JP2011182674A - ケラチナーゼおよびその製造法 - Google Patents
ケラチナーゼおよびその製造法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011182674A JP2011182674A JP2010049279A JP2010049279A JP2011182674A JP 2011182674 A JP2011182674 A JP 2011182674A JP 2010049279 A JP2010049279 A JP 2010049279A JP 2010049279 A JP2010049279 A JP 2010049279A JP 2011182674 A JP2011182674 A JP 2011182674A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- keratinase
- present
- culture
- producing
- genus aspergillus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010059345 keratinase Proteins 0.000 title claims abstract description 82
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims abstract description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 claims abstract description 20
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 claims abstract description 20
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 15
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 claims description 18
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 claims description 18
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 17
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 8
- 239000010902 straw Substances 0.000 claims description 8
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 7
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 claims description 6
- 235000013555 soy sauce Nutrition 0.000 claims description 6
- 244000294411 Mirabilis expansa Species 0.000 claims description 5
- 235000015429 Mirabilis expansa Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 5
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000013536 miso Nutrition 0.000 claims description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 claims description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 4
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 claims description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 4
- 235000020083 shōchū Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000019992 sake Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000013040 bath agent Substances 0.000 claims 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 abstract description 5
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 abstract description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 abstract description 3
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 16
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 9
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 9
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 6
