JPH08242892A - α−アミラーゼ活性測定法および測定試薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】β−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質として
用いるα−アミラーゼ活性測定方法において、血清や尿
などの体液中のβ−ガラクトシダーゼの作用により基質
が分解することを抑制し、アミラーゼ活性を精度よく簡
単な操作で測定する方法および試薬組成物を提供する。 【構成】下記一般式（Ｉ） 【化１】 （式中、ｎは０〜４の整数を示す。）で表されるβ−ガ
ラクトシルマルトオリゴ糖およびβ−Ｄ−チオガラクト
シル類、キレート剤、アミン類、ガラクトスタチンまた
は１ｍＭ以上のカルシウムイオンなどのβ−ガラクトシ
ダーゼ阻害剤を含む試薬に、試料中のα−アミラーゼを
作用させ、遊離するグルコースを測定することを特徴と
するα−アミラーゼ活性測定方法および測定用試薬組成
物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はβ−ガラクトシルマルト
オリゴ糖を基質として用いるα−アミラーゼ活性測定方
法および測定試薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、膵液や尿などの体液に含有さ
れるα−アミラーゼの活性を測定することにより、各種
疾患に診断が行われている。α−アミラーゼの活性測定
法には、(1)Viscosimetric法、(2)Turbidimetric法、
(3)Iosometric 法、(4)Saccharogenic法、(5)Chromogen
ic法、(6)Enzymatic法、(7)Radioimmunoassay 法などが
あり、現在、これらの多くの方法が日常検査室で用いら
れている。その中で、多くの施設で実施されていた Chr
omogenic法では、さらに近年の検査室の自動化の進行や
酵素活性測定法の標準化の進行により、基質の構造や生
成物等が明確でないデンプン、デキストリン、アミロー
ス、色素結合デンプンなどの基質を用いた測定法から、
α−アミラーゼ活性のより理論的解析の容易な各種マル
トオリゴ糖誘導体を用いる方法が開発され、各施設で用
いられている。このように多くの測定法が用いられるこ
とにより、多種多様なアミラーゼ活性値の表現法が用い
られてきた。そして、さらに新しい方法の開発により種
々の活性値表現法が導入され、臨床現場において混乱を
招いている（生物試料分析、Vol.17, No.2, 25〜44, 19
84) 。

【０００３】このような問題を解消すべく、各施設間の
アミラーゼ活性値表現法を統一する手段として、（イ）
標準物質を用い、値づけする方法および（ロ）標準法の
設定がある。しかし、これまで（イ）により施設間の測
定値が収束し、改善されることが確認されているもの
の、（ロ）が実施されていないため、標準物質自体の値
づけができない状態である。その標準法の設定は年々学
会などで盛り上がりを増しており、現在いくつかの標準
法の候補が上がりつつある。

【０００４】その有力な方法として、基質としてマルト
ペンタオースを用いるマルトペンタオース法がある。こ
の方法には、マルトペンタオースが天然に存在するもの
であり、α−アミラーゼの作用様式をより純粋に反映
し、感度、定量性とも良好であるという利点がある。こ
の方法では、α−アミラーゼ含有試料にマルトペンタオ
ースとα−グルコシダーゼとを作用させて、基質からグ
ルコースを遊離させ、グルコースの量を測定することに
より、α−アミラーゼの活性値を知ることができる。生
成したグルコースは、例えばグルコースオキシダーゼ／
パーオキシダーゼ／色素系を利用する定量法；グルコキ
ナーゼまたはヘキソキナーゼ／グルコース−６−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ系
を利用する定量法などにより測定される。

