JPH08322584A

JPH08322584A - フェニルアラニン産率改良の発酵方法

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Publication number: JPH08322584A
Application number: JP16273595A
Authority: JP
Inventors: Keiko Jo; 敬衡徐; Shunyo Yo; 春陽葉; Baimei O; 培銘王; Chii-Cherng Liao; 啓成廖
Original assignee: SHOKUHIN KOGYO HATSUTEN KENKYU; SHOKUHIN KOGYO HATSUTEN KENKYUSHO; Food Industry Research and Development Institute
Current assignee: SHOKUHIN KOGYO HATSUTEN KENKYU; SHOKUHIN KOGYO HATSUTEN KENKYUSHO; Food Industry Research and Development Institute
Priority date: 1995-05-26
Filing date: 1995-05-26
Publication date: 1996-12-10
Anticipated expiration: 2013-09-21
Also published as: JP2799690B2

Abstract

(57)【要約】【目的】フェニルアラニン産率改良の発酵方法。【構成】発酵過程中、適時、適度に酸素供給量をあげ
れば、酸素溶存値に影響することなく、同時にフェニル
アラニンの生産菌株に対するフィードバック抑制作用を
軽減し、それ故、大いに発酵の時間を短縮し、産率をあ
げることができた。且つ本発明は従来の生産過程の設計
の理念に反して行われたものである。また、本発明は短
棒状の桿菌を使ってフェニルアラニンを生産し、溶存酸
素注入法で、フェドバッチ式で生産した時、従来の大腸
桿菌を生産株としたような、低酸素状態での抑制作用を
起こす酢酸を産出することがない。また、本発明は原価
の低廉な糖蜜を基質として使用し、溶存酸素注入法の使
用に伴って、過量に添加した基質の生産菌により引き起
こす抑制作用を避けることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コリネバクテリーグル
タミック（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａ
ｍｉｃｕｍ）を用いてフェニルアラニン（Ｌ−ｐｈｅｎ
ｌａｌａｎｉｎｅ）の生産菌株のフェドバッチ（Ｆｅｄ
−Ｂａｔｃｈ）式発酵法を採った生産過程中に、適量及
び適時に溶存酸素の供給率を高めて、最終産物であるフ
ェニルアラニン（Ｌ−ｐｈｅｎｌａｌａｎｉｎｅ）の発
育菌株に対するフィードバック抑制作用を低減すること
をもって、発酵時間を短縮して産率をあげ、また、基質
の自動添加による溶存酸素注入法（ＤＯ−ｓｔａｔ）
を採用して、発酵液の低基質濃度と低酸素状態を制御
し、もってフェニルアラニンの生成状況を有利にすると
共に、高いフェニルアラニン産率を達成する方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】フェニルアラニン（Ｌ−ｐｈｅｎｌａｌ
ａｎｉｎｅ）は、人体に必要な一種のアミノ酸であると
同時に、人工甘味料のアスパルターセの合成原料でもあ
る。その主な工業生産方式には、酸素添加法と微生物に
よる発酵法がある。酸素添加法については、必要原料の
獲得が難しく、且つ原料の値段に変化が大きいために、
世界的には主に微生物発酵法を採用する傾向にある。ま
た、発酵過程においてはフェドバッチ（Ｆｅｄ−Ｂａｔ
ｃｈ）式方法が最も多く採用され、それはバッチ（Ｂａ
ｔｃｈ）式方法に較べて産率が遙に高く、連続式発酵方
法による高度の汚染発生の可能性も回避することができ
る。但し、フェドバッチ式発酵法でフェニルアラニンを
生産する場合、その産率はほとんどが最終産物であるフ
ェニルアラニンのフィードバック抑制作用に制限を受け
る。

【０００３】過去の研究文献には、抗フェニルアラニン
類似物、例えば、フルオルフェニルアラニン（ｐ−ｆｌ
ｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，又はｍ−ｆｌｕ
ｏｒｏｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）を利用して、抗フェ
ニルアラニンの高濃度産出菌株をより分ける、又は抗芳
香族アミン類似物、例えばアミノチロシン（３−ａｍｉ
ｎｏ−Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎ）とか、メチールトリプトフ
ァン（５−ｍｅｔｈｙｌｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）とを利
用して高濃度産出菌株をより分ける方法が記されている
が、より分けた変異株はフェニルアラニンに対する耐性
は高くなるが、フェニルアラニンの高濃度の下での生産
菌株に対する抑制作用の問題は未解決のままであった。