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 5
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- BDKZHNJTLHOSDW-UHFFFAOYSA-N [Na].CC(O)=O Chemical compound [Na].CC(O)=O BDKZHNJTLHOSDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 1-(4-chlorophenoxy)-3,3-dimethyl-1-(1,2,4-triazol-1-yl)butan-2-one Chemical compound C1=NC=NN1C(C(=O)C(C)(C)C)OC1=CC=C(Cl)C=C1 WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228251 Aspergillus phoenicis Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011511 Diospyros Nutrition 0.000 description 2
- 241000723267 Diospyros Species 0.000 description 2
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 2
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 2
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 2
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 description 1
- 241000131386 Aspergillus sojae Species 0.000 description 1
- 241001112078 Aspergillus usamii Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 244000239348 Echinochloa crus galli var. praticola Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 241000893980 Microsporum canis Species 0.000 description 1
- 235000006089 Phaseolus angularis Nutrition 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710174704 Subtilisin-like serine protease Proteins 0.000 description 1
- 241000893982 Trichophyton simii Species 0.000 description 1
- 240000007098 Vigna angularis Species 0.000 description 1
- 235000010711 Vigna angularis Nutrition 0.000 description 1
- 244000126002 Ziziphus vulgaris Species 0.000 description 1
- ZDPALFHDPFYJDY-UHFFFAOYSA-N [Na].OC=O Chemical compound [Na].OC=O ZDPALFHDPFYJDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000003788 bath preparation Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002070 germicidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001530 keratinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NFIYTPYOYDDLGO-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;sodium Chemical compound [Na].OP(O)(O)=O NFIYTPYOYDDLGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Devices For Medical Bathing And Washing (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Abstract
【課題】安全な微生物菌株から、新たな性質を有するケラチナーゼを効率よく製造する方法、ならびに該方法により得られるケラチナーゼを提供する。
【解決手段】芋、豆、穀物類にAspergillus属の微生物を接種して固体培養を行い、得られた培養物を２５℃〜６０℃の水に浸漬し、ケラチナーゼを抽出することを特徴とするケラチナーゼの製造方法、ならびに該方法により得られるケラチナーゼ。
【選択図】なし
【解決手段】芋、豆、穀物類にAspergillus属の微生物を接種して固体培養を行い、得られた培養物を２５℃〜６０℃の水に浸漬し、ケラチナーゼを抽出することを特徴とするケラチナーゼの製造方法、ならびに該方法により得られるケラチナーゼ。
【選択図】なし
Description
本発明は、ケラチナーゼおよびその製造法に関する。詳細には、本発明は、芋、豆、穀物類にAspergillus属の微生物を接種して固体培養を行い、得られた培養物を比較的高温の水に浸漬し、抽出を行うことを特徴とするケラチナーゼの製造方法、および該方法により得られるケラチナーゼに関する。