【０００５】α−グルコシダーゼはマルトペンタオース
などの四糖以上のオリゴ糖に作用しにくく、マルトース
やマルトトリオースなどの三糖以下のオリゴ糖に良好に
作用するため、上記基質を使用してグルコースを測定す
ることにより、α−アミラーゼの活性を測定することが
できる。しかし、α−グルコシダーゼはわずかではある
が基質であるマルトペンタオースに作用するため、測定
のブランクが上昇し、その結果、測定値の誤差が大きく
なるという欠点がある。そのため、α−グルコシダーゼ
と基質と一液化することにより、試薬としての安定性が
損なわれるという問題点が挙げられる。さらに、この測
定系では内因性のマルトースなどの影響を受けるため、
その除去に充分なα−グルコシダーゼが必要である。し
かし試薬の安定性の観点から、充分量のα−グルコシダ
ーゼが添加できず、結果としてマルトースの影響を受け
るという問題点も挙げられる。

【０００６】この問題を解決する手段として、マルトオ
リゴ糖の非還元末端のグルコシル残基の４位の水酸基に
β−１，４結合でガラクトシル基が結合した新規なオリ
ゴ糖を提供する方法（特開平4-279596号公報）がある。
この方法により得られた新規なβ−ガラクトシルマルト
オリゴ糖をα−アミラーゼの基質として用いることによ
り、追随酵素との一液化条件において、α−グルコシダ
ーゼなどの追随酵素の作用を受けず、内因性のマルトー
スなどの消去に十分なα−グルコシダーゼが添加できる
ため、α−アミラーゼ活性を精度よく簡単な操作で測定
することができることが予想される。

【０００７】しかしながら、測定対象となる血清および
尿中にはβ−ガラクトシダーゼが存在する可能性を有す
る。具体的には、例えば、尿中には数ユニット（ＩＵ）
存在することが知られている（東京化学同人発行、生化
学データブック、第1606頁、1979年発行）。したがっ
て、血清および尿中にβ−ガラクトシダーゼが存在する
と、β−ガラクトシルマルトオリゴ糖（特開平4-279596
号公報) の非還元末端グルコースに修飾された基質のガ
ラクトシル基のβ結合が加水分解され、ガラクトースと
マルトオリゴ糖を生じる問題点がある。生じたマルトオ
リゴ糖は追随酵素であるα−グルコシダーゼの作用を受
けることになり、測定のブランクを上昇させ、その結
果、測定値の誤差が大きくなる。このことは非還元性末
端グルコースをブロックし、上記追随酵素の作用から基
質の分解を阻止するという本来の効果が消失することに
なる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記したα−
アミラーゼ活性測定試薬の欠点を解決しようとするもの
であり、その目的とするところは、β−ガラクトシルマ
ルトオリゴ糖を基質として用いるα−アミラーゼ活性測
定方法において、血清や尿などの体液中のβ−ガラクト
シダーゼの作用により基質が分解することを抑制し、ア
ミラーゼ活性を精度よく簡単な操作で測定する方法およ
び試薬組成物を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、下記
一般式（Ｉ）

【化６】 （式中、ｎは０〜４の整数を示す。）で表されるβ−ガ
ラクトシルマルトオリゴ糖およびβ−ガラクトシダーゼ
阻害剤を含む試薬に、試料中のα−アミラーゼを作用さ
せ、遊離するグルコースを測定することを特徴とするα
−アミラーゼ活性測定方法である。

【００１０】また本発明は、下記一般式（Ｉ）

【化７】 （式中、ｎは０〜４の整数を示す。）で表されるβ−ガ
ラクトシルマルトオリゴ糖およびβ−ガラクトシダーゼ
阻害剤を含有することを特徴とするα−アミラーゼ活性
測定試薬組成物である。

【００１１】本発明にて使用するα−アミラーゼ測定基
質は、上記一般式（Ｉ）（式中、ｎは０〜４の整数を示
す。）で表されるβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖であ
る。本発明のβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖（Ｉ）の
骨格となるマルトオリゴ糖は、２〜６個の糖〔式（Ｉ）
のｎ＝０〜４に相当〕から形成される。マルトオリゴ糖
としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテト
ラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースが
ある。特にマルトテトラオースが好適である。マルトオ
リゴ糖の非還元性末端グルコースの修飾基であるガラク
トースは、非還元性末端グルコースの４位の水酸基にβ
型で結合している。具体的な化合物としては、４−Ｏ−
β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトース、４−Ｏ−β−
Ｄ−ガラクトピラノシルマルトトリオース、４−Ｏ−β
−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトテトラオース、４−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトペンタオースなど
がある。