【０００４】また、従来には、フェニルアラニンを回収
して精製する研究もなされた。例えば、銅イオンを用い
て発酵液のフェニルアラニンと結合させ沈殿させ、樹脂
でフェニルアラニンを吸着する方法があるが、ただしそ
の分離、回収の条件は発酵段階で行うことは適当でなか
った。それゆえ、現在の技術では経済的に符合した生産
企画をもって有効に発酵進行中の高濃度に産出したフェ
ニルアラニンを分離するには至っていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述の諸問題に因ん
で、本発明の解決しようとする課題を以下に述べる。基
質添加の制御方法中、溶存酸素注入法（ＤＯ−ｓｔａｔ
ｅ）が最も経済的でかつ効率の高い自動添加法である。
先の研究で明らかであるように、この方法は有効に基質
の添加の時機を制御するばかりでなく、且つ発酵液を低
基質濃度に維持し、よって高基質濃度の添加により産出
菌に対する抑制作用を避けることができる。この方法は
同時に発酵液を低酸素状態に維持する特性を備えてい
る。先の研究にてこの溶存酸素注入法を利用し、大腸菌
を使ってフェニルアラニンの産出菌発酵の製造工程を行
ったが、大腸桿菌は低酸素状態の下では酢酸を大量に産
出してフェニルアラニンを生成を抑制する。それゆえ、
簡単な溶存酸素注入法を使用してフェニルアラニンの生
産に成功した実例がはない。

【０００６】また、文献でフェニルアラニンの製造過程
に関する紹介には限りがあり、取り分け、酸素の供給に
よってフェニルアラニンの生成に関しては共通の認識が
ある。すなわち、低酸素状態ではフェニルアラニンの生
成に有利であるため、この見識に基づいて、文献に示さ
れるような発酵過程を考案し、発酵の後半を比較的低酸
素状態又は固定下酸素供給量を維持してフェニルアラニ
ンの濃度をあげる方法を採ったが、高濃度に生成したフ
ェニルアラニンの発酵後半期に対する影響には注意が及
ばず、そのため、フェニルアラニンの濃度によるフィー
ドバック抑制の影響を受け、濃度をあげることはできな
かった。

【０００７】それ故、フェニルアラニンの生産量をあげ
るためにも、フェニルアラニンの生産菌に対するフィー
ドバック抑制作用を軽減するかまたは阻止する必要があ
り、併せて現在使用されている発酵生成過程を改良し、
発酵時間の短縮を図ることに本発明の課題がある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記の課題を達成するた
め本発明では、コリネバクテリーの変異株、コリネバク
テリーグルタミック（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＣＣＲＣ１８３３５を利用し
てフェニルアラニンの生産菌とした。先の研究にて酸素
の供給量のフェニルアラニン生成に及ぼす影響に対する
検討の際、フェニルアラニンの濃度を考慮に入れなかっ
たが、フェニルアラニン濃度が発酵過程にだんだん高く
なるにつれて生産菌が産出したフィードバック抑制がフ
ェニルアラニンの継続的生成に影響を及ぼす。従って本
発明では、先にバッチ式発酵法をかりて様々な酸素供給
量の様々なフェニルアラニンの濃度の下での影響につい
て実験を行った。

【０００９】実験は５リットル攪拌式の発酵槽で行っ
た。各実験毎に３リットルの培養基が含まれて、その組
成は次のとおりである。糖蜜１０％硫酸アンモニウム、燐酸二水素カリウム
０．１％、燐酸水素二カリウム０．１％、硫酸マグネ
シウム０．００３％且つ５種類の様々な最初の濃度を、それぞれが０％、
０．５％、１．５％、及び２．０％のフェニルアラニン
を採った。一つの組成毎に３種類の異なる酸素の供給量
で実験を行った。３種類の異なる酸素の供給量は、その
流量を１．０Ｌ／ｍｉｎ．に固定して、３種類の異なる
回転速度をそれぞれ４００ｒｐｍ，６００ｒｐｍ，及び
９００ｒｐｍにした。実験はすべて温度３０℃及びｐＨ
７．０の下で行われ、ｐＨは１１．１Ｎの水酸化ナトリ
ウムを使って調整した。消泡剤はシリコンＫＮ−７２を
使った。溶存酸素値はＩｎｇｏｌｄ銘柄の探査針で量っ
た。菌の接種量は５％で、活性化時間は１８〜１０時間
とした。