従来、ケラチナーゼを選抜・取得するための方法としては、ケラチナーゼ活性を有する菌株を養鶏場等の土壌からスクリーニングし、得られた菌体そのものを利用する、あるいはそれらの菌体が有するケラチナーゼをコードする遺伝子をクローニングし、組換え発現させるというものであった（非特許文献１および２）。しかしスクリーニングにより得られた菌株には病原性を有する場合もあり、安全性に問題がある。したがって、安全性の高い菌株を用いてケラチナーゼを製造すること、ならびに安全性の高い菌株由来のケラチナーゼに対する必要性が生じている。
さらに、新たな性質を有するケラチナーゼを探索する必要性もある。例えば、近年よく用いられている洗剤は弱酸性のものが多く、かかる条件下でも十分に作用するケラチナーゼを洗剤に配合する必要性がある。
Singh, C.J. "Characterization of an extracellular keratinase of Trichophyton simii and its role in keratin degradation." Mycopathologia, 137, 13-16 (1997)
Descamps, F., Brouta, F., Vermout, S., Monod, M., Losson, B., Mignon, B. "Recombinant expression and antigenic properties of a 31.5-kDa keratinolytic subtilisin-like serine protease from Microsporum canis."FEMS Immunol Med Microbiol.38, 29-34 (2003)
本発明は、安全な微生物菌株から、新たな性質を有するケラチナーゼを効率よく製造する方法を開発すること、ならびにそのような方法により得られるケラチナーゼを提供することを課題とした。
本発明者らは、上記現状および課題に鑑みて鋭意研究を重ね、芋、豆、穀物類にAspergillus属の微生物を接種して固体培養を行い、得られた培養物を比較的高温の水に浸漬し、抽出を行うことにより得られる抽出液がケラチナーゼを含有すること、得られたケラチナーゼが酸性領域において高い活性を有する新規なタイプのものであること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のものを提供する：
（１）芋、豆、穀物類にAspergillus属の微生物を接種して固体培養を行い、得られた培養物を２５℃〜６０℃の水に浸漬し、ケラチナーゼを抽出することを特徴とするケラチナーゼの製造方法。
（２）穀物類が米または麦である（１）記載の方法。
（３）Aspergillus属が、酒造、焼酎、味噌、醤油製造用のものである（１）または（２）記載の方法。
（４）培養物を５０〜６０℃の水に浸漬する（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の方法により得られるケラチナーゼ。
（６）至適ｐＨがｐＨ約３．５〜ｐＨ約５である（５）記載のケラチナーゼ。
（７）下記の特徴：
ケラチンに作用し、エラスチン、コラーゲンに作用しない
至適ｐＨがｐＨ約３．５〜ｐＨ約５である
ｐＨ４〜ｐＨ６で２５℃、１６時間置いた後に失活が認められない
約５５℃までの温度にてｐＨ４．５で１時間置いた後に失活が認められない
を有するAspergillus属由来のケラチナーゼ。
（８）（５）、（６）または（７）記載のケラチナーゼを含有する洗剤、化粧品または入浴剤。
（１）芋、豆、穀物類にAspergillus属の微生物を接種して固体培養を行い、得られた培養物を２５℃〜６０℃の水に浸漬し、ケラチナーゼを抽出することを特徴とするケラチナーゼの製造方法。
（２）穀物類が米または麦である（１）記載の方法。
（３）Aspergillus属が、酒造、焼酎、味噌、醤油製造用のものである（１）または（２）記載の方法。
（４）培養物を５０〜６０℃の水に浸漬する（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の方法により得られるケラチナーゼ。
（６）至適ｐＨがｐＨ約３．５〜ｐＨ約５である（５）記載のケラチナーゼ。
（７）下記の特徴：
ケラチンに作用し、エラスチン、コラーゲンに作用しない
至適ｐＨがｐＨ約３．５〜ｐＨ約５である
ｐＨ４〜ｐＨ６で２５℃、１６時間置いた後に失活が認められない
約５５℃までの温度にてｐＨ４．５で１時間置いた後に失活が認められない
を有するAspergillus属由来のケラチナーゼ。
（８）（５）、（６）または（７）記載のケラチナーゼを含有する洗剤、化粧品または入浴剤。
本発明によれば、効率的なケラチンの製造方法、ならびに酸性領域および高温において高い活性を有する新規ケラチナーゼが提供される。しかも本発明において使用する菌株は麹菌などの食品醸造用の菌株であるため安全性が高く、得られるケラチナーゼの毒性に関しても心配はない。また本発明により得られるケラチナーゼは、廃棄物中の毛髪などのケラチン含有タンパク質の分解や皮膚、爪及び毛髪のケア用化粧品・入浴剤などに適用可能である。
本発明は、１の態様において、芋、豆、穀物類にAspergillus属の微生物を接種して固体培養を行い、得られた培養物を約２５℃〜約６０℃の水に浸漬し、ケラチナーゼの抽出を行うことを特徴とするケラチナーゼの製造方法に関するものである。
