CZ309221B6 - Způsob identifikace přírodních vzorků, zejména kapalných - Google Patents

Způsob identifikace přírodních vzorků, zejména kapalných Download PDF

Info

Publication number
CZ309221B6
CZ309221B6 CZ2018510A CZ2018510A CZ309221B6 CZ 309221 B6 CZ309221 B6 CZ 309221B6 CZ 2018510 A CZ2018510 A CZ 2018510A CZ 2018510 A CZ2018510 A CZ 2018510A CZ 309221 B6 CZ309221 B6 CZ 309221B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
sample
natural sample
irradiated
fluorescence spectrum
natural
Prior art date
Application number
CZ2018510A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2018510A3 (cs
Inventor
Lukáš NEJDL
Nejdl Lukáš Ing., Ph.D.
Vojtěch Adam
Adam Vojtěch prof. RNDr., Ph.D.
Markéta VACULOVIČOVÁ
Vaculovičová Markéta doc. Mgr., Ph.D.
Original Assignee
Mendelova Univerzita V Brně
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mendelova Univerzita V Brně filed Critical Mendelova Univerzita V Brně
Priority to CZ2018510A priority Critical patent/CZ309221B6/cs
Priority to DE19779741.8T priority patent/DE19779741T1/de
Priority to ES19779741T priority patent/ES2850623T1/es
Priority to DK19779741.8T priority patent/DK3857204T1/da
Priority to EP19779741.8A priority patent/EP3857204B1/en
Priority to HUE19779741A priority patent/HUE19779741T1/hu
Priority to PCT/CZ2019/000046 priority patent/WO2020064031A1/en
Publication of CZ2018510A3 publication Critical patent/CZ2018510A3/cs
Publication of CZ309221B6 publication Critical patent/CZ309221B6/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G01N33/14—Beverages
    • G01N33/143—Beverages containing sugar
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G01N33/14—Beverages
    • G01N33/146—Beverages containing alcohol
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/1717—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated with a modulation of one or more physical properties of the sample during the optical investigation, e.g. electro-reflectance
    • G01N2021/1725—Modulation of properties by light, e.g. photoreflectance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N2021/1761—A physical transformation being implied in the method, e.g. a phase change
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G01N2021/3125—Measuring the absorption by excited molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N2021/755—Comparing readings with/without reagents, or before/after reaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)

Abstract

Řešení se týká způsobu identifikace přírodních vzorků, zejména kapalných, jehož podstata spočívá vtom, že po změření fluorescenčního spektra přírodního vzorku v neozářeném stavu UV zářením dále zahrnuje: - ozáření známého přírodního vzorku UV zářením o vlnové délce 250 až 400 nm, po předem stanovený časový interval, - změření fluorescenčního spektra ozářeného známého přírodního vzorku, - ozáření neznámého přírodního vzorku UV zářením o vlnové délce 250 až 400 nm, po předem stanovený časový interval, - změření fluorescenčního spektra ozářeného neznámého přírodního vzorku, - porovnání změřeného fluorescenčního spektra ozářeného známého přírodního vzorku nebo fluorescenčního spektra ozářeného známého přírodního vzorku, který byl dříve uložen v databance informací, s fluorescenčním spektrem ozářeného neznámého přírodního vzorku, - určení, zda je neznámý přírodní vzorek shodný nebo odlišný od známého přírodního vzorku.

