JPH0880189A - エラスターゼ生産納豆菌及びこれを用いた納豆の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 エラスターゼ生産納豆菌の中でもとりわけ高
いエラスターゼ活性を示す納豆菌と、この高エラスター
ゼ生産納豆菌を用いた納豆の製造方法を得ることを目的
とする。 【構成】 バチルス・ズブチリスに属する納豆菌であっ
て、エラスターゼ生産性が改良された納豆菌変異株ＫＦ
Ｐ４１９株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４３０４）。バチルス・
ズブチリスに属し、エラスターゼ生産性が改良された納
豆菌である納豆菌変異株ＫＦＰ４１９株（ＦＥＲＭ Ｐ
−１４３０４）を用いて納豆を製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バチルス・ズブチリス
に属し、エラスターゼ生産性が改良された納豆菌と、こ
の納豆菌を用いる納豆の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】納豆は、周知のように、蒸煮大豆に納豆
菌を接種し、醗酵室の中で所定時間醗酵、熟成させて製
造されるものであり、従来より健康食品としての地位が
与えられている。

【０００３】一方、納豆菌は、一般にタンパク質を分解
するプロテアーゼ活性を示し、そして、このプロテアー
ゼにより、納豆の熟成過程において大豆のタンパク質が
ポリペプチドに分解され、更に納豆の旨味となる低分子
ペプチドやアミノ酸に分解されることが知られている。

【０００４】更に、従来においては、納豆菌の育種法と
してスクリーニング、変異処理（紫外線、放射線、薬剤
等）、細胞融合、遺伝子組換え等を用いて、高旨味・高
ナットウキナーゼ、高ナットウキナーゼ・低ビタミン
Ｋ、低臭、高プロテアーゼ、粘質物非生産、ビタミンＢ
₁₂生産等の性質を備えた納豆菌乃至納豆の開発が進めら
れている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】前述したように、菌体
外に高活性のプロテアーゼを産生する納豆菌の開発は近
時良く行われているが、バチルス・ズブチリスに属する
納豆菌にエラスターゼ活性を示すものがあることについ
ては以外と知られていない。況や、高エラスターゼ生産
納豆菌に関する研究乃至技術開発は殆ど無いといっても
過言ではない。

【０００６】ところで、エラスターゼは、エラスチンを
分解する豚膵臓由来の酵素で、高脂血圧症の改善に効果
のあることが知られている。

【０００７】本発明者等は、エラスターゼ生産納豆菌に
着目して本発明を完成した。すなわち、本発明は、エラ
スターゼ生産納豆菌の中でもとりわけ高いエラスターゼ
活性を示す納豆菌と、この高エラスターゼ生産納豆菌を
用いた納豆の製造方法を得ることを目的とするものであ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段及び作用】本発明者等は、
納豆菌にもエラスターゼを生産するものがあるという知
見を踏まえて、このエラスターゼ生産納豆菌を改良する
ことにより、更に高エラスターゼ生産納豆菌を開発する
ことが可能であろうと思料した。

【０００９】すなわち、土壌、枯草、稲藁等から耐熱性
胞子を形成する菌株を分離し、そのうちコロニーの形態
がバチルス・ズブチリスに属すると思われるものについ
て、エラスターゼ活性の高い菌株ＫＦＰ３５５株を選択
した。

【００１０】このＫＦＰ３５５株に種々の変異処理を行
ったところ、⁶⁰Ｃｏ照射で変異処理することにより、高
エラスターゼ活性株として、ＫＦＰ４１９株が分離され
た。

【００１１】菌株の同定は、バージーズ・マニュアル・
オブ・システマチック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅ
ｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第２巻に準拠して行ったと
ころ、ＫＦＰ３５５株及びＫＦＰ４１９株はバチルス・
ズブチリスに属する菌株と同定された。

