JPH0919288A - εーポリーＬーリシン分解酵素およびそれを用いた低重合度εーポリーＬーリシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ε−ポリ−Ｌ−リシンに特異性の高い加水分解
酵素を採取することを目的とし、その酵素を利用して低
重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンを得ることを目的とした。 【構成】クリセオバクテリウム・グループIIｂに属する
微生物を培養して、培養液中よりε−ポリ−Ｌ−リシン
分解酵素を採取し、それを用いてε−ポリ−Ｌ−リシン
から重合度２〜１９の低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンを
得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はクリセオバクテリウム・
グループIIｂに属する微生物を培養して、培養液中より
得られるε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素、その製造法、
及びε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素を利用した低重合度
ε−ポリ−Ｌ−リシンを製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ε−ポリ−Ｌ−リシンはグラム陰性菌、
グラム陽性菌、真菌等、各種の菌株に対し静菌作用があ
り、食品保存料として様々な食品の日持ち向上に利用さ
れている。食品は多種多様なので、食品の置かれている
環境によっては、ε−ポリ−Ｌ−リシンの通常量の添加
では効果が出ないことがある。そのときは大量に添加す
る必要があるが、それによって食品の風味が損なわれる
ことが多い。特開平４−２８７６９３号公報には、アス
ペルギルス(Aspergillus)属菌の産生する中性プロテア
ーゼでε−ポリ−Ｌ−リシンを処理するとε−ポリ−Ｌ
−リシンが加水分解され、その加水分解物を食品に添加
した場合、無処理のε−ポリ−Ｌ−リシンを添加した場
合と比較して、えぐ味が改善されることが記載されてい
る。しかし、アスペルギルス属菌の産生する中性プロテ
アーゼは基質特異性が広く、食品に直接添加された場合
は食品成分由来の蛋白に作用し、風味、触感が著しく変
化する恐れがある。そこで、ε−ポリ−Ｌ−リシンに特
異的に作用する分解酵素が求められていた。

【０００３】食品中のε−ポリ−Ｌ−リシンの量を測定
するさいは、従来からメチルオレンジ法、高速液体クロ
マトグラフィー等が用いられているが、食品成分の除去
が困難で煩雑であった。ε−ポリ−Ｌ−リシンに特異的
に作用する酵素があれば、それを用いて食品から容易に
ε−ポリ−Ｌ−リシンを定量できる測定方法が開発でき
ることが期待された。また、ε−ポリ−Ｌ−リシンを蛋
白水溶液に添加するとゲル化するなどの作用がある。そ
のさい添加するε−ポリ−Ｌ−リシンの分子量によっ
て、生成するゲルの物性が異なることが知られている。
そこで、蛋白に作用せず、ε−ポリ−Ｌ−リシンにのみ
作用する分解酵素が望まれていた。その他、低重合度ε
−ポリ−Ｌ−リシンは未知の生理活性を有し、多方面の
利用が期待できる。これらの理由から、ε−ポリ−Ｌ−
リシンに基質特異性の高い加水分解酵素が望まれてい
た。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はε−ポ
リ−Ｌ−リシンに基質特異性の高い加水分解酵素を提供
すること及びこの酵素を用いて低重合度ε−ポリ−Ｌ−
リシンを製造する方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らはかかる課題
を解決するために、広く自然界よりε−ポリ−Ｌ−リシ
ン分解酵素生産能を有する微生物を探索した。その結
果、新たに土壌より分離された菌（ＯＪ−７株）が、ε
−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素を培養液中に生産すること
を見いだした。また、この酵素を利用することによりε
−ポリ−Ｌ−リシンを効率よく製造できることを見いだ
し本発明を完成した。

【０００６】本発明において用いられる菌株であるＯＪ
−７株の菌学的性状は以下のとおりである。 （培養所見）肉汁寒天平板で２４時間３０℃で培養した
コロニーの形態は、直径１mm以下の円形、全縁で、低い
凸状、黄色、半透明、なめらかで光沢があった。グラム
陰性の短かん菌で芽胞形成及び運動性がなかった。カタ
ラーゼ及びチトクロームオキシダーゼ活性が陽性で、グ
ルコースＯＦ試験の成績が酸化的で陰性であった。ま
た、本菌株は３７℃及び４１℃で弱い生育を示し、４５
℃では生育が認められなかった。