Description

Způsob identifikace přírodních vzorků, zejména kapalných
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu identifikace přírodních vzorků, a to zejména kapalných, tedy včetně zkapalněných, včetně biologických vzorků, takže spadá do oblasti analytické chemie. Využívá pro identifikaci přirozených spektrálních vlastností látek, tedy absorpce a emise záření, které se mění v závislosti na UV ozáření. Spektrálním rozborem těchto vzniklých změn a chemických reakcí se získávají cenné informace o fyzikálních, chemických nebo biologických vlastnostech vzorku v krátkém čase a to bez nutnosti jakékoli předchozí složité přípravy zkoumaného přírodního vzorku.
Dosavadní stav techniky
Různorodé složení farmakologických přípravků, především léků, drogových směsí, tedy návykových a psychotropních látek, potravin, nápojů a biologických či klinických vzorků, například krevní plazma či moč, je základním problémem ztěžujícím jejich analýzu během jednotek až desítek minut. Ve většině případů musí před analýzou proběhnout extrakční, izolační a/nebo separační proces. Takto upravený vzorek je podroben instrumentální analýze, kterou provádí vysoce kvalifikovaná osoba pomocí složité a nákladné instrumentace. Celý proces, byť precizní, je časově a finančně náročný. Rychlá determinace farmaka může být klíčová při záchraně pacienta předávkovaného neznámým léčivem během převozu do nemocnice. Mimořádně důležité je odhalení vadné či padělané šarže léčiva před jeho distribucí. Schopnost během několika minut rozpoznat důležité vlastnosti zkoumané látky se jeví jako klíčová pro průmysl nebo potravinářství. Zejména se může jednat o kontrolu původu sudových vín nebo kontrolu kvality technologického zpracování ovocných šťáv a zeleninových extraktů popřípadě nápojů obsahující tyto šťávy a extrakty.
V posledních letech můžeme zaznamenat snahu zejména v medicínských oborech o metody využívající typické tvary neboli pattemy spekter, které jsou někdy označovány jako takzvané „otisky prstů“. Tyto metody vycházející zejména ze spektrální analýzy, například Ramanovy spektroskopie, infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací a hmotnostní spektrometrie klinických vzorků, přičemž se hodnotí tvary zaznamenaných spekter. Takto nelze přesně určit kvantitativní a kvalitativní zastoupení jednotlivých analytů ve vzorku, ale lze tato spektra přiřadit k celé řadě fyziologických nebo patologických stavů organizmu. Tímto způsobem lze vytvářet knihovny typických spekter, a mezi sebou je porovnávat. Navrhované metody identifikace vlastností látek využívají a hodnotí typické tvary spekter, na základě kterých lze zkoumaný vzorek přesně určit nebo studovat.
Mezi základní fyzikálně-chemické metody používané při analýze léčiv, drog, nebo potravin patří chromatografické metody, tedy kapalinová nebo plynová chromatografie, elektroforéza případně spektrální metody, tedy spektrofotometrie, infračervená nebo Ramanova spektroskopie. Extrakce analytu představuje jeden z kritických kroků analytického stanovení vlastností látek. Jako extrakční činidla se používají polární i nepolární rozpouštědla. Z polárních rozpouštědel se nejčastěji jedná o acetonitril, ethanol a methanol. Jedna z nej důležitějších podmínek pro dosažení vysoké účinnosti extrakce je volba vhodného pH. Hodnota pH extrakčního činidla má vliv na rozpustnost a/nebo ionizaci analytu. Dalším krokem v analýze může být derivatizace vzorku. Derivatizační reakce vedou k tvorbě detekovatelných derivátů, zvýšení citlivosti a selektivity, zvýšení rozlišení nebo umožnění separace vůbec. Obecně platí, že spektroskopické metody mají menší nároky na přípravu vzorků v porovnání s chromatografickými metodami. Například Ramanova spektroskopie je jednou z metod vibrační molekulové spektroskopie, která se používá k chemické identifikaci analytů obsažených ve vzorku. Metoda využívá tak zvaný Ramanův jev neboli Ramanův rozptyl, ke kterému dochází při interakci laserového paprsku s elektrony zkoumaného vzorku. Vzhledem
-1 CZ 309221 B6 ktomu, že každá látka vykazuje charakteristický posun vlnové délky, je možné tento jev využít k nedestruktivní identifikaci chemického složení vzorku, a to pomocí vytvoření souboru spekter typických pro dané analyty. Nevýhodou Ramanova rozptylu je jeho poměrně slabá intenzita zejména ve srovnání s absorpcí nebo emisí záření. Je tedy nutná značná čistota analyzovaného vzorku. Jakákoli fluorescenční příměs nebo případná fotochemická reakce znemožňuje provádění analýzy.