本発明のケラチナーゼの製造方法の第１の工程は、芋、豆、穀物類にAspergillus属の微生物を接種して固体培養を行う工程である。Aspergillus属の微生物を接種する芋、豆、穀物類はAspergillus属の微生物が増殖しケラチナーゼを産生しうるものであればいずれの種類であってもよく、限定されない。芋の例としてはバレイショ、サツマイモ、キャッサバなどが挙げられる。豆の例としてはダイズ、アズキ、ナタマメなどが挙げられる。穀物類の例としては米、麦、アワ、キビ、ヒエ、コウリャンなどが例示される。Aspergillus属の微生物を接種して固体培養を行うのに好ましい穀物類は米および麦であり、なかでも米が好ましい。芋、豆、穀物類へのAspergillus属の微生物の接種方法はいずれの方法であってもよいが、好ましくは胞子を形成したAspergillus属の微生物の菌体またはAspergillus属の微生物の胞子を適量接種する。接種後、よく混合することが好ましい。典型的には種麹を芋、豆、穀物類に適量接種する。芋、豆、穀物類は加熱処理をしていなくてもよく、蒸煮などの加熱処理をしたものであってもよい。接種量は、使用する芋、豆、穀物類の種類、量および加熱処理の有無、接種されるAspergillus属の微生物の種類、固体培養条件などに応じて当業者が適宜決定することができる。
固体培養は、Aspergillus属の微生物の発芽および増殖、ならびにケラチナーゼ産生に適した条件下で行うことが好ましい。温度、培養時間、水分量、通気量などの固体培養の諸条件もまた、使用する芋、豆、穀物類の種類、量および加熱処理の有無、接種されるAspergillus属の微生物の種類などに応じて当業者が適宜決定することができる。固体培養中は培養物の温度を適温に保ち、通気を図って菌の増殖および酵素の産生を促進するために、いわゆる「切返し」「盛り」「手入れ」等の作業を適宜行うことが好ましい。菌株や培養条件により異なるが、十分な菌糸の生育が見られた時点ないし十分な胞子の着生が見られた時点で、次の浸漬工程に移す。
上で説明した固体培養は、公知の製麹方法に従って行うこともできる。麹は、糸状菌を米、麦等の穀物類、大豆等の豆類、あるいは芋類などの食品素材に接種して発育させたものをいう。本発明において用いる芋、豆、穀物類は１種類であってもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。本発明に使用されるAspergillus属の微生物の菌株は、ケラチナーゼを産生しうる菌株であればいずいれの菌株であってもよいが、Aspergillus属の微生物が好ましい。なかでも酒造、焼酎、味噌、醤油製造用の麹菌が安全性の点から特に好ましい。好ましい麹菌の具体例としては、Aspergillus awamori、Aspergillus saitoi、Aspergillus saitoi var. kagoshimaensis、Aspergillus usami、Aspergillus sojae、Aspergillus oryzae、Aspergillusvar. kawachiiなどが挙げられる。本発明に用いるAspergillus属の菌株は１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。また、本発明に使用するAspergillus属の菌株として、種麹を用いてもよい。種麹は市販されており、適宜選択して使用することができる。本発明に使用できる好ましい種麹としては、株式会社菱六から市販されている「菱六もやし 糖化マイティ」、「菱六もやし 改良長白菌」、「菱六もやし SR-108」、「菱六もやし 長白菌」、「菱六もやし A-27」、「菱六もやし 白夜」、「菱六もやし 月下氷吟」、「菱六もやし 焼酎用白麹菌No.198」、「菱六もやし 焼酎用くろ」、「菱六もやし 醤油用旭菌」、「菱六もやし 特撰自動製麹用」または「菱六もやし 特殊吟醸用」などが例示される。
本発明のケラチナーゼの製造方法の第２の工程は、上記工程で得られた培養物を約２５℃〜約６０℃の水に浸漬し、ケラチナーゼを抽出する工程である。浸漬は培養物と水が十分に混ざるようにすればよい。浸漬の態様は特に限定はないが、培養物を水に浸してもよく、懸濁してもよい。水の量は、浸漬中にケラチナーゼの抽出が十分に行われるような量とする。浸漬中に適宜撹拌してケラチナーゼの抽出を促進してもよい。浸漬中に菌が増殖してもよく、増殖しなくてもよい。浸漬に用いる水の温度は約２５℃〜約６０℃、好ましくはより高温の約４５℃〜約６０℃、さらに好ましくは約５０℃〜約６０℃であり、例えば、約５０℃〜約５５℃、約５３℃〜約５７℃、あるいは約５５℃などの水に浸漬することができる。浸漬温度が低すぎるとケラチナーゼ以外の酵素の失活が抑制され、得られるケラチナーゼの純度が低下する。さらに酵素の抽出効率も低下する。浸漬温度が高すぎるとケラチナーゼの失活も進み、ケラチナーゼの収量が低下する。浸漬時間は、ケラチナーゼが十分に抽出される時間であればよい。通常は約２４時間〜約９６時間、好ましくは約３６時間〜約９６時間、例えば約３６時間〜約８４時間、約４０時間〜約４８時間、約４８時間〜約７２時間などである。浸漬時間が短すぎるとケラチナーゼの抽出が不十分となり、その収量が低下する。浸漬時間が長すぎるとケラチナーゼの失活が進み、さらには雑菌が繁殖してケラチナーゼが分解され、雑菌酵素の混入によりケラチナーゼの純度が低下してしまう。浸漬の水温および浸漬時間は上記範囲でなくてもよく、当業者が諸条件に応じて適宜決定することができる。
浸漬・抽出が終了したら抽出液をケラチナーゼ酵素液として得る。抽出液を固液分離して上清をケラチナーゼ酵素液としてもよい。したがって、本発明の製造方法における抽出は、上清を得る操作も包含しうる。上清は、公知の固液分離方法、例えば、遠心分離、ろ過、布で絞る等の方法を用いて得ることができる。得られたケラチナーゼ酵素液をそのままケラチナーゼとして使用してもよいが、酵素液を硫安等で濃縮してもよく、凍結乾燥等の処理を行ってから用いてもよい。さらに、酵素液を公知の手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニィークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動などの手段にて精製して、ケラチナーゼの純度を高めてから用いてもよい。