【０００７】（生化学的特徴）３０℃で４８時間生育し
た時、ＮＯ₃還元，インドール産生、グルコースからの
酸の産生及びアルギニン・ジヒドロラーゼ活性が陰性、
ウレアーゼ、エスクリン加水分解及び硝酸の産生が陽
性、βーガラクトシダーゼ活性及びリンゴ酸の資化性が
弱い陽性、グルコース、アラビノース、マンノース、マ
ルトース、グルコン酸、クエン酸及びフェニル酢酸の資
化性が陽性、マンニトール、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン、カプリン酸及びアジピン酸の資化性が陰性を示し
た。３０℃で７日間生育した時、色素産生、スターチ加
水分解、カゼイン加水分解、ＤＮａｓｅ活性、α−グル
コシダーゼ活性及びバリン・アリルアミダーゼ活性が陽
性、硫化水素産生、インドール産生及び、α−ガラクト
シダーゼ活性が陰性を示した。これらの性状から、本菌
株をクリセオバクテリウム(Chryseobacterium)グループ
IIｂと同定した。本菌株は工業技術院生命工学工業技術
研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５００４として寄託されてい
る。クリセオバクテリウムグループIIｂが当該酵素の活
性を有していることは今までに明らかにされていない。
本菌株より生産されるε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素の
酵素学的および理化学的性質について記述する。

【０００８】１.作用：ε−ポリ−Ｌ−リシンをエンド
型に加水分解して、ε結合の低重合度ε−ポリ−Ｌ−リ
シン（重合度ｎ＝２〜１９）を生成する。 ２.基質特異性：ε−ポリ−Ｌ−リシンを分解し、低重
合度ε−ポリ−Ｌ−リシンを遊離するが、α−ポリ−Ｌ
−リシンには作用しない。 ３.分子量：高速液体クロマトグラフィー法で測定し
た。分子量は約３６，０００である。 ４.温度の影響：至適反応温度は５５℃である。ｐＨ
７．０，１０分間の加熱では４０℃まで安定である。 ５.ｐＨの影響：至適反応ｐＨはｐＨ７．５である。４
℃、６０時間の加熱ではｐＨ７〜１１で安定である。

【０００９】６.酵素活性測定法：１モル濃度のリン酸
カリウム緩衝液(ｐＨ７．５)を０．１ｍｌ、２．５mg/
ｍｌのε−ポリ−Ｌ−リシン水溶液を０．４ｍｌ、生理
食塩水０．４ｍｌ及び酵素溶液を０．１ｍｌを入れた試
験管を３０℃で保温する。３０分間後、高速液体クロマ
トグラフィーの展開溶媒を１ｍｌ添加することで反応を
停止する。遠心分離で沈澱を除き、上清液の１０μＬを
逆相高速液体クロマトグラフィーに供する。展開溶媒は
リン酸２水素１ナトリウム１０ミリモル濃度 ＋過塩素
酸ナトリウム０．１モル濃度 ＋ オクチルスルホン酸
ナトリウム１０ミリモル濃度 ＋ アセトニトリル３
７．５％（ｖ／ｖ）の組成のものを用い、毎分１ｍｌの
流速で展開する。カラムはＭ＆Ｓパック Ｃ−１８(4.6
x 150mm)を用いる。２１５ｎｍの波長の紫外線でε−
ポリ−Ｌ−リシンの減少を測定する。本条件下で酵素溶
液１ｍｌ当たり１分間で１mgのε−ポリ−Ｌ−リシンを
分解する酵素量を１Ｕとする。

