JPH08505119A

JPH08505119A - 接合目的のためのタンパク質の光活性化

Info

Publication number: JPH08505119A
Application number: JP6503482A
Authority: JP
Inventors: サイクス、トーマス、アール．; ウー、トーマス、ケイ．; キューアイ、ペイ; エイ．ノージャイム、アントワーヌ
Original assignee: バイオミラ、インコーポレーテッド
Priority date: 1992-07-06
Filing date: 1993-07-06
Publication date: 1996-06-04
Also published as: ATE160222T1; NO950037D0; AU675235B2; DE69315213T2; FI950062A0; EP0649532B1; AU4666893A; CA2137561C; EP0649532A1; NO950037L; DE69315213D1; WO1994001773A1; FI950062A; US6313274B1; CA2137561A1

Abstract

(57)【要約】１つまたは２つ以上のジスルフィド結合を有するタンパク質、例えば抗体を、１つまたは２つ以上の上記ジスルフィド結合を還元して紫外線照射し反応スルフヒドリル基にする。こうして得た光活性化タンパク質を、スルフヒドリルと反応性の他の化学物質、例えば特定の放射性金属、キレート化剤、薬物あるいは毒素などと反応させ、例えばインビトロ診断、インビボ造影、治療などに有益な接台体を得る。

Description

【発明の詳細な説明】接合目的のためのタンパク質の光活性化発明の背景発明の分野本発明は、放射性同位体などの化学物質［chemical entity］と反応して有用な接合体を形成するように、紫外線照射によってタンパク質を光活性化する方法に関する。背景技術の説明Ａ．抗体の放射性標識法テクネチウム（その他の同様な放射性金属）で抗体を標識する従来法は、その抗体のジスルフィド結合を化学還元剤で還元してから、その還元した抗体を還元したパーテクネテート（過テクネチウム酸塩）と反応させる方法である。化学還元剤は、酸化しやすいので取り扱いが困難である。化学還元剤はタンパク質に対して好ましくない副反応（例えばカルボニル基を還元するなど）をもたらすおそれがあり、強い還元剤を使う必要性があるときは、所与の還元反応度合いを制御することが困難である。放射性標識に先立ち、反応を中止し、可能性としてあり得る毒性物質（例えば、もし還元のために使われるなら、ＤＴＴ）を除去し、テクネチウムの錯化を回避するため、そしてそれによって還元された抗体をタンパク質の標識を防ぐため、還元した抗体を残存する還元剤から分離しなければならない。この精製工程は膨大な時間を必要とするから、タンパク質の喪失、もしくはタンパク質の再酸化反応につながる。還元されたテクネチウム源が放射性標識にとって必要とされているため、ある一定量の化学還元剤が、その還元されたタンパク質か、またはテクネチウム源自体のいずれかに添加されなければならなかった。後者は標識が必然的に少なくとも２工程以上になることを物語っている。 RhodesらのJ.Nucl．Med.，27:685（1986）及びCrockfordとRhodesの米国特許第4,424,200号（1984）は、抗体のＦ（ab’）₂フラグメントを放射性同位体Ｔｃ −９９ｍで標識する方法について開示している。これらのフラグメントはフタレートータルトレート緩衝液中で、化学還元剤の二価の第一スズイオン（例えばＳｎＣｌ₂）とともに一晩インキュベートされている。この「予備的スズメッキ」工程は、重鎖をつないでいるジスルフィド結合の還元によって２量体のＦ（ab’ ）₂を単量体のフラグメントに変換させる。これらフラグメントは次にＴｃ−９９ｍと反応させられる。残念ながら、このRhodes法にはいくつかの欠点がある。第１に、この方法は抗体を還元させるため高濃度のスズイオンを必要とする。しかしそれにも拘わらず、Rhodesはスズイオンの約２／３がタンパク質との反応中に酸化し、残りは後に添加されたときパーテクネテートを還元するのに使われることを望んでいる。しかしスズイオンが抗体還元に関与する度合を制御することは困難である。スズイオンが少なすぎるときは、パーテクネテートは残留物によって完全には還元されないであろう。また、パーテクネテートが多すぎるときは、そのあるものはパーテクネテートを錯化させ抗体に結合しないことになろう。したがって抗体を還元した後に残存するスズイオンを除いて、それからパーテクネテートを還元するため少量の制御された量を戻し添加していくことが慣行である。この精製工程は当然時間も費用も多大なものになる。例えばBremerらの欧州特許出願第271,806号「テクネチウム-99mで標識された組織特異性物質の製造法」を参照されたい。 Rhodesの米国特許第5,078,985号は自分の予備的スズメッキ法は次のようなものであったと認めている。すなわち「タンパク質の精製不足、タンパク質におけるジスルフィド結合の継続的還元、パーテクネレートナトリウムとの混合に先立つ追加的に還元したタンパク質種の形成といった点に関連する問題。タンパク質におけるジスルフィド結合を還元するのに使うよりも少ないスズイオンが必要とされる。この場合、ある種のタンパク質にとって過大なスズイオンはジスルフィド結合を還元させ、タンパク質を所望の大きさよりも小さい断片にしてしまう」したがってRhodesの米国特許第5,078,985号は、スズイオンによるか、あるいはジチオトレイトール（DDT）のような別の薬剤によるかに関係なく、最初の還元後はその最初の還元剤ならびに不純物を実質的に除去し尽くすまでその還元したタンパク質を精製し、そして放射性核種を還元するのに十分な量のスズイオンを添加しなければならないということを記載している（後者は次の工程で添加される）。スズイオン濃度は高いので、抗体の好ましくない断片化が増えるおそれがある。これはスズイオンのような強い還元剤がジスルフィド結合を還元し、その還元の度合、ひいては断片化の度合が、濃度の関数となるからである。CrockfordとR hodesの方法は好ましくない断片化を減らす調節は容易でない。 CrockfordとRhodesの米国特許第4,424,200号はｐＨ４．５〜８．５が「好ましい」と主張するが、我々の経験から言えばｐＨの上限は実際には６である。これより高いｐＨではスズイオンが溶液から沈殿してしまって還元に利用できない。このことは、より高いｐＨでより安定なある種の抗体を含む一部のタンパク質にとって不幸なことである。 Rhodes法は長いインキュベーション時間を要する。上記第4,424,200号特許は少なくとも１５時間、好ましくは２１時間の反応を必要とする。かかる長時間の反応は温度制御または窒素供給の損失［loss］、汚染などの事故の危険に生来的にさらされているわけである。最後に、その収率には見るべきものがない。Croc kfordの米国特許第4,424,200号に報告されている収率は放射性標識されたＩｇＧ７３％である。より代表的な収率は表２に見られるように５０％を僅かに超える程度である。CrockfordのＴｃの約１７％がコロイド状であった。しかもその抗体上のＴｃの約２８％が「交換可能なもの」であった。 Shochatの米国特許第5,061,641号は同じ還元剤と緩衝液を使っているが、得られるテクネチウム標識した抗体をメルカプトアルカンまたはフォスフェイン［phosphane］のような「外因キャッピングリガンド」［exogenous capping ligand］と接触させ、放射性金属の残りの配位部位［ coordination sites］を塞ぎ、それによって安定化させるのに役立つであろうことを示唆している。しかしこの特許はRhodes法の他の欠点については何も言及していない。Ｂ．タンパク質のフォトアフィニティーラベル（光学的親和性標識）アルルアジド［arylazide］などの光活性化剤が支持体に抗原または抗体を固定するのに使われてきた。Kramerの米国特許第4689310号、Scheebersの米国特許第4716122号、AU-A-47690/85（organogen）参照。Dattaguptaの米国特許第47133 26号は核酸を基質に光化学的に結合させている。この他の分子も同一技術によって不溶化されている。Lingwoodの米国特許第4597999号、Pandeyらの、J．Immuno l．Meth.、94:237-47（1986）はハプテン第一芳香族アミン（３−アジド−N−エチルカルバゾール）をさまざまなタンパク質に接合させて合成抗原を製造している。さらに、架橋基の光化学開裂［photochemical cleavage ofａ bridging grou p］によって活性薬または活性毒素に変換される所の「プロドラッグ」［prodrug ］または「毒素前駆体」［protoxin］を調製することができる。Zweigの米国特許第4202323号、Senterの米国特許第4625014号、Edelsonの米国特許第4612007号、Reinherzの米国特許第443427号（col 4）参照。酵素をフォトアフィニティーラベルすることも公知である。 Chowdryの、Ann．Rev．Biochem.、48:293-305（1979）参照。この技術では特定の受容体［a specific receptor］または結合部位が予測されるバイオマトリックス［a biomatrix］とプローブ化合物［a probe compound］が相互反応することをできるようにされている。特定の複合体をそれらの互いの親和性で形成することによって、そのペアがプローブの反応基を介して化学結合されている。これがその受容体自体の本質特徴を大きく決定している。光活性基を組み込んでいるプローブの大いなる長所は、そのプローブの非特異的相互反応全部が除去された後に結合工程が開始され、こうして加水分解によるプローブの無差別結合ないし損失が殆ど、あるいは全くないのである。こうしたフォトアフィニティ試薬は、簡単な分子の合成ルートまたはより複雑な巨大分子のための光活性リガンドの接合によって調製することができる。このようなペプチドホルモン結合部位のフォトアフィニティラベルについてGa lardyらがJ．Biol．Chem.、249:350（1974）で報告している。採用されているプローブはアリルアジド［aryl azide］であるが、これは感光するとアリルニトレン［aryl nitrene］を産生するもので、炭素−水素結合中に挿入することによって炭素−水素結合を有する結合部位ならどこでもラベルすることができる。バイオミラ（ノウジャイム）の欧州特許出願第354,543号はキレート化基［che lating groups］をタンパク質（特に抗体）のような生体分子［biomolecule］に光化学的に付着させる技術について記載している。この技術は生体分子をキレート化できる［chelatable］イオンで間接的に放射性標識するのに使うことができる。キレート化基をまず光活性化可能な官能基に結合する。もし光の存在下で抗体と反応したときは、その「光キレート」が抗体を標識することになる。記載されている活性化された化学種はカルベン、ニトレンおよび遊離基（フリーラジカル）である。もっともニトレンしか実施例として挙げられていないが。Ｃ．タンパク質に紫外線照射した場合の影響に関する研究ヒトγグロブリンの低強度紫外線の照射は、フリーのスルフヒドリル基の産生およびタンパク質の凝集をもたらすことが知られている。Wickensらの「遊離基によるヒトγグロブリンの凝集」薬剤および作用11:650（1981）参照。ジスルフィド結合は不特定に還元され、その結果できたフリーのスルフヒドリルがフリーのチオール基と他の分子上に再結合して凝集体［aggregates］を産生する。その後に行った実験で、銅塩と過酸化水素の混合体のような酸素の遊離基のその他のソースも同じような効果を示すことが分かった。WickensらのBiochim．Biophys ．Acta、742:607（1983）参照。鎖間というよりむしろ鎖内のジスルフィド結合が主たるターゲットであるように考えられる。というのはそれ以上の断片化は観察されなかったからである。LunecらのJ．Clin．Invest．76:2084（1985）によれば、芳香族アミノ酸、特にトリプトファンおよびチロシンもまた攻撃される。研究者たちは、凝集体形成のメカニズムを介してＩｇＧの遊離基の損傷がリウマチ様因子の産生、すなわち凝集した抗体に対する自己免疫応答をもたらすことを教えてくれている。