【００１０】発酵過程中に、平均４時間毎にサンプルを
とり、ＨＰＬＣを経てフェニルアラニンを分析し、ジニ
ト口サリチル酸（ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ
ａｃｉｄ）法で残糖濃度を測定し、透過度６６０ｎｍで
測定した混濁度で細菌濃度を調べ、４時間毎の発酵過程
中の成長速率（）を求めた。

【００１１】成長速率のフェニルアラニン濃度に対する
関係を（図には表示せず）に示した（図１参照）。図１
に示されたように、発酵液に比較的多い最初のフェニル
アラニンを含んでいる場合は、細菌の成長速率も比較的
大きい影響を受けている。そして異なった回転速度（異
なった酸素供給量）を比較してみて、同一の最初のフェ
ニルアラニン濃度の下で比較的高い酸素を供給した場合
は、生産菌の発育は比較的早いことを発見した。

【００１２】もし僅かに比較的高い最初のフェニルアラ
ニン濃度を含んだ、即ち１％以上の発酵実験結果を見た
場合、菌体の成長速率のフェニルアラニン濃度に対する
関係を図に示した（図２を参照）。図２から異なる酸素
の供給量の下でのフェニルアラニンの生産菌に対する抑
制作用を求めることができる。もし図２の傾き（Ｓｌｏ
ｐｅ）がそれのフィードバック抑制による影響の程度と
定義するならば、これにより９００ｒｐｍの酸素供給量
の下では傾きは−１．６、６００ｒｐｍでは−２．４、
４００ｒｐｍでは−２．８３となり、これにより、酸素
供給量が段々減少するに伴って、産物のフィードバック
抑制現象が増加していることが伺われる、即ち、酸素の
供給量を増せば、産物のフェニルアラニンの生産菌に対
するフィードバック抑制作用を軽減することができる。

【００１３】相異なる酸素の供給量の下で、産物の収穫
率がフェニルアラニンの高濃度の影響による関係を図３
に示した。図３から分かるように、高い酸素供給量（９
００ｒｐｍ）で得た収穫率はすべて比較的低い酸素供給
量（４００ｒｐｍ及び６００ｒｐｍ）よりも低く、且つ
高いフェニルアラニン濃度の下では、６００ｒｐｍの酸
素供給量の収穫率が最もよい。それゆえ、適度に酸素供
給量をあげることに伴って、産物のフェニルアラニンの
フィードバック抑制作用を軽減し、同時に産物の収穫率
を増す。本発明の更に一歩進んだ具体的な説明を、以下
の実施例で詳述する。

【００１４】

【作用】フェニルアラニン（Ｌ−ｐｈｅｎｌａｌａｎｉ
ｎｅ）の生産菌株にフェドバッチ式発酵法を採った発酵
過程中に、適量及び適時に溶存酸素の供給率をあげるこ
とにより、最終産物であるフェニルアラニンの発育菌体
に対するフィードバック抑制作用を軽減することがで
き、もって発酵時間を短縮して産率をあげることができ
る、また、基質の自動添加による溶存酸素注入法を採用
して、発酵液の低基質濃度と低酸素状態を制御し、もっ
てフェニルアラニンの生成状況を有利にする。

【００１５】

【実施例】

実施例１：菌種の活性化と保存コリネバクテリーグルタミック（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＣＣＲＣ１８３３
５を、完全培養基（Ｃｏｍｐｌｅｔｅｍｅｄｉｕｍ）
に培養する。培養基１リットルの組成は下記のとおりで
ある：ブドウ糖（Ｇｌｕｃｏｓｅ）１０グラム、塩化ナ
トリウム（ＮａＣｌ）２．５グラム、酵母抽出物（Ｙｅ
ａｓｔｅｘｔｒａｃｔ）１０グラム、ペプトン（Ｐｅ
ｐｔｏｎｅ）１０グラムを含み、培養液は、４℃のアイ
スボックスに１〜２週間保存できる、または１０％のグ
リセリン（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を含ませた培養液を、−
８０℃の冷凍庫に保存する。上記の培養液を多数瓶調製
して、毎月一瓶取り出して、完全培養基の平板で活性化
する。