Důležitou metodou, která využívá soubor typických spekter, pro identifikaci analytu je také hmotnostní spektrometrie. Tato metoda muže být využita buď samostatně, nebo v kombinaci se separační technikou. Samostatné použití této metody pro určení vlastností látek bez předchozí separace vzorků může být problematické, protože složky směsi ionizované laserem a míra ionizace souvisí s řadou faktorů. Jedním z nich je například druh matrice, která se ke vzorku přidává v rámci analýzy. Taabsorbuje většinu energie ionizačního laseru a předá ji zkoumanému vzorku. Vzhledem k tomu, že operátor nezná složení vzorku, může vlivem nesprávně zvolené matrice dojít ke špatné nebo částečné ionizaci vzorku, což má za následek zkreslení nebo znemožnění analýzy.
Podstata vynálezu
Podstata způsobu identifikace přírodních vzorků, zejména kapalných, podle vynálezu spočívá v tom, že po změření fluorescenčního spektra přírodního vzorku v neozářeném stavu UV zářením dále zahrnuje ozáření známého přírodního vzorku UV zářením o vlnové délce 250 až 400 nm, po předem stanovený časový interval, změření fluorescenčního spektra ozářeného známého přírodního vzorku, ozáření neznámého přírodního vzorku UV zářením o vlnové délce 250 až 400 nm, po předem stanovený časový interval, změření fluorescenčního spektra ozářeného neznámého přírodního vzorku, porovnání změřeného fluorescenčního spektra ozářeného známého přírodního vzorku nebo fluorescenčního spektra ozářeného známého přírodního vzorku, který byl dříve uložen v databance informací, s fluorescenčním spektrem ozářeného neznámého přírodního vzorku a určení, zdaje neznámý přírodní vzorek shodný nebo odlišný od známého přírodního vzorku.
Přírodní vzorek obsahuje kovové ionty, zejména některé z Zn2+’ Cu2+, Fe2+, Mg2+, Se2+ nebo Cd2+ či disulfídické vazby nebo thiolovou skupinu, zejména některé z cystein, homocystein, glutathion oxidovaný, glutathion redukovaný, S-Adenosyl-L-homocystein, S-Adenosyl-methionin, koenzym A, cystamin, acetylcystein, gamma-L-Glutamyl-L-cystein.
Spektrální změny vyvolané UV ozářením se projeví změnou absorpčního nebo emisního nebo excitačního spektra anebo jako nárůst či pokles absorpčního, emisního či excitačního signálu. Tyto změny souvisejí zejména s tvorbou kvantových nanokrystalů, nebo změnou tvorby radikálů, nebo změnou degradace násobných chemických vazeb, nebo změnou fotovybělování, případně kombinací těchto změn.
Předmět vynálezu představuje novou, unikátní a jedinečnou fluorescenční spektroskopickou metodu, která na základě typických spekter dokáže určit či rozlišit jednotlivé vzorky nebo jejich vlastnosti.
Velkou výhodou jsou nízké nároky na přípravu vzorku. Vzorek je nutno pouze alespoň částečně rozpustit v destilované vodě nebo jiném rozpouštědle, například v dimethylsulfoxidu nebo smíchat s vhodným pufrovacím roztokem. Metoda nemá speciální nároky na kvalitu vzorků, proto je univerzální a lze ji využít v průmyslu, zemědělství, potravinářství, farmacii a výzkumných pracovištích.
Mimořádnou výhodou je rychlost analýzy vzorků. Celou proceduru, včetně přípravy vzorku, analýzy a vyhodnocení lze uskutečnit do několika minut. Například analýza léčiv nepřesahuje 10 min.
-2 CZ 309221 B6
Metoda nevyžaduje speciální úpravu analytických přístrojů a je kompatibilní s přístroji využívajícími pro svůj chod ultrafialové a viditelné záření.
Jednoduchost provádění analýz dovoluje využít kufříkové nebo ruční analyzátory, což umožňuje provádět analýzy všude tam, kde je zapotřebí.
Objasnění výkresů
Výsledky příkladných provedení a způsob identifikace přírodních vzorků podle vynálezu jsou znázorněny na přiložených obrázcích, kde obr. 1 schematicky znázorňuje podstatu metody podle vynálezu, kde vztahová značka 1 znázorňuje zdroj ultrafialového záření, které je definováno dobou trvání ozařování, což znázorňuje vztahová značka 2, vlnovou délkou, což znázorňuje vztahová značka 3 a jeho intenzitou působící na studovaný kapalný vzorek, který znázorňuje vztahová značka 4 a kde vztahová značka 5 znázorňuje zkoumaný vzorek, kde jsou vyvolány spektrální změny, které jsou způsobeny tvorbou fluorescenčních nanokrystalů podle vztahové značky 6, tvorbu volných radikálů, které znázorňuje vztahová značka 7, degradaci chemických vazeb, které znázorňuje vztahová značka 8 a fotovybělování, které znázorňuje vztahová značka 9, přičemž uvedené změny lze zaznamenat jako absorpční, fluorescenční a excitační spektra, jak znázorňuje vztahová značka 10, obr. 2 znázorňuje excitační spektra v rozsahu λεχ = 230 až 470 nm a Xem = 500 nm vybraných farmakologických přípravků, v tomto případě antihistaminik, rozpuštěných v destilované vodě (20 mg/ml): v případě vzorku A se jedná o přípravek Dithiaden - výrobce Zentiva, v případě vzorku B se jedná o přípravek Zenaro - výrobce Zentiva, v případě vzorku C se jedná o přípravek Aerius-výrobce SPLaboN.Vav případě vzorku D se jedná o přípravek Dasselta - výrobce Krká d.d,. Křivka pod označením 1 představuje excitační spektrum vzorku po 6ti minutovém ozáření v UV (Xem = 254 nm) transiluminátoru, křivka