【００１０】本発明の酵素はたとえば以下のようにして
製造される。クリセオバクテリウムグループIIｂ ＯＪ
−７（ＦＥＲＭ Ｐ−１５００４）を培養液で好気的に
培養する。この培養液は本菌が生育するものであればい
かなるものでも良いが、好ましくはペプトン１．５％
（ｗ／ｖ），酵母エキス１．５％（ｗ／ｖ），ショ糖
１．０％（ｗ／ｖ），塩化ナトリウム０．１％（ｗ／
ｖ），ｐＨ７．０の組成を持つ培養液を用いる。２５℃
から３３℃の温度で２日から５日間の期間培養し、遠心
分離機またはフィルターで菌体を除去する。菌体を除去
した液に蛋白沈澱剤を添加して培養液中の蛋白を沈澱さ
せる。当該酵素が沈澱し始めない濃度まで蛋白沈澱剤を
培養液に加える。生成した沈澱を遠心分離機またはフィ
ルターで除去する。沈澱を除去した液にさらに蛋白沈澱
剤を加え、当該酵素の大部分が沈澱し終わるまで続け
る。生成した沈澱を遠心分離機またはフィルターで濾過
して取り出す。これが粗製の当該酵素である。蛋白沈澱
剤としては、当該酵素を失活させないものであればいか
なるものでも用いられるが、好ましくは硫酸アンモニウ
ムを用い５０〜８０％飽和濃度の画分を得る。粗製の当
該酵素は、必要に応じて、さらにカラムクロマトグラフ
ィー等の手段で精製する。

【００１１】低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンはたとえば
以下のごとく製造される。原料として用いられるε−ポ
リ−Ｌ−リシンは重合度が２０以上あればいかなるもの
でも使用可能であるが、好ましくは和光純薬（株）製の
ε−ポリ−Ｌ−リシン塩酸塩、チッソ（株）製の５０％
（Ｗ／Ｗ）デキストリン粉末、低級脂肪酸グリセライド
製剤（商品名：ガードキープ）またはグリシン製剤（商
品名：ガードロング）が用いられる。原料のε−ポリ−
Ｌ−リシン塩酸塩をｐＨ７．０〜８．０の緩衝液に溶か
す。緩衝液としては当該酵素を失活させないものであれ
ばいずれのものでもよいが、好ましくはリン酸カリウム
緩衝液ｐＨ７．５が用いられる。この溶液に当該酵素の
水溶液を加えて混合し、２５℃〜４０℃で２時間インキ
ュベートする。より低い重合度のものを得たいときはイ
ンキュベート時間をより長くする。反応液を加熱する
か、有機溶媒または高速液体クロマトグラフィーの展開
溶媒を加えるかして反応を停止し、変成した当該酵素蛋
白を遠心分離機もしくはフィルターで濾過し取り除く。
その反応液を逆相液体クロマトグラフィーに供し、重合
度２〜１９のε−ポリ−Ｌ−リシンの画分を集める。カ
ラムはＯＤＳ逆相カラムを用いる。展開溶媒は低重合度
ε−ポリ−Ｌ−リシンが分離出来るものであればいかな
るものでもよいが、好ましくはＡ液：リン酸２水素１ナ
トリウム１０ミリモル濃度＋過塩素酸ナトリウム０．１
モル濃度＋オクチルスルホン酸ナトリウム１０ミリモル
濃度、Ｂ液：２倍濃度のＡ液とアセトニトリルを液量で
１：１に混合した溶液を使用する。展開はＡ液とＢ液の
混合液中において、展開１分後にＢ液の濃度が５０％
（Ｖ／Ｖ）から５５％（Ｖ／Ｖ）まで、２５分後に５５
％（Ｖ／Ｖ）から７０％（Ｖ／Ｖ）、３５分後に７０％
（Ｖ／Ｖ）〜７５％（Ｖ／Ｖ）に直線的に増加する濃度
勾配に毎分１ｍｌの流速で溶出させる。２１５ｎｍの波
長の紫外線でピークを検出し、目的の重合度のε−ポリ
−Ｌ−リシンを得る。溶出液を陽イオン交換樹脂にかけ
濃縮し、得られた濃縮液を凍結乾燥、真空乾燥あるいは
デキストリン等の多糖類を混ぜてスプレードライする等
の手段で粉末状の低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンを得
る。重合度の如何を問わないときは酵素反応停止後の液
を液体クロマトグラフィーをせず直接、イオン交換樹脂
にかけてもよい。