本発明のケラチナーの製造方法において、例えば５０℃以上の生体においては高温とされる温度で、例えば４８時間以上の比較的長時間の浸漬・抽出を行うことが特徴である。これらの条件下で安定して存在する酵素は少ないので、比較的簡単な操作、かつ低コストで、かつ遺伝子組換え技術等を用いることなく純度の高いケラチナーゼを得ることができる。また、かかる比較的高温での工程はバイオリアクターにおける酵素生産において冷却エネルギーを削減できる。さらに、本発明の製造方法は、既存の清酒や味噌、醤油などに代表される発酵食品を製造する糖化の工程を流用あるいは部分的に改変するだけで実施しうるという利点もある。
そのうえ、酒造、焼酎、味噌、醤油製造用の麹菌を用いてケラチナーゼを製造する場合には、得られるケラチナーゼ製品の安全性が保証されているので、ヒトやペットが日常使用する洗剤、爪または毛髪のケア用化粧品、入浴剤などへの適用において有利である。
本発明により得られるAspergillus属由来のケラチナーゼは、酸性・高温条件下、例えばｐＨ約３．５〜ｐＨ約５、約５５℃において高いケラチン分解活性を有し、安定である等の従来のケラチナーゼには見られない特徴を有する。すなわち、本発明により得られるケラチナーゼは、
ケラチンに作用し、エラスチン、コラーゲンに作用しない
ケラチン分解活性の至適ｐＨがｐＨ約３．５〜ｐＨ約５である
ｐＨ４〜ｐＨ６で２５℃、１６時間置いた後にケラチン分解活性の失活が認められない
約５５℃までの温度にてｐＨ４．５で６０分間置いた後にケラチン分解活性の失活が認められない
という特徴を有する。
ケラチンに作用し、エラスチン、コラーゲンに作用しない
ケラチン分解活性の至適ｐＨがｐＨ約３．５〜ｐＨ約５である
ｐＨ４〜ｐＨ６で２５℃、１６時間置いた後にケラチン分解活性の失活が認められない
約５５℃までの温度にてｐＨ４．５で６０分間置いた後にケラチン分解活性の失活が認められない
という特徴を有する。
上述のごとく、従来のケラチナーゼは中性からアルカリ性領域で活性を有するものが多いが、本発明のケラチナーゼは酸性領域において安定で高い活性を有する。最近の洗剤や化粧品は弱酸性のものが多く、本発明のケラチナーゼはこれらの洗剤や化粧品に好適に用いられる。本発明のケラチナーゼは、廃棄物中の毛髪などのケラチン含有タンパク質の分解、例えば、廃棄物処理剤や水質改善剤、下水処理剤の有効成分として用いられるほか、皮膚、爪および毛髪のケア用化粧品、入浴剤、洗剤などに添加して用いることができる。
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例はあくまでも例示説明であり、本発明を限定するものではない。
実施例１：ケラチナーゼの製造
洗米、浸漬、蒸煮が終了した原料米を４０℃程度に冷却し、種麹「菱六もやし 糖化マイティ」を所定重量比（０．３％ｗ／ｗ）だけ接種し、両者が均一となるまで混合した。その後、混合物を製麹装置内に投入して、初期温度を３２〜３４℃程度に加温した状態で固体培養（製麹）を行った。製麹装置内の培養物の温度は、製麹が進行するに従って時間的に変化していくので、「切返し」「盛り」「手入れ」等の作業により、３６〜４０℃程度を保持し、種麹接種後４０〜４８時間で製麹を終了した。
洗米、浸漬、蒸煮が終了した原料米を４０℃程度に冷却し、種麹「菱六もやし 糖化マイティ」を所定重量比（０．３％ｗ／ｗ）だけ接種し、両者が均一となるまで混合した。その後、混合物を製麹装置内に投入して、初期温度を３２〜３４℃程度に加温した状態で固体培養（製麹）を行った。製麹装置内の培養物の温度は、製麹が進行するに従って時間的に変化していくので、「切返し」「盛り」「手入れ」等の作業により、３６〜４０℃程度を保持し、種麹接種後４０〜４８時間で製麹を終了した。
得られた固体培養物（麹）と水を２：３（ｗ／ｗ）の比率で混合し、５５℃にて７２時間浸漬し、酵素を抽出した。得られた抽出物を０．４５μｍのフィルターにてろ過し、ろ液に７０％の飽和硫酸アンモニウムを加えて十分に沈殿を生じさせた後、１０，０００ｇにて１時間遠心し、上清画分を回収した。この上清画分を２Ｍ 硫酸アンモニウムにて平衡化した疎水カラム（Phenyl sepharose fast flow）にかけタンパク質を吸着させ、２Ｍ 硫酸アンモニウムで非結合のタンパク質を洗い流した後、１．３Ｍ硫酸アンモニウムで溶出させ回収した。この回収画分について透析を行い酵素溶液とした。
実施例２：ケラチナーゼの性質
実施例で得られた酵素溶液にケラチナーゼ活性を以下のようにして測定した。ケラチン分解の活性測定に用いた基質を下記のごとく調製した。トリ羽毛２．０ｇに対してジメチルスルホキシド１００ｍｌを加え１００℃にて２時間処理し、ろ過を行いケラチンを含むタンパク溶出液を回収した。回収したタンパク溶液に２倍量のアセトンを加え−２０℃で１６時間静置しタンパク質を沈殿させた。１６時間後、沈殿溶液を６，０００ｇで遠心し、沈殿を蒸留水で洗い、再度蒸留水を加えたものを基質とした。
実施例で得られた酵素溶液にケラチナーゼ活性を以下のようにして測定した。ケラチン分解の活性測定に用いた基質を下記のごとく調製した。トリ羽毛２．０ｇに対してジメチルスルホキシド１００ｍｌを加え１００℃にて２時間処理し、ろ過を行いケラチンを含むタンパク溶出液を回収した。回収したタンパク溶液に２倍量のアセトンを加え−２０℃で１６時間静置しタンパク質を沈殿させた。１６時間後、沈殿溶液を６，０００ｇで遠心し、沈殿を蒸留水で洗い、再度蒸留水を加えたものを基質とした。