【００１２】エラスターゼ活性の測定は、エラスチン−
オルセイン法を用い、ＫＦＰ４１９株が市販納豆菌に対
し略２倍のエラスターゼ活性の存することを確認した。

【００１３】ＫＦＰ４１９株の培養は、ＮＰＢ培地（肉
エキス１％、フィトン１％、食塩０．５％、ｐＨ７．
０）で行った。

【００１４】酵素の精製は、硫安沈殿と透析後、ＤＥＡ
Ｅ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ａ−２５、セ
ファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−７５、ＣＭ−２
３の３種のカラムクロマトグラフィーで行った。

【００１５】ＳＤＳ電気泳動には、アトー（株）製ＰＡ
ＧＥＬ勾配ゲル５２０ーＬ型を用い、等電点電気泳動に
は、ゲル濃度５％・架橋度３％のポリアクリルアミドゲ
ルを使用した。

【００１６】以上の結果、ＫＦＰ４１９株とその親株た
るＫＦＰ３５５株はグラム陽性の好気性桿菌で胞子を形
成し、大きさは０．９×１．２〜２．４μｍであり、更
に、７％ＮａＣｌ存在下で生育し、でんぷん分解性陽
性、硝酸塩還元性陽性であることが判明した。

【００１７】本発明において、培養液を３種のカラムク
ロマトグラフィーで分離した後、ＳＤＳ電気泳動を行っ
て、単一のバンドが得られた。この点から酵素の採れた
ことが認められた。ＳＤＳ電気泳動と等電点電気泳動
で、本酵素と市販標品とを比較した結果、それぞれ分子
量と等電点に差が見られた。至適ｐＨは、緑膿菌エラス
ターゼがｐＨ８、本酵素と、ズブチリシン・ナガーゼ及
び豚すい臓エラスターゼが、ｐＨ９であった。至適温度
では、本酵素とズブチリシンが５０℃、ナガーゼ・エラ
スターゼ（豚すい臓由来）が４５℃、エラスターゼ（緑
濃菌由来）が３５℃であった。阻害剤では、モノヨード
酢酸による阻害が見られた。

【００１８】このようにして、バチルス・ズブチリスに
属し、エラスターゼ生産性が改良された納豆菌変異株Ｋ
ＦＰ４１９株を得た。この菌株は、工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託されており、その受託番号は、Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４３０４である。また、親株たるＫＦＰ
３５５株も同様に、工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−１
４３０３である。

【００１９】更に、本発明は、バチルス・ズブチリスに
属し、エラスターゼ生産性が改良された納豆菌である納
豆菌変異株ＫＦＰ４１９株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４３０
４）を用いて納豆を製造する方法である。

【００２０】すなわち、納豆製造は、加温冷及び加湿除
湿を所定のプログラムに基づいて行う自動納豆製造機を
用い、発酵後冷蔵庫（５℃）で２４時間熟成させたもの
を分析に供した。一般分析等の種々の分析は納豆試験法
に従って行った。また、ＧＣとＨＰＬＣを用いてそれぞ
れ有機酸と糖成分の分析を行った。

【００２１】ＫＦＰ４１９株、ＫＦＰ３５５株、市販納
豆菌３種（ＫＦＰ１株，ＫＦＰ２株，ＫＦＰ４株）を用
いて製造した納豆では、ＫＦＰ４１９株の納豆が粘りが
強く、うま味のある納豆であった。

【００２２】ＫＦＰ４１９株、ＫＦＰ３５５株、市販納
豆菌３種とも一般成分に大きな差は見られなかった。

【００２３】尚、納豆中の有機酸は、ｉｓｏ−吉草酸、
ｉｓｏ−酪酸、酢酸、ヘキサン酸の順に増加量が多くな
る傾向が見られた。大豆中の糖成分には、スタキオース
が含まれていたが、納豆製造後の納豆中の糖成分には、
スタキオースはいずれの納豆菌株により製造された納豆
にも検出されなかった。また、大豆中のフルクトースは
どの納豆中にも検出されなかった。従って、各種納豆菌
は大豆中のスタキオース、フルクトース等の糖成分を栄
養源として生育し、納豆粘質物を生成することが示唆さ
れた。