【００１２】以下、実施例で本発明を説明する。本発明
は実施例のみに限定されるものではない。

【実施例】

実施例１ ペプトン１．５％（ｗ／ｖ），酵母エキス１．５％（ｗ
／ｖ），ショ糖１．０％（ｗ／ｖ），塩化ナトリウム
０．１％（ｗ／ｖ），ｐＨ７．０の組成を持つ培養液１
０ＬにクリセオバクテリウムグループIIｂ ＯＪ−７
（ＦＥＲＭ Ｐ−１５００４）を２８℃で３日間振とう
培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離にて取り
除き、得られた上清中に５２３Ｕ（２８２１mg）の当該
酵素活性を認めた。この上清液に硫酸アンモニウムを加
え、５０〜８０％飽和濃度の粗製の当該酵素の画分３２
０Ｕ（６２４mg）を得た。

【００１３】上記の粗製の当該酵素６２４mgを0.01モル
濃度のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶かし、
同じ緩衝液に平衡化したＤＥＡＥ−セファセル(300ｍ
ｌ)に吸着させ、0.1モル濃度のリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）で溶出した画分を０．０１モル濃度のリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。その画
分８６．４Ｕ（１１５mg）を同じ緩衝液に平衡化したＤ
ＥＡＥ−セファセルのカラム（サイズ：直径３０mm, 長
さ１００mm）に吸着させ、0.1モル濃度のリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した活性画分に塩化カリ
ウムを１モル濃度になるように加えた。この画分５５．
１Ｕ（６．７mg）を同じ緩衝液に平衡化したフェニルセ
ファセルのカラム（サイズ：直径３０mm, 長さ３０mm）
に吸着させ、0.1モル濃度のリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で溶出した活性画分を集めた。この画分を0.
1モル濃度のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）＋５
０％（ｖ／ｖ）グリセロールで透析し、当該酵素の精製
標品を得た。この精製標品は１２．３Ｕで０．９０mg、
比活性が１３．７Ｕ／mg proteinであった。

【００１４】実施例２ 和光純薬製ε−ポリ−Ｌ−リシン塩酸塩（分子量２００
０〜４０００、重合度２０〜３５）１０ｍｇ／ｍｌ水溶
液０．５ｍｌ、０．１モル濃度のリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．５）０．１ｍｌ、イオン交換水０．３５ｍｌ
からなる水溶液に、ε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素１．
７５Ｕ／ｍｌ水溶液０．０５ｍｌを加えて混合し反応さ
せた。その直後にこの反応液５０μｌを取り出し、この
反応液にＡ液２５％、Ｂ液７５％からなる展開溶媒５０
μｌを加え遠心分離し、上清１０μｌを逆相高速液体ク
ロマトグラフィーに供した。カラムは化学品検査協会製
Ｌ−カラム（ＯＤＳ）（４．６×２５０ｍｍ）を用い
た。展開溶媒としてＡ液：リン酸２水素１ナトリウム１
０ミリモル濃度＋過塩素酸ナトリウム０．１モル濃度＋
オクチルスルホン酸ナトリウム１０ミリモル濃度、Ｂ
液：２倍濃度のＡ液とアセトニトリルを液量で１：１に
混合した溶液を使用した。展開はＡ液とＢ液の混合液中
において、展開１分後にＢ液の濃度が５０％（Ｖ／Ｖ）
から５５％（Ｖ／Ｖ）まで、２５分後に５５％（Ｖ／
Ｖ）から７０％（Ｖ／Ｖ）、３５分後に７０％（Ｖ／
Ｖ）〜７５％（Ｖ／Ｖ）に直線的に増加する濃度勾配で
最終的に７５％（Ｖ／Ｖ）で毎分１ｍｌの流速で溶出さ
せた。２１５ｎｍの波長の紫外線で検出したところ、図
１のクロマトグラムを得た。