【００１６】実施例２：５リットルの攪拌式発酵槽にて
発酵培養コリネバクテリーグルタミック（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＣＣＲＣ１８３３
５を液体完全培養基に培養し、３０℃にて２４時間振動
培養を行い、この種培養菌（ｓｅｅｄｃｕｌｔｕｒ）を
２．５％の割合で種培養基（ｓｅｅｄｍｅｄｉｕｍ）
を含んだ溝のある三角瓶に接種する、３０℃にて、１５
０ｒｐｍの振動器で１８〜２０時間振動培養する。この
種用培養基の組成は次の通りである：糖蜜３．５％（Ｗ
／Ｖ），硫酸アンモニウム０．３％，ソイプロテイン
（ｓｏｙｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ｈｙｄｒｏｌｙｉｓ
ｆｒｏｍｃｈｌｏｒｉｃａｓｉｄ）５％，燐酸水素二
カリウム０．１％，燐酸二水素カリウム０．０１％，硫
酸マグネシウム０．０３％，炭酸カルシウム２％等。ｐ
Ｈを７に調製する。培養後の種用培養菌を６．７％の割
合で、３リットルの発酵培養基を入れた５リットルの発
酵槽に接種する、３０〜５０℃で、１１．１Ｎの濃アン
モニア水（ＮＨＯＨ）を使ってｐＨを６．８〜７．５
の間に調製する、攪拌速率はそれぞれ４００，６００，
９００ｒｐｍで通気流量は、１．０Ｌ／ｍｉｎ．にてバ
ッチ（ｂａｔｃｈ）式発酵を行った。

【００１７】フェドバッチ式生産法種用培養菌を１４％の割合で、１．４リットルの発酵用
培養基を含む５リットルの発酵槽に接種し、攪拌速率６
００ｒｐｍ，通気流量は１．０Ｌ／ｍｉｎ．、温度とｐ
Ｈは上記のバッチ式発酵に同じく、接種後の第２日目に
培養基を追加した。・種用培養基の組成は、糖蜜３．５％，硫酸アンモニウ
ム０．３％，ソイプロテイン５％，硫酸マグネシウム
０．０３％，炭酸カルシウム２％，燐酸二水素カリウム
０．１％、ｐＨを７．０に調製した。・発酵用培養基の組成は、糖蜜７％，燐酸二水素カリウ
ム０．１％，硫酸アンモニウム０．３％，ｐＨを７．０
に調製した追加培養基の組成は、糖蜜５０％である。

【００１８】実施例３：溶存酸素注入法で発酵してフェ
ニルアラニンを生産する。溶存酸素注入法を利用する
際、基本的に次の幾つかの基本装置が使われる。溶存酸素電極と表示器コンピュータデータの取
得とディジタル制御器電気信号作動ポンプ

【００１９】フェドバッチ式で発酵が行われる際、バッ
チ式の段階では、発酵が固定した酸素供給の下（１Ｌ／
ｍｉｎ．）で２０−２６時間発酵し続けた発酵液の溶存
酸素値はゼロ付近に降下し、溶存酸素値がゼロ付近で維
持され発酵液内の発酵可用の糖が使い果たされる頃に、
溶存酸素注入値は急速に高くなり、この変化の信号がコ
ンピュータに捕らえられ、コンピュータからの信号をポ
ンプに送って原料の添加が行われる。平均の添加量は６
０−８０ｍｌ／ｍｉｎ．で、一旦原料が発酵液内に入れ
ば溶存酸素値はまた元のゼロ値付近に戻り、この操作は
反復されて発酵終了まで続く。

【００２０】実施例４：酸素の供給率をあげてフェドバ
ッチ式でフェニルアラニンを生産酸素供給率をあげることによって、フェニルアラニンの
生産菌に対するフィードバック抑制作用を軽減し、発酵
時間を短縮できる。本実施例は、実施例３と比較するた
め、同じような操作状況で行われた。ただ、発酵が２
１．１時間に攪拌速率を６００ｒｐｍから９００ｒｐｍ
にあげ、発酵４４時間後に通気流量を１．０Ｌ／ｍｉ
ｎ．から２．０Ｌ／ｍｉｎ．にあげたフェニルアラニン
の産率を図５に示した。

【００２１】２０グラム／リットルのフェニルアラニン
濃度に到達するための発酵の所要時間は、固定した酸素
供給量では７７時間を経過して始めて到達することがで
きるが、もし酸素供給量を増加した状態の下では、僅か
に５４時間の発酵時間で到達することができ、発酵時間
は２３時間近く短縮できた。もし産物の収穫率を計算す
るならば、収穫率は９．１％にも達し、約７％増したこ
とになる。