【００２４】

【実施例】以下、本実施例により本発明を詳細に説明す
る。

【００２５】本実施例において、土壌、枯草、稲藁等か
ら耐熱性胞子を形成する菌株を分離し、そのうちコロニ
ーの形態がバチルス・ズブチリスに属すると思われるも
のについて、エラスターゼ活性の高い菌株ＫＦＰ３５５
株を選択した。

【００２６】以下、図１に示すように、このＫＦＰ３５
５株に⁶⁰Ｃｏ照射を行い、大きなコロニーを得て、プロ
テアーゼ活性検査を行い、その中から最良株３株を選抜
した。爾後、ニトロソグアジン処理を行って６２株釣菌
し、プロテアーゼ活性検査を行って最良の２株を選抜し
た。更に前記２株にニトロソグアジン処理を行って２２
株ずつ釣菌し、４４株の中からエラスターゼ活性の高い
菌株ＫＦＰ４１９株が分離された。

【００２７】図２は、スクリーニングにおける供試菌の
エラスターゼ活性のデータであり、１分間にオルセイン
１μｇを生成する酵素活性を１単位（Ｕ）としている。
尚、ＫＦＰ１乃至４は市販の納豆菌から純粋分離して得
た菌株である。図２から明らかなように、ＫＦＰ４１９
株は、市販の納豆菌に対し、略２倍のエラスターゼ活性
を示している。

【００２８】ところで、本実施例において、エラスター
ゼの精製は、以下の通りである。

【００２９】ＮＢＰ倍地で２４時間の前培養を行い、同
様にＮＰＢ倍地で３日間の培養を行った後、遠心分離
（１０，０００×ｇ、１５分）と、硫酸アンモニウム沈
澱（６０〜８０％飽和、１０，０００×ｇ、３０分）を
行い、一夜透析し、これを、ＤＥＡＥ−セファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ａ−２５（０．１Ｍトリス緩衝液
ｐＨ８．０）、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ
−７５（０．１Ｍトリス緩衝液 ｐＨ８．０）、ＣＭ
２３−セルロース（０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ５．
０）、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−７５
（０．１Ｍトリス緩衝液 ｐＨ８．０）で順次精製し、
エラスターゼのラウリル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。

【００３０】図３は、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ）Ｇ−７５のカラムクロマトグラフィーで行ったエラ
スターゼの精製を示す図で、黒丸は吸光度、白丸は酵素
活性を示す。図において、画分番号１５にピークの出て
いることが解る。尚、Ｉ及びIIは、画分Ｉと画分IIを示
す。

【００３１】図４は、エラスターゼのポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す図で、前記
画分番号１５にピークの出ている酵素を採りポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動のプレートの上に乗せ、プレート
の下をプラス、上をマイナスにして電気を導通して行っ
たものである。このポリアクリルアミドゲル電気泳動に
て示されるように、分子量の小さいもの程、下方に移動
し、他方、分子量の大きい物は移動し難く、そして純度
を見てみると一つになっており、この点から酵素の採れ
たことが認められた。

【００３２】次に、本酵素がエラスチンを分解する速度
を調べた。図５は、エラスターゼ反応のラインウイーバ
バルクのプロットを示す図である。良く知られているよ
うに、縦軸は時間あたりの分解速さの逆数、横軸はエラ
スチンの濃度の逆数であり、そして、基質濃度を種々変
えて実験したところ、図示のような所定の勾配を得た。
これから、Ｋｍ値が７．０ミリモルであることが解り、
従来におけるエラスターゼと同等の速度であることが確
認された。

【００３３】図６は、エラスターゼに対する温度の効果
を示すもので、本酵素が何度で一番よく反応するかを調
べた。これによると、本酵素は、５０℃程度において良
く反応することが解った。尚、図において線が切れてい
るのは、低温から高温まで一度に実験することができな
いので、７℃から２５℃、２０℃から６０℃、５５℃か
ら８０℃迄の３回に分けて実験したことによる。