【００１５】次に、前記反応液の残りを３０℃で４時間
反応させ、反応液５０μｌに上記と同じ展開溶媒０．２
ｍｌを加えて上記と同様に遠心分離し、上清１０μlを
同様に逆相高速液体クロマトグラフィーに供し、図２の
クロマトグラムを得た。重合度２から２０以下の低重合
度ε−ポリ−Ｌ−リシンとＬ−リシンのピークが認めら
れ、ε−ポリ−Ｌ−リシンの低分子化が明らかにみられ
た。また、Ｌ−リシンのピークが極めて低いことから、
当該酵素反応の様式はエンド型と推定された。この反応
液５０μｌから凍結乾燥にて０．２２ｍｇの重合度２〜
１９のε−ポリ−Ｌ−リシンが得られた。さらに、混合
液を２０時間反応させ、反応液５０μｌを取り出し同様
に逆相液体クロマトグラフィーに供したところ、図３の
クロマトグラムを得た。重合度２から６の低重合度ε−
ポリ−Ｌ−リシンとＬ−リシンが検出され、重合度７以
上のものはほとんど検出されなかった。この反応液５０
μｌから凍結乾燥にて０．２１ｍｇの重合度２〜６のε
−ポリ−Ｌ−リシンが得られた。

【００１６】比較例 実施例２のε−ポリ−Ｌ−リシンの代わりにシグマ社製
α−ポリ−Ｌ−リシン臭酸塩（分子量４０００〜１５０
００、重合度３５〜１３０）を用いて、実施例２に準拠
して反応をおこない反応０時間後と２４時間後との反応
産物を分析した。反応０時間後のクロマトグラムを図
４、２４時間後のクロマトグラムを図５で表した。反応
２４時間後でもクロマトグラムにほとんど変化がみられ
なかった。これはこの酵素がα−ポリ−Ｌ−リシンに作
用しないことを示す。

【００１７】

【発明の効果】本願発明に関わるε−ポリ−Ｌ−リシン
分解酵素はε−ポリ−Ｌ−リシンに基質特異性が高く、
ε−ポリ−Ｌ−リシンを加水分解し低重合度ε−ポリ−
Ｌ−リシン及びＬ−リシンを生成する。この酵素は、蛋
白の共存下で蛋白を分解することなくε−ポリ−Ｌ−リ
シンを分解することができる。この性質によって、低重
合度ε−ポリ−Ｌ−リシンの食品工業を中心として多方
面の用途が開ける。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２において、ε−ポリ−Ｌ−リシンを基
質とした反応での反応直後（０時間）の反応液の逆相ク
ロマトグラムである。

【図２】実施例２において、ε−ポリ−Ｌ−リシンを基
質とした反応での反応４時間後の反応液の逆相クロマト
グラムである。

【図３】実施例２において、ε−ポリ−Ｌ−リシンを基
質とした反応での反応２４時間後の反応液の逆相クロマ
トグラムである。

【図４】比較例において、α−ポリ−Ｌ−リシンを基質
とした反応での反応直後（０時間）の反応液の逆相クロ
マトグラムである。

【図５】比較例において、α−ポリ−Ｌ−リシンを基質
とした反応での反応２４時間後の反応液の逆相クロマト
グラムである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の理化学的性状を示すε−ポリ−Ｌ−
   リシン分解酵素。 １.作用：ε−ポリ−Ｌ−リシンをエンド型に加水分解
   し、低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンを生成する。 ２.基質特異性：ε−ポリ−Ｌ−リシンを分解し、低重
   合度ε−ポリ−Ｌ−リシンを遊離するが、α−ポリ−Ｌ
   −リシンには作用しない。 ３.至適反応条件：至適ｐＨはｐＨ７．５であり至適温
   度は５５℃である。 ４.安定条件：安定ｐＨ範囲はｐＨ７〜１１であり安定
   温度範囲はｐＨ７．０で１０分間加熱した時、４０℃ま
   で安定である。 ５.分子量：高速液体クロマトグラフィーで測定した分
   子量は約３６，０００である。
2. 【請求項２】クリセオバクテリウム・グループIIｂに属
   するε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素生産菌を培養して、
   ε−ポリ−Ｌ−リシンを加水分解し低重合度ε−ポリ−
   Ｌ−リシンを生成する酵素を培養液中より採取すること
   を特徴とするε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素の製造法。
3. 【請求項３】ε−ポリ−Ｌ−リシンを請求項１記載の酵
   素で加水分解することにより低重合度ε−ポリ−Ｌ−リ
   シンを製造する方法。
4. 【請求項４】重合度が２０以上のε−ポリ−Ｌ−リシン
   を請求項１記載の酵素で加水分解することにより、重合
   度が２〜１９であるε−ポリ−Ｌ−リシンを製造する方
   法。