【００１２】このようなβ−ガラクトシルマルトオリゴ
糖の製造法としては、マルトオリゴ糖とラクトースの混
合液にβ−ガタクトシダーゼを作用させる方法（特開平
4-279596号公報) などがある。

【００１３】本発明にて使用するβ−ガラクトシダーゼ
阻害剤としては、例えばβ−Ｄ−チオガラクトシル誘導
体、キレート剤、アミン類、ガラクトスタチンまたは１
ｍＭ以上のカルシウムイオンが挙げられる。β−チオガ
ラクトシド誘導体としては、例えばイソプロピルチオガ
ラクトシドなどがある。またキレート剤としては、ＥＤ
ＴＡ−２Ｎａ、ＥＤＴＡ−３Ｎａなどがある。さらにア
ミン類としては、例えばエタノールアミン、メルカプチ
ルアミンなどがある。カルシウムイオンの供給源として
は、塩化カルシウム、酢酸カルシウムなどがある。これ
らは単独または複数の組み合わせで用いることができ
る。

【００１４】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬組
成物は、上記β−ガラクトシルマルトオリゴ糖（Ｉ）を
基質として含有するものであり、通常、さらにα−グル
コシダーゼおよび／またはグルコアミラーゼを含有し、
生成したグルコースを測定する。グルコースを測定する
方法としては、例えばグルコースオキシダーゼ／パーオ
キシダーゼ／色素系を利用する定量法、またはグルコキ
ナーゼまたはヘキソキナーゼ／グルコース−６−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ系
を利用する定量法などによる酵素系（追随酵素系）があ
る。

【００１５】本発明に用いられるα−グルコシダーゼの
起源は、特に限定されない。動物、植物、微生物などか
ら得られるα−グルコシダーゼが利用され得る。特に、
酵母起源、バチルス・ステアロサーモフィラス起源が好
適に使用され得る。

【００１６】本発明に用いられるグルコアミラーゼの起
源も特に限定されない。例えば、リゾブスデレマー(Rhi
z.delemar)から得られるグルコアミラーゼが好適に使用
され得る。

【００１７】本発明用いられるグルコキナーゼの起源も
特に限定されない。例えば、動物、微生物などから得ら
れるグルコキナーゼが利用され得る。特に、酵母起源、
ザイモモナス・モビリス起源、バチルス・ステアロサー
モフィラス起源が好適に使用され得る。

【００１８】本発明用いられるグルコース−６−ホスフ
ェイトデヒドロゲナーゼの起源も特に限定されない。例
えば、動物、植物、微生物などから得られるグルコース
−６−ホスフェイトデヒドロゲナーゼが利用され得る。
特に、ザイモモナス・モビリス起源、バチルス・ステア
ロサーモフィラス起源が好適に使用され得る。

【００１９】本発明のカルシウムイオンを除く各々の試
薬濃度は特に限定されない。好ましくは、β−ガラクト
シルマルトオリゴ糖１〜５０ｍＭ、カルシウムイオンを
のぞくβ−ガラクトシダーゼ阻害剤０．０１ｍＭ〜２０
０ｍＭ、カルシウムイオン１〜２００ｍＭ、α−グルコ
シダーゼ１〜５００ｕ／ｍｌ、グルコアミラーゼ０．０
１〜１００ｕ／ｍｌ、グルコキナーゼ０．０１〜２０ｕ
／ｍｌ、グルコース−６−ホスフェイトデヒドロゲナー
ゼ０．０１〜２０ｕ／ｍｌ、アデノシン−５−トリホス
フェート０．１〜２０ｍＭ、ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド(NADH)およびニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドホスフェイト(NADPH) ０．１〜２０ｍＭが含
有されれる。本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬組
成物は、必要に応じて、さらにその他の添加剤、例えば
界面活性剤、塩化ナトリウムなどの塩類、蛋白結合防止
剤、防腐剤などを含有するものである。