このように、ジスルフィド結合を還元するほどまで長時間に亙って紫外線照射に抗体をさらすことは通常好ましくないことであると考えられる。上述の抗体に関する知見は紫外線照射によるジスルフィド酵素の不活性化（例えばトリプシン）に関する研究における知見と一致している。シスチンの分裂［ cystine disruption］が主たる貢献要素になりやすい。しかもトリプトファン残基またはチロシン残基が所与のタンパク質中に存在することはシスチン残基の破壊［destruction］に貢献することがある。K．Doseの「ジスルフィド結合を有するタンパク質の紫外線不活性化の論理的側面」Photochem．Photobiol．6，437-4 43（1967）、K．Doseの「芳香族アミノ酸の存在下におけるフリーシスチンの光分解」Photochem．Photobiol．8，331-335（1968）参照。その結果、ジスルフィドを有する抗体の紫外線照射は禁忌を指示するものであって、抗原結合及び／又はエフェクター機能に必須のジスルフィド結合が開裂したときは失活にいたるおそれがある。ここに述べられた事項ならびに引例はいずれも先行技術となるものではない。また出願人は引例した出版物のいずれの名目上の印刷年月日および出版物内容の正確性に関する異議に対して権利を保留するものとする。発明の概要本発明は上述した背景技術の欠点を解消せんとするものである。具体的にはタンパク質、特に他の化学物質［chemical entities］（「パートナー」）に接合するジスルフィドを有するタンパク質（例えば抗体）の光化学活性化について考察するものである。好ましい１実施例では、パートナーが放射性金属、特にテクネチウム、のような放射性同位体となっている。別の実施例ではパートナーは別のタンパク質、毒素またはキレートとなっている。ここに記載の方法は活性化させたタンパク質の簡単な「ワンポット」［one po t］調製を可能にする。具体的な例としては、これに限定されるものではないが、タンパク質を活性化し、テクネチウムで放射性標識することを開示している。放射性標識は迅速であり、１時間以内で高い放射性標識収率が得られる。この収率は事実、一晩のインキュベーションで予めスズメッキする方法で得られるものより高速なのである。反応程度は容易に制御することができ、また、いかなる試薬の除去も不要である。生理的食塩水［saline］以外の緩衝液の使用も含まれ、ｐＨが６以上のものを使って媒体は抗体の安定性のために最適化することができる。テクネチウムで抗体を標識するこの方法を使うと、５％以下のコロイド状Ｔｃおよび２％以下の交換可能なＴｃを通常観察することができる。驚くべきことに抗体に照射してもそれを不活性化せず、潜在的な免疫凝集体を形成することになる。もっともこうした問題は背景技術に鑑み予想されていたことではあった。免疫凝集体の形成が予想され得た１方法は、光化学反応によって形成された遊離したチオールの反応を介して２個の異なる抗体分子を結合する新しいジスルフィド結合を形成することである。抗原性を増大させることができると考えられている光化学的に誘発されるジスルフィド結合の還元のもう一つの効果は、抗体分子中の他所に同等の酸化をもたらすことができるということである。Wickenの論文（WickensらのAgents and Ac tions,11，650，1981）は抗体分子中の酸化部位を同定していないが、トリプトファンまたはチロシンの側鎖のような芳香族アミノ酸の側鎖が照射中に酸化されることを示す証拠（蛍光データ）を提出している。古典的な有機化学では、このような並行酸化／還元反応を不均化［disproportionation］と呼んでいる。我々はしたがって抗体の分子内不均化を見ていることになる。個々の抗体分子の酸化されたトリプトファンまたはチロシンの誘導体はその後に反応することができ、免疫原性を増加させ、または抗原結合活性を減殺する架橋を形成する。抗体の相補性決定領域中のTyr，Phe，およびTrp残基の頻度［frequency］が与えられれば、抗体のジスルフィド結合の光化学還元が、抗原結合能をかなり喪失する可能性を伴ってＣＤＲ中に酸化的変化を起こし得たということを予想するようになろう。しかもある種のジスルフィド結合、例えば可変ドメインに局在するようなものは、抗原結合作用に重要に係わることがあり、光化学還元がこうしたジスルフィド結合を開裂したかどうかを先験的に述べることはできることではなかった。 Noujaimがある一定の誘導された抗体［derivatized antibodies］を紫外線照射した結果、抗原結合能を喪失するということを経験していないという事実はWi ckensらの否定的知見を克服するものではなかった。Noujaimは紫外線照射の結果その抗体がより抗原的になったか否かについて決定していない。したがってWick ensおよびNoujaim両者の技術開示を知っている当業者は、照射された抗体が免疫凝集を形成するか、免疫系を活性化するような仕方でほかに改変されるかといった点につきなお心配するであろう。 Noujaimの場合には芳香族アジド誘導体のような光反応性分子をナイトレンのような著しく反応性の高い中間体に変換させるために照射を利用している。ナイトレン生成反応およびカルベンまたはナイトレンのその後のアタックの双方とも非常に迅速なので、Noujaimの方法に必要な反応時間は典型的には５分である。一方Noujaimは抗体の存在下ではアジドは光分解され得ることを記載しているのであって、照射が抗体に何らかの効果を及ぼすとは考えていない。むしろ抗体は、アジドの光活性化の結果生ずるナイトレンによる化学的アタックの受動的な基質と見られている。これとは対照的に、本発明では抗体自体を紫外線照射によって光活性化している。すると抗体はその遊離したチオール基を介してパートナー分子と反応するか、あるいは可能性として、その芳香族アミノ酸の反応性誘導体と反応する。これらの成分［moieties］はNoujaimのナイトレン（またはカルベン）よりもずっと少ない反応性のものである。抗原結合作用の保持率に関するNoujaimの発見は、必ずしも当業者による本発明の好ましい実施例を推定するにまで至るものではない、という点を指摘しておく。Noujaimの光活性化装置は水で冷却され水晶体ジャケットで被覆されたHanov ia紫外線ランプ（254nm）である。反応混合体は当該ランプの中心から10cm離して設置され、照射は１〜１０分行われている。本発明の第２実施例では光源は外見上同一であるが、反応混合体はランプに近づけられ（10cm）、照射時間はより長く（30分）取られている。したがって本発明の第１実施例の照射条件はNoujai mの開示する条件よりも過激［drastic］であると要約することが適切と思量される。出願人は第１実施例の条件に限定することを欲するものではないが、Noujai mが観察した抗原結合作用が小さいからという理由だけで単純にもし照射がより長時間行われるか、または抗体がより感受性の強くなる波長の光で行われた場合にもこのことが真実とされると推定することは当業者としては躊躇するところであろう。Wickensは超過照射時間をさらに長期化すると抗体の損傷が増大することを示唆している。驚くべきことに、本発明が考察している長時間化照射にも拘わらず抗原性の増大も（二量体の形成によると、芳香族残基の修飾によるとを問わず）、抗原結合能の減少もいずれも重大な問題とはならないことが判明した。発明者らは何らかの理論に拘束されることを欲するものではないが、ジスルフィド結合は光化学還元に対する感受性において様々であるが、抗原結合活動に最も直接関与しているジスルフィド結合がアタックに最も少ししか影響されないものでもあると信じている。芳香族残基について言えば、どのような修飾が起こっていようと芳香族残基は抗原性を促進することはなく、あるいは抗原結合に干渉することもないと考えられる。特許請求の範囲の記載をここに繰り返したことにして、好ましい実施例として本明細書中に挙げ、組み込むものとする。図面の簡単な説明図１は、Ｔｃ−９９ｍで標識した、照射ＭＡｂ１７０の放射化学クロマトグラフィである。主要なピーク(1)はモノマーのＴｃ−９９ｍＭＡｂ１７０である。小さな肩をなす(2)(3)は各々Ｔｃ−９９ｍ低分子量［Low MW］タンパク質とＴｃ−９９ｍ緩衝複合体である。縦座標はＮａＩ（Ｔ１）結晶検出器を通して測定した相対ユニットでの放射能で、横座標はＳＥ−ＨＰＬＣカラムに注入した後の時間（分）である。図２は、ＭＡｂ１７０（白い四角）およびＭＡｂＢ４３（黒い四角）の放射性標識に与える紫外線照射効果を示す。これらは、Rhodes法で標識されたとき（白い丸）照射されていないＭＡｂ１７０の放射性標識と比較される。縦座標はＧ５０スピンカラムで測定されたタンパク質に結合しているＴｃ−９９ｍの％で、横座標は照射された抗体の時間すなわち照射時間（分）、または照射していない抗体の予備的スズメッキ時間である。図３は、照射されたＴｃ−９９ｍ標識されたＭＡｂ１７０の紫外線２８０ｎｍクロマトグラムである。主たるピークは検出不能の凝集ないしフラグメント形成がないモノマーＭＡｂ１７０である。縦座標は相対ユニットでの２８０ｎｍの紫外線吸光度で、横座標はＳＥ−ＨＰＬＣカラム上に注入後の時間（分）である。図４は放射性標識収率に及ぼす光活性化波長の効果を示す。図５は光活性化段階の期間の関数としてのスルフヒドリル生成を示す。図６は放射性標識収率に及ぼすスルフヒドリルブロッキング剤の効果を示す。図７は、放射性標識されたシステインの割合によって表される光活性化反応に及ぼすシスチン誘発（チャレンジ）の効果について考察するものである。図８は、システインチャレンジ後スズイオンで還元し光活性化したＭＡｂ１７０の放射性標識（Ｔｃ−９９ｍ）の収率を比較したものである。図９は、放射性標識収率に及ぼすスズソースと濃度の効果に関するプロット図である。図１０は、放射性標識収率に及ぼすスズ濃度と照射時間の効果を示す。図１１は、放射性標識収率に及ぼす照射量および照射時間の効果を示すものである。図１２Ａ〜１２Ｄは、のマウスにおける、放射性標識した抗体を調製するために使用される方法による、Ｔｃ−９９ｍＭＡｂ１７０の生体分布［biodistribution］を比較したものである。好ましい実施例の詳細な説明光活性化することができるタンパク質接合目的のために光化学的に活性化させることができるタンパク質は、好ましくは、タンパク質の意図した使用法にとっては必須ではないジスルフィド結合を有するものである。このようなタンパク質では２つのシステイン残基のチオール（−ＳＨ）側鎖の酸化の結果、ジスルフィド結合が存在する。これらの残基は異なるポリペプチド鎖上に存在するか、あるいは同一のポリペプチド鎖上に存在する。酸化の結果、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）が元のシステイン残基のβ炭素間に形成される。還元後はそれら残基は技術的に言えば半シスチンとでも言うべきであるが、システイン、シスチン、半シスチンという語はしばしば互換的に使用されているから、正しい意味はコンテクストから明らかとなろう。照射の効果は前述したようにジスルフィド結合の還元開裂［reductive cleavage］で遊離したチオール基を残す。ジスルフィド結合されたタンパク質の例としては、抗体、多くの酵素、一定のホルモンがある。抗体免疫グロブリンはインビトロ診断、インビボ造影、病気治療または特殊な抗原による病気の治療に使うことができる。免疫グロブリン（抗体）の基本ユニットの構造は４つのポリペプチドの複合体、すなわち２つの同一の低分子量（軽い［light］）の鎖と２つの同一の高分子量（重い［heavy］）の鎖が非共有会合［associations］とジスルフィド結合の両方によって結び付けられている状態である。種々の抗体がこれら基本ユニットの１〜５個をどこかにもっている。こうした免疫グロブリンのユニットを記号的に「Ｙ」で表す。Ｙの各枝は１本のＨ鎖のアミノ末端部と、１本の会合したＬ鎖によって形成されている。Ｙのベースは２本のＨ鎖のカルボキシ末端部によって形成されている。Ｙの結び目［node］はいわゆるヒンジ部で、きわめて柔軟である。１個の抗体分子中にある免疫グロブリンユニットの数、個々のユニットのジスルフィド架橋構造、および鎖の長さや配列上の相違によって、５クラスのヒト抗体（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）、およびこれら５クラス中のさまざまなサブクラスが構造的相違に基づいて識別されている。１つの抗体のこれらクラスおよびサブクラスはイソタイプである。