ケラチン分解活性測定方法について説明する。０〜５０ｍＭ 酢酸‐ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）中に、８ｍｇ／ｍｌ濃度になるように基質を加え基質溶液とした。基質溶液に１／１０ ｖ／ｖの酵素溶液を加え５５℃にて一時間反応させた。氷冷することで反応を停止させた。酵素を加えずに基質溶液のみのものも５５℃一時間反応させ、氷冷したのちに酵素を１／１０ ｖ／ｖ加えゼロタイム（反応開始時）のサンプルとした。反応停止させた液を１２，０００ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収した。回収した上清に２倍量のニンヒドリン溶液を加え１００℃で５分発色反応を行い、５７０ｎｍの吸光度を測定し、１時間反応液とゼロタイム反応液の吸光度を比較することで活性の有無を判定した。図１に１０倍に希釈した培養液を用いて酵素活性の時間経過を追ったデータを示す。グラフから明らかなように時間経過とともに基質と酵素溶液を含む反応液においてはアミノ酸量が増加していることが認められている一方で、酵素溶液のみの反応液ではアミノ酸量が増加していないことから酵素の自己消化は認められず、アミノ酸の増加が基質であるケラチンが分解されたためであることが確認された。比活性は５７０ｎｍ／２８０ｎｍで計算すると、培養抽出液の段階で０．００４６、疎水カラム溶出後のサンプルで１．２４であった。
次に、疎水カラム溶出後のサンプルについて、ケラチナーゼの諸性質を調べた。活性測定は上記ごとくケラチンを基質として行った。
（ａ）至適ｐＨ
それぞれのｐＨで基質と酵素を５５℃で１時間反応させ活性測定を行った。それぞれのバッファーは、５０ｍＭ ギ酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ２．５〜３．５）、５０ｍＭ 酢酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ３．５〜６）、５０ｍＭ リン酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ６〜８）を用いた。結果を図２に示す。本発明のケラチナーゼは酸性側で活性が高く、ｐＨ３．５〜ｐＨ５が至適ｐＨと考えられた。本発明のケラチナーゼはｐＨ４．５において最も活性が高かった。
（ａ）至適ｐＨ
それぞれのｐＨで基質と酵素を５５℃で１時間反応させ活性測定を行った。それぞれのバッファーは、５０ｍＭ ギ酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ２．５〜３．５）、５０ｍＭ 酢酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ３．５〜６）、５０ｍＭ リン酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ６〜８）を用いた。結果を図２に示す。本発明のケラチナーゼは酸性側で活性が高く、ｐＨ３．５〜ｐＨ５が至適ｐＨと考えられた。本発明のケラチナーゼはｐＨ４．５において最も活性が高かった。
（ｂ）ｐＨ安定性
酵素溶液をそれぞれのｐＨ下で１６時間インキュベートした後、５０ｍＭ 酢酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）中で，基質と酵素を５５℃で１時間反応させて活性測定を行った。それぞれのバッファーは、１０ｍＭ ギ酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ３）、１０ ｍＭ酢酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ４〜６）、１０ｍＭ リン酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ６〜８）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９）を用いた。結果を図３に示す。本発明のケラチナーゼは酸性側で安定で、ｐＨ４〜６で最も安定であり、これらのｐＨに２５℃、１６時間置いた後であっても失活は認められなかった。
酵素溶液をそれぞれのｐＨ下で１６時間インキュベートした後、５０ｍＭ 酢酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）中で，基質と酵素を５５℃で１時間反応させて活性測定を行った。それぞれのバッファーは、１０ｍＭ ギ酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ３）、１０ ｍＭ酢酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ４〜６）、１０ｍＭ リン酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ６〜８）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９）を用いた。結果を図３に示す。本発明のケラチナーゼは酸性側で安定で、ｐＨ４〜６で最も安定であり、これらのｐＨに２５℃、１６時間置いた後であっても失活は認められなかった。
（ｃ）温度安定性
基質以外の反応液をそれぞれの温度にて事前に１時間インキュベートし（５０ｍＭ酢酸−ナトリウムバッファー中）、一度氷中で冷却したあと、５０ｍＭ 酢酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）中で基質と酵素を５５℃で、１時間反応させた。結果を図４に示す。本発明のケラチナーゼは５５℃までの温度（１時間保持）では失活が認められなかった。
基質以外の反応液をそれぞれの温度にて事前に１時間インキュベートし（５０ｍＭ酢酸−ナトリウムバッファー中）、一度氷中で冷却したあと、５０ｍＭ 酢酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）中で基質と酵素を５５℃で、１時間反応させた。結果を図４に示す。本発明のケラチナーゼは５５℃までの温度（１時間保持）では失活が認められなかった。
（ｄ）基質特異性