【００３４】図７は、エラスターゼのｐＨに対する効果
を示すもので、本酵素がどのｐＨで一番よく反応するか
を調べた。これによると、本酵素は、ｐＨ９．０で良く
反応することが解った。

【００３５】図８は、エラスターゼの安定性を示すもの
で、室温（黒三角印）の場合は１月で活性が零になって
しまい、冷蔵（白丸印）は５０日程度で活性が２０％位
下降し、冷凍（黒丸印）の場合は２００日でも活性が６
０％は残っていることが確認された。

【００３６】図９は、微生物由来エラスターゼとプロテ
アーゼの比較を行ったもので、本実施例のＫＦＰ４１９
株と、バチルスサチルス・アミロサッカリチカス、バチ
ルスナットーＮＳＩ、好アルカリ性バチルスＹａＢ、好
アルカリ性バチルス２２１、シュードモナスエールギノ
ーサ（緑濃菌）とを比較した。すなわち、ＫＦＰ４１９
株の場合、最適ｐＨは９．０であり、他のもののエラス
ターゼ最適ｐＨと異なっており、また、安定ｐＨも、他
の酵素が５−１０と報告されていてやや大雑把であるの
に対し、ＫＦＰ４１９株の場合は厳密に測定したところ
８−９であった。更に、安定剤も、他の酵素にはカルシ
ウムを添加すると安定化されるのに対し、ＫＦＰ４１９
株の場合はそのような事実は見られなかった。阻害剤
（酵素活性を無くす試薬）は、ＫＦＰ４１９株の場合も
含めて、エラスターゼ活性を無くすものが共通して用い
られる。分子量、つまりタンパク質の大きさは、他のも
のが２７，０００乃至２５，０００であるのに対し、Ｋ
ＦＰ４１９株の場合は２９，８００、と大きく相違して
いる。この比較例からも明らかなように、本実施例のＫ
ＦＰ４１９株における生成エラスターゼの特徴が現れて
いる。

【００３７】以上のことから、ＫＦＰ４１９株は、新種
の高エラスターゼ生産納豆菌であることが思料されるも
のである。

【００３８】本発明に係るＫＦＰ４１９株と、ＫＦＰ３
５５株、市販の納豆菌３株、すなわちＫＦＰ１株、ＫＦ
Ｐ２株及びＫＦＰ４株を用い、常法に従ってそれぞれ納
豆を製造し、これらの成分を比較検討した。尚、納豆の
製造は、図１０に示すように、２４時間の醗酵過程と、
これに続く２４時間の熟成過程を設けて行った。

【００３９】図１１は、前記供試菌株を用いて製造され
た納豆の成分を表わしたもので、本発明に係るＫＦＰ４
１９株は、他の菌株のものと比べ、上段の水分、タンパ
ク質、脂肪、灰分、炭水化物において大差ないこと、下
段において、γ−ＧＴＰが高く、更に、プロテアーゼ活
性が高いという特徴のあることが判明した。

【００４０】図１２は、供試菌株によって生産される粘
質物の相対粘度を示す図で、ＫＦＰ４１９株のものを１
００として表わしている。この図からＫＦＰ４１９株の
ものがとりわけ市販のものに対し、比較的粘りの強い納
豆であることが理解され得る。

【００４１】図１３は、納豆粘質物中のエラスターゼ活
性を表わしたもので、本発明に係るＫＦＰ４１９株で納
豆を製造した場合も、培地で培養していた場合と同様に
エラスターゼ活性を発揮するか否かを調べた。そして、
図に示されるように、ＫＦＰ４１９株は、市販のものの
略２倍のエラスターゼ活性の存することを確認した。