【００２０】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬組
成物の形状は、凍結乾燥物、非凍結乾燥物のいずれでも
良く、限定されない。

【００２１】本発明の一実施態様は、上記一般式（Ｉ）
で表されるβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖およびβ−
ガラクトシダーゼ阻害剤、α−グルコシダーゼおよび／
またはグルコアミラーゼを含有するα−アミラーゼ活性
測定試薬組成物である。

【００２２】さらに具体的な本発明のα−アミラーゼ活
性測定試薬組成物としては、上記一般式（Ｉ）で表され
るβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、（ｂ）β−ガラク
トシダーゼ阻害剤、（ｃ）α−グルコシダーゼおよび／
またはグルコアミラーゼ、（ｄ）グルコキナーゼ、
（ｅ）グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、（ｆ）アデノシン−５−トリホスフェート、（ｇ）
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドホスフェイトを含有する
ものが例示される。

【００２３】本発明の別な実施態様は、上記一般式
（Ｉ）で表されるβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、α
−グルコシダーゼおよび／またはグルコアミラーゼおよ
びβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む試薬に、試料中の
α−アミラーゼを作用させ、生成するグルコースを測定
してα−アミラーゼ活性を求めるα−アミラーゼ活性測
定方法である。

【００２４】本発明のグルコースの測定系は特に限定さ
れない。例えばグルコースオキシダーゼ／パーオキシダ
ーゼ／色素系を利用する定量法、またはグルコキナーゼ
またはヘキソキナーゼ／グルコース−６−ホスフェート
デヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ系を利用
する定量法などによる酵素系（追随酵素系）などが利用
され得る。特にグルコキナーゼ／グルコース−６−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ
系を利用する定量法が好適に利用され得る。

【００２５】本発明における基質分解の反応式を４−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトテトラオースを例
にあげて説明する。 (1)４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトテトラ
オースを基質とし、生成したグルコースをグルコキナー
ゼ／グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ／
ＮＡＤＨ系で測定する場合

【００２６】 （１） ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトテトラオース ↓α−アミラーゼ ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトース ＋ マルトース （２） α−グルコシダーゼおよび／または グルコアミラーゼ マルトース → グルコース （３） グルコキナーゼ グルコース＋ＡＴＰ → グルコース−６−リン酸＋ＡＤＰ （４） グルコース-6- ホスフェートデヒドロゲナーゼ グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤ → グルコノラクトン−６−リン酸 ＋ ＮＡＤＨ

【００２７】ＡＴＰ：アデノシン−５−トリホスフェー
ト ＡＤＰ：アデノシン−５−ジホスフェート ＮＡＤ：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド ＮＡＤＨ：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド

【００２８】上記反応にて生成されるＮＡＤＨの上昇を
光学的に追跡することにより、α−アミラーゼ活性を求
めることができる。グルコースの測定方法としては、α
−アミラーゼの反応を連続的に追跡するレート法および
一定時間反応させた後、反応を止めて測定するエンドポ
イント法のいずれもが使用されうる。

【００２９】本発明方法における酵素反応時には、グル
コアミラーゼはα−グルコシダーゼとほぼ同等の働きを
有する。ただし、α−グルコシダーゼがマルトトリオー
ス以下の低分子グリコシドにはよく作用するが、マルト
テトラオース以上のグルコシドには作用しにくいのに対
して、グルコアミラーゼはマルトテトラオース以上のグ
ルコシドにも作用する。例えば基質としてマルトペンタ
オース以上の高分子グルコシドを用いると、α−アミラ
ーゼの作用によりマルトテトラオース以上のグルコシド
が生成することがある。このようなマルトテトラオース
以上のグルコシドは、α−グルコシダーゼでは分解され
にくいが、グルコアミラーゼを用いるとグルコース単位
まで容易に分解される。そのためレート法においてはα
−アミラーゼ活性を直接反映するまでの遅延時間の短
縮、エンドポイント法においては感度が上昇するという
利点があるので、α−グルコシダーゼおよびグルコアミ
ラーゼを共存させて用いる追随酵素系は好適に利用され
る。