【００２２】

【発明の効果】酸素供給率をあげることによって、フェ
ニルアラニンの生産菌に対するフィードバック抑制作用
を軽減し、発酵時間を短縮できる。２０ｇｒａｍ／Ｌの
フェニルアラニン濃度に到達する発酵の所要時間は、固
定した酸素供給量では７７時間を要するが、もし酸素供
給量を増加した状態の下では、僅かに５４時間の発酵時
間で到達することができ、発酵時間は２３時間近く短縮
できた。もし産物の収穫率を計算するならば、収穫率は
９．１％にも達し、約７％増したことになる。

【図面の簡単な説明】

【図１】相異なる最初のフェニルアラニン濃度が相異な
る酸素供給量の下でコリネバクテリーグルタミックの成
長速率に及ぼす影響を示す図である。

【図２】相異なる酸素供給率が高フェニルアラニン濃度
の下でのコリネバクテリーグルタミックの成長に伴って
産出した、相異なる程度の産物フィードバック抑制に対
する影響を示す図である。

【図３】相異なる最初のフェニルアラニン濃度の相異な
る酸素供給量の下での産物収穫率に対する影響を示す図
である。

【図４】溶存酸素注入法を使って固定した酸素供給量の
下での典型的なフェドバッチ式発酵法でのフェニルアラ
ニン生産時間の曲線を示す図である。

【図５】溶存酸素注入法を使って酸素供給量を増加した
状態でフェドバッチ式発酵法でのフェニルアラニン生産
時間の曲線を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】コリネ属バクテリー（Ｃｏｒｙｎｅｆｏ
ｒｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いてフェドバッチ（Ｆ
ｅｄ−Ｂａｔｃｈ）式発酵法により、フェニルアラニン
（Ｌ−ｐｈｅｎｌａｌａｎｉｎｅ）を生産すると共に、
溶存酸素注入法により、発酵液中に原料を添加する時機
を制御することを特徴とする、フェニルアラニン産率改
良の発酵方法。
【請求項２】前記バクテリーはコリネバクテリーグル
タミック（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔ
ａｍｉｃｕｍ）であることを特徴とする、請求項１に記
載のフェニルアラニン産率改良の発酵方法。
【請求項３】前記の原料は糖蜜を含むことを特徴とす
る、請求項１に記載のフェニルアラニン産率改良の発酵
方法。
【請求項４】前記の発酵培養液の液中のｐＨは６．０
−７．５の範囲であることを特徴とする、請求項１に記
載のフェニルアラニン産率改良の発酵方法。
【請求項５】前記の発酵工程は、温度２５℃〜３５℃
の範囲で行われることを特徴とする、請求項１に記載の
フェニルアラニン産率改良の発酵方法。
【請求項６】前記の発酵培養液に酸素を供給すること
を特徴とする、請求項１に記載のフェニルアラニン産率
改良の発酵方法。
【請求項７】発酵によるフェニルアラニンの生産過程
中、フェニルアラニンの濃度が高くなった場合には、酸
素の供給率をあげて最終産物であるフェニルアラニンの
生産菌株に対するフィードバック抑制現象を低減し、も
って発酵時間の短縮と産率の増加を図ることを特徴とす
る、フェニルアラニン産率改良の発酵方法。
【請求項８】前記の発酵生産過程は、フェドバッチ方
式を利用して原料を発酵液中に注入することを特徴とす
る、請求項７に記載のフェニルアラニン産率改良の発酵
方法。
【請求項９】前記の発酵生産過程は、溶存酸素注入法
を利用して原料を培養液中に添加する時機を制御するこ
とを特徴とする、請求項８に記載のフェニルアラニン産
率改良の発酵方法。
【請求項１０】前記の発酵液中に添加する原料は、糖
蜜を含むことを特徴とする、請求項８に記載のフェニル
アラニン産率改良の発酵方法。
【請求項１１】前記の発酵に使用する菌株は、コリネ
属のバクテリーを含むことを特徴とする請求項７に記載
のフェニルアラニン産率改良の発酵方法。
【請求項１２】前記の発酵に使用する菌株は、コリネ
バクテリーグルタミック（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であることを特徴とす
る、請求項１１に記載のフェニルアラニン産率改良の発
酵方法。
【請求項１３】前記の発酵培養液中のｐＨは６．０−
７．５の範囲であることを特徴とする請求項１２に記載
のフェニルアラニン産率改良の発酵方法。
【請求項１４】前記の発酵培養液中の温度は、温度２
５℃〜３５℃であることを特徴とする、請求項１２に記
載のフェニルアラニン産率改良の発酵方法。