【００４２】図１４は、前記供試菌株を用いて製造され
た納豆の官能検査結果を示すもので、醗酵終了後２日目
に、専門のパネラー８名により、それぞれ最高の７から
最低の１迄の７段階評価において、各パネラーが普段購
入する市販の納豆と同じ程度のものを「４」とした場合
に、これと対比して各項目に亘りその評価を記入したも
のの平均値を出したものである。これによると、ＫＦＰ
４１９株で製造した納豆は、特に、味がよく、糸引き性
が高く、総合評価が良好である結果が得られている。

【００４３】更に、本発明者等は、浸浸大豆、蒸煮大
豆、並びに前記供試菌株を用いて製造された納豆の糖分
（図１５）と、有機酸（図１６）の分析を試みた。

【００４４】納豆には６乃至７％の糖分が含有されてい
ることが知られているが、図１５は、納豆は浸浸大豆や
蒸煮大豆に比べその含有量が減少することを示してい
る。中でもＫＦＰ２株は糖分が他よりは多いが、ＫＦＰ
４１９株は市販の納豆の糖分含有量の範囲内に位置して
いることが理解される。

【００４５】同様に、有機酸も、図１６に示すように、
ＫＦＰ４１９株は市販の納豆の有機酸含有量の範囲内に
位置していることが理解される。

【００４６】このようにして、ＫＦＰ４１９株を用いて
製造された納豆は、一方で、普通の納豆ができているこ
と、他方で、市販の納豆に比べ略２倍もエラスターゼ活
性の高いことが明らかとなった。

【００４７】

【発明の効果】以上説明したように、本発明は、エラス
ターゼ生産納豆菌の中でもとりわけ高いエラスターゼ活
性を示す納豆菌であり、そして、この高エラスターゼ生
産納豆菌を用いて製造された納豆は、特にエラスターゼ
活性が高く、更に味がよくて糸引き性が高いものであ
り、従って、本発明による納豆菌及び納豆は、納豆一般
が有する健康食品として評価を、名実ともにより一層高
めることができるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】バチルスナットーＫＦＰ３５５の放射線照射突
然変異を示すフローチャートである。

【図２】スクリーニングにおける供試菌のエラスターゼ
活性を示すものである。

【図３】セファデックスＧ−７５によるエラスターゼの
精製を示す図である。

【図４】エラスターゼのポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す図である。

【図５】エラスターゼ反応のラインウイーババルクのプ
ロットを示す図である。

【図６】エラスターゼに対する温度の効果を示す図であ
る。

【図７】エラスターゼのｐＨに対する効果を示す図であ
る。

【図８】エラスターゼの安定性を示す図である。

【図９】微生物由来エラスターゼとプロテアーゼの比較
を示すものである。

【図１０】納豆製造における温湿度条件を示す図であ
る。

【図１１】供試菌株を用いて製造された納豆の成分を表
わしたものである。

【図１２】供試菌株によって生産される粘質物の相対粘
度を示す図である。

【図１３】納豆粘質物中のエラスターゼ活性を表わした
ものである。

【図１４】供試菌株を用いて製造された納豆の官能検査
結果を示すものである。

【図１５】納豆の遊離糖含量を示す図である。

【図１６】納豆の有機酸含量を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 木村 典代 東京都千代田区一ツ橋２−２−１ 共立女 子大学内 (72)発明者 吉見 朋恵 東京都千代田区一ツ橋２−２−１ 共立女 子大学内 (72)発明者 渡辺 杉夫 東京都板橋区大山東町29番９号 鈴与工業 株式会社内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バチルス・ズブチリスに属する納豆菌で
   あって、エラスターゼ生産性が改良された納豆菌変異株
   ＫＦＰ４１９株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４３０４）。
2. 【請求項２】 バチルス・ズブチリスに属し、エラスタ
   ーゼ生産性が改良された納豆菌である納豆菌変異株ＫＦ
   Ｐ４１９株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４３０４）を用いて納豆
   を製造することを特徴とする納豆の製造方法。