５０ｍＭ酢酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）中それぞれの基質濃度が８ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、酵素溶液を加え５５℃にて１時間反応させて活性を測定した。結果を表１に示す。本発明のケラチナーゼはケラチンを最も強く分解した。ゼラチンおよびカゼインも分解されたが、ケラチンほどではなかった。コラーゲンおよびエラスチンは本発明のケラチナーゼによっては分解されなかった。
分解活性の強さ ＋＋＞＋
−は分解が認められないことを示す。
５０ｍＭ酢酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）中それぞれの基質濃度が８ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、酵素溶液を加え５５℃にて１時間反応させて活性を測定した。結果を表１に示す。本発明のケラチナーゼはケラチンを最も強く分解した。ゼラチンおよびカゼインも分解されたが、ケラチンほどではなかった。コラーゲンおよびエラスチンは本発明のケラチナーゼによっては分解されなかった。
分解活性の強さ ＋＋＞＋
−は分解が認められないことを示す。
（ｅ）阻害剤
５０ｍＭ酢酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）中の阻害剤（表２参照）および基質に酵素溶液を加え、５５℃にて１時間反応させて活性を測定した。本発明のケラチナーゼはＳＤＳ、ＰＭＳＦおよびペプスタチンＡによって阻害されることがわかった。
５０ｍＭ酢酸−ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）中の阻害剤（表２参照）および基質に酵素溶液を加え、５５℃にて１時間反応させて活性を測定した。本発明のケラチナーゼはＳＤＳ、ＰＭＳＦおよびペプスタチンＡによって阻害されることがわかった。
本発明は、洗剤、爪または毛髪のケア用化粧品、入浴剤などの製造、ならびに下水処理や水質改善等に利用可能である。
Claims (8)
- 芋、豆、穀物類にAspergillus属の微生物を接種して固体培養を行い、得られた培養物を２５℃〜６０℃の水に浸漬し、ケラチナーゼを抽出することを特徴とするケラチナーゼの製造方法。
- 穀物類が米または麦である請求項１記載の方法。
- Aspergillus属が、酒造、焼酎、味噌、醤油製造用のものである請求項１または２記載の方法。
- 培養物を５０〜６０℃の水に浸漬する請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
- 請求項１〜４のいずれか１項記載の方法により得られるケラチナーゼ。
- 至適ｐＨがｐＨ３．５〜ｐＨ５である請求項５記載のケラチナーゼ。
- 下記の特徴：
ケラチンに作用し、エラスチン、コラーゲンに作用しない
至適ｐＨがｐＨ３．５〜ｐＨ５である
ｐＨ４〜ｐＨ６で２５℃、１６時間置いた後に失活が認められない
５５℃までの温度にてｐＨ４．５で１時間置いた後に失活が認められない
を有するAspergillus属由来のケラチナーゼ。 - 請求項５ないし７のいずれか一項に記載のケラチナーゼを含有する洗剤、化粧品または入浴剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010049279A JP5699261B2 (ja) | 2010-03-05 | 2010-03-05 | ケラチナーゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010049279A JP5699261B2 (ja) | 2010-03-05 | 2010-03-05 | ケラチナーゼおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011182674A true JP2011182674A (ja) | 2011-09-22 |
| JP5699261B2 JP5699261B2 (ja) | 2015-04-08 |
Family
ID=44789707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010049279A Active JP5699261B2 (ja) | 2010-03-05 | 2010-03-05 | ケラチナーゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5699261B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5748256B1 (ja) * | 2014-09-04 | 2015-07-15 | 金氏高麗人参株式会社 | ジンセノサイド組成物 |
| CN112175977A (zh) * | 2020-10-30 | 2021-01-05 | 华中农业大学 | 一种米曲霉角蛋白酶基因及其表达载体与应用 |
| CN117286126A (zh) * | 2023-09-27 | 2023-12-26 | 北京华腾信和科贸有限公司 | 一种长时间耐热耐酸角蛋白酶及其在羊毛样品处理中的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1417328A (zh) * | 2001-11-09 | 2003-05-14 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 | 一种角蛋白酶的固态发酵制备方法及其应用 |
-
2010