【００３０】本発明において、体液中のβ−ガラクトシ
ダーゼ活性は以下の方法により測定する。Ｏ−ニトロフ
ェニル−β−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を基質と
して、β−ガラクトシダーゼの作用より生成するＯ−ニ
トロフェノールの生成量を４１０ｎｍの吸光度の変化で
測定する。１分間に１マイクロモルのＯ−ニトロフェノ
ールを生成する酵素量を１ユニット（ＩＵ）とする。

【００３１】β−ガラクトシダーゼの活性測定方法 １．試薬 ０．１Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ７．３ （３７℃） ３．３６Ｍ メルカプトエタノール溶液 ３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 溶液 ０．３４ｍＭ ＯＮＰＧ溶液（Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラ クトピラノシド）

【００３２】２．操作方法 下記反応混液をキュベットに調製し、３７℃で約５分間
予備加温する。 ２．５ｍｌ ０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．３ ０．１ｍｌ メルカプトエタノール溶液 ０．１ｍｌ ＭｇＣｌ₂ 溶液 ０．１ｍｌ ＯＮＰＧ溶液

【００３３】酵素液を０．１ｍｌ添加し、速やかに混和
後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で４１０
ｎｍの吸光度変化を２〜３分間記録し、その初期直線部
分から、１分間あたりの吸光度変化量を求める（△ＯＤ
ｔｅｓｔ）。盲検は、酵素液の代わりに、酵素希釈液
（１．０ｍＭのＭｇＣｌ₂ を含む５０ｍＭリン酸緩衝液
ｐＨ７．３）を０．１ｍｌを加え、上記同様に操作を行
って１分間あたりの吸光度変化を求める（△ＯＤｂｌａ
ｎｋ）。

【００３４】３．計算式

【数１】

【００３５】３．５：Ｏ−ニトロフェノールの上記測定
条件下でのミリモル分子吸光係数（ｃｍ²/マイクロモ
ル） １．０：光路長（ｃｍ）

【００３６】

【発明の効果】本発明では、β−ガラクトシルマルトオ
リゴ糖を基質として用いるα−アミラーゼ活性測定方法
において、βーガラクトシダーゼ阻害剤により、血清や
尿などの体液中のβ−ガラクトシダーゼの作用による基
質分解を抑制するため、アミラーゼ活性を精度よく簡単
な操作で測定することができる。

【００３７】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。実施例１ 各種β−ガラクトシダーゼ阻害剤の検討 本発明のβ−ガラクトシダーゼ阻害剤（後記表１に記
載）を含む、β−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質と
して用いた、下記組成Ｃからなるα−アミラーゼ活性測
定試薬をそれぞれ調製した。なお、比較例としてマルト
ペンタオースを基質として用いた試薬、およびβ−ガラ
クトシダーゼ阻害剤を含まない、β−ガラクトシルマル
トオリゴ糖を基質として用いた試薬、それぞれ下記組成
Ａ、Ｂを調製した。

【００３８】 試薬組成Ａ（対照例）： ５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ７．０） α−グルコシダーゼ １８０ｕ／ｍｌ グルコキナーゼ ２ｕ／ｍｌ グルコース−６−ホスフ ェートデヒドロゲナーゼ ２ｕ／ｍｌ ＣａＣｌ₂ ０．５ｍＭ ＮａＣｌ ２０ｍＭ 酢酸マグネシウム ５ｍＭ β−ニコチンアミドアデ ニンジヌクレオチド（ＮＡＤ） １．２ｍＭ アデノシン−５−トリホスフェート（ＡＴＰ） １．２ｍＭ マルトペンタオース １０ｍＭ