pod označením 2 představuje excitační spektrum vzorku v nativním stavu, tedy bez ozáření UV zářením. Data byla pořízena fluorescenčním analyzátorem Infinite M200 pro. Vzorky byly ozářeny a analyzovány po 100 μΐ v UV transparentní 96 jamkové destičce, obr. 3 znázorňuje emisní spektra (λεχ = 250 nm a Xem = 280 až 600 nm) vybraných džusů, kde vzorek označený A představuje pomerančový džus od společnosti BASIC, označený výrobcem jako 100% koncentrát, vzorek označený B představuje grepový džus od stejné společnosti a vzorek označený C představuje jablečný džus, rovněž od stejné společnosti. Křivka 1 představuje výsledek, kdy 50 μΐ vzorku bylo smícháno s 50 μΐ 0,1 mol/litr fosfátovým pufrem pH 7, křivka 2 představuje výsledek, kdy 50 μΐ vzorku ředěného 1:1 destilovanou vodou bylo smícháno s 50 μΐ 0,1 mol/litr fosfátovým pufrem pH 7, křivka 3 představuje výsledek, kdy = 50 μΐ vzorku ředěného 1:2 destilovanou vodou bylo smícháno s 50 μΐ 0,1 mol/litr fosfátovým pufrem pH 7 a křivka 4 představuje výsledek, kdy 50 μΐ vzorku ředěného 1:4 destilovanou vodou bylo smícháno s 50 μΐ 0,1 mol/litr fosfátovým pufrem pH 7. Vzorky byly ozařovány UV transiluminátorem (Xem = 254 nm) po 100 μΐ v UV transparentní 96 jamkové destičce po dobu 10 minut. Data byla pořízena fluorescenčním analyzátorem Infinite M200 pro., obr. 4 znázorňuje emisní spektra (λεχ = 250 nm a Xem = 280 až 600 nm) vybraných odrůdových vín, kde vzorek A představuje ryzlink rýnský, vzorek B představuje ryzlink vlašský, vzorek C představuje tramín červený a vzorek D představuje sauvignon. Křivka 1 uvádí výsledek, kdy 50 μΐ vzorku bylo smícháno s 50 μΐ 0,1 mol/litr fosfátovým pufrem pH 7, křivka 2 uvádí výsledek, kdy 50 μΐ vzorku ředěného 1:1 destilovanou vodou bylo smícháno s 50 μΐ 0,1 mol/litr fosfátovým pufrem pH 7, křivka 3 uvádí výsledek, kdy 50 μΐ vzorku ředěného 1:2 destilovanou vodou bylo smícháno s 50 μΐ 0,1 mol/litr fosfátovým pufrem pH 7 a křivka 4 uvádí výsledek, kdy 50 μΐ vzorku ředěného 1:4 destilovanou vodou bylo smícháno s 50 pL 0,1 mol/litr fosfátovým pufrem pH 7. Vzorky byly ozařovány UV transiluminátorem (Xem = 254 nm) po 100 μΐ v UV transparentní 96 jamkové destičce po dobu 15 minut. Data byla pořízena fluorescenčním analyzátorem Infinite M200 pro., a obr. 5 znázorňuje excitační spektra v rozsahu λεχ 230 až 370 nm a Xem = 400 nm vybraných extraktů odrůd rajčat, kde vzorek A představuje odrůdu Sassari, vzorek B představuje odrůdu Grammy a vzorek C představuje odrůdu Tirrenico. Křivka 1 uvádí excitační spektrum vzorku po 20ti minutovém ozáření v UV (Xem = 254 nm) transiluminátoru, křivka 2 uvádí excitační spektrum vzorku v nativním stavu, tedy neozářený UV zářením. Data byla pořízena
-3 CZ 309221 B6 fluorescenčním analyzátorem Infinite M200 pro. Vzorky byly ozářeny a analyzovány po 100 μΐ v UV transparentní 96 jamkové destičce. Extrakty, tedy kousky rajčat byly lisovány a přefiltrovány přes 25 mm Syringe filter s 0.2 pm membránou, obr. 6 představuje porovnání vzorku moči zdravého člověka a pacienta s diagnostikovaným karcinomem prostaty. Vzorek moči byl naředěn vždy 1:1, 1:2, 1:4 a 1:8 s fosfátovým pufrem pH 7 o koncentraci 0,1 mol/litr a napipetován do UV transparentní 96 jamkové destičky po 100 μΐ. Poté byla zaznamenána intenzita fluorescence (λεχ= 400 nm a Xem = 470 nm) vzorků bez UV ozáření a po 20 minutách ozáření UV transiluminátorem (Xem = 254 nm). Grafy označené A představují intenzitu fluorescence kontrolního vzoru moči zdravého člověka před ozářením (tečkované sloupce) a po UV expozici (křížem šrafované sloupce) grafy označené B představují podíl intenzity fluorescence (kostičkové sloupce) kontrolního vzorku po a před UV expozicí, přičemž vyjadřují signifikantně rostoucí trend, grafy označené C představují intenzitu fluorescence vzorku moči pacienta s karcinomem prostaty před ozářením (tečkované sloupce) a po UV expozici (křížem šrafované sloupce) a grafy označené D představují podíl intenzity fluorescence (kostičkové sloupce) vzorku moči pacienta s karcinomem prostaty po a před UV expozicí, kde je patrný nesignifíkantně rostoucí trend. Data byla pořízena fluorescenčním analyzátorem Infinite M200 pro., obr. 7 znázorňuje schématické provedení vnitrobuněčné analýzy pomocí fluorescenční korelační spektroskopie a fluorescenčního mikroskopu, kde vztahová značka 11 představuje 10 μΐ vzorku, který je nakápnut na podložní sklíčko 12, číslo 13 představuje vzorek, který je překryt z důvodu odstranění ambientního osvětlení stínícím obalem, číslo 14 představuje objektiv fluorescenčního mikroskopu zaostřený na konfokální objem (typicky 0,5 fL) do vybrané části studovaného vzorku 15, číslo 16 představuje excitační laser (Xem = 385 nm), který v průběhu analýzy indukuje ve vzorku fluorescenční kvantové tečky, které j sou schematicky vyobrazené pod číslem 17a vztahová značka 18 představuj e detektor a obr. 8 se vztahovou značkou 19 znázorňuje reálné foto 2% agarózového gelu, který obsahoval zinek a cystein, zaznamenané fluorescenčním mikroskopem, kde došlo k vybělení neboli ztrátě autofluorescence, což znázorňuje vztahová značka 20 a k vytvoření fluorescenčních nanokrystalů, což znázorňuje vztahová značka 21. Vztahová značka 22 znázorňuje reálné foto jedné buňky pořízené fluorescenčním mikroskopem, kde došlo k vytvoření fluorescenčních nanokrystalů, které jsou označeny vztahovými značkami 23 a 24, jejichž spektrální rozbor poskytuje informace o daném místu v buňce. Fluorescenční nanokrystaly označené vztahovou značkou 21, 23 a 24 vznikly v průběhu analýzy excitačním laserem o Xem = 385 nm.
Příklady uskutečnění vynálezu
Vynález je dále blíže popsán pomocí příkladů provedení, které však žádným způsobem neomezují jiná možná provedení v rozsahu patentových nároků. Schematicky je způsob identifikace látek podle vynálezu znázorněn na obr. 1.
V prvním kroku je kapalný vzorek analyzován v nativním stavu, tedy neozářený UV. Poté je vystaven UV záření o přesně definované intenzitě po dobu několika vteřin nebo minut. Doba ozařování závisí na intenzitě UV, vlnové délce a objemu vzorku. UV záření vyvolá chemické změny ve vzorku, které se promítnou jako spektrální změny specifické pro dané složení. Fotony UV záření mají vysokou energii a mohou proto štěpit chemické vazby. Například chlor za běžných podmínek nereaguje s alkany. Po ozáření UV začne reagovat, protože UV záření štěpí chemickou vazbu v molekule CU, která se rozpadá na extrémně reaktivní radikály, ty pak reagují i s inertními alkany. Přítomnost iontů kovů, typicky Zn2+’ Cu2+, Fe2+, Mg2+, Se2+, Cd2+ a látek obsahujících disulfidickou vazbu (-S-S-) a nebo thiolovou skupinu (-SH), zejména cystein, homocystein, glutathion, S-Adenosyl-L-homocystein, S-Adenosyl-methionin, koenzym A, cystamin, acetylcystein, gamma-L-Glutamyl-L-cystein ve vzorku po interakci s UV způsobí tvorbu celé řady nano a mikro částic, komplexů nebo klastrů, které významným způsobem ovlivňují spektrální vlastnosti studované matrice. Koncentrace těchto prekurzorů, tedy iontů kovů a -SH, -S-Sobsahující sloučeniny, nutných pro vznik klastrů se pohybuje v rozsahu 1 nM až 3 mM. Rozbor spektrálních signálů takto vzniklých klastrů poskytuje cenné informace o fyzikálních, chemických nebo biologických vlastnostech vzorku. Hodnotí se tedy změny absorpčních a fluorescenčních,
-4 CZ 309221 B6 tedy excitačních nebo emisních signálů, jejich tvar, průběh, intenzita, doba života fluorescence, fluorescenční anizotropie, photobleaching (vybělování), difůzní koeficienty fluoroforu před a po ozáření UV.
Dojde-li ke změně vzorku přidáním další komponenty, k záměně za jinou, anebo změně typu a koncentrace thiolových sloučenin (tj. -SH, -S-S- obsahující sloučeniny) nebo iontů kovů popisovaná metoda tuto změnu zachytí. Stejně tak metoda zachytí přirozené rozdíly ve vzorcích, například odrůdy rostlin nebo klinické změny vyvolané onemocněním.
Zamýšlené metodické postupy mohou být implementovány do klasického stolního spektrometru nebo dokonce do podoby ručního zařízení, což umožní provádět analýzy přímo na místě.
Jako zdroj UV záření lze typicky využít stolní transiluminátor (Xem = 254 nm) nebo UV laserový paprsek (Xem = 385 nm). Uze také použít i jiné zdroje světla o vhodné vlnové délce jako například elektroluminiscenční diody, UED či lampy. Změny vyvolané UV zářičem jsou typické pro chemické složení vzorku a lze je monitorovat běžnou spektroskopickou instrumentací, tedy spektrofotometru, fluorescenční spektroskopií, korelační fluorescenční spektroskopií a podobně.
Příklad 1
Zkoumanou látkou je v tomto případě chemický přípravek, kterým je lék. Ten je nejdříve homogenizován nájemnou frakci drcením a navážen v daném případě na 10 až 20 mg. K navážce léku se přidá 1 ml destilované vody anebo jiného rozpouštědla, například dimethylsulfoxidu. Vzorek je minutu intenzivně míchán či protřepáván a po rozpuštění, alespoň částečném se 50 μΐ vzniklé suspenze smíchá s 50 μΐ 0,1 mol/litr fosfátového pufiru pH 7 anebo destilované vody v UV transparentní mikrotitrační destičce nebo spektroskopické kyvetě. Vzorek je nejdříve analyzován v nativním stavu pomocí spektroskopických metod absorpce excitace a/nebo emise záření. Příkladem může být absorpční sken v rozsahu 230 až 800 nm anebo excitační sken při λεχ = 230 až 470 nm a Xem = 500 nm (popřípadě 450 nm). Poté je destička se vzorkem vystavena 6 minut UV záření (Xem = 254 nm) v transiluminátoru nebo pomocí jiného zdroje záření. Poté se spektrální analýza zopakuje za stejných parametrů. Výsledkem analýzy jsou unikátní spektra, která jsou typická pro daný analyt respektive pro složení vzorku.
Tento postup a jeho výsledky korespondují s obr. 2. Analogicky se postupuje i u jiných kapalných, rozpuštěných či suspenzních vzorků. Tímto způsobem lze provádět profilaci chemických směsí za účelem jejich ztotožnění.
Příklad 2
Zkoumanou látkou je v tomto případě ovocný nápoj nebo víno. Nápoj se naředí na čtyři koncentrace půlovým ředěním destilovanou vodou. Poté je smíchán v poměru 1:1 s 0,1 mol/litr fosfátovým pufrern pH 7 v mikrotitrační destičce nebo spektroskopické kyvetě. Destička je exponována 10 až 15 minut UV zářením (Xem = 254 nm) v transiluminátoru nebo pomocí jiného zdroje záření. Poté jsou zaznamenána emisní či excitační spektra. Příkladem může být emisní sken při λεχ = 250 nm a Xem = 280 až 800 nm. Zaznamenaná emisní či excitační spektra jsou typická pro daný nápoj.
Tento postup a jeho výsledky korespondují s obr. 3 a 4. Tímto způsobem lze přesně determinovat, z jakého ovoce šťáva pochází, anebo jestli byla dodržena potřebná technologie při zpracování, skladování, odstranění slupky před lisováním, nebo podobnými operacemi v rámci přípravy nápoje.
Příklad 3
Zkoumaným předmětem jsou zeleninové nebo ovocné extrakty. Extrakt nebo šťáva vzniklá
-5 CZ 309221 B6 lisováním anebo výluhem z ovoce nebo zeleniny je přefiltrována z důvodu odstranění dužiny anebo jiných nečistot a pevné frakce. Poté je vzorek smíchán v poměru 1:1 s 0,1 mol/litr fosfátovým pufrem pH 7 v mikrotitrační destičce nebo spektroskopické kyvetě. Vzorek je nejdříve analyzován v nativním stavu, tedy bez UV ozáření pomocí spektroskopických metod, tedy absorpce, excitace a emise záření. Příkladem může být excitační sken při λεχ = 230 až 370 nm a Xem = 400 nm. Poté je destička se vzorkem vystavena po dobu 20 minut UV záření (Xem = 254 nm) v transiluminátoru nebo v jiném UV zařízení. Poté se spektrální analýza zopakuje za stejných parametrů. Výsledkem analýzy jsou unikátní spektra, která jsou typická pro danou odrůdu ovoce anebo zeleniny.
Tento postup a jeho výsledky korespondují s obr. 5. Tímto způsobem lze rozpoznat a identifikovat různé odrůdy zeleniny a ovoce.
Příklad 4
Zkoumaným předmětem jsou klinické vzorky. Stejně jako v předchozích příkladech lze postupovat i s biologickými či klinickými vzorky, jakými jsou obvykle krevní plazma anebo moč. U těchto vzorků lze popsanou metodou studovat fyziologické nebo patologické stavy organizmu asociované s ionty kovů a -S-S-, -SH molekulami. Změna koncentrace iontů kovů a/nebo -S-S-, -SH sloučenin ve studovaném vzorku se projeví změnou emisního nebo excitačního spektra tvaru nebo jako nárůst či pokles emisního nebo excitačního signálu při konkrétní vlnové délce (např. λεχ = 400 nm a Xem = 470 nm) po UV ozáření.
Tento postup a jeho výsledky korespondují s obr. 6. Tímto způsobem lze provádět kontrolní testy a odhalovat tak vážná onemocnění v raném stádiu.
Příklad 5
V tomto případě je zkoumání zaměřeno na lokalizaci a identifikaci buněčných procesů. Buněčná linie popřípadě histologický řez je umístěna či nakápnuta 1 až 50 μΐ na podložní sklíčko a vložena do fluorescenčního mikroskopu. Pomocí mikroskopu a příslušného softwaru jsou vybrána místa v buňce, která mají být analyzována. Dále se vybere laser s vhodnou vlnovou délkou (typicky Xem = 385 nm), který po dobu několika vteřin popřípadě minut, nejčastěji v rozsahu 1 až 90 vteřin indukuje v místě analýzy vznik klastrů. Tyto klastry se vyhodnocují v reálném čase anebo po ukončení analýzy. Vzniklé klastry jsou typické pro dané místo v buňce, pro jeho složení a pro biologické či chemické děje v něm probíhající. Příklad průběhu analýzy je uveden na obr. 7.
Průmyslová využitelnost
Uplatnění metody podle vynálezu lze očekávat v oblastech, kde je potřeba monitorovat složení farmakologických prostředků, kvalitu a složení nápojů či potravin či diagnostikovat vážná onemocnění z tělních tekutin nebo na úrovni histologického řezu nebo vzorků buněk. Metoda umožňuje například odhalovat padělání, nebo zjišťovat nelegální aditiva ve směsích, například léků, potravin, a mnoha jiných druhů látek. Podobně lze metodu využít při odhalování celé řady přestupků spojených s paděláním potravin, nebo nedodržováním dané technologie nebo receptury při výrobě nápojů a potravin. Dále se může jednat o identifikaci léčiva záchrannou službou, během převozu pacienta do nemocnice. Nemocnicím nebo výzkumným pracovištím metoda poskytne levný a rychlý screeningový nástroj pro studium klinických vzorků. V případě využití pokročilých spektroskopických technik, jako je fluorescenční korelační spektroskopie, lze uvedenou metodou lokalizovat či monitorovat buněčné procesy v rámci jedné buňky. Zamýšlená metoda je kompatibilní se všemi spektroskopickými metodami využívající elektromagnetické vlnění v klasickém rozsahu.

Claims (3)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob identifikace přírodních vzorků, zejména kapalných, vyznačující se tím, že po změření fluorescenčního spektra přírodního vzorku v neozářeném stavu UV zářením dále zahrnuje - ozáření známého přírodního vzorku UV zářením o vlnové délce 250 až 400 nm, po předem stanovený časový interval,
    - změření fluorescenčního spektra ozářeného známého přírodního vzorku,
    - ozáření neznámého přírodního vzorku UV zářením o vlnové délce 250 až 400 nm, po předem stanovený časový interval,
    - změření fluorescenčního spektra ozářeného neznámého přírodního vzorku,
    - porovnání změřeného fluorescenčního spektra ozářeného známého přírodního vzorku nebo fluorescenčního spektra ozářeného známého přírodního vzorku, který byl dříve uložen v databance informací, s fluorescenčním spektrem ozářeného neznámého přírodního vzorku,
    - určení, zdaje neznámý přírodní vzorek shodný nebo odlišný od známého přírodního vzorku.
  2. 2. Způsob identifikace přírodních vzorků, zejména kapalných, podle nároku 1, vyznačující se tím, že přírodní vzorek obsahuje kovové ionty zejména některé z Zn2 Cu2+, Fe2+, Mg2+, Se2+ nebo Cd2+.
  3. 3. Způsob identifikace přírodních vzorků, zejména kapalných, podle nároku 1, vyznačující se tím, že přírodní vzorek obsahuje thiolovou skupinu zejména některé z: cystein, homocystein, glutathion oxidovaný, glutathion redukovaný, S-Adenosyl-L-homocystein, S-Adenosyl-methionin, koenzym A, cystamin, acetylcystein, gamma-L-Glutamyl-L-cystein.
CZ2018510A 2018-09-27 2018-09-27 Způsob identifikace přírodních vzorků, zejména kapalných CZ309221B6 (cs)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2018510A CZ309221B6 (cs) 2018-09-27 2018-09-27 Způsob identifikace přírodních vzorků, zejména kapalných
DE19779741.8T DE19779741T1 (de) 2018-09-27 2019-09-17 Verfahren zur Identifizierung der Eigenschaften von Substanzen, insbesondere von flüssigen Substanzen
ES19779741T ES2850623T1 (es) 2018-09-27 2019-09-17 Un método para identificar propiedades de sustancias, en particular sustancias líquidas
DK19779741.8T DK3857204T1 (da) 2018-09-27 2019-09-17 Fremgangsmåde til identifikation af egenskaber af stoffer, især flydende stoffer
EP19779741.8A EP3857204B1 (en) 2018-09-27 2019-09-17 A method for identifying the properties of a sample, in particular a liquid sample
HUE19779741A HUE19779741T1 (hu) 2018-09-27 2019-09-17 Eljárás anyagok, különösen folyékony anyagok tulajdonságainak meghatározására
PCT/CZ2019/000046 WO2020064031A1 (en) 2018-09-27 2019-09-17 A method for identifying the properties of substances, in particular liquid substances