Ｈ鎖およびＬ鎖のアミノ末端領域はカルボキシ末端領域よりも配列がはるかに多枝であるから、可変ドメインと呼ばれている。これが抗体の１部をなしているわけで、抗体のこうした構造がその抗体の抗原結合特異性をなしているのである。重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインは共に１個の抗原結合部位を形成し、こうして基本的な免疫グロブリンユニットは２つの抗原結合部位を持つことになる。抗原結合部位の壁は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの超可変部分によって境界つけられたものである。結合部位の多様性は、超可変領域における配列変化と、Ｈ鎖とＬ鎖とのランダムな組合せによる会合［association］とによってできたものである。集合的にこの超可変部分は抗体のパラトープ［paratope］と名付けられている。このパラトープは同系の抗原のエピトープに本質的に相補的である。Ｈ鎖およびＬ鎖のカルボキシ末端部は不変ドメインを形成する。これらのドメインはずっと僅かにしか多様性がないのであるが、まず第一に、ある動物種と別の動物種とで異なり、第二に、同一個体において、各々は異なる機能を有する数種のイソタイプをもっている。ＩｇＧ分子はホモロジーユニットに分割することができる。Ｌ鎖は２つのユニット、Ｖ_LとＣ_L、そしてＨ鎖は４つのユニット、Ｖ_H、Ｃ_H１、Ｃ_H２、Ｃ_H３をもっている。全部が約１１０個のアミノ酸の長さであり、中央部に存在する６０個のアミノ酸残基に亙る鎖内ジスルフィド架橋を有している。２つのＶ領域ホモロジーユニットの配列は、４つのＣ領域ホモロジーユニットの配列と同様に類似したものである。これらのホモロジーユニットがドメインを形成しているのである。２つの可変ドメインについては既に言及した。また４つの不変ドメインもある。ＩｇＧの温和なタンパク分解消化は興味のあるフラグメントを産生させる。Ｖ −Ｃ１はＦａｂ，Ｃ_H２-Ｃ_H３はＦｃ，（Ｖ−Ｃ１）₂は（Ｆａｂ’）₂，Ｖ−Ｃ１−Ｃ２はＦａｂｃ、そしてＶ単独はＦｖである。可変ドメインは抗原結合に関与するが、不変ドメインはさまざまなエフェクター機能を有している。増殖および分化を行うようなＢ細胞の刺激、補体細胞溶解系［complement cell lysis system］、オプソニン作用の促進［opsonization］、侵略物を摂取するマクロファージの誘因［attraction］などである。さまざまなイソタイプの抗体が異なる不変ドメインを持っており、したがって異なるエフェクター機能を有している。最もよく研究されたイソタイプはＩｇＧとＩｇＭである。「抗体」とは、特に断りがない限りここでは「無傷の」［intact］抗体とそのさまざまなタンパク分解誘導体［proteolytic ｄerivatives］を含むものとする。抗体は他の分子に接合されて診断、治療等に有用な接合体を産生することがある。抗体の可変ドメインは特定の抗原ターゲットに特異的に結合する能力を接合体に付与する。抗体は医療的に関心のある抗原、例えば病原菌［pathogens］（ウイルス、バクテリア、菌類、原生動物［protozoa］など）、寄生虫、腫瘍細胞、あるいは特殊な医療症状に関連したものに対して向けられることがある。腫瘍関連抗原［tu mor-associated antigen］（ＴＡＡ）の場合には、癌は肺、結腸、直腸、乳房、卵巣、前立腺、頭、首、骨、免疫系、その他の解剖学的部位のものであろう。特に関心がある抗原としては、癌種胚性抗原［carcinoma-embryonic antigen］（ＣＥＡ），ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン［human chorionic gonadotropin］（ｈＣＧ）、α−フェトプロテイン［alpha-fetoprotein］（ＡＦＰ），フェリチン、Thomsen-Friedenreich抗原（ＴＦ-alpha:ＴＦ-beta）、段階特異的胚性抗原 -１［stage-specific embryonic antigen-1］（ＳＳＥＡ−１）、ヒト哺乳類腫瘍関連抗原［human mammaryｔumor-associated antigen］（ｈＭＴＡＡ），オンコモジュリン［oncomodulin］、マリグニン［malignin]、ヒト胎盤性ラクトゲン［human placental lactogen］（ｈＰＬ），前立腺抗原［prostatic antigen］（ＰＡ），前立腺酸性ホスファターゼ［prostatiｃ acid phosphatase］（ＰＡＰ），高分子量メラノーマ関連抗原［high molecular weight-melanoma-associa ted antigen］（ＨＭＷ−ＭＡＡ），サイログロブリン［thyroglobulin］（Ｔｇ），チロシンホスホキナーゼ［tyrosine phosphokinase］（ＴＰＫ），表皮細胞成長因子［epidermal growth factor］（ＥＧＦ），神経細胞特異的エノラーゼ［neuron-specific enolase］（ＮＳＥ），組織ポリペプチド抗原［tissue poly peptide antigen］（ＴＰＡ）、β-2ミクログロブリン［beta-2 microglobulin ］（β２Ｍ），ホスホヘキソースイソメラーゼ［phosphohexose isomerase］（ＰＨＩ），フィブリン、Ｔｎ，シアリルＴｎ［sialyl Tn］、CA-19.9，CA-125，及びCA-15.3がある。ここに「腫瘍特異性抗原」とは、特定の腫瘍またはその特定の腫瘍に強く相関関係がある抗原特性を意味するものと理解されたい。しかし腫瘍特異的抗原に関する現時点での業界の理解は、腫瘍特異的抗原が腫瘍組織に必ずし特異的でなく、つまり腫瘍組織に対する抗体が正常組織の抗原と交差反応し得ることを意味している。腫瘍特異的抗原が腫瘍細胞に特異的でなくても、実際上、腫瘍特異的抗原に結合する抗体は、交差反応による保証されていない危険ないし阻害を起こすことなく、所望の工程を遂行するのに十分に腫瘍細胞に特異的であるということが頻繁に生ずるのである。多数の要因がこの実際上の特異性に貢献しているのである。例えば、腫瘍細胞上の抗原の量は正常細胞上に見られる交差反応抗原量をはるかに超えるか、腫瘍細胞上の抗原がより効果的に顕現する可能性がある。したがって「腫瘍特異的抗原」という用語は、実用性に関連しているのであって、絶対的意味の特異性を指すために使ったり、腫瘍に特異性な抗原を指すために使ったりすることを意図したものではない。ＭＡｂ１７０（精確にはＭＡｂ１７０Ｈ．８２）は、免疫学的に適当なキャリヤ（血清アルブミン）に結び付けられるThomsen-Friedenreich（ＴＦ）β（Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ）二糖ハプテンを有する合成複合糖質で、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫することで産生されるＩｇＧｌκイソタイプのマウスモノクローナル抗体である。これはそのインビトロのヒト腺癌組織との反応性に基づき選択された。これは乳房、卵巣、子宮内膜、結腸、前立腺および膀胱の腺癌と明らかに反応する。これについてはより詳細に本願と同時出願に係る1988年５月12日付出願の米国特許出願第07/153162号に述べられている。そのことを指摘してその記載内容を、1986年10月27日付米国特許出願第06/927277号の継続出願である本願に組み入れるものとする。ＭＡｂ１７０は、腺癌の放射免疫診断用のＴｃ−９９ｍで放射性標識した抗体キット（TRUSCINT AD，Biomira，Inc.，Edmonton，Alberta，Canad a）中に規格化されている。McEwanらのNuclear Medicine Communications，13:1 1-19（1992）参照。ＭＡｂ１７０を分泌するハイブリドーマ（１７０Ｈ８２．Ｒ１８０８）がブタペスト条約に基づく国際寄託機関である12301 Parklawn Drive ，Rockville，Maryland 20852 USAに所在のAmerican Ｔype Culture Collection に1991年７月16日寄託され、登録番号ＨＢ１０８２５を付与された。この寄託は上記ハイブリドーマまたはＭＡｂ１７０を製造したり、使ったり、販売したりすることを認めたものと解釈されてはならない。ＭＡｂＢ４３（より精確にはＢ４３．１３）は、一部を卵巣腹水から精製した高分子量ムチンでマウスを免疫し、卵巣癌関連抗原のＣＡ１２５に対する反応度合から選択して作ったＩｇＧ₁κイソタイプのマウスモノクローナル抗体である。これはＭＡｂＯＣ１２５がＣＡ１２５に結合することを阻害する。ＭＡｂＢ４３は生検組織内の、および卵巣の漿液状癌ならびに子宮内膜癌内のＣＡ１２５抗原と反応する。これは卵巣癌の放射免疫診断用にＴｃ９９ｍで放射性標識した抗体キット（TRUSCINT 0V，Biomira，Inc．Edmonton，Alberta，Canada）にされている。CapstickらのInt．J．Biol．Markers，6:129-135（1991）参照。これら２つの抗体を本発明の一般性に対する限定と解釈してはならない。ここで抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。対象がヒトであるときは、問題の抗原に対し使用可能な免疫応答を示すことができる動物を免疫することによって抗体を得ることができる。動物としてはマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、その他の適当な実験動物でよいであろう。抗原は自然発生の免疫原という形式、あるいはハプテンおよび免疫原のキャリヤの合成免疫原複合体の形式で提供される。モノクローナル抗体の場合は、免疫させた動物の抗体産生細胞を「不死」または「不死化した」ヒトまたは動物の細胞と融合して抗体を産生するハイブリドーマを得るのである。所望ならその免疫グロブリン鎖の１本または２本以上をコードする遺伝子をクローニングして抗体を別の宿主細胞に産生させ、さらに所望なら、その遺伝子を配列を変更するように突然変異させて、抗体の免疫グロブリン特性を出させることもできる。ジスルフィド結合酵素ジスルフィド結合した酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、アルドラーゼ、パパイン、およびグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼがある。こうした酵素は例えば標識として利用するために他の分子と接合することができる。その他のジスルフィド結合タンパク質アルブミン、トランスフェリン、ソマトスタチンがある。アルブミンは放射性同位体と接合することができ、血液溜剤［blood pool agent］として利用することができる。トランスフェリンは放射性同位体で標識することができ、トランスフェリン受容体を造影するのに利用することができる。つまりある種の腫瘍は大量のトランスフェリン受容体をもっていることが知られているからである。ソマトスタチンは放射性同位体で標識して腫瘍造影するのに利用することができる。数種のタンパク質のスルフヒドリル／ジスルフィド組成を表１０９Ａに示す。非ジスルフィド結合のタンパク質本発明は、光分解によって生じた遊離基と反応することで一層反応性を促進された残基（例えば芳香族残基）を含有するプレアルブミンとかタンパク質Ａ（プロテインＡ）といった非ジスルフィド結合タンパク質を光活性化するのに使うこともできる。照射光活性化させるタンパク質は紫外線放射によって照射される。紫外線放射とは大略、１０〜８２０nm波長の電磁スペクトル領域と定義されている。より短い波長の量子［quanta］はよりエネルギーに富んでいるが、タンパク質をより効果的に損傷してしまう。２５０〜３２０nmのレンジの波長の、おおよそ、例えば少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９９％の紫外線放射でタンパク質を照射するのが好ましい。好ましくは放射は２７０〜３２０ｎｍの波長を含むこと、より好ましくはそうした波長のものから主としてできているのがよい。紫外線放射は、水素ランプまたは重水素ランプ、キセノンアーク灯、あるいは水銀灯のような適当な放射源から得ることができる。これらのランプはランプが発する光の効果的な波長を変更することができるように蛍光塗装されているのがよい。