- 2010-03-05 JP JP2010049279A patent/JP5699261B2/ja active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1417328A (zh) * | 2001-11-09 | 2003-05-14 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 | 一种角蛋白酶的固态发酵制备方法及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6014031896; Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４, 2004, ｐ．８５-９３ * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5748256B1 (ja) * | 2014-09-04 | 2015-07-15 | 金氏高麗人参株式会社 | ジンセノサイド組成物 |
| WO2016035182A1 (ja) * | 2014-09-04 | 2016-03-10 | 金氏高麗人参株式会社 | ジンセノサイド組成物 |
| CN112175977A (zh) * | 2020-10-30 | 2021-01-05 | 华中农业大学 | 一种米曲霉角蛋白酶基因及其表达载体与应用 |
| CN112175977B (zh) * | 2020-10-30 | 2022-04-15 | 华中农业大学 | 一种米曲霉角蛋白酶基因及其表达载体与应用 |
| CN117286126A (zh) * | 2023-09-27 | 2023-12-26 | 北京华腾信和科贸有限公司 | 一种长时间耐热耐酸角蛋白酶及其在羊毛样品处理中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5699261B2 (ja) | 2015-04-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5699261B2 (ja) | ケラチナーゼおよびその製造法 | |
| JP2011182663A (ja) | 鯖速醸魚醤及びその製造法 | |
| JP6800950B2 (ja) | 血栓溶解酵素の高生産のバチルス・サブチリス菌株 | |
| JP3564121B2 (ja) | 納豆菌及び納豆の製造方法 | |
| KR101834230B1 (ko) | 저염식 담금 메주 된장의 제조방법 | |
| JP2002306159A (ja) | 醤油用麹菌及びそれを用いた醤油の製造法 | |
| JP2008048686A (ja) | 大豆加工食品 | |
| JP4663954B2 (ja) | 発酵食品及びその凝集処理方法 | |
| JP4657568B2 (ja) | γ−アミノ酪酸富化麹及び高塩分食品の製造方法 | |
| JP2000106835A (ja) | 紅麹及びその製造法 | |
| JP2000060536A (ja) | 麹の製造方法 | |
| JP3783915B2 (ja) | 納豆菌由来の生理活性物質 | |
| JPH10165191A (ja) | 麹菌によるγ−アミノ酪酸の生産 | |
| JPH0616678B2 (ja) | 菜種粕の処理法 | |
| KR20010104790A (ko) | 비지를 이용한 효소분해 간장 및 그 간장의 제조방법 | |
| JP5912717B2 (ja) | 小麦グルテン酵素分解液 | |
| JPH0662793A (ja) | 固体麹の製造法 | |
| JPH0371877B2 (ja) | ||
| JPS61170384A (ja) | 塩化マグネシウムを利用した発酵方法 | |
| JPH04166055A (ja) | 納豆の製造法 | |
| Aljammas et al. | Partial purification and characterization of Rhizomucor miehei protease from wild-type and mutated strains | |
| JPS62134062A (ja) | 調味液の製造方法 | |
| JP2004290155A (ja) | 麹菌およびその育種法 | |
| JPH0449989B2 (ja) | ||
| JP2005046049A (ja) | 新規発酵豆乳およびその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20120309 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130304 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20130304 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140805 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141001 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20141021 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20141119 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20141119 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20141120 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5699261 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |