JPH08503074A

JPH08503074A - 脂質過酸化の指標としてのマロンジアルデヒドおよび４−ヒドロキシ−２−エンアルデヒドの比色分析法、該方法を行うためのキット、該方法に使用する置換インドールおよびその製造

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Publication number: JPH08503074A
Application number: JP6525048A
Authority: JP
Inventors: ジェラール・モニエール、ドミニク; エデルメイエール、イレーヌ; ショーディエール、ジャン; ヤダン、ジャン−クロード・ヨントブ
Original assignee: ビオキシテク
Priority date: 1993-05-06
Filing date: 1994-05-06
Publication date: 1996-04-02
Anticipated expiration: 2018-04-28
Also published as: FR2704947B1; AU6795594A; DE69421497T2; AU687401B2; DE69421497D1; FR2704947A1; EP0650599A1; WO1994027155A1; EP0650599B1; JP3401006B2; ES2142398T3; CA2139591A1

Abstract

(57)【要約】本発明の方法は、（ａ）分析しようとする媒体に式：（式中、ＡおよびＣは同じかまたは異なり、それそれＨ、を示し、しかし同時にＨを示すことはなく、Ｂは

Description

【発明の詳細な説明】脂質過酸化の指標としてのマロンジアルデヒドおよび４−ヒドロキシ−２−エンアルデヒドの比色分析法、該方法を行うためのキット、該方法に使用する置換インドールおよびその製造本発明の主題は、置換インドールタイプの化合物による、脂質過酸化の過程で生成するマロンジアルデヒド（１，３−プロパンジアールまたはＭＤＡ）および４−ヒドロキシ−２−エンアルデヒドの比色アッセイ法、この方法を行うための必要物またはキット、この方法を行うに際して試薬として使用できる新規インドール誘導体およびその製造である。置換インドールの調製の従来技術において、特にインドール環上に６までの置換基Ｒ¹〜Ｒ⁷を有するという事実によって多数の意味を有する２−フェニルインドール誘導体を含有する日焼けに対して作用することをねらった組成物が文献ＵＳ−Ａ−４,５２２,８０８によって知られている。その上、該インドールのベンゼン部分においては置換基Ｒ⁴〜Ｒ⁷は幾つかの意味を有し、特に炭素数１〜４のアルコキシラジカルまたはカルボキシアルキルラジカル（実際は式：(ＣＨ₂)_nＣＯＯＨのカルボキシアルキレン基である）を示している。本発明においては、たとえば２−フェニルインドール誘導体などの新規な２− アリールインドール誘導体を用いるが、該誘導体は特に該インドール環のフェニル部分の置換基がアルコキシラジカルでもアルキルラジカルでもカルボン酸アルキレンラジカルでもないという事実によって、従来技術の文献に記載されたものとは異なっている。一方、文献J．Chem．Soc．（Ｃ１９７１、２６０６〜２６０８頁）には２− アリールインドール誘導体、とりわけジメチル化またはトリメチル化インドール誘導体が記載されているが、該誘導体は本発明の主題とは異なるものである。最後に、文献Chemical Abstracts、volume ７４，９７１、４４４頁、abstrac t １２５３２６ｖには、Ｒ²＝ＯＣＨ₃でＲ＝メチルである化合物が記載されているが、該化合物は本発明の主題とは異なる。たとえば子かん前症、心筋梗塞およびショック状態などのある種の病的状態においては、循環しているリポタンパク質の酸化またはある種の細胞膜の酸化が脂質過酸化物（分解する）の生成を引き起こす。これら過酸化不飽和脂肪酸の分解生成物のアッセイにより、関係する病的状態を示すことができ、該状態の展開を追跡することができる。本明細書において「脂質過酸化」なる表現は、ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）またはそのエステル（特にリン脂質、コレステリルエステルおよびモノ−、ジ− およびトリグリセリド）のヒドロペルオキシド、ジアルキルペルオキシドおよびエンドペルオキシドの生成並びにその分解に導く反応経路をひとまとめにしていう。「脂質過酸化物」の生成は、非酵素的起源：元素状態の酸素の存在下での自動酸化、一重項酸素の付加、それ以前に生成したヒドロペルオキシドの存在下または不在下、遷移金属錯体によってまたはたとえばフェリヘモグロビン、フェリミオグロビンまたはヘマチンなどの部分的に分解された金属タンパク質によって触媒された酸化、によるものである。この生成はまた、酵素的起源、すなわち植物または動物のリポキシゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼまたはミクロソームのチトクロームＰ−４５０オキシゲナーゼの作用の結果としても起こる。最後に、該生成は酵素反応と非酵素反応とのカップリングによって起こる。これは、たとえば、酸素および酵素的還元系の存在下、ある種の生体異物の一価還元を伴う脂質酸化の場合である。脂質過酸化物の分解の結果、非常に多くの有機副産物が生成される。この分解は、酵素的起源（たとえばペルオキシダーゼおよび／またはトロンボキサンシンセターゼの作用）または非酵素的起源（熱的、光化学的、還元的、または遷移金属錯体による触媒）によるものである。脂質過酸化物の分解による主要な有機副産物のうち、ある種のアルコール、共役ジエン、共役トリエン、揮発性炭化水素（エタン、ペンタンまたはエチレンなど）、ある種の飽和、不飽和および／またはヒドロキシル化アルデヒドまたはケトン、ある種の飽和または不飽和エポキシド、上記アルデヒドと媒体中に存在する分子のアミノ基との反応の結果生成するシッフの塩基、およびある種の上記化合物と多官能性分子構造との会合体が挙げられる。かくして定義された「脂質過酸化」なる表現は、もっぱら遊離またはエステル化されたＰＵＦＡペルオキシドの生成または分解経路に対して用いられる。ＰＵＦＡが酸化しやすさの明白な傾向を有することは、以下の反応式に示すように、これら化合物中にシス，シス−１，４−ペンタジエン残基が規則正しく存在することによるものであり、この存在によって、メチレンのＣ−Ｈ結合のホモリシス切断によって最初に生成したラジカル中間体の安定化する非局在化が可能となる。生物学的媒体において最も重要なＰＵＦＡは、リノール酸に由来するＰＵＦＡおよびα−リノレン酸に由来するＰＵＦＡ、すなわち、それそれ「ｎ−６」および「ｎ−３」として知られるクラスに属するＰＵＦＡである。それゆえ、脂質過酸化指標の測定はまた、上記ＰＵＦＡの過酸化生成物または副産物に対して可能な限り特異的でなければならない。過去において、脂質過酸化の測定法が多数記載されている。これら方法は５つの主要なクラスに分けることができる。１．直接または間接分光光度法２．分光蛍光法３．電気化学的方法４．化学ルミネセンス法５．クロマトグラフィー法クラス２〜５に属する方法は最近記載されている（文献１および２）。これら方法は、特異性または装置の複雑さという問題を提起しており、熟練していない研究者による日常的な使用を排除している。クラス１の知られた直接分光光度法（本発明はこれに属する）は以下のようにまとめることができる。「共役ジエン」のための標準法は、２３３ｎｍでの吸光度の測定に基づいており、これによってＰＵＦＡのヒドロペルオキシドおよびアルコールのビス−アリル（トランス−ジエン）構造を高感度で定量することが可能である。大部分の生物学的試料において、他のジエン構造の存在およびカルボニル基およびモノアルケンの非常に強い吸光度は、残念ながら一連の妨害を引き起こし、該妨害は示差分光分析法によってのみ除くことができるが、該方法は一般に未知の組成を有する生物学的試料のアッセイには用いることができない。マロンジアルデヒド（１，３−プロパンジオールまたはＭＤＡ）の比色アッセイは、最も一般的に用いられている脂質ペルオキシド指標である（文献２）。ＭＤＡは、アラキドン酸の酵素的代謝物でもあり、ＰＵＦＡの過酸化の二次産物でもある（文献３）。ＭＤＡの酵素的産生の主要経路は、トロンボキサンシンセターゼのものであり（文献４）、該酵素はプロスタグランジンＰＧＨ₂（エンドペルオキシド）をトロンボキサンＡ₂、Ｌ−１２−ヒドロキシ−５，８，１１−ヘプタトリエノエートおよびＭＤＡに変換する（それそれ１／３、１／３、１／３の比率にて）。非酵素的起源のＭＤＡは、ビス−アリルペルオキシルラジカルに由来する単環または２環のエンドペルオキシドのラジカル分解によって生成する。ＭＤＡの化学的および生化学的特性は、詳細な論評の主題であった（文献５）。ＭＤＡは、水溶液または有機溶液中でモノエノール−モノアルデヒドの形態で完全にエノール化される揮発性の化合物である。ＭＤＡは、求核（エノラート）および親電子（アルデヒド）の両特性を示し、このことが、ＭＤＡが自己重合して多かれ少なかれ可逆性のオリゴマー付加物の混合物を生成する傾向性を説明している。酸性ｐＨにて加熱したとき、ＭＤＡはある種の求核化合物と反応して種々の縮合生成物を生成する。幾つかのＭＤＡ縮合生成物に対して定量法およびアッセイ法が提唱されているが、いずれも完全に満足のいくものではない。２−ヒドラジノベンゾチアゾールに由来するピラゾールベンゾチアゾール、またはメチルヒドラジンに由来する１−メチルピラゾールは、高い揮発性によって気相クロマトグラフィー（クラス５の方法）によって定量できる。Ｎ−メチルピロール（文献６）は、ＭＤＡに特徴的な発色団付加物を与える。しかしながら、その半減期は比色測定に対しては短すぎるので大系列の試料に行うことはできない。２−メチルインドールもまたＭＤＡと発色団付加物を生成するが、分子吸光係数が低すぎる（εｍ＃３２，０００１．モル^-1．ｃｍ^-1）ので生理学的濃度（０．５〜５μモル）のＭＤＡをアッセイすることができない（文献７）。実際には、チオバルビツル酸（ＴＢＡ）が、発色団縮合生成物（２分子のＴＢＡが１分子のＭＤＡに付加することにより生成）の高い安定性および５３０〜５３５ｎｍでの分子吸光係数のために、現在、比色法によるＭＤＡのアッセイのために殆ど唯一用いられている。加えて、この生成物は蛍光性であるので、分光蛍光法によってもアッセイすることができる。ＭＤＡおよび／またはＴＢＡと反応する脂質過酸化生成物（以下、「ＴＢＡＲＳ」と称する）のためのアッセイ手順は、すべて酸性ｐＨ（＜３．８）と長期の加熱（８０〜９５℃、２０〜６０分）を要する。試料の酸性化および加熱により、一般に濁った懸濁液となるので、測定前にたとえばｎ−ブタノールで抽出することにより清澄化する必要がある。ＴＢＡの試験の変法は非常に多数あり、この方法がとりわけその信頼性に関して問題を提起していることを際立たせている（文献８）。事実、ＴＢＡの試験は２つの主要な問題を提起している、すなわち、 −必要とされる温度およびｐＨ条件が二次反応をもたらし、ＴＢＡと反応する人為処理生成物が生じるためにアッセイが歪められる；および −ＴＢＡはＭＤＡに特異的な試薬ではない。第一の妨害源は、脂質由来であるがＭＤＡとは異なるアルデヒドの存在による。ある種のモノアルデヒドは該試験の標準条件下でＴＢＡと反応し、ＭＤＡ：ＴＢＡ（１：２）付加物の吸光度を妨害する生成物を生じる（文献９）。ある種の色素の生成の収率は定かではない。なぜなら、該収率は、試料中に同時に存在するアルデヒドおよびある種の中間体付加物のそれそれの濃度に依存するからである。これら化学的機構の幾つかは論議されている（文献１０）。脂質起源のモノアルデヒドの存在による発色生成物は、一般に４５０ｎｍと５００ｎｍとの間に１または２以上の吸光バンドを有し、該バンドは広く、ＭＤＡ：ＴＢＡ（１：２）付加物の吸光バンドと重複する。該発色生成物は５３０〜５３５ｎｍにおける吸光度をかなりの因数で増大させる。なぜなら、酸化された脂質を抽出すると、生成したモノアルテヒドの量の合計はＭＤＡの生成を上回るからである（文献５）。第二の妨害源は、非脂質化合物からのＭＤＡまたはＴＢＡＲＳの生成によるものである。デオキシリボースおよびそのヌクレオシド誘導体（文献１１）並びにピリミジンおよび２−アミノピリミジンは、試験条件下で真のＭＤＡと同様の挙動を示す（文献８）。さらに、ショ糖およびグルコースなどの糖は、種々のペルオキシドやアセトアルデヒドなどのアルデヒドの存在下でＴＢＡＲＳの生成に対して強力な相乗作用を有し（文献１２）、一方、これら分子は別々に存在する場合にはＴＢＡＲＳを生成しない。シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）は、５５０ｎｍ付近で強い吸収を示す付加物を生成する（文献８）。ビリルビン、ビリベルジンおよび溶血血清もまた「汚染」吸収を示す。それゆえ、ＴＢＡの試験は、 −ＭＤＡに加えて脂質起源のＴＢＡＲＳが生成すること、 −該試験条件下で活性の非脂質起源の混入物のために反応妨害（ＭＤＡまたはＴＢＡＲＳの生成）が存在することによる特異性の問題を提起している。混入付加物の吸収スペクトルまたは蛍光スペクトルがＭＤＡ：ＴＢＡ（１：２）付加物のスペクトルと重複するため、複数の波長を用いることによる測定の特異性を改善することができない。ＭＤＡ付加物のクロマトグラフィー分離もまた、ＴＢＡの試験条件下での真のＭＤＡの人為処理物の生成の問題を回避することができない。これら困難のため、幾つかの研究所をＭＤＡ並びに他のアルデヒドのためのクロマトグラフィーアッセイ法の開発へ向かわせた（文献１）。これら方法は、時間がかかり、複雑である。それゆえ、これら方法は、大系列の試料に対して日常的に用いるのは困難であるが、これら開発は、脂質過酸化現象におけるＭＤＡおよび他のアルデヒドの生成の重要性を指摘することを可能にした。それゆえ、エステルバウアー（Esterbauer）および彼の同僚は、４−ヒドロキシノネナール（４−ＨＮＥ）の生成が脂質過酸化現象に特徴的であることを示した（文献１３）。「ｎ−６」ＰＵＦＡの酸化は、この４−ＨＮＥの生成の原因であり、その収率はアラキドン酸２０：４（ｎ−６）の場合に最大である。関連化合物である４−ヒドロキシヘキセナールは、「ｎ−３」ＰＵＦＡから生成される。要約すると、媒体、とりわけ生物学的媒体中のＭＤＡおよび／または他のエンアルデヒドは脂質過酸化の指標を構成するが、これらをアッセイするために信頼性があり実行が容易な方法はこれまで得られていない。それゆえ、本発明の目的は、とりわけ、４−ヒドロキシ−２−エンアルデヒド、とりわけＭＤＡと反応する新規な試薬を利用できるようにすること；安定であり同様の唯一の発色団構造（最大吸収波長か５７０ｎｍよりも大きいかまたは５７０ｎｍに等しい）を有する縮合生成物の定量的な生成により、脂質過酸化の指標としてのエンアルデヒドのためのおよび酸に不安定なその誘導体（アセタール、チオアセタール、イミン、エノールエーテルまたはエーテルチオエーテルなど）のための比色アッセイを利用できるようにすること、その際、「エンアルデヒド」なる語は、４−ヒドロキシ−２−エンアルデヒドおよびＭＤＡを包含する群に適用されることを理解すべきである。４−ヒドロキシ−２−エンアルデヒドは、たとえば、４−ヒドロキシノネナール、４−ヒドロキシヘキセナール、４−ヒドロキシデセナールおよび４−ヒドロキシドデカナール、並びにＭＤＡである；４−ヒドロキシ−２−エンアルデヒドのアッセイと同じ吸収波長にてＭＤＡに特異的な比色アッセイを可能とすることである。これら目的は本発明によって達成されるが、本発明は新規な化学試薬を使用し、これら試薬とエンアルデヒドとの付加生成物の色原体特性を活用する。これら試薬は、とりわけ、３位で置換されていないインドール環系の存在、および極性プロトン溶媒（とりわけ水、メチルアルコール、エチルアルコールおよびアセトニトリルなど）中での溶解性を特徴とする。これら試薬がエンアルデヒドに付加することによって生成する発色団は、常に５７０ｎｍよりも大きいかまたは５７０ｎｍに等しい最大吸収波長を示す。本発明は、これら試薬を用いた簡単で迅速な方法を提供する。該方法は、ＴＢＡ法に比べてはるかに温和な温度条件下（高温で長期間加熱することによる人為処理物の可能性を大幅に制限する）、安定であり同様の唯一の発色団構造を有する縮合生成物の定量的生成により、エンアルデヒドおよび酸に不安定なその誘導体（アセタール、チオアセタール、イミン、エノールエーテルまたはエノールチオエーテル）を比色法により脂質過酸化の指標としてアッセイすることを可能にする。それゆえ、この方法は、大系列の試料に対する日常的なアッセイに充分に適している。さらに詳しくは、本発明の一つの側面によれば、本発明の主題は、媒体、とりわけ生物学的媒体における脂質過酸化の指標として全エンアルデヒドまたはマロンジアルデヒド単独の比色アッセイ法であり、該アッセイ法は本質的に、（ａ）以下の一般式（Ｉ）：（式中、ＡおよびＣは同じかまたは異なり、それぞれＨ、を示し、ＡおよびＣは同時にＨを示すことはなく、Ｒ¹はＨ；アルキル；アラルキル；アリール環上で置換されたアラルキル；アルキルスルホネート、Ｙ⁺；アルキルホスホネート、Ｙ⁺；またはアルキルカルボキシレート、Ｙ⁺；Ｒ²はＨ；−ＯＲ⁴；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；Ｉ；−ＮＯ₂；−ＳＯ₃ ^-Ｙ⁺；−ＣＮ；− ＣＯＯＲ⁴；または−ＣＯＮＲ⁵Ｒ⁶；Ｒ³はＨ；−ＯＲ⁴；−ＮＲ⁵Ｒ⁶；−ＳＲ⁴；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；Ｉ；−ＮＯ₂；− ＳＯ₃ ^-Ｙ⁺；−ＣＮ；−ＣＯＲ⁵；−ＣＯＯＲ⁴；または−ＣＯＮＲ⁵Ｒ⁶；Ｒ⁴はＨ；アルキル；アラルキル；またはアリール環上で置換されたアラルキル；Ｒ⁵はＨ；アルキル；アラルキル；またはアリール環上で置換されたアラルキル；Ｒ⁶はＨ；アルキル；アラルキル；またはアリール環上で置換されたアラルキル；Ｙ⁺は有機または無機塩基のカチオン；Ｂはであることを理解すべきである；アルキルは１〜６Ｃを有する直鎖または分枝鎖基を示し；アリール環上で置換されたアラルキルは、該アリール環が、（１〜６Ｃ）アルキル、（１〜６Ｃ）アルコキシ、ヒドロキシ、アミノおよびカルボキシルから選ばれる１または２以上の基で置換されていることを意味することを理解すべきである）で示される化合物および有機もしくは無機塩基とのまたは有機もしくは無機酸との任意の付加塩から選ばれた試薬を該媒体に加え；（ｂ）かくして加えた媒体を、強カルボン酸、強スルホン酸および過塩素酸よりなる群から選ばれた酸によるかまたは塩酸、臭化水素酸または硫酸によって酸性にし；（ｃ）かくして酸性にした媒体を、加えた酸の性質に従って媒体中に存在するすべてのエンアルデヒドまたはマロンジアルデヒド単独と試薬との発色団付加生成物の生成により安定な発色を得るのに充分な時間、２５〜６０℃の温度にてインキュベートし；（ｄ）使用した試薬の発色団付加生成物に特異的な吸収波長にて該発色媒体の吸光度を測定し、該測定を、必要に応じて全エンアルデヒドの濃度またはマロンジアルデヒド単独の濃度を決定するために利用することを特徴とする。選択した一般式（Ｉ）の化合物においてＲ⁴がＨである場合は、無機もしくは有機塩基との付加塩を用いることができ、該塩基は、たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ土類金属炭酸塩、トリエチルアミンおよびアルギニンから選択することができる。選択した一般式（Ｉ）の化合物においてＲ⁵および／またはＲ⁶がＨである場合は、無機もしくは有機酸との付加塩を用いることができ、該酸は、たとえば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、酒石酸、メタンスルホン酸およびトリフルオロメタンスルホン酸から選択することができる。発色団の生成に導くインキュベーションは、酸性媒体中で行わなければならない。インキュベーション時間は、本質的に、使用した温度に依存する。インキュベーション時間は、一般に１時間を越えることはなく、大抵の場合はこれよりも短い。本発明によれば、一般式（Ｉ）で示される試薬はある種の酸の存在下で上記脂質過酸化過程によるすべてのエンアルデヒドまたはＭＤＡ単独と反応して長期間安定な発色団付加生成物を生成し、該生成物の最大吸収波長はいかなる場合にも５７０ｎｍよりも大きいかまたは５７０ｎｍに等しく、式（Ｉ）の試薬の性質に依存することがわかった。さらに正確には、強カルボン酸、強スルホン酸または過塩素酸の存在下では一般式（Ｉ）の試薬は媒体中に存在するすべてのエンアルデヒドと反応し、一方、塩酸、臭化水素酸または硫酸の存在下では該試薬は本質的にＭＤＡとのみ反応し、使用した試薬に特徴的な発色団化合物を生成する。いずれの酸も別々に包装するのが有利である。これら酸は超高純度の品質でなければならず、純粋な形態にてまたは脱イオン水中に希釈した母液として５モル／リットル以上の濃度にて貯蔵するのが有利である。本発明の方法において、最終反応媒体における酸の最終濃度は、一般に０．５〜２．５モル／リットルの範囲であるのが有利である。一般式（Ｉ）の試薬に関しては、たとえば水と混和性の有機溶媒、とりわけアセトニトリル、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールなどの相溶性の有機溶媒中、または中性水もしくは酸性水中または緩衝液中の母液の形態で取り扱うのが有利である。母液中の試薬の濃度は、一般に、使用した溶媒中での溶解度の関数として５〜４０ミリモル／リットルの範囲であるのが有利である。この試薬は、最終反応物媒体中の最終濃度が３〜２５ミリモル／リットルとなるように使用時に大抵の場合希釈されるであろう。それゆえ、本発明は、被験媒体中に存在するすべてのエンアルデヒドをアッセイするのみならず、試料、とりわけ生物学的試料中、４−ヒドロキシ−２−エンアルデヒドの存在下でＭＤＡを特異的にアッセイすることをも可能とする。それゆえ、本発明による方法は、第一のサンプリングでエンアルデヒドの全量を測定し、第二のサンプリングでＭＤＡの全量を測定するかまたはその逆を行うことを可能とする。この新規方法の非常に温和な操作条件は、ＴＢＡ法に付随する非常に多くの人為処理物の殆どを除去することを可能とすることにより、該方法を特に信頼性および再現性ある方法としている。一般式（Ｉ）の試薬は、一般に、以下の式の共通構造を有する発色団を生成する：ＭＤＡ（Ｒ＝Ｈ）の場合は発色団の生成には酸化工程を必要としないが、一方、４−ヒドロキシ−２−エンアルデヒドの場合には酸化が必要であり、それゆえ、反応媒体を周囲酸素中で脱気することができない。トリフルオロ酢酸は、使用可能な強カルボン酸である。メタンスルホン酸およびトリフルオロメタンスルホン酸は、使用可能な強スルホン酸である。しかしながら、使用した酸および試薬の純度の程度に応じ、ＭＤＡ以外のエンアルデヒドが反応に関与している場合には発色団の生成収率は有意に変化し得る。本発明の他の側面によれば、金属塩、たとえば５マイクロモルの第二鉄塩を最終反応媒体中に加えると、試験したすべてのエンアルデヒドによる発色団の生成に対して再現性がありかつ最大の収率を得ることが可能であることがわかった。本発明による新規アッセイ法は、一般的なおよび臨床化学における生物学的研究のための、とりわけ研究または品質管理または医学診断の分野に用いることのできるアッセイキットを開発するための新規手段を構成する。それゆえ、本発明の方法は、食品の傷みの程度並びに腸経路または非経口経路で使用する栄養液剤の傷みの程度を評価するのに用いることができる。医学診断の分野においては、本発明の方法は、妊婦における子かん前症および高血圧、不安定な狭心症および無症状の心筋虚血などの病的状態を確認するのに用いることができる。本発明の方法はまた、動脈または血管形成の血栓崩壊介入の有効性を確認するのに用いることができる。本発明の方法は最後に、ショック状態（敗血症性または外傷性）、ある種の急性中毒、糖尿病、ＡＩＤＳ、ある種の栄養不良状態、および鉄過剰の遺伝病の治療における治療の有効性の指標を提供する。本発明の方法はまた、最後に、臓器移植の手術後の継続管理および／または体外循環処置に用いることができる。標的とする試料は、とりわけ、全血漿または脱タンパク質血漿、赤血球溶解液、脳脊髄液、選択的沈降によって得られた血漿リポタンパク質または固形組織ホモジネートなどの生物学的試料である。アッセイすべき試料は、本質的に液体であり、たとえば任意に緩衝した水性媒体中または水と混和する有機溶媒中の材料、とりわけ生物学的材料の抽出液、溶液または分散液である。アッセイすべき試料は、たとえば任意に緩衝した水性媒体中または有機媒体中に分散させた生物学的試料の遠心分離ペレットであってよい。これら液体試料は、たとえばメタリン酸、トリクロロ酢酸またはリンタングステン酸などの酸を用いて沈殿させることにより脱タンパクさせた水溶液であってよい。これら試料には、中性またはカチオン性の界面活性剤（特に、１００ｍｌ当たり０〜２ｇの量で）、たとえばルブロール（Lubrol）^R（ポリエチレンオキシドの縮合物）またはテトラアルキルアンモニウム塩が含まれていてよい。いずれにしても、最終反応媒体中の試料の容量比（酸添加後）は、該媒体中で単一の液相が得られることと両立しなければならい。色原体付加化合物を生成させるための試料と式（Ｉ）の試薬とのインキュベーションは、人為処理生成物（これが存在するとアッセイ結果が歪められる）を生成させる二次反応を回避するために、６０℃を越えない温度で行わなければならない。使用する式（Ｉ）の試薬に応じ、選択した温度における反応媒体のインキュベーション時間は、測定する発色団に対して最大の生成収率に対応する安定なプラトーを達成できるように設定すべきである。インキュベーション時間は、一般に６０分未満であるか６０分に等しい。全エンアルデヒドをアッセイするに際しては、最終反応媒体を脱気してはならない。脱気はＭＤＡを単独でアッセイする場合に特定の仕方で行う。しかしながら、最終反応媒体は、前以て周囲酸素中で脱気していない溶液および溶媒からなるのが一般に好ましい。強酸の存在下でエンアルデヒドまたはＭＤＡ単独と一般式（Ｉ）の色原体試薬との反応により生成した発色団の吸光度の分光測光は、使用した試薬に特異的な発色団の最大吸収波長（≧５７０ｎｍ）の領域内（±５ｎｍ）に設定した波長で行わなければならない。有利な態様によれば、場合によって全エンアルデヒド濃度またはマロンジアルデヒド単独の濃度を検量曲線により測定する。この検量曲線は、既知の濃度のアルデヒドの１種または上記酸に不安定なその前駆体の水溶液または有機溶液から作成することができる。溶媒は、該溶液を利用する間に、使用したアルデヒドの重合または使用した前駆体の加水分解を回避することができるように選択しなければならない。アッセイしようとする媒体中に認められると思われるエンアルデヒド、たとえばＭＤＡまたは４−ヒドロキシノネナール（４−ＨＮＥ）または脂質過酸化の過程で通常生成するあらゆるエンアルデヒドを含有する標準溶液を用いるのが有利である。使用する標準溶液は、検量曲線のための幾つかの点を得ることができるように希釈できるような濃度を有していなければならない。前以て設定したアッセイ条件（酸性化およびインキュベーション）下で行う検量曲線を得るため、所定濃度に対する吸光度Ａとアルデヒドを含有しないコントロールに対する吸光度Ａ₀との差異を既知濃度のエンアルデヒドの関数としてプロットする。その際、これら吸光度は、該エンアルデヒドと使用した試薬とで生成した付加生成物に特徴的な最大吸収波長にて読み取る。かくして直線が得られるが、その傾きは測定する付加生成物のみかけのモル吸光係数に等しい。とりわけＭＤＡ、４−ヒドロキシノネナールおよび４−ヒドロキシヘキセナールを用いた種々の試験によると、使用したエンアルデヒドの如何にかかわらず、該直線の傾きは式（Ｉ）の同じ所定の試薬について実質的に同じであることが示された。それゆえ、検量曲線を確立するため、アッセイしようとする媒体中に存在すると思われるエンアルデヒドのいずれの一つをも用いることが可能である。入手が容易なＭＤＡまたは４−ヒドロキシノネナールを用いるのが有利である。特別のケースであるＭＤＡ単独のアッセイの場合には、以下の実験の記載のところで一層詳細に説明するであろうように、該アッセイに特徴的な条件（塩酸または臭化水素酸による酸性化）下で反応する実質的に唯一のエンアルテヒドであるＭＤＡを用いることにより、該条件下で検量曲線を確立するのか好ましい。求めようとするエンアルデヒドの濃度は、試料の吸光度Ａの測定値およびアルデヒドを含有しないコントロールに対する吸光度Ａ₀の測定値および検量直線の傾きに対応するモル吸光係数Ｅから決定することができる。これから以下の式が得られる：［エンアルデヒドの濃度］＝（Ａ−Ａ₀）×Ｋ／Ｅ上記等式中、エンアルデヒド濃度はモル・１^-1で表示される；ＡおよびＡ₀は１ｃｍの光路長で読み取り、ｃｍ^-1で表示される；Ｋは希釈係数である；Ｅは１・モル^-1・ｃｍ^-1で表示される。エンアルデヒド濃度はまた、差異Ａ−Ａ₀を用いることにより、測定値Ａを用いて検量曲線から直接求めることができる。本発明の他の側面によれば、本発明の主題は、上記一般式（Ｉ）に対応する試薬を本質的に含有することを特徴とする、上記アッセイ法を行うための必要物またはキットである。この試薬は、相溶性の溶媒、たとえば、とりわけアセトニトリル、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールなどの水混和性の有機溶媒中、または中性または酸性の水中または緩衝液中の母液として存在しているのが有利である。母液中の試薬の濃度は、使用した溶媒中での溶解度に依存して一般に５〜４０ミリモル／１である。この試薬は、最終反応媒体中での最終濃度が３〜２５ミリモル／１となるように使用時に非常にしばしば希釈されるであろう。好ましい態様によれば、本発明による必要物またはキットは、トリフルオロ酢酸などの強有機酸、メタンスルホン酸やトリフルオロメタンスルホン酸などの強スルホン酸、過塩素酸、硫酸、塩酸および臭化水素酸よりなる群から選ばれた少なくとも１種の強酸をさらに包含する。各酸はそれぞれ別個に包装する。酸は超高純度の品質でなければならず、純粋な形態でまたは脱イオン水中に５モル／１以上の濃度に希釈した母液の形態で貯蔵するのが有利である。最終反応媒体中の酸の最終濃度は、一般に０．５〜２．５モル／１であろう。好ましい他の態様によれば、本発明による必要物またはキットは、さらに、参照または標準試料として、少なくとも１種の脂質過酸化指標エンアルデヒドまたはそのようなアルデヒドの少なくとも１種の酸不安定な前駆体を水溶液または有機溶液中に既知の濃度で包含する。一般式（Ｉ）の化合物は、以下の一般法１〜３に従って調製することができる。一般式１：フィッシャー法この一般式（Ｉ）の化合物の調製のための一般法は、文献（文献１４）に記載された方法に基づいている。該方法は、以下の反応式Ｉにまとめて示すように、置換されているかまたは置換されていないアリールヒドラジン塩酸塩からの本質的に３つの工程からなる。上記反応式中、ｎは１または２である。還流下の市販のアリールヒドラジン塩酸塩の溶液に、対応アセチル化芳香族誘導体（該誘導体自体市販されているかまたは公知方法の一つに従って調製する（文献１５））の溶液を加える。還流を１５〜９０分間維持する。冷却後、所望の生成物が沈殿もしくは析出する。ある場合には、シリカカラムでの液体クロマトグラフィーによる精製が必要となる。環化の工程は、標準法に従ってポリリン酸を用いて行う。アルミナカラムでの液体クロマトグラフィーによる精製の後に所望の生成物が得られ、再結晶させる。得られたインドール誘導体のアルキル化には、ジメチルスルホキシド中、室温にて粉末水酸化カリウムと数時間反応させることによるアニオン生成の第一段階を必要とする；ついで、たとえば硫酸メチルなどのアルキル化剤を加える。通常の処理後、シリカカラムでの液体クロマトグラフィーによる精製後に所望の生成物を得、再結晶させる。実施例１〜７においてこの一般法１を説明する。一般法２：文献１６によるこの方法は、以下の反応式IIに示すように、本質的に２−エチニルアニリンタイプの化合物（置換されているかまたは置換されていない）からの３つの工程を含む。式中、ｎは１または２である。２−エチニルアニリンタイプの化合物をパラジウムゼロ（Ｐｄ⁰）およびヨウ化第一銅（ＣｕＩ）の存在下、室温にてハロゲン化アリールまたはトリフルオロメタンスルホン酸アリールの作用に１〜６時間供する。通常の処理およびシリカまたはアルミナカラムでの液体クロマトグラフィーによる精製後に対応置換アリール誘導体が得られる。環化工程は、上記誘導体を還流アセトニトリル中で２〜３０時間加熱することにより、触媒量の塩化パラジウム（ＰｄＣｌ₂）を用いて行う。シリカまたはアルミナカラムでの液体クロマトグラフィーの後または再結晶後に所望の生成物を得る。アルキル化は方法１と同じ手順にて行う。実施例８〜１１においてこの一般法２を説明する。一般法３：文献１７によるこの方法は、以下の反応式IIIに示すように、本質的に２−ハロアニリンまたは３−アミノ−２−ハロナフタレンタイプの化合物からの４つの工程を含む。場合に応じて出発物質である２−ブロモアニリンまたは３−アミノ−２−ブロモナフタレンを、たとえばクロロギ酸エチルなどのクロロギ酸アルキルタイプの試薬とピリジン中で反応させることにより対応カルバミン酸エステル誘導体に変換する。かくして得られた化合物を、Ｐｄ¹¹錯体、ヨウ化第一銅およびたとえばトリエチルアミンなどの塩基の存在下、８０〜１００℃にてアセチレン試薬の作用に数時間供する。かくして得られた対応アリールアセチレン化合物を、対応アルコール溶媒中のナトリウムアルコキシド、たとえばエタノール中のナトリウムエトキシドの作用に還流下で供する。抽出および液体カラムクロマトグラフィーによる精製後、インドール誘導体が得られる。アルキル化は方法１と同じ手順にて行う。実施例１２においてこの一般法３を説明する。一般式（Ｉ）においてＡ、ＢおよびＣ並びにＲ¹〜Ｒ⁶が前記と同じであり、ＡまたはＣがＨを示す場合に、他の置換基ＣまたはＡがを示し；Ｒ²およびＲ³がＨ以外；ＯＲ⁴であり、ＡまたはＣがＨを示す場合に、他の置換基ＣまたはＡがを示し、Ｂがを示し、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³は同時にＨを示さない化合物は新規であり、本発明の主題の一つを構成する。本発明を以下の実験の部に示す非限定的実施例によりさらに一層詳細に説明する。実験の部：Ｉ．本発明に従って用いる化合物の調製：特に断らない限り、反応はすべて窒素の不活性雰囲気下で行う。質量スペクトル（ＭＳ）はナーマグ（Nermag）Ｒ１０−１０Ｂ装置で記録する。使用したイオン化の様式は、７０電子ホルトでの電子衝撃（ＥＩ）、アンモニア中での化学イオン化（ＣＩ）、またはグリセリンマトリックスでの高速原子衝撃（ＦＡＢ）のいずれかである。 ¹Ｈおよび¹³ＣＮＭＲスペクトルは、バリアンジェミニ−２００（Varian Ｇ emini−２００）装置で記録する。化学シフトは、テトラメチルシランとの対比でｐｐｍで表してある。多重度は、以下のようにして表してある：「ｓ」は一重項、「ｂｓ」はブロードの一重項、「ｄ」は二重項、「ｔ」は三重項および「ｍ」は多重項。融点（ｍ．ｐ．℃）はガレンカンプ（Ｇallenkamp）装置で記録し、補正せずに示してある。液体カラムクロマトグラフィーによる精製は、メルク^RＳｉ６０シリカまたは活性II−IIIのメルク^R中性アルミナのいずれかを用いて行う。Ａ．方法１を用いた実施例実施例１：１,１’-ジメチル−２,２’−（ｍ−フェニレン）ジインドールの調製：１，３−ジアセチルベンゼンビス（フェニルヒドラゾン）：エタノール（２０ｍｌ）中に溶解した１,３−ジアセチルベンゼン（６.４８ｇ；４０ミリモル）を、還流下の水（８０ｍｌ）中のフェニルヒドラジン塩酸塩（１２.７２ｇ；８８ミリモル）および酢酸ナトリウム（１９.６８ｇ；２４０ミリモル）の溶液に加える。添加終了後、この反応混合物をこれら条件下で３０分間維持する。室温に冷却した後、０℃にて３時間撹拌する。かくして得られる懸濁液を濾過する。沈殿を２×５０ｍｌの水で洗浄し、ついで真空乾燥させる。再結晶（９５％エタノール）後に所望の生成物を得る。収量：１３.４１ｇ；９８％物理特性： ^★1H NMR(DMSO-d₆)： 2.27 ppm (s， 6H)； 6.78 ppm (m，2H)； 7.20-7.32 ppm (m， 8H)； 7.40 ppm (t，1H，J=8 Hz)； 7.68 ppm (d，2H，J=8 Hz)； 8.29 ppm (bs，1H)； 9.31 ppm (s，2H)．２，２’ −（ｍ−フェニレン）ジインドール：上記で得た生成物を９０℃にてポリリン酸（１００ｍｌ）中に溶解する。かくして得られた混合物を１２０〜１３０℃にて３時間加熱する。ついで、この反応混合物を氷水（８００ｍｌ）中に注ぐ；酸の完全な溶解には約１．５時間を要する。この工程の間に沈殿が生じる。得られた懸濁液を濾過し、ついで２×２００ｍｌの水で洗浄する。残渣を酢酸エチル（４００ｍｌ）中に再溶解し、中性になるまで飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させる。溶媒を減圧下で蒸発させる。アルミナカラムでの液体クロマトグラフィー（溶出勾配：ヘキサン／酢酸エチル６：１から４：１）により精製した後に所望の生成物を得る。収量：３.８５ｇ；３２％物理特性：融点：２８２℃（分解） ^★1H NMR (DMSO-d₆)： 6.98-7.18 ppm (m，6H)； 7.44 ppm (d，2H，J=8 Hz)； 7.55 ppm (t， 1H，J=7 Hz)； 7.58 ppm (d，2H，J=8 Hz)； 7.80 ppm (dd， 2H，J=1.5-7 Hz)； 8.39 ppm (t，1H，J=1.5 Hz)．１,１’-ジメチル−２,２’−（ｍ−フェニレン）ジインドール：ジメチルスルホキシド（３０ｍｌ）中の上記で得た２,２’−（ｍ−フェニレン）ジインドール（３.８５ｇ；１２.５ミリモル）の溶液に、粉末の水酸化カリウム（５．６ｇ；１００ミリモル）を加える。この反応混合物を室温で６４時間撹拌する。ついで硫酸メチル（１５.７５ｇ；１２５ミリモル）を加える。１５分後、この反応混合物に水（１００ｍｌ）を加える。生成物を酢酸エチル（３００ｍｌ）で抽出する。有機相を２×１００ｍｌの飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、ついで硫酸マグネシウムで乾燥させる。再結晶（ヘキサン／酢酸エチル１：１）させた後に所望の生成物を得る。収率：３.３３ｇ；８１％物理特性：融点：１５０℃ ^★1H NMR (DMSO-d₆)： 3.83 ppm (s，6H)； 6.68 ppm (s，2H)； 7.08 ppm，(m，2H)； 7.21 ppm (m，2H)； 7.52 ppm (d，2H，J:8=Hz)； 7.59 ppm (d， 2H，J=7.5 Hz)； 7.67 ppm (s，3H)； 7.79 ppm (s，1H)． ^★13C NMR (DMSO-d₆)： 31.25 ppm； 101.84 ppm； 110.47 ppm； 119.95 ppm； 120.45 ppm； 121.90 ppm； 127.69 ppm； 127.71 ppm； 128.79 ppm； 129.51 ppm； 132.95 ppm； 138.56 ppm； 140.83 ppm． ^★ MS (EI，70 eV)： 336 (100，M⁺)； 320 (12)； 204 (10)； 168 (30)．実施例２：５−フルオロ−１−メチル−２−（２’−チエニル）インドールの調製：２−アセチルチオフェン４−フルオロフェニルヒドラゾン：方法１に従い、この化合物を市販の４−フルオロフェニルヒドラジン塩酸塩（アルドリッチ）および市販の２−アセチルチオフェン（アルドリッチ）から調製する。収率：７１％物理特性 ^★1H NMR (DMSO-d₆)： 2.25 ppm (s，3H)； 6.98-7.20 ppm (m，5H)； 7.23 ppm (d，1H， J=3.0 Hz)； 7.40 ppm (d，1H，J=5.0 Hz)； 9.30 ppm (bs，1H)．５−フルオロ−２−（２’−チエニル）インドール：方法１に従い、この化合物を上記で得た２−アセチルチオフェン４−フルオロフェニルヒドラゾンから調製する。収率：４６％物理特性： ^★ ¹H NMR (DMSO-d₆)： 6.65 ppm (s，1H)； 6.93 ppm (td，1H，J=2.5-9.0-9.0 HZ)； 7.15 ppm (dd，1H，J=3.5-5.0 Hz))； 7.25 ppm (dd，1H， J=2.5-10.0 Hz))； 7.34 ppm (dd，1H，J:4.5-9.0 Hz)； 7.50ー 7.58 ppm (m，2H)； 11.66 ppm (bs，1H)．５−フルオロ−１−メチル−２−（２’−チエニル）インドール：方法１に従い、この化合物を上記で得た５−フルオロ−２−（２’−チエニル）インドールから調製する。収率：７４％物理特性 ^★ ¹H NMR (DMSO-d₆)： 3.85 ppm (s，3H)； 6.65 ppm (s，1H)； 7.15 ppm (td，1H， J=2.5-9.0-9.0 Hz))； 7.23 ppm (dd，1H，J=3.5-5.0 Hz)； 7.35 ppm (dd，1H，J=2.5-10.0 Hz)； 7.43 ppm (d，1H，J= 3.5 Hz)； 7.53 ppm (dd，1H，J=4.5-9.0 Hz)； 7.70 PPm (d， 1H，J=5.0 Hz)． ¹³C NMR (DMSO-d₆)： 31.32 ppm； 101.98 ppm (d，J:65.2 Hz)； 104.82 ppm (d， J=23.5 Hz)； 110.16 ppm (d，J=26.1 Hz)； 111.59 ppm (d， J:10.1 Hz)； 127.49 ppm； 127.54 ppm； 128.53 ppm； 133.26 ppm； 135.14 ppm； 135.64 ppm； 157.7 ppm (d，J= 233.4 Hz)． ^★ MS (EI,70 eV)： 231 (100，M⁺)； 216 (14)； 107 (12)； 45 (20)．実施例３：４−および６−フルオロ−１−メチル−２−（２’−チエニル）インドールの調製：２−アセチルチオフェン３−フルオロフェニルヒドラゾン：この化合物は、方法１に従い、市販の３−フルオロフェニルヒドラジン塩酸塩（アルドリッチ）および市販の２−アセチルチオフェン（アルドリッチ）から調製する。収率：４２％物理特性： ^★ ¹H NMR (DMSO-d₆)： 2.26 ppm (s，3H)； 6.52 ppm (td，1H，J=2.5-8.5-8.5 Hz)； 6.84-7.0 ppm (m，2H)； 7.03 ppm (dd，1H，J=3.5-5.0 Hz)； 7.16-7.30 ppm (m，1H)； 7.28 ppm (dd，1H，J=1.0-3.5 Hz)； 7.43 ppm (d d，1H，J=1.0-5.0 Hz))； 9.50 ppm (bs，1H)．４−および６−フルオロ−２−（２’−チエニル）インドール：これら化合物は、方法１に従い、上記で得た２−アセチルチオフェン３−フルオロフェニルヒドラゾンから調製する。収率：２つの異性体の１：１混合物として７４％物理特性： ^★ ¹H NMR (DMSO-d₆)：２つの異性体の１：１混合物 6.68 ppm (d，0.5H，J=1 Hz)： 6.72 ppm (m，0.5H)； 6・76- 6.91 ppm (m，1H)； 7.0-7.24 ppm (m，2.5H)； 7.44-7.60 ppm (m，2.5H)； 11.7 ppm (bs，0.5H)； 11.9 ppm (bs，0.5H)．４−および６−フルオロ−１−メチル−２−（２’−チエニル）インドール：これら化合物を、方法１に従い、上記で得た４−および６−フルオロ−２−（２’−チエニル）インドールの混合物から調製する。収率：６８％４−フルオロ−１−メチル−２−（２’−チエニル）インドール：物理特性：融点：８６℃ ^★ ¹H NMR (DMSO-d₆)： 3.85 ppm (s，3H)； 6.70 ppm (s，1H)； 6.85 ppm (dd，1H， J=8.0-10.0 Hz); 7.17 ppm (td，1H，J=5.0-8.0-8.0 Hz)； 7.24 ppm (dd，1H，J=3.5-5.0 Hz)； 7.37 ppm (d，1H， J=8.5 Hz)； 7.47 ppm (d，1H，J=3.5 Hz)； 7.52 ppm (d，1H， J=5.0 HZ)． ^★ ¹³C NMR (DMSO-d₆)： 31.72 ppm； 99.06 ppm； 105.21 ppm (d，J=19.2 Hz)； 106.17 ppm (d，J=3.5 Hz)； 122.97 ppm (d，J=7.4 Hz)； 127.03 ppm； 127.06 ppm； 127.66 ppm； 128.17 ppm； 128.21 ppm； 134.28 ppm (d，J=24.1 Hz)； 141.43 PPm (d， J=12 Hz)； 156.77 ppm (d，J=248 Hz)． ^★ MS (EI，70 eV)： 231 (100，M⁺)； 216(8)； 198(10)； 185(14)； 172(10)； 45 (20)．６−フルオロ−１−メチル−２−（２’−チエニル）インドール：物理特性：融点：７４〜７５℃ ^★ ¹H NMR (DMSO-d₆)： 3.80 ppm (s，3H)； 6.92 ppm (td，1H，J=2.5-9.0-9.0 Hz)； 7.21 ppm (dd，1H，J=3.5-5.0 Hz)； 7.34-7.44 ppm (m，2H)； 7.54 ppm (dd，1H，J=5.5-8.5 Hz)； 7.67 ppm (d，1H； J= 5.0 Hz)． ^★ ¹³C NMR (DMSO-d₆)： 31.44 PPm； 96.49 ppm (d，J=26.5 Hz)； 103.26 ppm； 109.23 ppm (d，J=24.5 Hz)； 121.84 ppm (d，J=10.0 Hz)； 124.67 ppm； 126.76 ppm； 127.29 ppm； 128.20 ppm； 134.40 PPm： 134.99 ppm (d，J=4.0 Hz))； 139.00 ppm (d， J=11.8 Hz)； 160.66 ppm(d，J=238.9 Hz)． ^★ MS (EI，71 eV)： 231 (100，M⁺)； 216 (10)； 185 (12)； 172 (14)； 58 (50)； 45 (60)．実施例４：１−メチル−２−（２’−セレノフェニル）インドールの調製：２−アセチルセレノフェンフェニルヒドラゾン：この化合物は、市販のフェニルヒドラジン塩酸塩（アルドリッチ）および２− アセチルセレノフェン（それ自体、ウメザワ（Ｓ．Ｕmezawa）によって記載された方法（文献１８）に従って得られる）から調製する。収率：８２％物理特性： ^★ ¹H NMR (DMSO-d₆)： 2.25 ppm (s，3H)； 6.75 ppm (tt，1H，J=1.5-1.5-7.0- 7.0 Hz)； 7.08-7.28 ppm (m，4H)； 7.24 ppm (dd，1H，J=3.5- 5.5 Hz)； 7.35 ppm (dd，1H，J=1.0-3.5 Hz)； 7.95 ppm (dd， 1H，J=1.0-5.5 Hz)； 9.30 ppm (bs，1H)．２−（２’−セレノフェニル）インドール：この化合物は、方法１に従い、上記で得た２−アセチルセレノフェンフェニルヒドラゾンから調製する。収率：６１％物理特性： ^★ ¹H NMR (DMSO-d₆)： 6.66 ppm (d，1H，J=1.5 Hz)； 6.97 ppm (m，1H)； 7.09 ppm (m，1H)； 7.33 ppm (dd，1H，J=4.0-5.5 Hz)； 7.34 ppm (d， 1H，J=8.0 Hz)； 7.48 ppm (d，1H，J=8.0 Hz)； 7.65 ppm(dd， 1H，J=1.0-4.0 Hz)； 8.11 ppm (dd，1H，J=1.0-5.5 Hz)； 11.51 ppm (bs，1H)． ^★ ¹³C NMR (DMSO-d₆)： 99.92 ppm； 111.39 ppm； 119.82 ppm； 120.15 ppm； 122.11 ppm； 125.68 ppm； 128.87 ppm； 130.66 ppm； 130.98 ppm； 134.73 ppm； 137.21 ppm； 140.99 ppm． ^★ MS (EI，70 eV)： 247(100，M⁺)； 167 (80)； 139 (40)； 127 (15)； 113 (15)； 89 (30)； 63 (40)； 43 (45)．１−メチル−２−（２’−セレノフェニル）インドール：この化合物は、方法１に従い、上記で得た２−（２’−セレノフェニル）インドールから調製する。収率：９０％物理特性： ^{★ 1}H NMR (DMSO-d₆)： 3.83 ppm (s，3H)； 6.65 ppm (s，1H)； 7.05 ppm (m，1H)； 7.20 ppm (m，1H)； 7.43 ppm (dd，1H，J=3.5-5.0 Hz)； 7.45- 7.57 ppm (m，3H)； 8.28 ppm (dd，1H，J=1.0-5.0 Hz)． ^★ ¹³C NMR (DMSO-d₆)： 31.04 ppm； 102.53 ppm； 110.41 ppm； 120.09 ppm； 120.33 ppm； 122.15 ppm； 127.50 ppm； 129.24 ppm； 130.76 ppm； 133.29 ppm； 135.89 ppm； 138.47 ppm； 139.06 ppm． ^★ MS (EI，70 eV)： 261 (100，M⁺)； 180(70)； 167 (20)； 152 (2-5)； 63 (30)．実施例５：１−メチル−２−フェニルインドールの調製：この化合物は、方法１に従い、市販の２−フェニルインドール（ランカスター）からアルキル反応によって得る。収率：８７％物理特性：融点：１００〜１０１℃ ^★ ¹H NMR (DMSO-d₆)： 3.75 ppm (s，3H)； 6.57 ppm (s，1H)； 7.07 ppm (m，1H)； 7.19 ppm (m，1H)； 7.40-7.64 ppm (m，6H)． ^★ ¹³C NMR (DMSO-d₆)： 31.05 ppm； 101.43 ppm； 110.37 ppm； 119.90 ppm； 120.40 ppm； 121.75 ppm； 127.78 ppm； 128.21 ppm； 128.97 ppm； 129.30 ppm； 132.54 ppm； 138.49 ppm； 141.53 ppm． ^★ MS (EI，70 eV)： 207 (100，M⁺)．実施例６：５−（１−メチル−２−フェニルインドリル）スルホン酸ナトリウムの調製：この化合物は、標準法（文献１５）に従い、上記で得た１−メチル−２−フエニルインドールから調製する。収率：２４％物理特性：融点：＞３６０℃ ^★ ¹H NMR (D₂O)： 3.18 ppm (s，3H)； 6.21 ppm (s，1H)； 7.0-7.20 ppm (m，6H)； 7.55 ppm (dd，1H，J=1.5-8.0 Hz)； 7.90 ppm (d，1H，J= 1.5 Hz)． ^★ ¹³C NMR (D₂O)： 32.94 ppm； 104.62 ppm； 113.00 ppm； 120.89 ppm； 121.69 ppm； 129.07 ppm； 130.51 ppm； 130.98 ppm； 131.38 ppm； 134.23 ppm； 137.22 ppm； 141.66 ppm； 145.09 ppm．実施例７：５,５’−［１,１’−ジメチル−２,２’−（ｍ−フェニレン）ジインドリル］スルホン酸ナトリウムの調製：この化合物は、標準法（文献１５）に従い、実施例１で得た１,１’−ジメチル−２,２’−（ｍ−フェニレン）ジインドールから調製する。収率：４８％物理特性：融点：＞３６０℃ ^★ ¹H NMR(D₂O)： 3.26 ppm (s，6H)； 6.13 ppm (s，2H)； 6.77 ppm (bs，1H)； 7.16-7.34 ppm (m，5H)； 7.55 ppm (dd，2H，J=1.5-8.5 Hz)； 7.95 ppm (d，2H，J=1.5 Hz)． ^★ ¹³C NMR(D₂O)： 33.11 ppm； 104.85 ppm； 113.17 ppm； 120.77 ppm； 121.57 ppm； 128.89 ppm； 128.98 ppm； 131.06 ppm； 131.59 ppm； 134.33 ppm； 136.87 ppm； 141.71 ppm； 144.71 ppm； 144.76 ppm； 144.85 ppm． ^★ MS (FAB，グリセロール)： 563 (20)； 541 (M+H⁺，20)； 461 (20)； 265 (100)．Ｂ．方法２を用いた実施例：実施例８：１−メチル−２−（２’−チエニル）インドールの調製：２−［２’−（２”−チエニル）エチニル］アニリン：ジエチルアミン／ジメチルホルムアミド（４：１）（１０ｍｌ）中の２−エチニルアニリン（４４０ｍｇ；３．８ミリモル）および２−ヨードチオフェン（７９８ｍｇ；３．８ミリモル）の溶液に、テトラキス（トリフェニルホスフイン）パラジウム（４２０ｍｇ；３８マイクロモル）およびヨウ化第一銅（１４．４ｍｇ；７６マイクロモル）を加える。この反応混合物を室温にて６時間撹拌し、ついで水（１００ｍｌ）およびｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（１００ｍｌ）を加える。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過する。溶媒を減圧下で蒸発させる。シリカカラムでの液体クロマトグラフィー（溶出液：ヘキサン／酢酸エチル９：１）により精製した後に所望の生成物を結晶形にて得る。収量：５６０ｍｇ；７４％物理特性： ^★ ¹H NMR (CDCl₃)： 4.23 ppm (bs，2H)； 6.70 ppm (m，2H)； 7.00 ppm (dd，1H， J=3.5-5.0 Hz)； 7.13 ppm(m，1H)； 7.22-7.38 ppm(m，3H)．２−（２’−チエニル）インドール：上記で得た生成物（５６０ｍｇ；２.８ミリモル）をアセトニトリル（１５ｍｌ）中に溶解し、ついで塩化パラジウム（２５ｍｇ；０.１４ミリモル）を加える。この反応混合物を３時間加熱還流する。溶媒を減圧下で蒸発させる。シリカカラムでの液体クロマトグラフィー（溶出液：ヘキサン／酢酸エチル９：１）により精製した後に所望の生成物をわずかに黄色がかった粉末の形態で得る。収量：４００ｍｇ；７１％物理特性：融点：１６８℃ ^★ 1H NMR (DMSO-d₆)： 6.65 ppm (s，1H)； 6.92 ppm(td，1H，J=1.0-7.0-7.0 Hz)； 7.09 ppm (td，1H，J=1.0-7.0-7.0 Hz)； 7.36 ppm (d，1H， J=7.0 Hz)； 7.46-7.55 ppm (m，3H)； 11.55 ppm (bs，1H)． ^★ ¹³C NMR (DMSO-d₆)： 98.96 ppm； 111.40 ppm； 119.84 ppm； 120.20 ppm； 122.04 ppm； 123.79 ppm； 125.41 ppm； 128.43 ppm； 128.80 ppm； 132.22 ppm； 135.85 ppm； 137.13 ppm． ^★ MS(IE，70 eV)： 199 (100，M⁺)； 171 (10)； 154 (10)．１−メチル−２−（２’−チエニル）インドール：ジメチルスルホキシド（３０ｍｌ）中の２−（２’−チエニル）インドール（３.０ｇ；１５ミリモル）の溶液に粉末の水酸化カリウム（２.５２ｇ；４５ミリモル）を加える。この反応混合物を室温にて１４時間撹拌する。ついで硫酸メチル（６.６ｇ；５２.５ミリモル）を加える。１５分後、反応混合物に水（１００ｍｌ）を加える。生成物を酢酸エチル（２００ｍｌ）て抽出する。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（２×１００ｍｌ）で洗浄し、ついで硫酸マグネシウムで乾燥させる。シリカカラムでの液体クロマトグラフィー（溶出液：シクロヘキサン／酢酸エチル３０：１）および再結晶（ヘキサン／イソプロパノール２：１）により精製した後に所望の生成物を得る。収量：２.６２ｇ；８２％物理特性：融点：５８℃ ^★ ¹H NMR (DMSO-d₆)： 3.87 ppm (s，3H)； 6.65 ppm (s，1H)； 7.05 ppm (t，1H， J=8.0 Hz)； 7.19 ppm (t，1H，J=8.0 Hz)； 7.23 ppm (dd，1H J=3.5-5.0 Hz)； 7.41 ppm (d，1H，J=3.5 Hz)； 7.50 ppm (d， 1H，J=7.0 Hz)； 7.55 ppm (d，1H，J=7.0 Hz)； 7.68 ppm (d， 1H， J=5.0 Hz)． ^★ ¹³C NMR (DMSO-d₆)； 31.03 ppm； 102.04 ppm； 110.39 ppm； 120.08 ppm； 120.37 ppm； 122.14 ppm； 127.17 ppm； 127.43 ppm； 128.53 ppm； 133.65 ppm； 133.87 ppm； 138.37 ppm． ^★ MS (EI，70 eV)： 213 (100，M⁺)； 167 (15)； 154 (15)； 89 (20)； 58 (60)； 45 (45)； 39(25)．実施例９：１−メチル−５−ニトロ−２−（２’−チエニル）インドールの調製：５−ニトロ−２−（２’−チエニル）インドール：この化合物は、文献１９に記載された方法に従い、２−（２’−チエニル）インドールのニトロ化により得られる。収率：５３％物理特性： ^★ ¹H NMR (DMSO-d₆)： 6.96 ppm (s，1H)； 7.20 ppm (dd，1H，J=3.5-5.0 Hz)； 7.52 ppm (d，1H，J=9.0 Hz)； 7.60-7.66 ppm (m，2H)； 8.0 ppm (dd，1H，J=2.0-9.0 Hz)； 8.51 ppm (d，J=2 Hz)； 12.33 (bs，1H)．１−メチル−５−ニトロ−２−（２’−チエニル）インドール：この化合物は、方法１に従い、上記で得た５−ニトロ−２−（２’−チエニル）インドールからアルキル化反応により得られる。収率：８３％ ^★ ¹H NMR (DMSO-d₆)： 3.98 PPm (s，3H)； 6.98 ppm (s，1H)； 7.27 ppm (dd，1H， J=3.5-5.5 Hz)； 7.53 ppm (d，1H，J=3.5 Hz)； 7.74 ppm (d， 1H，J=9.0 Hz)； 7.78 ppm (d，1H，J=5.5 Hz)； 8.07 ppm (dd， 1H，J=2.0-9.0 Hz)； 8.57 ppm (d，1H，J=2.0 Hz)．実施例１０：５−アミノ−１−メチル−２−（２’−チエニル）インドールの調製：この化合物は、塩化スズ（ＳｎＣｌ₂）を用い、実施例９で得た１−メチル− ５−ニトロ−２−（２’−チエニル）インドールを還元することにより得られる。収率：６３％物理特性： ^★ ¹H NMR (DMSO-d₆)： 3.72 ppm (d，3H，J=1.5 Hz)； 4.60 ppm (bs，2H)； 6.35 ppm (s，1H)； 6.58 ppm (d，1H，J=8.5 Hz)； 6.65 ppm (s，1H)； 7.14-7.22 ppm (m，3H)； 7.32 ppm (m，1H)； 7.61 ppm (m， 1H)． ^★ MS (EI，70 eV)： 228 (100，M⁺)； 213 (30)； 114 (10)．実施例１１：２−｛１’−［２’一（２”−チエニル）インドリル］｝エチルホスホン酸ニナトリウムの調製：１−（２’−ジエトキシホスホノ）エチル−２−（２”−チエニル）インドール：この化合物は、上記実施例で使用したアルキル化の方法に従い、市販のビニルジエトキシホスホネート（アルドリッチ）を用いて２−（２’−チエニル）インドールのアルキル化により得られる。収率：５３％物理特性： ^★ ¹H NMR(DMSO-d₆)： 1.17 ppm (t，6H，J=7.0 Hz)； 2.17 ppm (m，2H)； 3.94 ppm (m，4H)； 4.46 ppm (m，2H)； 6.66 ppm (s，1H)； 7.08 ppm (t， 1H，J=7.5 Hz)； 7.17-7.27 ppm (m，1H)； 7.47 ppm (d，1H， J=7.5 Hz )； 7.57 ppm (d，1H，J=7.5 Hz)； 7.72 ppm (d，1H， J=5.0 Hz)．２−｛［１’−［２’−（２”−チエニル）インドリル］｝エチルホスホン酸二ナトリウムこの化合物は、トリメチルシリルブロマイドを用い、上記１−（２’−ジエトキシホスホノ）エチル−２−（２”−チエニル）ィンドールの加水分解により得られる。収率：９９％物理特性： ^★ ¹H NMR (D₂O)： 1.85 ppm (m，2H)； 4.42 ppm (m，2H)； 6.48 ppm (s，1H)； 7.02 ppm (t，1H，J=7.5 Hz)； 7.09 ppm (dd，1H，J=3.5- 5.0 Hz)； 7.16-7.26 ppm (m，2H)； 7.39 ppm (dd，1H， J=1.0-5.0 Hz)； 7.45 ppm (d，1H；J=7.5 Hz)； 7.53 ppm (d， 1H，J=7.5 Hz)． ^★ ¹³C NMR (D₂O)： 36.75 ppm (d，J=125 Hz)； 42.94 ppm； 105.01 ppm； 113.35 ppm； 123.10 ppm； 123.48 ppm； 125.16 PPm； 129.79 ppm； 130.38 ppm； 131.10 ppm； 136.10 ppm； 136.55 ppm； 139.99 ppm． ^★ MS (FAB，グリセロール）： 374 (55)： 352 (30，M+H⁺)； 165 (25)； 148 (30)； 137 (50)； 122 (70)； 108 (100)．Ｃ．方法３を用いた実施例：実施例１２：１−メチル−２−フェニルベンゾ（ｆ）インドールの調製：３−アミノ−２−ブロモナフタレン：この化合物は、文献２０に記載の方法に従い、市販のビス（ヘキサクロロシクロペンタジエニル）−２−ブロモ−３−ニトロナフタレン（アルドリッチ）から得られる。収率：７１％物理特性： ^★ ¹H NMR(CDCl₃)： 4.25 ppm (bs，2H)； 7.09 ppm (s，1H)； 7.22 ppm (t，1H， J=7.5 Hz)； 7.36 ppm (t，1H，J=7.5 Hz)； 7.56 ppm (d，1H， J=7.5 Hz)； 7.60 ppm (d，1H，J=7.5 Hz)； 7.96 ppm (s，1H)．２−ブロモ−３−（エトキシカルボニル）アミノナフタレン：この化合物は、方法３に従い、上記で得た３−アミノ−２−ブロモナフタレンおよび市販のクロロギ酸エチル（アルドリッチ）から調製する。収率：７５％物理特性： ^★ ¹H NMR(CDCl₃)： 1.36 ppm (t，3H，J=7 Hz)； 4.28 ppm (q，2H，J=7 Hz)； 7.29 ppm (bs，1H)； 7.42 ppm (m，2H)； 7.66 ppm (d，1H，J= 8 Hz)； 7.78 ppm (d，1H，J=8 Hz)； 8.05 ppm (s，1H)； 8.59 ppm (s，1H)． ^★ MS (EI，70 eV)： 293 (32，M⁺)； 249 (12)； 234 (25)； 223 (35)； 214 (14)； 193 (70)； 186 (77)； 140 (35)； 114 (100)； 87 (28)： 63 (50)．２−（エトキシカルボニル）アミノ−３−（２’−フェニルエチニル）ナフタレン：この化合物は、方法３に従い、上記で得た２−ブロモ−３−（エトキシカルボニル）アミノナフタレンから調製する。収率：８３％物理特性： ^★ ¹H NMR (CDCl₃)： 1.37 ppm (t，3H，J=7 Hz)； 4.30 ppm (q，2H，J=7 Hz)； 7.32- 7.50 ppm (m，5H)； 7.54-7.63 ppm (m，3H)； 7.72 ppm (d，1H， J=8 Hz)； 7.78 ppm (d，1H，J=8 Hz)； 8.02 ppm (s，1H)； 8.58 ppm (s，1H)．２−フェニル−１（Ｈ）−ベンゾ（ｆ）インドール：この化合物は、方法３に従い、上記で得た２−（エトキシカルボニル）アミノ −３−（２’−フェニルエチニル）ナフタレンから調製する。収率：３４％物理特性： ^★ ¹H NMR(DMSO-d₆)： 7.08 ppm (d，1H，J=1 Hz)； 7.27 ppm (m，2H)； 7.40 ppm (d， 1H，J=7 Hz)； 7.51 ppm (t，2H，J=7.5 Hz)； 7.85 ppm (s， 1H)； 7.87-8.09 ppm (m，4H)； 8.07 ppm (s，1H)； 11.54 ppm (bs，1H)． ^★ MS (EI，70 eV)： 243 (100，m⁺)； 215 (18)； 139 (38)； 87 (13)； 77 (25)； 63 (14)．１−メチル−２−フェニルベンゾ（ｆ）インドール：この化合物は、方法１の記載と同様にして、２−フェニル−１（Ｈ）−ベンゾ（ｆ）インドールをアルキル化することにより調製する。収率：７２％物理特性： ^★ ¹H NMR (DMSO-d₆)： 3.85 ppm (s，3H)； 6.75 ppm (s，1H)； 7.33 ppm (m，2H)； 7.47-7.62 ppm (m，3H)； 7.65-7.72 ppm (m，2H)； 7.91- 8.02 ppm (m，3H)； 8.13 ppm (s，1H)． ^★ MS (EI，70 eV)： 257 (100，M⁺)； 215 (12)； 77 (11)．実施例１３：１−メチル−２−フェニルベンゾ（ｆ）インドール−５,７−ジスルホン酸の調製：上記で得た１−メチル−２−フェニルベンゾ（ｆ）インドール誘導体（０.１５ｇ；０.５８ミリモル）を発煙硫酸（２０％ＳＯ₃）（１ｍｌ）で０℃にて１時間処理する。ついで、この反応媒体に冷水（２ｍｌ）をゆっくりと滴下する。かくして得られた懸濁液を濾過した後、冷水（２００μｌ）で洗浄し、２つの異性体、１−メチル−２−フェニルベンゾ（ｆ）インドール−５,７−ジスルホン酸および１−メチル−２−フェニルベンゾ（ｆ）インドール− ６,８−ジスルホン酸の混合物を非常に吸湿性の黄色の粉末の形態で得る。この混合物の収率は８８％である。液体カラムクロマトグラフィーにより精製した後、所望の生成物を収率３５％で得る。物理特性： ^★ ¹H NMR (D₂O + NaOD)： 3.44 ppm (s，3H)； 7.30 ppm (m，5H)； 7.84 ppm (s，1H)； 8.21 ppm (m，1H)； 8.45 ppm (m，1H)； 8.80 ppm (s，1H)． ^★ MS （陰イオン FAB；トリエタノールアミン）： 416 (M-H； 50%)； 336 (20%)； 195(100%)．実施例１４：１−メチル−２−フェニルベンゾ（ｆ）インドール−６,８−ジスルホン酸の調製：この誘導体は、液体カラムクロマトグラフィーにより精製した後、上記混合物から５３％の収率で得られる。物理特性： ^★ ¹H NMR (D₂O + NaOD) 3.61 ppm (s，3H)； 7.30 ppm (m，5H)； 8.08 ppm (s，1H)； 8.26 ppm (m，1H)； 8.43 ppm (m，1H)； 8.50 ppm (s，1H)． ^★ MS （陰イオン FAB；トリエタノールアミン）： 416 (M-H； 50%)； 336 (20%)； 195 (100%)．実施例１５：１−メチル−２−フェニルベンゾ（ｆ）インドール−５,７−ジスルホン酸二ナトリウム塩の調製：１−メチル−２−フェニルベンゾ（ｆ）インドール−５,７−ジスルホン酸（７５ｇ；０.１８ミリモル）を塩化ナトリウムの熱飽和溶液（７.５ｍｌ）で処理する。室温に冷却し、濾過し、４／５倍に希釈した塩化ナトリウムの飽和溶液（５００μｌ）で洗浄した後、所望の生成物を平らでわずかに黄色で蛍光性の結晶の形態で得る。収率：７８％物理特性： ^★ m.p.：〉360℃ ^★ ¹H NMR (D₂O)： 3.60 ppm (s，3H)； 6.65 ppm (bs，1H)； 7.38-7.50 ppm (m， 5H)； 7.98 ppm (s，1H)； 8.19 ppm (m，1H)，8.50 ppm (s， 1H)； 8.82 ppm (s，1H) ^★ MS （陰イオン FAB；トリエタノールアミン）： 496 (20%)； 438 (35%)； 206 (100%)； 194 (85%)； 171 (46%)； 113 (45%)．実施例１６：１−メチル−２−フェニルベンゾ（ｆ）インドール−６，８−ジスルホン酸二ナトリウム塩の調製：１−メチル−２−フェニルベンゾ（ｆ）インドール−６,８−ジスルホン酸（８０ｇ；０.１９ミリモル）を塩化ナトリウムの熱飽和溶液（８.０ｍｌ）で処理する。室温に冷却し、濾過し、４／５倍に希釈した塩化ナトリウムの飽和溶液（５００μｌ）で洗浄した後、所望の生成物を平らでわずかに黄色で蛍光性の結晶の形態で得る。収率：８２％物理特性： ^★ m.p.：〉360℃ ^★ ¹H NMR (D₂O)： 3・73 PPm (S，3H)； 6.61 ppm (bs，1H)； 7.38-7.50 ppm (m， 5H)； 8.23 ppm (bs，2H)； 8.49 ppm (bs，1H)； 8.54 ppm (s， 1H) ^★ MS （陰イオン FAB；トリエタノールアミン）： 496 (20%)； 438 (35%)； 206 (100%)； 194 (85%)； 171 (46%)； 113 (45%)． II．本発明の方法を実施するための実施例：実施例１７：１−メチル−２−フェニルインドール（実施例５の化合物）を用いた脂質過酸化の比色アッセイ：１−メチル−２−フェニルインドール（以下、「色原体試薬Ｒ１」または一層簡単に「試薬Ｒ１」と称する）は、４５℃にてＭＤＡおよび４−ヒドロキシアルケナールと反応する。１分子のＭＤＡまたは４−ヒドロキシアルケナールと２分子の試薬Ｒ１とが縮合して安定な発色団が得られ、その最大吸収波長（試薬Ｒ１に特徴的である）は５８６ｎｍに等しい。この理由から、この方法を以下「ＬＰＯ−５８６法」と呼ぶことにする。ＭＤＡの場合には、この発色団は式：を有する。ＬＰＯ−５８６法は、水性試験試料でのＭＤＡおよび４−ヒドロキシ−２−エンアルデヒドに特異的なアッセイを可能とする。その実行が簡単であることは、大系列の試料において脂質過酸化を測定するのに特によく適している。他の比色アッセイ法で知られている妨害の殆どがＬＰＯ−５８６法においては回避され、このことは遥かに高い特異性および感度となって反映される。ＬＰＯ−５８６法の変法は、４−ヒドロキシ−２−エンアルデヒドを含有する試料中でＭＤＡの量を特異的に測定することを可能にする（以下参照）。これら２つのパラメータを同じ試料中で特異的に測定することにより、ＭＤＡの酵素的起源を評価することが可能となる（たとえば、トロンボキサンの生合成）。この方法を行うための主要な試薬は、ボックス（必要物またはキットの形態にて）の中に配置することができる。そのようなボックスには、たとえば、１００のアッセイを行うことが可能な量の試薬、すなわち：試薬Ｒ１：アセトニトリル中の色原体試薬Ｒ１の１０．３ミリモル溶液；（３× １８ｍｌ）試薬Ｒ２：１０.４モルのメタンスルホン酸；（３×５.５ｍｌ）適当な場合には３４マイクロモルの塩化第二鉄を含有標準溶液Ｓ１：２０ミリモルのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.４）中の１,１, ３,３−テトラメトキシプロパンの１０ミリモル溶液；（１ｍｌ）標準溶液Ｓ２：アセトニトリル（１ｍｌ）中の４−ヒドロキシノネナールジエチルアセタールの１０ミリモル溶液が含まれていてよい。（注）：１,１,３,３−テトラメトキシプロパンおよび４−ヒドロキシノネナールジエチルアセタールは、酸性媒体中でそれぞれＭＤＡおよび４−ヒドロキシノネナールに変換される。これら溶液はすべて密封したビンに包装すべきであり、ビンの表示に示された期限日まで＋４〜＋１０℃にて貯蔵すべきである。これら溶液は凍結すべきでない。開封および使用後、注意深く栓をしたビンを＋４〜＋１０℃にて貯蔵すべきである。これら条件下、これら溶液は、ビンを最初に開封した臼から２カ月間使用することができる。装置は、本質的に、０〜２吸光度単位の間隔で５８６ｎｍ（±４ｎｍ）の波長での吸光度の測定を可能にする吸光光度計；１ｃｍの光路長を有する１ｍｌ分光分析セル；４５±１℃にサーモスタットで調温した水浴。脂質過酸化測定を行う際、使用するガラス製品が酸（酢酸または塩酸）での洗浄および非常に純粋な脱イオン化水での充分な濯ぎに対して耐性であることを必要とする。１回使用の試験管および栓はボックスの溶媒および酸と両立するものでなければならない。試料の希釈および測定に用いる製品（水、緩衝液および溶媒）はすべて、超高純度の品質でなければならない。実験手順１．試薬Ｒ１の最終溶液の調製使用する直前に、３容量の試薬Ｒ１の初期溶液（１８ｍｌ）を１容量（６ｍｌ）の純粋なメタノールを添加することにより希釈する。アセトニトリル／メタノール３：１（ｖ／ｖ）混合物中に７．７ミリモルのＲ１を含有するＲ１−ｄｉｌ溶液が得られる。この溶液（すぐに使用できる）は１日以上貯蔵すべきでない。２．アッセイ各系列の測定の前に、５８６ｎｍにおける分光光度計の吸光度０を水に対して調節する。（ａ）Ｒ１−ｄｉｌ溶液（６５０μｌ）をすべての試験管に分配する。（ｂ）各アッセイについて：２００μｌの試料を添加した後に撹拌する。試薬Ｒ２（メタンスルホン酸）（１５０μｌ）を添加することにより反応を開始させる。充分に混合し、ついで試験管に注意深く栓をする。４５℃にて平衡化した水浴中で反応混合物を４０分間インキュベートする。吸光度（Ａ）を５８６ｎｍにて測定する。（ｃ）各系列のアッセイにおいてコントロールの試料（［アルデヒド］＝０）を２つずつ用い、この平均吸光度（Ａ_o）を、アッセイすべき各試料の存在下で測定した吸光度（Ａ）からその後に差し引く。コメント：各溶液の添加の順序は逆にしてはならない。選択した作業温度（４５℃）は、反応が４０分でプラトーに達することを可能にする。５８６ｎｍにおける吸光度（Ａ−Ａ_o）の強度は、ＭＤＡおよび４−ヒドロキシアルケナールの濃度の一次関数である。それは少なくとも２時間安定である。３．検量：標準溶液Ｓ１およびＳ２により、それぞれＭＤＡおよび４−ヒドロキシノネナールに対する検量「範囲」を得ることが可能になる。使用前に、１００マイクロモルの濃度が得られるようにこれら溶液を試料と同し媒体で１／１００（ｖ／ｖ）に希釈する。試料の代わりに０〜２００μｌの１００マイクロモル標準溶液を用い、媒体で２００μｌ（全量）とした他は上記方法２と同様の操作を行う。この手順は、最終反応媒体（分光光度計セル）中で０〜２０マイクロモル濃度の間隔を包含する。最小二乗直線回帰は、吸光度の差異（Ａ−Ａ_o）がＭＤＡおよび４−ヒドロキシノネナール濃度の一次関数であることを示すに違いない。もしそうでない場合は、使用した試薬が不純であるかまたは分解していることを意味する。測定した生成物のみかけのモル吸光係数（Ｅ）は、直線回帰の直線の傾きに等しい。添付の図１は、１５％の濃度にてメタンスルホン酸（試薬Ｒ２）とともに４５ ℃にてインキュベートした間のテトラメトキシプロパン（ＴＭＰ）と１−メチル −２−フェニルインドール（ＭＰＩ）との付加物の生成の動力学を示す。図２および３は、検量曲線の例を示す。これらは、ＭＤＡおよび４−ヒドロキシノネナールで同じモル吸光係数（Ｅ）が得られることを示している。さらに詳しくは、図２は、以下の条件：１５％（ｖ／ｖ）の濃度のメタンスルホン酸、４５℃で４０分間インキュベート、で確立したテトラメトキシプロパン（酸性媒体中でＭＤＡに変換される）を用いて得られる検量曲線を示す；図３は、図２と同じ条件下で確立した、４−ヒドロキシノネナールジエチルアセタール（４−ヒドロキシノネナールに変換される）を用いて得られる検量曲線を示す。４．濃度の計算以下の等式が試料中のＭＤＡおよび４−ヒドロキシ−２−エンアルデヒドのモル濃度を与える。［ＭＤＡ＋４−ヒドロキシ−２−エンアルデヒド］＝（Ａ−Ａ_o）×５／Ｅコメント：この濃度はまた、使用した検量曲線の縦軸にＡ−Ａ_oをプロットすることによっても得られる。５．感度、正確さおよび再現性感度：検出閾値は、最終反応媒体中の０．５マイクロモルのエンアルデヒド濃度未満である。実際には、この濃度はアッセイの下限と考えることができる。それゆえ、２００μｌの試料容量に対しては、ＭＤＡおよび／または４−ヒドロキシアルケナールのアッセイ下限は２．５マイクロモルの濃度に対応する。正確さ：０〜２０マイクロモル間隔内の４つの標準濃度（＋８℃にて貯蔵したアセタールの１０ミリモル標準母液から使用時に調製した希釈液）に対して同じ臼に６回の測定を行った場合、計算した変動係数はすべて５％未満である。再現性＋８℃で貯蔵した同じ標準母液を用いて上記実験を１０日の間隔をあけて繰り返した場合、２つの系列の測定値から計算した新たな変動係数はなお５％未満のままである。６．可能な妨害リチウムまたはナトリウムヘパリネートは、５８６ｎｍにおける吸光度強度に人為処理増大をもたらす。４５℃でインキュベートする間に、最大吸収波長が５０５ｎｍに等しい化合物の生成による強度の変動するピンク色の発色を生じる。５０５ｎｍにおける吸収は、一般に５８６ｎｍにおける発色団の吸収を妨害しない。コメント：試料をとりわけ以下の媒体で希釈する：Ｈ₂Ｏ；２０ミリモルのトリス−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７．