例えば内部出力は２５４ｎｍでも、それより長い波長において塗装を蛍光現象せしめることがあり、それが外部に発光されるものとなる。好ましくない波長を濾過して除くため、適当なフィルタを取り付けることもよい。水晶は１９０〜８２０ｎｍの光を通すが、ホウケイ酸ガラスは３００〜８２０の透過スペクトルである。選択的に紫外線放射を通す他の材料としては、窓ガラス、光学（［white crown］）ガラス、バイコール、クォーツクリスタル、透明溶解クォーツ、サプラシル［suprasil］，合成サファイア、天然蛍石、合成フッ化リチウム［lithium fluoride］、およびプレキシガラス（商品名）（ポリメチルメタクリレート）がある。広狭双方の帯域フィルタが知られている。こうしたフィルタをランプ本体に組み込むか、容器［vessel］・光源間の光の通路上に設置する。あるいはタンパク質を全部または部分的にフィルタ材で作られた容器中に入れてもよい。ジスルフィド結合がきわめて特異的な波長に特に光活性化性が強いことがあるが、そのような場合は放射によるタンパク質の損傷を最小にするため狭帯域透過フィルタを使うのがよいであろう。紫外線フィルタに関するより詳細な説明はCalvertとPitts，Jr.の、Photochemistry，pp．686-798 、Chapter 7、“Experimental Methods in Photochemistry”（John Wiley＆Son s，N.Y.：1966）を参照して戴きたい。ターゲット箇所における効果的放射強度は、光源強度、光源・反応容器間の距離、およびランプフィルタと容器壁の放射吸光度の関数である。光路上のフィルタの厚さや光源を変えることによるよりも、むしろ光源に対して対象を近づけたり遠ざけたりすることで効果的な強度を調節するのが一般に最も便利である。しかし上記パラメータのいずれも必要に応じて修正することもできる。光活性化の全体的程度は、採用された波長におけるタンパク質の光活性化に対する感受性はもとより、放射強度および照射時間の関数である。効果的な強度と同様に、照射時間も容易に変更することができる。どのようなタンパク質に対しても強度および照射時間は最適値を特定するために体系的に変化させることを考えている。タンパク質が特定の紫外線波長の照射に対して特に感受性が敏感なときは、その波長を濾過して除くことによって少なくともある程度まで反応を遅らせることができる。逆にタンパク質が耐性（又は抵抗性）であるときは、タンパク質が最も敏感となる波長での強度および照射時間を増やすことになろう。光源は反応容器から好ましくは１〜１０ｃｍ、より好ましくは５ｃｍ離して置くのがよい。この容器は好ましくは水晶ガラスまたはホウケイ酸ガラスで作られるのがよい。照射時間は代表的には５〜１００分、好ましくは１０分以上６０分以下、より好ましくは１５分以上、さらにより好ましくは少なくとも２０分である。タンパク質濃度は通常１〜１０mg/mlで、より好ましくは約６mg/mlである。ｐＨは代表的には４〜９、より好ましくは６〜７である。パーテクネテートがパートナーであるときは、５〜１００μg、より好ましくは約１０〜３０μgのＳｎで還元するのが好ましい。反応媒体も光活性化の進行に影響する可能性がある。特に媒体のｐＨとか、トリプトファンおよびチロシンのような感受性の強いアミノ酸の存否、グルタチオンおよびジチオトレイトールのような遊離基の阻害剤または過酸化物のような遊離基生成体の存否は、正または負の効果を有している。ジスルフィド結合はｐＨ８のとき還元に、より感受性が強いことが知られている。このｐＨあたりでの紫外線放射効果こそ、それより低いｐＨ値でのものより効果的であるに違いない。紫外線エネルギーがチロシンとかトリプトファンといった隣接するアミノ酸によって吸収され、シスチンのジスルフィド結合に変移［transferreddown to］されたら、これらのアミノ酸の不在は生成されるＳＨ基の数を減少させるであろう。（前述したように）紫外線エネルギーが遊離基を生成するとすれば、遊離基の阻害剤は生成されるＳＨ基の数を減少させるであろう。同様に遊離基の活性化因子［activators］または生成因子［generators］がより多くのＳＨ基を生成することになる。紫外線照射の前にアスコルビン酸（遊離基のスカベンジャー）をタンパク質溶液に加えるとＴｃ−９９ｍ放射性標識の効率を急激に減少させるが、このことは遊離基のメカニズムが関係しているものと考えられる。生産規模の原料の光活性化はＭＡｂその他のターゲットの均一溶液が入れられた容器を市販の紫外線源を使って照射中継続的に撹拌しながら照射することによって得ることができる。あるいは、紫外線源の周囲または中心を通る適当なガラス管内に大量の溶液を通して循環させることもできる（特別あつらえ製でなければならない）。材料は小瓶（バイアル）に入れてオンライン照射（すなわち１個の紫外線源経由のアセンブリライン）またはバルク照射（全小瓶を同時に照射）して照射することができる。タンパク質を照射して光活性化させたら、即座に接合させる、または将来の使用に備えて貯蔵する。接合反応が所望のｐＨレンジを保持するのに適切な緩衝液中で行われる。必要なら凍結乾燥により、またはチオール安定剤の添加により材料の安定性を向上させる。接合の「パートナー」光活性化させたタンパク質は、放射性金属、薬物、毒素、キレートなどの対象たる「パートナー」と接合させる。タンパク質の光活性化が遊離したチオール基を形成したら、そのタンパク質はどんなスルフヒドリル反応試薬［sulfhydryl reactive agent］とも接合することができよう。好ましくは試薬は遊離したチオール基に実質的に特異的なものがよい。試薬はナイトレン、カルベンのような極端に反応性のものである必要はもちろんない。スルフヒドリル反応性放射性金属本発明の方法でタンパク質に結合させることができる放射性金属はスルフヒドリル基にしっかりと結合するものである。概して従来の定性分析図式において比較的不溶性のスルフヒドリルを形成する金属イオンがそうしたものである。例えば、Tc-99m、Re-186、Re-188、Cu-64、Hg-195、Hg-197、Hg-20 3、Pb-203、Pb/Bi-212、Zn-72、Ag-105、Ag-111、Au-198、Au-199、Cd-115、Cd- 115m、Sn-117、Sn-125、その他同様なもののイオンである。約５０〜５００ＫｅＶのレンジ内のγ放射エネルギーを有する放射性金属がシンチグラフィーにとって有用である。陽電子射出体［positron emitter］も造影用に利用することができる。βおよびα放射体は治療に利用できる。好ましくは放射性標識の効率は８０％以上であることがよく、より好ましくは９０％以上がよい。望ましくはこれら好ましい収率は約２時間を超えない時間内、より好ましくは約１時間以内に照射されたタンパク質で達成されるのがよい。１実施例では、パートナーはパーテクネテート、レニウム酸塩［rhennate］、その他類似の化学的性質を有する放射性同位体剤となっている。一般に、パーテクネテートまたはレニウム酸塩はそれがタンパク質の遊離したチオール基と反応するように還元される。これに適した還元剤としては塩化第一スズ［stannous c hloride］およびスズタルトレート［stannous tartrate］のようなスズイオン源がある。酒石酸タルトレートイオンはＳｎ−Ｔｃ複合体を安定化するのでスズタルトレートが好ましい。当業者に知られている上記以外の還元剤としては、2-メルカプトエタノール、1,4-ジチオトレイトール、2,3-ジヒドロキシブタン-1.4-ジチオール、2-アミノエタンチオールＨＣｌ，2-メルカプトエチルアミン、チオグリコレート、シアニドおよびシステインがある。還元剤の量ならびにインキュベーション時間は使用する還元剤によって調節される。光活性化する前にスズイオンをタンパク質に加え、パーテクネテートをその後に加えるか、またはタンパク質をまず光活性化してから、照射後にスズイオンとパーテクネテートを加えてもよい。余分なスズを除去するための洗浄は不要であって、抗体その他のパートナーではなく放射性金属を還元するのに使うだけなので、典型的には少量の還元剤で済む。簡単に入手でき、市販のパーテクネテート生成器で容易に調製できるから、シンチグラフィーにとってはテクネチウム−９９ｍが好ましい放射性標識である。スルフヒドリル含有タンパク質のテクネチウム標識は一般に従来法で行う。パーテクネテートは普通、生理的食塩水溶液中の最も一般的にはＮａＴｃＯ₄の形式で、市販の生成器により調製される。当業者によく知られた新型生成器のメーカーが言うように、調製工程を適当に修正すればパーテクネテートのその他の形式も使用することができる。パーテクネテートは生理的食塩水中、例えば約３〜７のｐＨ値、好ましくは３．５〜５．５、より好ましくは約４．５〜５．０のｐＨ値で緩衝された０．９％（生理学上の）生理的食塩水中で、約０.２〜１０mCi/mlの活性で一般に使用される。最適な緩衝液としては、例えばアセテート、タルトレート、フタレート、フォスフェートなどがある。レニウムは周期表中でテクネチウムの真下にあり、同一の外殻電子構造［oute r shell electronic configuration］をもっている。レニウムおよびその化合物はテクネチウムおよびその類縁化合物に非常によく似た化学特性をもつものと考えられている。実際にレニウム化合物は、還元およびキレート化に関する限りテクネチウム化合物と同様に挙動するが、酸化に対するレニウムのより敏感な感受性は取り扱いにより細心な注意を必要とする。放射性同位体Ｒｅ−１８６は造影および治療の両者にとって有望である。これは約３.７日の半減期で、高いＬＥＴβ放射（１．０７ＭｅＶ）および便利なγ 放射エネルギー（０．１３７ＭｅＶ）を有している。レニウムは過レニウム酸塩（パーレネート）からつくることができ、還元されたレニウムイオンはタンパク質に非特異的に結合することができる。したがって還元されたパーレネートが抗体のようなタンパク質分子のスルフヒドリル基に結合するタンパク質のＲｅ−１８６標識法は有益である。Ｒｅ−１８８は発生器で作られる約１７時間の半減期のβおよびγ放射体で、造影および治療に利用することができよう。レニウム標識法は、系から空気その他の酸化の原因となるものが存在しないように細心の注意が要求されることを除けば、テクネチウム標識法とほぼ同様にして行われる。Ｒｅ−１８６はテクネチウム発生器として現在使うことができるものに類似の発生器を使って過レニウム酸ナトリウム［sodium perrhenate］の形で産生することができる。「還元したパーテクネテート」または「還元したパーレネート」とは、パーテクネテートまたはパーレネートを化学還元し、チオール基でキレート化することによって形成されたテクネチウムまたはレニウムのイオンの種［species］のことである。還元されたパーテクネテートは、上記キレート化合物中にＴｃ（III ）及び／又はＴｃ（IV）及び／又はＴｃ（Ｖ）の形で存在するもので、還元されたパーレネートはＲｅ（III）及び／又はＲｅ（IV）及び／又はＲｅ（Ｖ）の形で存在するが、より高いかより低い酸化状態及び／又は多重［multiple］酸化状態は排除することができないもので、これらも本発明の範囲内に入っているものである。銅は普通Ｃｕ（II）の形で存在するが、Ｃｕ（Ｉ）及び／又はＣｕ（II ）も排除されない。水銀は普通Ｈｇ（Ｉ）及び／又はＨｇ（II）の形で存在する。鉛／ビスマスは普通Ｐｂ（II）又はＰｂ（IV）の形で存在する。還元は従来の種々の還元剤のいずれによっても行うことができるが、好ましくは一般に水溶液中のスズイオンがよい。その他の適切な還元剤としては、例えば、ジチオナイト、ボロハイドライド［borohydride］，鉄イオン［ferrous ion］，スルホン酸ホルマジン［formadine］などである。スズイオンが、例えばＨＣｌなどの水性酸［aqueous acid］に接触させれば、例えば箔、顆粒、粉末、ターニング［turnings］などのスズ金属から直接［iｎ situ］つくることができるのは便利なことである。銅イオンも硫黄キレーター［sulfur chelators］によってしっかりとキレート化することができる。Ｃｕ−６７も造影および治療に使うことができるもう一つの魅力的な放射性核種である。これは約２．６日の半減期で、βエネルギーは比較的低いがβ（０．５７０ＭｅＶ）およびγ放射体（０．１８５ＭｅＶ）である。Ｃｕ−６７は比較的高価で現在のところ簡単に利用できるものではないが、需要が増えればこうした状況も変化するかもしれない。