDNAがハイブリダイズし、ハイブリッ
ドDNAが形成される。DNAをハイブリッドさせる方
法は周知である。
を加熱する加熱手段を有する。必要に応じて、冷却手段
を有し得る。加熱により、二本鎖DNAを解離して一本
鎖とし、プローブとハイブリダイズさせるためである。
カレータの存在下行う。インターカレータが共存する
と、ハイブリダイゼーションの形成が早められると同時
に、生じたハイブリッドDNAを安定化し得る。
としては、フェロセン化合物、カテコールアミン化合
物、金属ビピリジン錯体、金属フェナンスリン錯体、ビ
オローゲン化合物などが挙げられる。フェロセン、カテ
コールアミン、金属ビピリジン錯体、金属フェナンスリ
ン錯体、ビオローゲンなどを導入した縫い込み型インタ
ーカレータなどが好ましく、特に好ましくは、フェロセ
ン修飾縫い込み型インターカレータである。
タは、数nM〜数mMオーダーの濃度範囲で用いられ得る。
好ましくは0.1mM〜5mMであり、最も好ましくは0.5mMで
ある。
の層間に侵入し、一種の電荷移動錯体を形成する。ハイ
ブリッドを形成しない場合(つまり一本鎖のままであれ
ば)インターカレーションは起こらない。インターカレ
ーションにより、電極に流れる電流量が変化する。この
電流は(ハイブリダイズにより形成された)二本鎖DN
Aにインターカレートしたインターカレータの酸化、還
元によるものである。二本鎖DNAの形成の程度がイン
ターカレートの程度として検出され得る。従って、この
電流量を検出および/または測定することにより、ハイ
ブリッドDNAの存在が検出され、あるいはハイブリッ
ドDNAの量が測定される。従って、本願発明の装置
は、電流量を検出および/または測定する手段を有す
る。このような手段(装置)としては、サイクリックボ
ルタモグラム、デファレンシャルパルスボルタモグラ
ム、ポテンシオスタットが挙げられる。
ータ存在下におけるハイブリダイゼーション反応後、電
極を洗浄し、遊離のインターカレータを除いておく。従
って、本願発明の装置は、電極の洗浄手段を有し得る。
られる、導電性の物質で修飾されたDNAプローブが固
定された電極、該電極に固定されたDNAプローブとD
NAを含む試料とをインターカレータ存在下に反応さ
せ、ハイブリッドDNAを形成させる手段、および、該
反応後の電極の電流を検出および/または測定する手段
が提供され、本願発明の装置が作成され得る。
を用いて検出され得る。
は、例えば上記の作成方法で作成された導電性の物質で
修飾されたDNAプローブが固定された電極と、DNA
を含む試料とをインターカレータ存在下に反応させ、該
DNAプローブとDNAとのハイブリッドDNAを形成
させる。ハイブリダイズの条件は周知である。より厳密
に特定する場合は、用いるプローブの塩基組成あるいは
長さ等によって、ハイブリダイズの条件、適切な塩濃度
と時間などが設定され得る。
要なインターカレータを洗い流し、電極の電流量を検出
および/または測定することにより、ハイブリダイズし
たDNAを検出および/または測定する。
明が実施例のみに限定されないことはいうまでもない。
れた電極の作成) (1)フェロセンカルボン酸N−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステルの合成 フェロセンカルボン酸0.5g(2.2mM)とN−ヒドロキシス
クシンイミド0.29g(2.5mM)の20mlジオキサン溶液に、
撹拌下ジシクロヘキシルカルボジイミド0.5g(2.5mM)の5
mlジオキサン溶液を添加し、24時間室温で撹拌した。
反応混合物中に析出した成分のうち、シリカゲルクロマ
トグラフィー処理により暗黄色成分を分取した。暗黄色
成分の物性は下記の通りである。
成 DNAプローブとして、チミジンの20マー(T20A)
(アプライドバイオシステムズ社製のModel391 PCR-MAT
ETM/PCR-MATE EP)を用いて行った。T20A26nmol(E
260=8800M-1cm-1として算出)を1.3mM炭酸ナトリウム
−炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH9.0)20μlに溶解し
た。これに上記(1)で得られたフェロセンカルボン酸
N-ヒドロキシスクシンイミドエステル1.3μmolを含む6m
lのDMSO溶液を加え、室温で一晩振とうした。反応
混合物をTEAA(triethylamine-acetic acid 緩衝液)
(pH7.0)で1mlに希釈した後、NAP-10カラム(Pharma
cia Sephadex G-25)によりTEAA緩衝液を溶離液として
保持容量1mlから2.5mlの部分を分取した。これを減圧濃
縮(40℃以下)し、逆相HPLC(LiChrospher 100RP‐18
(e)/Cica-MERCK)で分取した。収量は7.4nmol(29%)
であった。
オール化 フェロセン修飾DNAのチオール化は、公知の方法、B.