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2018510A CZ309221B6 (cs) 2018-09-27 2018-09-27 Způsob identifikace přírodních vzorků, zejména kapalných

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2018510A3 CZ2018510A3 (cs) 2020-04-08
CZ309221B6 true CZ309221B6 (cs) 2022-06-01

Family

ID=68104347

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2018510A CZ309221B6 (cs) 2018-09-27 2018-09-27 Způsob identifikace přírodních vzorků, zejména kapalných

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP3857204B1 (cs)
CZ (1) CZ309221B6 (cs)
DE (1) DE19779741T1 (cs)
DK (1) DK3857204T1 (cs)
ES (1) ES2850623T1 (cs)
HU (1) HUE19779741T1 (cs)
WO (1) WO2020064031A1 (cs)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2133689A1 (en) * 2008-05-23 2009-12-16 Itt Manufacturing Enterprises, Inc. Detection of materials based on raman scattering and laserincluded fluorescence by deep excitation

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08505119A (ja) * 1992-07-06 1996-06-04 バイオミラ、インコーポレーテッド 接合目的のためのタンパク質の光活性化
US20070141726A1 (en) * 2005-12-19 2007-06-21 Agency For Science, Technology And Research Detection via switchable emission of nanocrystals
US8568991B2 (en) * 2011-12-23 2013-10-29 General Electric Company Photoactivated chemical bleaching of dyes

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2133689A1 (en) * 2008-05-23 2009-12-16 Itt Manufacturing Enterprises, Inc. Detection of materials based on raman scattering and laserincluded fluorescence by deep excitation

Also Published As

Publication number Publication date
ES2850623T1 (es) 2021-08-31
HUE19779741T1 (hu) 2022-06-28
EP3857204B1 (en) 2023-04-19
EP3857204A1 (en) 2021-08-04
DE19779741T1 (de) 2021-10-14
CZ2018510A3 (cs) 2020-04-08
DK3857204T1 (da) 2021-08-16
WO2020064031A1 (en) 2020-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Samokhvalov Analysis of various solid samples by synchronous fluorescence spectroscopy and related methods: A review
EP0818674A2 (en) Spectroscopic method
Perez-Guaita et al. Multimodal vibrational imaging of cells
JP3248905B2 (ja) 水分含量を有する生物学的物質の分析方法
Başar et al. Investigation of preeclampsia using raman spectroscopy
AU2002346615B2 (en) A method for identifying markers
Sarimov et al. The use of fluorescence spectra for the detection of scab and rot in fruit and vegetable crops
Açikgöz et al. Determination of ethanol in blood samples using partial least square regression applied to surface enhanced raman spectroscopy
Dadi et al. Spectroscopy and Spectrophotometry: principles and applications for colorimetric and related other analysis
Juarez et al. Effects of crime scene contaminants on surface‐enhanced Raman analysis of hair
Nejdl et al. UV-Induced fingerprint spectroscopy
CZ309221B6 (cs) Způsob identifikace přírodních vzorků, zejména kapalných
USMAN et al. Applications of miniaturized and portable near infrared (NIR), Fourier transform infrared (FT-IR) and Raman spectrometers for the inspection and control of pharmaceutical products
Medipally et al. Effect of hemolysis on Fourier transform infrared and Raman spectra of blood plasma
Macedo et al. Non-destructive molecular FTIR spectromicroscopy for real time assessment of redox metallodrugs
Woess et al. Raman spectroscopy for postmortem interval estimation of human skeletal remains: A scoping review
Coat et al. Characterizing the spoilage of egg products using targeted and non-targeted approaches
Soysal et al. Raman tweezers as an alternative diagnostic tool for paroxysmal nocturnal hemoglobinuria
Indrayanto et al. The application of molecular spectroscopy and chemometrics in dentistry
Thomas et al. Selective monitoring of stern-volmer quenching of chiral molecules via fluorescence detected circular dichroism
Puangploy et al. Development of fluorescent phycocyanin-Cu2+ chemosensor for detection of homocysteine
Kwok Separations with Raman spectroscopy for identification of oxidatively modified components in Parkinson's Disease
Frank et al. UV spectrophotometry measures UV radiation absorption by a sample, following Beer-Lambert law relating concentration to absorbance.
Yang et al. Rapid surface-enhanced Raman spectroscopy detection of low-dose APIs in pharmaceutical drugs
Liu et al. Comparison of four types of raman spectroscopy for noninvasive determination of carotenoids in agricultural products