これはチオールとしっかりしたキレート化合物をつくるという利点がある。標識は簡単迅速で放射性金属のために何の還元剤も必要でない。銅の標識は、例えば塩化物をナトリウム、カリウムまたはクエン酸アンモニウム、タルトレートなどと混合することによって、例えば塩化物、シトレート、タルタラートなどの適当な塩の形にある銅イオン、通常Ｃｕ（II）イオン、の溶液でチオール含有のタンパク質を反応させることで行う。Ｃｕ−６７は現在、0ak Ridge National Laboratories，Tennessee、またはLoｓ Alamos National Labor atories，N．Mex．からＣｕＣｌ₂として購入することができる。亜鉛、銀、金およびカドミウムの同位体はＳＨ基を銅と同様にキレート化すると考えられる。銅に対すると同じようなキレート化作用をするその他の放射性核種、例えば銀および鉛も本発明の方法によってチオール含有化合物に結合させることができる。Ｈｇ−１９７は約１．５日の半減期で、７８〜２６８ＫｅＶのエネルギーレンジのγ線を放射し、Ｐｂ−２０３は約５１時間の半減期をもつ約２７５ＫｅＶの強いγ放射体で、γシンチグラフィーに適したものとされている。Ｂｉ −２１２は半減期約１時間、６．０９ＭｅＶのエネルギーのα放射体で、インビボ治療に大いに期待されている。これは約１０．６時間の半減期で、２３９ＫｅＶのγ放射をするＰｂ−２１２前駆体から直接［in situ］つくられる。このようにＢｉ−２１２治療用の抗体接合体はＰｂ−２１２で標識された接合体である。ここでは鉛／ビスマスまたはＰｂ／Ｂｉの省略記号がこれを示すために使うこととする。抗体タンパク質へのキレート化はＣｕ−６７標識と同様な方法で行われる。水銀放射性同位体は、例えば0ak Ridge National Laboratoriesから、通常、ＨｇＣｌ₂またはＨｇ（ＮＯ₃）₂として入手することができる。鉛／ビスマス放射性同位体は、Argonne National Laboratoriesから通常、支持されたラドン発生体［supported radon generator］の形式で入手することができる。本発明はここに例として挙げた放射性金属イオンに限定されるものではなく、スルフヒドリル基にしっかりと結合するイオンになら一般的に適用されるものであることを理解されたい。安定同位体も治療（例えば関節炎にＡｕ）または診断（例えば電子顕微鏡用にコロイド状Ａｕ化合物）を目的としてタンパク質に接合させることができる。キレート化合物キレート化合物は、光活性化される抗体に直接反応することができないキレート化可能な物質、例えばある種の放射性同位体と抗体を会合［associate］させるのに使用することができる。本発明は特定のキレート化剤に限定されるものではない。ＥＤＴＡ誘導体およびＤＴＰＡ誘導体が好ましいが、多くのキレート化剤が知られている。Mearsの米国特許第46786 67号、Wiederの米国特許第4352751号、Hnatowichの米国特許第4479930号、Meare sの米国特許第4043998号、Uedaの米国特許第4564742号、Davidsonの米国特許第4 673562号、Hnatowichの米国特許第4668503号、Aranoの米国特許第4559221号、Co staの米国特許第3809632号参照。ＥＤＴＡおよびそれに類縁のポリカルボン酸のほかに、大環状キレーターが特に注目される。キレート化剤は、そのキレート化機能を保持しつつ光活性化されたタンパク質の遊離したチオールと反応するように、必要なら誘導される［derivatized］。次の表はいろいろな剤によってキレート化されたイオンを示すものである。薬物適している薬物としては、アドリアマイシンのような抗生物質、メトトレキセートのような抗腫瘍剤、５−フルオロウラシル及びシス白金、及びペンタミジンイセチオネートのような抗寄生虫剤などがある。抗体がこのような薬物に接合すると、対応する抗原が発生する部位にその薬物を引き付けるように作用する。毒素毒素は腫瘍、寄生虫または微生物細胞に関連する抗原に対して特異的な抗体に都合よく接合する。毒素としては例えば植物性（例、リシン、アブリン［abrin ］），動物性（例、ヘビ毒）、あるいは微生物性（例、ジフテリア毒素、破傷風毒素）のものがある。薬物や毒素は、抗体のほかにも、アルブミンのような別の担体タンパク質に接合することができる。スルフヒドリル反応剤生来的にスルフヒドリル反応性でない分子も、問題の分子に反応性の基とスルフヒドリル反応基との両方を有する二官能架橋剤によって本発明の光活性化タンパク質に接合することができる。本剤は問題の分子（例、アミノ基、カルボキシ基またはヒドロキシ基を介して）及び光活性化されたタンパク質の分子双方と同時に反応するか、または問題の分子を誘導体化［derivatized］してパートナー分子を形成するために使用することができ、このパートナー分子を薬剤から誘導された部分［a ｍoiety］によってスルフヒドリル反応させることができる。あるいは問題の分子と反応性にして光活性化されたタンパク質を誘導するために使用することができる。スルフヒドリル反応剤としては、ヨードアセトアミドのようなαハロアセチル化合物、Ｎ−エチルマレイミドのようなマレイミド、アセテート、塩化物、またはナイトレイトの対イオンとの3,6-ビス-（マーキュリーメチル）ジオキサンのような水銀誘導体、及びジスルフィドジオキサイド誘導体のようなジスルフィド誘導体、ポリメチレンビスメタンチオスルフォネート試薬とクラベセイン［ crabescein］（還元された抗体のジスルフィド結合を介して追加することが認められた２個の遊離したスルフヒドリル基を有するフルオレセインの蛍光誘導体）がある。ヨードアセテートのようなαハロアセチル化合物はスルフヒドリル基と容易に反応してアミドをつくる。こうした化合物は遊離したチオールをカルボキシメチル化するのに使われた。これらは厳格にＳＨ特異性でないからアミンと反応するであろう。この反応にはチオレートイオンの求核攻撃があり、ハロゲン化物の置換をもたらす。反応性のハロアセチル部分［moiety］のＸ -ＣＨ₂ＣＯ-が種々の目的で化合物中に取り込まれた。例えばブロモトリフルオロアセトン［bromotrifluoroacetone］がＦ−１９の組込みのために使われ、またＮ−クロロアセチルヨードチラミン［N-chloroacetyliodotyramine］が放射性ヨウ素をタンパク質に導入するのに使われた。Ｎ−エチルマレイミドのようなマレイミドは、特に他の基がプロトン化されるｐＨ値７以下のときには、スルフヒドリル基にかなり特異性であると考えられている。チオールはマレイミドとミカエル反応して二重結合への付加物だけを産生する。こうしてできたチオエーテル結合は非常に安定で、生理的条件下では開裂することができない。またこれらはアミノ基およびイミダゾール基とずっと遅い速度で反応する。例えばｐＨ７での単純なチオールとの反応は相当するアミンとの反応より約千倍も速いのである。反応に関係する３００ｎｍ領域での固有の吸光度変化は、反応をモニターするのに好都合な方法となる。これらの化合物は低いｐＨ値では安定であるが、高いｐＨでは加水分解に対して感受性が強い。一般的説明に関してはWongのChemistry of Protein Conjugation and Cross-l inking，CRC Press，Inc.、Boca Ratonの1991:Chapters 2 and 4）を参照のこと。接合体およびその利用法インビトロ免疫診断１実施例では抗体をインビトロ免疫診断に使うため検出可能な標識に接合させている。この標識としては、光活性化した抗体の遊離したチオール基に直接または間接に接合することができる放射性標識、発蛍光団、または酵素がある。サンプルとしては臨床的なもの（例えば、血液、尿、精液、脳脊髄液［cerebrospinne fluid］、または固体組織もしくは固体器官、あるいは非臨床的な土、水、食品など）がある。分析は質的または量的でも、またどのようなフォーマットでもよく、例えばサンドイッチフォーマットあるいは競合フォーマットがある。数々のイムノアッセイフォーマット、標識、固定化技術などが次の刊行物に記載されている。すなわち0'SullivanのAnnals Clin．Biochem.，16:22 1-240（1976）、McLarenのMed．Lab．Sci.，38:245-51（1981）、OllerichのJ． Cl1n．Chem．Clin．Biochem.，22.895-904（1984）、NgoとLenhoffのMol．Cell ．Biochem.，44:3-12（1982）などである。ここに指摘して明細書への記載に代えることとする。免疫造影［immunoimaging］免疫接合体［immunoconjugate］をインビボ免疫造影に使うこともできる。この目的のためには抗体はその位置を外部に視覚化する手段によって標識されなければならない。典型的には免疫造影剤が適切な放射性同位体と直接（テクネチウムの場合のように）または間接（キレート化したインジウムのように）に抗体標識される。患者に注射した後、例えばγ放射体の場合には、γシンチレーションカメラのような放射性標識から放射される粒子［particles］を感知する検出器で接合体の位置を追跡するのである。免疫治療免疫治療のため抗体は適切な放射性同位体、薬物または毒素に接合される。概論としてのインビボ利用免疫造影または免疫治療のいずれにせよ、接合体を患者に導入しなければならない。好ましくは注射で導入するのがよい。典型的には剤は血管内（静脈内または動脈内）に投与されるか、あるいはしばしば浸剤［infusion］によって髄腔内［intrathetically］に投与される。さらに場合によっては皮下注射、粘膜注射、筋肉注射、頭蓋骨内、その他の一般に認められた薬物投与経路を介して接合体を投与してもよい。免疫造影技術および免疫治療技術に関するさらに進んだ考察は、ChatalのMono clonal Antibodies in Immunoscintography （CRC Press:1989）、Magerstadtの Antibody Conjugates andMalignant Disease （CRC Press 1981）、BurchielらのRadioimmunoimaging and Radioimmunotherapy （Elsevier）に見ることができる。また、免疫学的方法に関する概括的考察はHarlowとLaneのAntibodies:A Labor atory Manual （Cold Spring HarborLaboratory:1988）にある。その他その他のタンパク質も、それが適当なマーカーに対して十分なる特異性および親和性を有しているなら、抗体と同様な方法で、診断、造影または治療のためにターゲット剤として使うことができる。BakkerらのReceptor scintigraphy with a Radioiodinated somato statin analog:Radiolabeling，Purification，Biologic Activity and in Vivo Application in Anima1s．J．Nucl.，Med.，31:1501-1509，1990，参照のこと。酵素、レクチン、その他さまざまな生物学的受容体が結合剤として作用することができる。ＴＰＫ，ＥＧＦ，ＮＳＥ，ＴＰＡ，Ｂ２Ｍ，ＰＨＩおよびフィブリンは、ある種の腫瘍に優先的に取り込まれることが知られている。その他の活性化法［activation method］ Lunecらは次の三つの方法によるＩｇＧ凝集体［aggregates］の形成について報告している。すなわち（a）硫酸銅と過酸化水素の混合物、（b）アラキドン酸、そして（c）光分解である。そのメカニズムは、ジスルフィドを攻撃し、分子の分子構造を崩壊させるフリーラジカルの発生によるものと考えられている。またフリーラジカルを発生させるために酵素的方法［enzymatic processes］（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、およびグルタチオンペルオキシダーゼ）を利用することも示唆している。本発明は、光分解以外のジスルフィドを攻撃するフリーラジカルを発生させる方法によって、ジスルフィドのあるタンパク質を光活性化することを促進することにも及ぶものである。実施例実施例１〜１１のための材料および方法Ａ．紫外線装置水冷式石英ジャケットのついたConrad-Hanovia式低圧石英水銀灯（Ace Cat #1 2128）を使った。