【００３９】 試薬組成Ｂ（比較例）： ５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ７．０） α−グルコシダーゼ １８０ｕ／ｍｌ グルコキナーゼ ２ｕ／ｍｌ グルコース−６−ホスフ ェートデヒドロゲナーゼ ２ｕ／ｍｌ ＣａＣｌ₂ ０．５ｍＭ ＮａＣｌ ２０ｍＭ 酢酸マグネシウム ５ｍＭ β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ） １．２ｍＭ アデノシン−５−トリホスフェート（ＡＴＰ） １．２ｍＭ ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトテトラオース １０ｍＭ

【００４０】 試薬組成Ｃ（本発明）： ５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ７．０） α−グルコシダーゼ １８０ｕ／ｍｌ グルコキナーゼ ２ｕ／ｍｌ グルコース−６−ホスフ ェートデヒドロゲナーゼ ２ｕ／ｍｌ ＣａＣｌ₂ ０．５ｍＭ ＮａＣｌ ２０ｍＭ 酢酸マグネシウム ５ｍＭ β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ） １．２ｍＭ アデノシン−５−トリホスフェート（ＡＴＰ） １．２ｍＭ ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトテトラオース １０ｍＭ β−ガラクトシダーゼ阻害剤（表１参照）

【００４１】

【表１】

【００４２】試薬組成Ａ、Ｂ、Ｃ（表１）に示された各
試薬３．５ｍｌに試薬ブランク用生理食塩水、市販管理
血清に血清：大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ（２５０
ＩＵ／ｍｌ）＝９：１で混合したサンプル１、その対照
としてβ−ガラクトシダーゼの代わりに生理食塩水を添
加したサンプル２をそれぞれ０．０５ｍｌ添加し、３７
℃にて３分間放置したのち、３４０ｎｍにおける吸光度
の変化を測定した。測定結果は、非還元性末端グルコー
スがガラクトースで修飾されていないマルトオリゴ糖誘
導体基質を用いたα−アミラーゼ測定法である、体外診
断用医薬品ダイヤカラー・ＡＭＹネオレート（東洋紡績
社製）で値づけされたヒューミラーゼコントロールで補
正し、α−アミラーゼ活性（ＩＵ／ｌ）を算出した。さ
らにその結果を表２に示した。

【００４３】

【表２】

【００４４】表２から明らかな如く、本発明の試薬組成
Ｃはβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を添加することによ
り、サンプル１、２の測定値に差はなく、また試薬組成
Ａ（対照例）とも測定値に差がなかった。一方、試薬組
成Ｂ（比較例）はβガラクトシダーゼの影響によりサン
プル１の測定値が上昇している。このことから本発明が
β−ガラクトシダーゼの影響を回避し、正確にα−アミ
ラーゼを測定することができることがわかる。

【００４５】実施例２ カルシウムイオンの検討 下記試薬組成Ｄに、β−ガラクトシダーゼ阻害剤とし
て、ＣａＣｌ₂を終濃度で０、０．５、０．８、１、
５、１０ｍＭで添加し、α−アミラーゼの活性測定法に
対するβ−ガラクトシダーゼの影響度を測定した。サン
プルとして人由来α−アミラーゼ（１００ｕ／ｍｌ）：
サンプル１、大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ（２５ｕ
／ｍｌ）：サンプル２を用いた。操作は、各試薬組成
３．５ｍｌにサンプル０．０５ｍｌを添加し、３７℃に
おいて３分間放置したのち、３４０ｎｍにおける吸光度
の変化を測定した。測定結果は、１分間あたりの吸光度
変化量からα−アミラーゼの活性測定法に対するカルシ
ウム濃度およびβ−ガラクトシダーゼの影響（△ＯＤ／
ｍｉｎ）を測定した。その結果を表３に示す。

【００４６】 試薬組成Ｄ： ５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ７．０） α−グルコシダーゼ １８０ｕ／ｍｌ グルコキナーゼ ２ｕ／ｍｌ グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ ２ｕ／ｍｌ ＮａＣｌ ２０ｍＭ 酢酸マグネシウム ５ｍＭ β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ） １．２ｍＭ アデノシン−５−トリホスフェート（ＡＴＰ） １．２ｍＭ ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトテトラオース １０ｍＭ ＣａＣｌ₂ ０、０．５、０．８、１、５、１０ｍＭ