４）；５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）、０．１％ルブロール^Rの存在下または不在下。温度、緩衝液、ｐＨまたは回収容量などのアッセイパラメータのいかなる修飾も修飾をもたらす。生物学的試料でのアッセイの例（全エンアルデヒド）１．血漿０．１７モルのＥＤＴＡ三カリウム（４８μｌ）を入れた試験管に３ｍｌの血液試料を入れる。１７００×ｇおよび４℃にて１０分間遠心分離を行った後、血漿を赤血球ペレットから分離させる。アッセイはつぎの１時間以内に行わなければならず、血漿を０〜＋４℃に保持しておく。以下に示す条件下にて２００μｌの血漿に対してアッセイを行う。試薬Ｒ２の存在下で４５℃にて４０分間インキュベートした後、血漿を氷上で冷却し、２５００×ｇおよび４℃にて１０分間遠心分離にかけ、上澄み液の吸光度（Ａ）を５８６ｎｍにて測定する。血漿の代わりに水を用いることにより、コントロールの試験（［アルデヒド］＝０）を行うことができる。その平均値が値Ａ_oを与える。これら測定値を用い、上記で説明したようにしてＭＤＡとエンアルデヒドの合計濃度を決定する。２．組織ホモジネート例：ラット脳のホモジネートホモジネートの調製は、２０ミリモルのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中で１／１０（ｇ／ｍｌ）にて行う。全ホモジネートかまたは低速遠心分離上澄み液（１７００×ｇ）のいずれかに対してアッセイを行う。２００μｌの被験量で、血漿について記載したのと同様にしてアッセイを行う。非常に過酸化されたホモジネートに関しては、被験量を減少させ、上記緩衝液で２００μｌとする。ＭＤＡの特異的アッセイ上記手順においてメタンスルホン酸（試薬Ｒ２）の代わりに同容量の濃度３７％の塩酸を用いれば、反応プラトーは６０分の終了後に達成され、５８６ｎｍにおいてＭＤＡに特異的な測定が得られる。図４は、これら条件下で得られた検量曲線の一例を提供するものであり、これら条件下では４−ＨＮＥの反応性か実質的に無視できるものであることを示している。さらに詳しくは、図４は、一方でテトラメトキシプロパン（ＴＭＰ）とともに、他方で４−ヒドロキシノネナールジアセタール（ジエチルアセタール）［４− ＨＮＥ（ジアセタール）］とともに、１５％（ｖ／ｖ）の濃度のＨＣｌの存在下、４５℃にて６０分間インキュベートした後に得られた検量曲線を示す。上記手順を組み合わせることにより（２つの試験試料および２つの異なるアッセイ）、一方で上記エンアルデヒドの濃度を、他方でＭＤＡの濃度を検量することが可能になる。ＭＤＡから得られるみかけのモル吸光係数（Ｅ）は、上記２つの手順におけるものと同じである。文献１．エステルバウアー（ＥＳＴＥＲＢＡＵＥＲＨ.）およびチーセマン（ＣＥＥＥＳＥＭＡＮＫ.Ｈ.）、（１９９０）、アルテヒド脂質過酸化生成物：マロンアルデヒドおよび４−ヒドロキシノネナールの測定；Ｍeth.Ｅnzymol.、１８６、４０７〜４２１２．ドレイパー（ＤＲＡＰＥＲＨ.Ｈ.）およびハドレイ（ＨＡＤＬＥＹＭ. ）、（１９９０）、脂質過酸化の指標としてのマロンジアルデヒドの測定；Ｍet h.Ｅnzymol.、１８６、４２１〜４３１３．フランケル（ＦＲＡＮＫＥＬＥ.Ｎ.）およびネフ（ＮＥＦＦＷ.Ｅ.）（１９８３）、脂質過酸化生成物からのマロンアルデヒドの生成；Ｂiochim.Ｂiop hys.Ａcta、７５４、２６４〜２７０４．ヘッカー（ＨＥＣＫＥＲＭ.）ら、（１９８７）、ヒト血漿からの均一トロンボキサンシンセターゼの生成物、動力学および基質特異性：新規酵素アッセイの開発、Ａrch.Ｂiochem.Ｂiophys.、２５４、１２４５．ジャネロ（ＪＡＮＥＲＯＤ.Ｒ.）（１９９０）、脂質過酸化および過酸化組織損傷の診断指標としてのマロンジアルデヒドおよびチオバルビツール酸− 反応性；Ｆree 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ショーディエール、ジャンフランス国エフ―94100サン・モール・デ・フォセ、アブニュー・ガブリエル・ペリ49番テール (72)発明者ヤダン、ジャン−クロード・ヨントブフランス国エフ―75011パリ、リュ・デュ・フォーブール・サン・タントワーヌ 127番

Claims

【特許請求の範囲】１．媒体、とりわけ生物学的媒体中の脂質過酸化の指標としてのエンアルデヒドまたはマロンジアルデヒド単独の比色アッセイ法であって、（ａ）下記一般式（Ｉ）：（式中、ＡおよびＣは同じかまたは異なり、それそれＨ、を示し、ＡおよびＣは同時にＨを示すことはなく、Ｒ¹＝Ｈ；アルキル；アラルキル；アリール環上で置換されたアラルキル；アルキルスルホネート、Ｙ⁺；アルキルホスホネート、Ｙ⁺；またはアルキルカルボキシレート、Ｙ⁺；Ｒ²＝Ｈ；−ＯＲ⁴；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；Ｉ；−ＮＯ₂；−ＳＯ₃ ^-Ｙ⁺；−ＣＮ；− ＣＯＯＲ⁴；または−ＣＯＮＲ⁵Ｒ⁶；Ｒ³＝Ｈ；−ＯＲ⁴；−ＮＲ⁵Ｒ⁶；−ＳＲ⁴；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；Ｉ；−ＮＯ₂；− ＳＯ₃ ^-Ｙ⁺；−ＣＮ；−ＣＯＲ⁵；−ＣＯＯＲ⁴；または−ＣＯＮＲ⁵Ｒ⁶；Ｒ⁴＝Ｈ；アルキル；アラルキル；またはアリール環上で置換されたアラルキル；Ｒ⁵＝Ｈ；アルキル；アラルキル；またはアリール環上で置換されたアラルキル；Ｒ⁶＝Ｈ；アルキル；アラルキル；またはアリール環上で置換されたアラルキル；Ｙ⁺＝有機もしくは無機塩基のカチオン；Ｂ＝であることを理解すべきである；アルキルは１〜６Ｃを有する直鎖または分枝鎖基を示し；アリール環上で置換されたアラルキルは、該アリール環が１または２以上の基（同じかまたは異なっていてよく、（１〜６Ｃ）アルキル、（１〜６Ｃ）アルコキシ、ヒドロキシ、アミノおよびカルボキシルから選ばれる）で置換されていることを意味することを理解すべきである）で示される化合物および有機もしくは無機塩基または有機もしくは無機酸とのその任意の付加塩から選ばれる試薬を該媒体に加え；（ｂ）かくして添加した媒体を、強カルボン酸、強スルホン酸および過塩素酸よりなる群から選ばれた酸によるか、または塩酸、臭化水素酸または硫酸により酸性化し；（ｃ）かくして酸性化した媒体を、使用した酸の性質に応じて該媒体中に存在するすべてのエンアルデヒドまたはマロンジアルデヒド単独と該試薬との発色団付加生成物の生成による安定な発色を得るに充分な期間、２５〜６０℃の温度にてインキュベートし；（ｄ）使用した試薬の発色団付加生成物に特異的な吸収波長にて該発色した媒体の吸光度を測定し、該測定を、エンアルデヒド濃度の決定かまたはマロンジアルデヒド単独の濃度の決定に利用することを特徴とする方法。２．該酸性化を強カルボン酸、強スルホン酸または強過塩素酸を用いて行う、上記エンアルデヒドの比色アッセイのための請求項１に記載の方法。３．該酸性化を塩酸、臭化水素酸または硫酸を用いて行う、ＭＤＡ単独のアッセイのための請求項１に記載の方法。４．最終反応媒体が金属塩、好ましくは第二鉄イオンを含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法。５．場合に応じて前記エンアルデヒドまたはマロンジアルデヒド単独の濃度の決定を、所定濃度における吸光度Ａとアルデヒドを含有しないコントロールの吸光度Ａ₀との差異（これら吸光度は、前記エンアルデヒドと使用した一般式（Ｉ）の化合物との付加生成物に特徴的な最大吸収波長で読み取る）を既知のエンアルデヒド濃度の関数としてプロットすることにより、実施したアッセイと同じ反応条件下にて標準エンアルデヒド溶液によって確立した検量曲線を用いて行う、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。６．求めるエンアルデヒド濃度の決定を、試料の吸光度Ａの測定値およびアルデヒドを含有しないコントロールでの吸光度Ａ₀の測定値および検量直線の傾きに対応するモル吸光係数Ｅから［エンアルデヒド濃度］＝（Ａ−Ａ₀）×Ｋ／Ｅ（式中、エンアルデヒド濃度はモル・１^-1で表示される；ＡおよびＡ₀は１ｃｍの光路長で読み取り、ｃｍ^-1で表示される；Ｋは希釈係数である；Ｅは１．モル^-1．ｃｍ^-1で表示される）に基づいて行う、請求項５記載の方法。７．一般式（Ｉ）の化合物が１−メチル−２−フェニルインドールであり、該化合物はエンアルデヒドと５８６ｎｍに等しい最大吸収波長を有する安定な発色団を生成する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。８．請求項１に記載の一般式（Ｉ）の試薬を本質的に包含することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法を行うための必要物またはキット。９．トリフルオロ酢酸などの強有機酸、メタンスルホン酸もしくはトリフルオロメタンスルホン酸などの強スルホン酸、過塩素酸、硫酸、塩酸および臭化水素酸よりなる群から選ばれた少なくとも１の強酸をさらに包含する請求項８に記載の必要物またはキット。１０．参照または標準試料として、少なくとも１の脂質過酸化指標エンアルデヒドまたはそのようなエンアルデヒドの一つの酸不安定な前駆体を水性または有機溶液中で既知の濃度でさらに包含する、請求項８または９に記載の必要物またはキット。１１．一般式（Ｉ）：（式中、ＡおよびＣは同じかまたは異なり、それそれＨ、を示し、ただし、ＡおよびＣは同時にＨを示すことはなく、Ｒ¹＝Ｈ；アルキル；アラルキル；アリール環上で置換されたアラルキル；アルキルスルホネート、Ｙ⁺；アルキルホスホネート、Ｙ⁺；またはアルキルカルボキシレート、Ｙ⁺；Ｒ²＝Ｈ；−ＯＲ⁴；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；Ｉ；−ＮＯ₂；−ＳＯ₃ ^-Ｙ⁺；−ＣＮ；− ＣＯＯＲ⁴；または−ＣＯＮＲ⁵Ｒ⁶；Ｒ³＝Ｈ；−ＯＲ⁴；−ＮＲ⁵Ｒ⁶；−ＳＲ⁴；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；Ｉ；−ＮＯ₂；− ＳＯ₃ ^-Ｙ⁺；−ＣＮ；−ＣＯＲ⁵；−ＣＯＯＲ⁴；または−ＣＯＮＲ⁵Ｒ⁶；Ｒ⁴＝Ｈ；アルキル；アラルキル；またはアリール環上で置換されたアラルキル；Ｒ⁵＝Ｈ；アルキル；アラルキル；またはアリール環上で置換されたアラルキル；Ｒ⁶＝Ｈ；アルキル；アラルキル；またはアリール環上で置換されたアラルキル；Ｙ⁺＝有機もしくは無機塩基のカチオン；Ｂ＝ただし、アルキルは１〜６Ｃを有する直鎖または分枝鎖基を示し；アリール環上で置換されたアラルキルは、該アリール環が１または数個の基（同じかまたは異なっていてよく、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6アルコキシ、ヒドロキシル、アミノおよびカルボキシルから選ばれる）で置換されていることを意味する；ただし、ＡまたはＣがＨを示す場合は、他の置換基ＣまたはＡはを示し；Ｒ²およびＲ³はＨとは異なり；−ＯＲ⁴；ＡまたはＣがＨを示す場合は、他の置換基ＣまたはＡはを示し；Ｂはを示し、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³は同時にＨを示さない）で示される化合物。