サンプルを（光源から５ｃｍの）水冷式ジャケットから３ｃｍ離した地点でさまざまな時間間隔で照射した。Ｂ．放射化学分析放射性標識したタンパク質を7.8×300mm TSK-3000SWの分析カラムを使ったサイズ排除（ゲル濾過）の高圧液体クロマトグラフィ（SE-HPLC）及びSephadex G- 50スピンカラムを使った改変ソフトゲルクロマトグラフィで分析した。SE-HPLC カラムは、凝集体、単量体タンパク質，フラクション化産物、無反応還元テクネチウム複合体、遊離したパーテクネテートおよび結合還元したテクネチウム種の相対量を測量するのに有益である。Sephadex G-50スピンカラムは安定なタンパク質に結合した放射能の割合について決定するための簡単で迅速な方法である。Ｃ．ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）光分解した後に放射性標識したＭａｂ１７０の免疫反応性を評価するため、ウサギ抗−ＭＡｂ１７０抗体を利用したＲＩＡをポリスチレンチューブに固定化した。試験サンプルおよび対照サンプルのさまざまな希釈液とＩ−１２５ＭＡｂ１７０との競合を分析することによって免疫反応インデックス（指数）を得た。インデックスは５０％阻害を示す試験サンプルの濃度に対する５０％阻害を示す標準対照の濃度の下記比率から引き出した。実施例１ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびヒトトランスフェリンの放射性標識紫外線照射を使った最初の放射性標識実験はＢＳＡおよびヒトトランスフェリンで行った。ｐＨ７．０の０．０５Ｍリン酸緩衝液中の三つの異なる濃度（１、５、１０mg/ml）のＢＳＡまたはヒトトランスフェリン溶液を用意した。２００ μlのタンパク質溶液を12×75mmクオーツ試験管中にパイプで導き上記の（A）方法で０、５、１５、または３０分間、それぞれ照射した。照射後、スズタルタラート溶液１００μl（Ｓｎ⁺²の＞２０μg）を添加し、３００μlのＴｃ−９９ｍパーテクネテートナトリウムを添加した。この混合物を３０分間インキュベーションし、Sephadex G-50スピンカラムで分析し安定タンパク質の放射性標識割合を決定した。結果を表１に示す。紫外線照射後は還元パーテクネテートによるタンパク質の放射性標識比率が向上していることを結果は示している。タンパク質濃度が高いときは、反応はより効果的で、短い照射時間でより高い比率で放射性標識することを示している。実施例２石英試験管内におけるＭＡｂ１７０の紫外線照射０.０５ＭＰＢＳ，ｐＨ７.０中の約６mg/mlのＭＡｂ１７０（Blomira，Inc.，Edmonton）を上記方法（A）のセットアップと同一のセットアップで照射した。ＭＡｂ（200μl）を石英試験管（12×75mm）中で３０分間照射し、次に酒石酸第一スズ100μl、さらに300μlのＴｃ−９９ｍパーテクネテートナトリウムを添加した。反応混合物をSE-HPLCで３０分後に分析した。放射性標識された種［species］の比率は、１８％のＭＡｂ凝集体、４９．３％のＭＡｂモノマー、９．０％の低分子量タンパク質種［species］および２３.０％のＴｃ−９９ｍ緩衝液複合物およびＴｃ−９９ｍパーテクネテートであった。実施例３ホウケイ酸ガラスのバイアル中でのＭＡｂ１７０の紫外線照射ＭＡｂ１７０（６mg/ml）２００μlおよび０．１Ｍタルタラート１０μlを５m Mの塩化第一スズとともに含む窒素パージした２mlのホウケイ酸ガラス円筒バイアルを上記（A）方法におけると同様のセットアップで３０分間照射した。等体積のＴｃ−９９ｍパーテクネテートナトリウムをそのバイアルに添加した。３０分後、反応混合物をSephadex G-50スピンカラムで分析した。得られたSE-HPLCクロマトグラムを図１に示す。結果は、Ｔｃ−９９ｍ放射活性の９５％以上はＭＡｂ１７０反応中のタンパク質に結合することを示している。図１に見るように、この過程は温和で標本中に余分に放射性標識されたフラグメントまたは凝集体をもたらすことはない。実施例４石英試験管およびホウケイ酸ガラスバイアルの紫外線吸収スペクトル石英試験管およびホウケイ酸ガラス試験管の紫外線吸収スペクトルを、HP8452 UV/Vis分光光度計によって測定した。石英ガラスは１９０〜８２０nmの範囲で優れた紫外線透過率を示した。ホウケイ酸ガラス試験管は３００nm以下で高い吸光度を有していたので、３２０nm以上の紫外線波長で照射の大半を行った。２種類のガラスに見られる紫外線吸光度の相違は、短い波長のほうが長い波長よりも大きいダメージをもたらす可能性があることから、タンパク質に対する全体的影響が変化しやすいということを示している。照射するのに好ましい容器はホウケイ酸ガラスの試験管または円筒バイアルである。実施例５紫外線照射によってＭＡｂ１７０をＴｃ−９９ｍ放射性標識するためのスズイオン量の最適化さまざまな量の酒石酸第一スズ（Ｓｎ⁺²を５〜４μg含有している）を２mlの窒素でパージしたホウケイ酸ガラス円筒バイアル中でＭＡｂ１７０（６mg/ml）と混合した。バイアルを次に上記の方法(A)と同じセットアップで６０分間照射した。Ｔｃ−９９ｍパーテクネートナトリウムの等量を添加し放射性標識比率を Sephadex G-50スピンカラムで３０分後に測定した。結果を表２に示す。放射性標識比率がＳｎ⁺²量の増加に伴い減少していることが結果から明瞭に見て取れる。Ｓｎ⁺²の最適量は５〜２０μgのレンジである。放射性標識収率の減少は、おそらくは照射されたタンパク質と高いＳｎ濃度で形成されたＴｃ−９９ｍ複合物との間の競合に起因するものと考えられる。実施例６ＭＡｂ１７０およびＭＡｂＢ４３のＴｃ−９９ｍ放射性標識に対する紫外線照射時間の効果ＭＡｂ１７０をRhodes法によって予めスズメッキしてからパーテクネテートと反応させた。予めスズメッキする緩衝液は４０ｍＭＫＨフタレート、１０ｍＭＮａＫタルトレート、ｐＨ５．６中の０．００５ＭのＳｎ⁺²からなるものである。抗体は１．７mg/mlの開始濃度であった。３部の抗体溶液を２部の予備スズメッキ用の緩衝液に混合して、１mg/mlの抗体の最終タンパク質濃度および２３７mg/mlの最終Ｓｎ⁺²濃度を得た。反応用バイアルを窒素でパージし、シールして室温で２４時間までインキュベーションした。１、３、６、１２および２４時間目にサンプリングを行った。２４時間インキュベーション時に残りの予めスズメッキした抗体溶液を２mgに分別し使うまで−２０℃で貯蔵した。Ｔｃ−９９ｍ標識は生理的食塩水０．５ml中のＴｃ−９９ｍの２mCiを添加して行った。３０分の反応時間後に、SE-HPLCおよびSephadex G-50スピンカラムを使ってバイアルを分析した。この従来法の標識方法を光活性化法と比較した。２mlの窒素でパージしたホウケイ酸ガラス円筒バイアル中のＭＡｂ１７０（６ mg/ml、２００μl）をＳｎ⁺²イオン５μgとともに上記(A)方法のセットアップと同一のセットアップで５〜１２０分間照射した。もう一つのモノクローナル抗体であるＭＡｂＢ４３（Biomira，Inc．Edmo nton）も紫外線照射でＴｃ−９９ｍ放射性標識するのに適しているか否か試験した。ＭＡｂＢ４３（５mg/ml）をスズイオン５μgとともに上記（A）方法のセットアップと同一のセットアップで、それとは異なる時間照射した。等体積のＴｃ−９９ｍパーテクネテートナトリウムを照射後に添加した。結果を図２及び表２Ａに示す。紫外線照射により高い放射性標識収率が得られることを結果は示している。６０分照射サンプルのSE-HPLCは約９５％のＩｇＧモノマーを示したが、これはソフトゲル（Sephadex G-50スピン）カラムの結果を裏付けている。Ｂ４３の放射性標識に最適な条件はＭＡｂ１７０のそれとは異なるように見えるが、これはおそらく抗体中のアミノ酸成分における相違に基づくものと考えられる。照射強度を増大させることによって時間を短くすることが可能であることに注意されたい（例えばより高い出力の紫外線源を使うとか、反応溶液を光源に近づけるとか、あるいはガラスの照射容器壁厚を薄くするとかして）。実施例７ＭＡｂ１７０のＴｃ−９９ｍ放射性標識におけるタンパク質濃度の影響２mlの窒素でパージしたホウケイ酸ガラス円筒バイアル中の５μlのスズイオンを含むＭＡｂ１７０の１〜１０mg/mlという一連のサンプルを３０分間照射した。等体積のＴｃ−９９ｍパーテクネテートナトリウムを照射後に各バイアルに添加し、放射性標識割合を Sephadex G-50スピンカラムで分析した。放射性標識収率割合を表３に示す。放射性標識収率は濃度に比例し、タンパク質量を増加させると放射性標識の得られる量を増加させるものであることを結果は物語っている。実施例８照射された抗体分子のみかけ上の大きさに対する照射の影響放射性標識された照射されたＭＡｂ１７０のSE-HPLC分析（紫外線280nm痕跡）（図３）は、抗体がみかけ上の大きさの変化を何ら受けないことを示している。実施例９照射および放射性標識後のＭＡｂ１７０の免疫反応性の評価実施例２で述べた条件下にＭＡｂ１７０を照射し放射性標識した。未処理のＭＡｂの免疫反応性と、照射したＭＡｂならびに照射しかつ放射性標識したＭＡｂの免疫反応性とを、標準抗イデイオタイプＲＩＡ（Materials and Methoeds，C ．RIAに記載）を使って比較した。結果を表４に示す。照射し、その後にＴｃ−９９ｍで放射性標識して処理したＭＡｂ１７０試料は免疫反応性を９０％以上も保持している。これは、こうした２段階の工程（照射、そしてその後の放射性標識）が抗体に最小限のダメージしか与えていないことを示している。実施例１０光分解中の凝集体形成実施例２で述べたようにしてＭＡｂ１７０を照射し放射性標識した。そうして得た調製物のサンプルをSE-HPLCカラムに注入し、280nmでの吸光度により溶出プロフィルを追跡した。図３はこのＭＡｂの紫外線280nmクロマトグラムを示し、抗体が何らの凝集も示さず、ＩｇＧモノマーの主ピークの左側に小さなピークができていない、また最小限のフラグメント形成しか示さなかった（ＩｇＧモノマーの主ピークの右側に小さなピークが見える）。実施例１１ｐＨの効果ＰＢＳ（１０mMのリン酸緩衝生理的食塩水、ｐＨ７）または０．１Ｍの酒石酸ナトリウムカリウム（ｐＨ６）中で、ウオータージャケットから３cmでそれぞれ１．５時間または１時間照射したＭＡｂ１７０を比較する実験を行った。ＰＢＳ中のＭＡｂの標識効率割合は９２．２％、酒石酸［tartrate］中のＭＡｂは９１ .６％であった。この差は重要でない。ｐＨに対する絶対的優先性を確立していたわけではないが、少なくともＭＡｂ１７０にとってはｐＨは高い標識収率を得るに当たってファクターとなるものではないらしい。実施例１０１紫外線波長の収率に及ぼす効果に関する研究異なる紫外線源を光活性化反応に用いてみた。石英ウオータージャケットに設置した単一のHanovia紫外線ランプを用いて最初の実験を行った。この光源からの主放射は254nm波長の形式であった。Rayonet光化学リアクターは、Hanovia系に一定の利点をもたらすので、後の発展研究に役立つものを選んだ。Rayonetの光リアクターはリアクター室内の８個の紫外線ランプに適合することができる。研究者は２個、４個、６個または８個のランプのいずれをも点灯させることができ、光活性化中の平均強度をコントロールすることができる。紫外線スペクトルの異なる部分をカバーする紫外線ランプの３タイプを選択することもできる。異なるタイプの紫外線フィルタの使用と組合せれば、これは光活性化反応効率に及ぼす紫外線波長の効果を研究する手段になる。光活性化反応は石英試験管を照射容器として使ってRayonet光活性化リアクター内で行われる。リアクターからの紫外線光は、石英管に到達する前に2〃×2〃の狭帯域透過フィルタ（254〜365nm）を介して通過しなければならない。ＭＡｂ１７０の０．５mL（50mM PBS中の5mg/ml）を石英試験管中に入れ、ＭＡｂ１mgあたり３０ngのＳｎ⁺²を添加した。溶液をさまざまな波長のフィルタを使って照射しＴｃ−９９ｍパーテクネテートナトリウムで放射性標識した。各波長における相対放射性標識収率をそれらさまざまな波長における相対照射強度によって標準化した。６つの実験につき表１０１に示してある。各実験につきフィルタの透過波長、公称ランプ波長、ランプ出力、その透過波長における相対ランプ強度、および照射時間を測っている。照射時間は透過波長における強度の違いを補償するように選択されたことに注意されたい。図４は透過した波長に対する放射性標識抗体の収率を描いた棒グラフである。収率は254から313にかけて着実に上昇するが、波長が334に増加すると急激に降下している。