A.Connolly, NucleicAcids Res.,13, 4484 (1985) に従
って行った。
極表面への固定化 (3)で得られたチオール基を導入したdT20量体溶液
1μl(3.4X10-10mol)を、金電極(0.79mm2)に滴下
し、4℃で1時間放置した。その後電極を水で洗浄し、
洗浄水からチオール基導入dT20量体を回収した。HPLC
にて、反応しなかったチオール基導入dT20量体を測定
して、電極に固定されたdT20量体量を算出すると2.9X
10-11mol(29pmol)であった。これをトリス塩酸−EDTA
(pH7.0)緩衝液中にて保存した。
カレータの調製)フェロセン修飾縫い込み型インターカ
レータは、上記A(1)で調製したフェロセンカルボン
酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステルと、下記の方
法により作成したアミン体とを用いて合成した。
mol)と1,4−(3−アミノプロピル)ピペラジン40m
l(0.194mmol)をTHF30ml中で8時間還流した。室温ま
で冷やした後それをそのまま、へキサンに再沈澱させ、
結晶を濃過により回収した。さらに最少量のクロロフォ
ルムに溶解させ工一テルに再沈澱させた。沈澱物を除去
後、エーテルを減圧除去する。クロロフォルムに再溶解
させ、ヘキサンによる再沈澱後、結晶を回収した。収量
は330mg、収率52%であった。
カレータの合成 上記A(1)で調製したフェロセンカルボン酸N−ヒド
ロキシスクシンイミドエステルと、B(1)の方法で調
製したアミン体(NaDI)とを反応させて合成した。
(1)で調製したエステル600mg(1.8mmole)とをクロ
ロフォルム30mlに溶解した。これを室温で50時間撹拌
した。これをシリカゲルのTLCにかけメタノールを溶媒
として展開した。原点にNaDI、Rf値0.8にフェロセンカル
ボン酸N-ヒドロキシンイミドエステル、Rf値0.2にブロ
ードな目的物と思われるスポットが確認された。反応溶
液を減圧留去した後、メタノールに溶かし、展開溶媒に
メタノールを用いてシリカゲルカラムで展開し、目的物
と思われる画分を得た。メタノールを減圧留去し、クロ
ロフォルムに溶かした。ろ過後、ろ液を濃縮し、水で再
沈澱させ、アセトンて再結晶し、結晶を回収した。アセ
トンで再結晶した後のTLC(MeOH)はRf値0.2のスポットの
みであった。
あった。得られたインターカレータは382nmに吸収極大
を有していた。
相補的に結合するDNAフラグメントとしては合成オリ
ゴヌクレオチドdA20を用いた。dA2029pmolと上記
(B)で作成したインターカレーター0.5mMとを含む30%DM
SO-41mM(AcOK-AcOH)緩衝液(pH5.2)に、フェロセン
修飾プローブDNA(dT20)が表面に固定化された電
極を浸した。反応は、40℃、10分間行った。
30%DMSO-41mM(AcOK-ACOH)緩衝液(pH 5.2)で洗浄
し、遊離インターカレーターを除去した。
測定したのが、図1である。測定は、41mM酢酸カリウム
−酢酸緩衝液(pH 5.2)、30%DMSO、スキャン速度100m
V/secの条件で行った。
フェロセンインターカレータに由来する619mVの増加電
流は0.15μAであった。従って、dA20がdT20に結合する
ことにより、つまり、電極に固定化されたプローブDN
Aに相補的なDNAが結合することにより、特定の配列
が検出できることがわかる。
記(B)で作成したインターカレーター0.5mMとを含む30%
DMSO-41mM(AcOK-AcOH)緩衝液(pH5.2)に、フェロセ
ン修飾プローブDNA(dT20)が表面に固定化された
電極を浸した。反応は、40℃、10分間行った。
30%DMSO-41mM(AcOK-ACOH)緩衝液(pH 5.2)で洗浄
し、遊離インターカレーターを除去した。
測定した結果を図2に示す。増加電流の検出限界から、
上記電極により検出可能なDNAの検出限界は、数fmol
と推定された。この図から、特定の配列を有するDNA
の検出および定量が可能であることがわかる。
ラベル法、発光法と比較して同等あるいはより高感度で
ある。
ブDNAを電極に固定化し、インターカレータ存在下、
DNA試料と反応させた後、電極の電流を検出および/
または測定することにより、特定の配列を有するDNA
が検出および/または測定される。この方法により、従
来のRIを用いるオートラジオグラフィーのように数日
を要せず、リアルタイムで検出することが可能となる。
そしてオートラジオグラフィーで必須の、現像の手間が
不要である。さらに、オートラジオグラフィーては感光
度不足が現像によって初めて確認され、感光度が不足す
る時には再度フィルムを感光させる必要があり、時間的
ロスが生じる。本発明では、このような時間的ロスが皆
無となる。さらに、被験DNAを制限酵素処理、電気泳
動による分画処理などが不要になるため、分画装置など
を要せず、簡便に特定の配列を有するDNAが検出、測
定され得る。
を測定した図である。
Claims (7)
- 【請求項1】 特定の配列を有するDNAを検出する方
法であって、該方法は、導電性の物質で修飾されたDN
Aプローブが固定された電極と、DNAを含む試料とを
インターカレータ存在下に反応させ、該DNAプローブ
とDNAとのハイブリッドDNAを形成させる工程;お
よび、該反応後の電極の電流を検出および/または測定
する工程;を有する、方法。 - 【請求項2】 前記導電性物質が酸化還元活性を有する
化合物である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記インターカレータが、フェロセン修
飾縫い込み型インターカレータである、請求項1に記載
の方法。 - 【請求項4】 特定の配列を有するDNAを検出する装
置であって、該装置は、導電性の物質で修飾されたDN
Aプローブが固定された電極;該電極に固定されたDN
AプローブとDNAを含む試料とをインターカレータ存
在下に反応させ、ハイブリッドDNAを形成させる手
段;および、 該反応後の電極の電流を検出および/または測定する手
段;を有する、装置。 - 【請求項5】 前記導電性物質が酸化還元活性を有する
化合物である、請求項4に記載の装置。 - 【請求項6】 前記インターカレータがフェロセン修飾
縫い込み型インターカレータである、請求項4に記載の
装置。 - 【請求項7】 導電性の物質で修飾されたDNAプロー
ブが電極に固定されている、特定のDNA配列を検出す
るための電極。
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