【００４７】

【表３】 表３から明らかな如く、カルシウムイオンの添加濃度を
高くするのに従い、サンプル１（α−アミラーゼ）では
ＣａＣｌ₂ ０．８ｍＭ以上あれば、測定値は変わらない
が、サンプル２（β−ガラクトシダーゼ）ではＣａＣｌ
₂ １ｍＭ以上で測定値が低くなる。このことから、カル
シウムイオン１ｍＭ以上でβ−ガラクトシダーゼの影響
を回避する効果があることがわかる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/34 6807−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/34 1/48 6807−4Ｂ 1/48 Ｚ (72)発明者 菊地 俊郎 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（Ｉ） 【化１】 （式中、ｎは０〜４の整数を示す。）で表されるβ−ガ
   ラクトシルマルトオリゴ糖およびβ−ガラクトシダーゼ
   阻害剤を含む試薬に、試料中のα−アミラーゼを作用さ
   せ、遊離するグルコースを測定することを特徴とするα
   −アミラーゼ活性測定方法。
2. 【請求項２】 一般式（Ｉ） 【化２】 （式中、ｎは０〜４の整数を示す。）で表されるβ−ガ
   ラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよび
   ／またはグルコアミラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ
   阻害剤を含む試薬に、試料中のα−アミラーゼを作用さ
   せ、生成するグルコースを測定して、α−アミラーゼ活
   性を求める請求項１記載のα−アミラーゼ活性測定方
   法。
3. 【請求項３】 生成したグルコースの測定を、グルコー
   スオキシダーゼ／パーオキシダーゼ／色素系またはグル
   コキナーゼまたはヘキソキナーゼ／グルコース−６−ホ
   スフェートデヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ
   Ｈ系で行う請求項１項記載のα−アミラーゼ活性測定方
   法。
4. 【請求項４】 β−ガラクトシダーゼ阻害剤が、β−Ｄ
   −チオガラクトシル類、キレート剤、アミン類、ガラク
   トスタチンまたは１ｍＭ以上のカルシウムイオンである
   請求項１項記載のα−アミラーゼ活性測定法。
5. 【請求項５】 一般式（Ｉ） 【化３】 （式中、ｎは０〜４の整数を示す。）で表されるβ−ガ
   ラクトシルマルトオリゴ糖およびβ−ガラクトシダーゼ
   阻害剤を含有することを特徴とするα−アミラーゼ活性
   測定試薬組成物。
6. 【請求項６】 一般式（Ｉ） 【化４】 （式中、ｎは０〜４の整数を示す。）で表されるβ−ガ
   ラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよび
   ／またはグルコアミラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ
   阻害剤を含有する請求項５記載のα−アミラーゼ活性測
   定試薬組成物。
7. 【請求項７】（ａ）下記一般式（Ｉ） 【化５】 （式中ｎは０〜４の整数を示す。）で表されるβ−ガラ
   クトシルマルトオリゴ糖、（ｂ）β−ガラクトシダーゼ
   阻害剤、（ｃ）α−グルコシダーゼおよび／またはグル
   コアミラーゼ、（ｄ）グルコキナーゼ、（ｅ）グルコー
   ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、（ｆ）アデノ
   シン−５−トリホスフェート、（ｇ）ニコチンアミドア
   デニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）またはニコチンアミ
   ドアデニンジヌクレオチドホスフェイト（ＮＡＤＰＨ）
   を含有する請求項５記載のα−アミラーゼ活性測定試薬
   組成物。
8. 【請求項８】 β−ガラクトシダーゼ阻害剤が、β−Ｄ
   −チオガラクトシル類、キレート剤、アミン類、ガラク
   トスタチンまたは１ｍＭ以上のカルシウムイオンである
   請求項５項記載のα−アミラーゼ活性測定試薬組成物。