したがって最も好ましい波長は250〜320nmのレンジである。実施例１０２光活性化中のスルフヒドリル生成光活性化中に生成される遊離したスルフヒドリル量をEllman試薬を使った反応で測定する。Hanovia紫外線システムを使ってＭＡｂ１７０を石英試験管内でＭＡｂ１７０を光活性化する。照射後のさまざまな時間に少量を分別しEllman試薬と反応させる。412nmにおける紫外線吸光度を測定しシステインのモル濃度を136 00の吸光係数を使って計算する。結果を図５に示す。１抗体分子当たりのＳＨ基の数は約１５分間で殆ど４個にまで増加する。それ以上になると増加は速度を落とし、例えば（t＋15）〜（t＋ 60）分の間隔で約５．５個になっている。実施例１０３標識収率に及ぼすスルフヒドリルブロッキングの効果遊離したスルフヒドリル基は、ヨードアセトアミドとかＮ−エチルマレイミドのようなスルフヒドリル反応性物質によって簡単にブロックすることができる。スルフヒドリルをブロックした後の放射性標識収率の減少は、スルフヒドリルの放射性標識反応における役割を示すことになる。ＭＡｂ１７０（０．１Ｍタルタラート緩衝液中の５mg/ml）を２mlホウケイ酸ガラスのバイアル中に入れた。バイアルを蓋し、クリンプし［crimped］、窒素で１分間パージし、そして300nmで１０〜１５分間照射した。それから５〜１０ μgのSn/mg ＭＡｂを使ってＴｃ−９９ｍパーテクネテートナトリウムで１：１の比率で放射性標識を行った。ブロッキングのため、ヨードアセトアミドの２０ mMまたはＮ−エチルマレイミドの２０mMを照射直後に添加し放射性標識をする前に１５〜３０分間インキュベーションした。放射性標識収率をSE-HPLCで決定した。ヨードアセトアミド（ＩＡ）またはＮ−エチルマレイミド（ＮＥＮ）によるスルフヒドリルブロッキングの結果を表１０２および図６に示す。データは遊離したスルフヒドリルの生成の放射性標識に対する重要性を鮮明に示している。実施例１０４標識収率へのスルフヒドリル置換の効果放射性標識反応におけるスルフヒドリル基関与の事実を示す別の１例はシステインとの相互反応によって示される。スルフヒドリル置換反応はＴｃ−ＳＨ接合体の安定性を損なうおそれがある。Ｔｃ−９９ｍＭＡｂ１７０をスズ還元または光活性化（３００nmで３０分間）によって調製する。ｄｄＨ₂Ｏ中のシステインの保存溶液６．６ｍＭを調製する。Ｔｃ−９９ｍＭＡｂ１７０をシステイン溶液と混合し、ＭＡｂ：システインのモル比を１：１０〜１：９００のレンジにする。その混合物をインキュベーション後にSE-HPLCで異なる時間間隔で分析しタンパク質へ結合していない放射能％を測定する。図７は４つの異なるＭＡｂ：システイン比（１：１０、１：５０、１：３００、１：９００）のインキュベーション後５分および２時間におけるシステインのチャレンジにおける放射性標識システインの収率を示す。図８はスズイオン還元された抗体および光活性化された抗体についてシステインチャレンジにもかかわらず放射性標識される抗体の収率を、２つの異なるＭＡｂ：システイン比（１：１０、１：５０）において比較したものである。スズイオン還元された抗体と光活性化された抗体との間で結果に重大な差異は見られないが、このことはこれら２者がシステインキレート転移［cysteine transchelation］に関して同じようなインビトロ安定性をもっていることを物語っている。実施例１０５光活性化後のパーテクネテート還元剤として選択されたスズ源の効果標識するべき抗体のパーテクネテートおよびジスルフィド結合の両者を還元するためスズイオンを使う従来法においては、スズイオン源は非常に重要なものとなっている。例えばRhodes法では、リン酸第一スズ［stannous phosphate］はその複合体があまりにも安定で抗体は還元することができないから、使うことができない。しかしスズイオンとの錯体を形成する能力［stannous complexing capacities］のさまざまなレベルにあるさまざまなスズ源を光活性化後のパーテクネテート還元剤として使うことができることを発見した。スズ種［species］の量は最適Ｔｃ −９９ｍ放射性標識のために最適化されなければならない。数種のスズ源を光活性化後のパーテクネテート還元剤として使ってみた。スズ種の保存溶液を調製し、ヨウ素滴定によってそのスズ成分を分析した。スズ種のさまざまなレベルをＭＡｂ１７０に加え３００nmで３０分間照射した。次に光活性化したＭＡｂのＴｃ−９９ｍ放射性標識の収率をSE-HPLCで決定した。図９は酒石酸第一スズおよびピロリン酸第一スズで得られる優れた放射性標識収率を示す。Ｓｎメチレンジホスホネート緩衝液中での収率は、Ｓｎ：ＭＡｂ（ｗ／ｗ）比の比較的狭いレンジとしては高いが、この比率としてはなお好ましいレンジ内にある。ＳｎＥＤＴＡ中での反応の収率は２つの好ましい緩衝液中で反応が生じた時よりもかなり低い。この図には示されていないが、リン酸第一スズによる収率はメチレンジホスホネートとピロリン酸第一スズのデータの中間に位置する。実施例１０６収率に及ぼすＭＡｂ緩衝液の効果 YM30薄膜を有するAmicon限外濾過槽［Amicon ultrafiltration cell］を使ってＭＡｂ１７０をさまざまな緩衝液中に透析ろ過した。使った緩衝液はｐＨ７．５、０．１ＭのTris，ｐＨ６．０、０．１Ｍのタルトレート緩衝液およびｐＨ５．５、０．０５Ｍの酢酸ナトリウムを含有していた。ＭＡｂの５００μlを２５μgのＳｎ／ｍｇＭＡｂとともにガラス内に入れる。その溶液を３０分間３００nmで照射する。次に溶液を１：４（ＭＡｂ：パーテクネテート）比で放射性標識しSE-HPLCで分析する。結果を表１０６に示す。３種すべての緩衝液で高い収率が得られた。前述の実施例におけるスズ源も抗体の光活性化を阻害することがなかったから、好ましい波長の紫外線照射を実質的に吸収しない緩衝液をここに考察している光化学反応に使うことができると言うことができる。タンパク質をテクネチウムで標識するときであって、テクネチウムがスズイオンで還元されたパーテクネテートの形で供給されるときは、緩衝液もそのスズイオン還元系と競合できるものであることが必要である（前述の実施例ではＥＤＴＡでの問題はスズイオンとあまりにも強力な複合体を形成してしまったということを思い出して頂きたい）。実施例１０７収率に及ぼすスズイオン濃度の効果光活性化した調合物［formulation］中のスズイオン量は、還元されたＴｃ種の光活性化タンパク質との競合［competition］のため最終品の放射性標識収率に影響し得る。したがって試料中のスズイオン量は放射性標識収率に悪影響を及ぼすことなく完全なパーテクネテート還元を行うことができるに十分な量があるように最適化しなければならない。ｐＨ７.４、０．５ＭのＰＢＳ中の塩化第一スズ結晶を溶解してリン酸第一スズ溶液を調製する。次にこの溶液をヨウ素滴定スズ分析［iodometric stannous assay］で分析し、スズのレベルを決定する。ＭＡｂ１７０（５mg/ml）に加えられるリン酸第一スズ溶液を計算し（１５〜３０μgのＳｎ／ｍｇＭＡｂの最終スズ濃度を出すため）、ＭＡｂ溶液に移す。０．５mlづつ分取したＭＡｂ溶液を２mlの窒素でパージしたガラスバイアル中に注入する。このバイアルをさまざまな時間間隔、３００nmで照射し放射性標識収率を分析する。図１０は４つの異なるスズイオン濃度における放射性標識収率を時間別にプロットしたものである。実施例１０８収率に及ぼす照射量の効果光活性化および光活性化後の放射性標識の動態［kinetics］は二相性パターンであるように見える。放射性標識収率には初期に急速な増加があり、次に比較的穏やかな相が現れ、それが水平になるまで続く。一括［bulk］容器照射中における照射量の変化は、単位量当たりの平均照射強度の減少により反応の動態を変化させるものと考えられる。５０mlホウケイ酸ガラスバイアル（3.8×7.5cm）を照射容器として用いる。25 〜30μgのSn/mg ＭＡｂを含有するさまざまな量（５、２０、４０ml）のＭＡｂ１７０をそのバイアルに加える。次にバイアルを３００nmで照射しサンプルをさまざまな時間間隔で取り出して放射性標識収率を分析する。結果を図１１に示す。予想通り、少ない照射量の方が高い収率をもたらす。実施例１０９抗体以外のタンパク質の光活性化による標識Ｔｃ−９９ｍ放射性標識のために光活性化反応を利用することはモノクローナル抗体に限られたものではない。これ以外のシステイン含有タンパク質もこの方法でＴｃ−９９ｍ放射性標識されている。このように光活性化はさまざまなタンパク質ならびにペプチドの構造につき利用される可能性をもっている。最適な放射性標識収率を得る条件は、システインおよびその他のアミノ酸成分における可変性［variablity］、また分子の三次構造のために、タンパク質ごとに異なる可能性がある。表１０９の標識比較実験において、全タンパク質はｐＨ７．４、５０mMのPBS 緩衝液中にある。５〜１９μｇのＳｎ／ｍｇタンパク質を含有するタンパク質溶液０．２〜０.２５mlを２mlガラスバイアルに注入した。サンプルを３００nmで照射した後Ｔｃ−９９ｍパーテクネテートナトリウムで放射性標識した。対照バイアル中のタンパク質溶液も等量のスズイオンを有していたが紫外線照射には当てられなかった。結果を表１０９に示す。放射性標識されたトランスフェリンとＢＳＡの収率を３つの放射性標識されたモノクローナル抗体の収率と比較することができる。実施例１１０個々のバイアル照射による小規模光活性化これは簡単な方法であるから、その製造のため１mg以下からグラム単位までの材料を使った簡単なバイアルを個々に照射して一括容器［bulk-vessel］照射系または流動［flow-through］照射系に置くなどさまざまな形式で光活性化を行うことができる。反応中は閉鎖照射系を利用でき複雑な反応後洗浄など必要でないから、製品の無菌状態を容易に維持することができる。したがってこの方法は日常的な研究所での研究あるいは製薬工業における拡大規模の製造にも容易に採用することができる。光活性化は8×300nmの紫外線ランプが装備されたRayonet光化学リアクターを使って行うことができる。予めクリンプされた［precrimped］ホウケイ酸ガラスの殺菌された空バイアル（2mL）をHillister Stier社（カナダ）から購入した。不活性空気を保持させるためこれらのバイアルを窒素でパージした。一遍にバイアル８個まで保持することができるRayonetのメリーゴーランドユニットをサンプルホルダーとして使用した。このユニットをフォトリアクター室内に降ろし、全部のバイアルに一様に照射できるように室内で回転させた。Ｍａｂ１７０（５mg/ml）をリン酸第一スズと混合し（0.5Mのリン酸塩緩衝液中の30μgのSn⁺²/mg MAb）、１mgの分別量（約0.2ml）を殺菌した使い捨て注射器でシール済みバイアル中に注入した。バイアルをメリーゴーランドユニットに置きフォトリアクター室内に降ろした。バイアルを室内で４５分回転させて照射させた。照射直後、バイアルを室から取り出し中身で標識し−２０℃で冷凍保存した。対照セットを等量のＭａｂ１７０とリン酸第一スズで調製し、光活性化させずに同時間インキュベーションした。Ｍａｂ１７０の両セットの放射性標識収率をオンライン放射能検知器を使ってSE-HPLCで決定した。実施例１１１一括照射による光活性化大掛かりな規模の反応をさせるには、反応容器として１個の一括照射容器を使うことができる。均一な照射を確保するために容器内で溶液を効果的に混合する必要がある。反応容器の大きさはフォトリアクターの室内スペースによって決まる。ここで実際使ったフォトリアクターでは300ml容器が十分に照射することができ、1.5gまでの規模（5mg/mlのＭａｂを使って）が可能なものであった。（ａ）一括容器照射でのＭａｂ１７０の光活性化両側にアームポートのある300ml入り石英ボトルを反応容器として使った。Ｍａｂ１７０（5mg/mlで60ml、計300mg）をリン酸第一スズ（0.5Mのリン酸塩緩衝液中30μgのSn⁺²/mg MAb）と混合した。Ｍａｂ溶液を磁気撹拌棒とともに石英容器中に入れ、フォトリアクター中の磁気撹拌器上に置いた。容器の頭部空間［he adspace］を両側のアームポートを利用して照射中に窒素でパージした。溶液を照射中撹拌し、サンプルを定期的な時間間隔をおいて容器から取り出し、Ｔｃ− ９９ｍパーテクネテートナトリウムで放射性標識した。放射性標識収率をSE-HPL Cで決定した。結果を表１１１に示す。（ｂ）一括容器照射でのヒトＩｇＧ（Gaminune N）の光活性化ヒトＩｇＧ（Gamimune N，Miles，Canada）をｐＨ７.４の50mM PBSで5mg/mlまで希釈した。ヒトＩｇＧを上記（ａ）と同様に処理した。結果を表１１１Ａに示す。実施例１１２循環流動系における光活性化光活性化反応の拡大化規模での別の方法はタンパク質照射のために流動系［fl ow-through system］を使うものである。フォトリアクター室の中心に取り付けるガラスまたは石英のコイルを用意することができる。タンパク質溶液を反応室の外側に置いた容器中に溜めておき、その溶液を紫外線光にさらしたコイルを介してポンプ供給することによって照射を行う。この形式では２態様が試みられた。第一の態様はＭａｂ溶液をコイルを介して循環させ保存容器に戻すものである。この態様においては溶液の十分な混合が必要である。第二の態様は溶液をコイルを介して制御された流速でポンプ供給し、最終製品として別に用意した収集ボトルに集めるという「１回」流動のものである。流し照射法は殆ど無限に規模拡大化を可能にし、単一照射容器を使う場合の「量的効率」を解消する。 PBS緩衝液（ｐＨ7.4，0.5M，1.8ml）をＭａｂ１７０（110ml，5mg/ml）の撹拌された溶液中に添加した。次にリン酸第一スズ溶液3.7ml（3.3mgのスズ／ml溶液 ; 12.1mgスズ）を添加した。それらの材料を室温で８個の紫外線ランプの装備されたRayonetミニリアクター内に通じるホウケイ酸ガラス製コイル中で照射した。ポンプ速度は２０RPMであった。照射中、サンプルをさまざまな時間間隔で取り出しパーテクネテートと反応させ、そしてＴｃ−９９ｍ放射性標識の収率を分析した。結果を表１１２に示す。実施例１１３１回流動系による光活性化サンプルを照射中さまざまな時間間隔で取り出しＴｃ−９９ｍ放射性標識の収率を分析した。９０％以上の放射性標識収率が常態的に得られた。実施例１１４凍結乾燥抗体の光活性化凍結乾燥Ｍａｂキットはより長い長期的な生産安定性とか、冷凍形式よりも容易な貯蔵性や出荷性などの一定の長所を提供することができる。光活性化されたＭａｂは適当な凍結乾燥サイクルを使って凍結乾燥することができ、こうして得られた製品は生物学的および放射化学的特徴を保持している。ケーク構造の外観を改良するため不活性な増量剤が通常その調合物［formulation］に添加される。Ｍａｂ１７０（110ml，550mg）を循環流動設計に従い光活性化する。工程の最後の段階でイノシトール濃度0.5％（最終Ｍａｂ濃度＝2mg/0.6ml），Ｍａｂ溶液の2mgドーズを自動ディスペンサーを使い5ml入りの空のバイアルに分注し部分的に蓋をした。次にバイアルをVirtus凍結乾燥器に移し、次のサイクルで凍結乾燥した。 −４５℃予備冷却棚に約1.5時間第一次乾燥：棚温度＝−２０℃±１℃ ランプ時間＝１８分保圧時間＝１５時間真空レベル＝１８０ｍT 第２次乾燥：棚温度＝２５℃±１℃ ランプ時間＝４５分保圧時間＝１３時間真空レベル＝１８０mT以上凍結乾燥後、バイアルを凍結乾燥器内で自動閉蓋し、手でクリンプ［crimp］した。凍結乾燥後の放射性標識収率をSE-HPLCで測定した。（表１１４）実施例１１５抗体の構造および活性に及ぼす光活性化の効果生物学的に活性であるか、または受容体に特異性な分子にとっては、放射性標識に使われる工程がその分子の反応性を変化させないものであることが重要である。また、放射性標識された分子は生化学的ならびに放射化学的の双方において純粋［pure］でなければならない。常態的な放射薬学的［radiopharmaceutical ］生産においては製品は相当期間安定を保持し、放射性標識自体がインビトロ、インビボの両者において安定を保持することが望まれる。間接的方法でＴｃ−９９ｍ放射性標識されたタンパク質にとっては、接合反応は特異的アミノ酸をターゲットにするか、あるいは非特異的（例えば光化学反応可能なアジドキレート化合物）である。たまたまアミノ酸または接合のターゲットが分子の活性部位にあるときは、その分子の免疫反応性は中間的になる［compromise］。反応後の分子の付加的な処理、例えば反応後の精製は、製品の全体的収率を低下させるだけでなく、免疫反応性をさらに減少［reduction］させる危険がある。（ａ）光活性化Ｍａｂ１７０のSDS-PAGEおよびIEFプロフィル光活性化させたＭａｂの生物学的特性につき常時監視する。製品の品質変化を監視するためにSDS-PAGE（還元条件下）及びIEF［isoelectric focusing］が使われる。サイズ排除カラムを用いたHPLCが製品中の凝集［aggregation］あるいは断片化［fragmentation］の程度の測定に使用される。個別バイアル照射でＭａｂ１７０を光活性化する。次に光活性化Ｍａｂを−２０℃で凍結しサンプルの１分別を分析するために採取する。確立された工程を踏んでSDS-PAGEおよびIEFを行う。結果を表１１５に示す。（ｂ）光活性化Ｍａｂ１７０のSE-HPLC（紫外線）分析個別バイアル照射によりＭａｂ１７０を光活性化する。光活性化Ｍａｂを−２０℃で凍結しサンプルの１分別を分析するために採取する。TSK SW3000XL分析カラム（7.8 100mm）およびTSK SW3000ガードカラムを使ってSE-HPLCを行う。溶出液をプログラム可能なBeckman UV/Vis検出器を使って280nmにおける紫外線吸光度を監視し、Beckmanシステムゴールドソフトウエアを使ってまとめた。結果を表１１５Ａに示す。（ｃ）光活性化Ｍａｂ１７０及び光活性化Ｍａｂ１７４のSE-HPLCプロフイルＴｃ−９９ｍ放射性標識したタンパク質の放射化学プロフィルを凝集体、タンパク質モノマー、断片生成物、無反応の還元剤テクネチウム複合体、遊離したパーテクネテートおよび結合した還元テクネチウム種の相対量を測定することができるSE-HPLCで常時監視した。Ｍａｂ１７０およびＭａｂ１７４を個別バイアル照射によって光活性化した。光活性化ＭａｂをＴｃ−９９ｍパーテクネテートナトリウムで約30mCi/mgの比活性で放射性標識した。SE-HPLC放射化学プロフィルを表１１５Ｂに示す。（ｄ）紫外線照射し放射性標識されたＭａｂ１７０の免疫反応性紫外線光活性化したＭａｂ１７０の免疫反応性について２種類の技術で測定した。紫外線処理したＭａｂ１７０が結合部位をI-125Ｍａｂ１７０標準と競合するように抗イディオタイプＲＩＡを使った。Ｍａｂ１７０結合抗原発現セルラインのＭａｂ１７０との結合を調べるためセルラインバイオアッセイ［cell-line bioassay］も行った。光活性化Ｔｃ−９９ｍＭａｂ１７０に関する両分析結果を表１１５Ｃにまとめた。（ｅ）凍結乾燥した光活性化Ｍａｂ１７０に関する安定性の研究光活性化され標識されたＭａｂ１７０の凍結乾燥製剤の生化学プロフィルの変化を表１１５Ｄにまとめた。（ｆ）光活性化され放射性標識されたＭａｂの安定性と血清のチャレンジ個別バイアル照射によりＴｃ−９９ｍＭａｂ１７０を調製し、Ｔｃ−９９ｍパーテクネテートナトリウムで放射性標識した。放射性標識したＭａｂ１７０の６μ lをヒト血清300μlと混合し、37℃でインキュベーションした。インキュベーション後２４時間および４８時間後、混合体をSE-HPLCで分析し、Ｍａｂ関連ピークをフラクションコレクターで収集した。Ｍａｂフラクション中の放射能量を測定し全放射能に対する割合として表した。（表１１５Ｅ）実施例１１６放射性標識抗体の生体内分布に及ぼす光活性化の効果３種類の技術を使ってＭａｂ１７０をＴｃ−９９ｍで放射性標識した。変形Rho des法（Sn処理したもの）でスズ還元技術を用いた。個別バイアル照射（UV-Lyo ）を使って調製した凍結乾燥製剤（紫外線流動）からの、および凍結乾燥製剤からの流動光活性化技術でＭａｂ１７０を放射性標識した。放射性標識したＭａｂの20μgを正常Balb/Cマウスに尾静脈から血管注射した。注射後のいろいろな時間経過した時点でマウス群を殺し、問題の臓器を切開した。３種類の複合体の生体内分布につき図１２Ａ〜１２Ｄにまとめてある。本明細書中に言及された全特許、特許出願ならびに刊行物は、本願出願人の先行出願も含めて、それらの言及により本明細書に組込むものとする。免疫反応性指標とは抗イディオタイブＲＩＡから得た値、ＲＩＡはウサギ抗MAｂ１７０でコーティングされた円筒管でなり、Ｉ−１２５で標識されたＭＡｂ１７０と試験又は対照の標準サンプルとの事後的競合。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者ウー、トーマス、ケイ. カナダ、ティ６ケイ３ピー７、アルバータ、エドモントン、サーティーンスアベニュー 7020 (72)発明者キューアイ、ペイカナダ、ティ６ジェイ４アール１、アルバータ、エドモントン、アハンドレッドフォースストリート 2412 (72)発明者ノージャイム、アントワーヌエイ. カナダ、ティ６エム２ケイ４、アルバータ、エドモントン、ウイルキンロード 58

Claims

【特許請求の範囲】１．タンパク質のジスルフィド結合の少なくとも一部を還元するのに十分な強度および時間だけタンパク質を紫外線照射し、その結果得た光活性化タンパク質をパートナー物質と反応させることを特徴とする、１つまたは２つ以上のジスルフィド結合を有し、かつ、遊離したチオール部分と反応するパートナー物質を有するタンパク質接台体の調製法。２．タンパク質が抗体であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質接合体の調製法。３．抗体が腫瘍関連抗原を優先的に認識するものであることを特徴とする請求項２に記載のタンパク質接合体の調製法。４．タンパク質が酵素であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質接合体の調製法。５．タンパク質がアルブミン、トランスフェリン、ソマトスタチンからなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質接台体の調製法。６．パートナー物質が薬物または毒素であることを特徴とする請求項１〜５に記載のタンパク質接合体の調製法。７．パートナー物質が放射性同位体をキレート化することができ、かつ、遊離したチオールと反応する部分を有しているキレート化剤であることを特徴とする請求項１〜５に記載のタンパク質接合体の調製法。８．パートナー物質が、光活性化タンパク質との反応のために任意にに還元されている放射性金属イオンであることを特徴とする請求項１〜５に記載のタンパク質接合体の調製法。９．イオンが還元されたパーテクネテートまたは還元されたパーレネートであることを特徴とする請求項８に記載のタンパク質接合体の調製法。１０．パーテクネテートまたはパーレネートがスズイオンで還元されていることを特徴とする請求項９に記載のタンパク質接合体の調製法。１１．スズイオンがタンパク質のジスルフィド結合をも還元することができない条件下でパーテクネテートまたはパーレネートをスズイオンで還元することを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質接合体の調製法。１２．スズイオンの実質的な沈殿を起こすことなく、還元がスズイオンで行われ、反応が６より大きいｐＨ値で行われることを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質接合体の調製法。１３．パートナー物質に接合したタンパク質の割合が少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％であることを特徴とする請求項１〜１２に記載のタンパク質接合体の調製法。１４．パートナー物質との反応に先立ちタンパク質が約１時間以下の時間だけ照射されることを特徴とする請求項１３に記載のタンパク質接合体の調製法。１５．照射が１０分以上、好ましくは１５分以上、より好ましくは少なくとも２０分であることを特徴とする請求項１〜１４に記載のタンパク質接合体の調製法。１６．照射が主として２５０〜３２０nmのレンジ、好ましくは２７０〜３２０nm のレンジの波長であることを特徴とする請求項１〜１５に記載のタンパク質接合体の調製法。１７．パートナー物質がそれ自身は光活性化されないものであることを特徴とする請求項１〜１６に記載のタンパク質接合体の調製法。１８．パートナー物質が、光活性化タンパク質との反応時にナイトレン、またはカルベンでないことを特徴とする請求項１〜１７に記載のタンパク質接合体の調製法。１９．パートナー物質が実質的に特異的に、遊離したチオールと反応するものであることを特徴とする請求項１〜１８に記載のタンパク質接合体の調製法。