JPH08220090A - 体液中の白血球の濃度を比色法により測定するための改良法 - Google Patents

体液中の白血球の濃度を比色法により測定するための改良法

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JPH08220090A JP7295289A JP29528995A JPH08220090A JP H08220090 A JPH08220090 A JP H08220090A JP 7295289 A JP7295289 A JP 7295289A JP 29528995 A JP29528995 A JP 29528995A JP H08220090 A JPH08220090 A JP H08220090A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 試料中の、白血球、エステラーゼ及びプロテ
アーゼから選択される分析対象物を測定する際に、バッ
クグラウンドのジアゾニウムカップリング及び色の変化
を最小に抑えることのできる組成物、それを用いる試験
具及び試験方法を提供する。 【解決手段】 分析対象物の存在を測定するための組成
物であって、ジアゾニウム塩、及び、白血球、エステラ
ーゼ又はプロテアーゼの存在下で加水分解されうるエス
テル、及びアルカリ土類金属の塩を含むことを特徴とす
る組成物、それを用いる試験具及び試験方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生物学的液体中の
白血球の存在を比色法により測定するための方法に関す
る。更に詳しくは、本発明は、エステラーゼ又はプロテ
アーゼの存在下で色の変化を受けるように処方された試
薬組成物中での、アルカリ土類金属の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】患者の尿又は他の体液中の異常に高いレ
ベルの白血球の存在は、恐らく腎臓又は尿生殖路の感染
症或は他の機能不全のような病的状態の示標である。従
って、正確な尿中白血球に関する情報は、このような病
気の診断及び治療をする医師にとって非常に重要なもの
である。
【０００３】伝統的に、医師は、尿沈渣又は遠心分離し
ていない尿中の白血球を数えるという目視による測定方
法であって、遠心分離機及び顕微鏡のような高価な装置
と、臨床医の側の過度の時間を必要とする方法に頼って
きた。更に、この伝統的な方法は、損われていない細胞
のみを検出するという不利な点を有する。泌尿器系中の
白血球は、大量の細胞溶解に都合のよい状態を受けやす
い。例えば、ｐＨが異常に高い尿中では、白血球の半減
期は６０分間という短さになる。溶解した細胞は、目視
による検査法では検出されないため、誤って低い測定値
及び偽陽性という結果が出る。
【０００４】更に最近になって、医師は、完全な細胞自
体を数えるよりもむしろ白血球に含有される加水分解酵
素を測定することに頼っている。白血球に含有されてい
る加水分解酵素のエステラーゼ及びプロテアーゼの測定
により、白血球の存在を比色法により測定する方法は、
エステラーゼ又はプロテアーゼにより加水分解されると
着色アルコール性物質を生成する色原性エステルを含む
組成物を利用する。これらの組成物の多くは、促進化合
物及びジアゾニウム塩カップリング剤をも含む。
【０００５】従って、先行技術には、酵素活性により開
裂すると着色した物質又は他の検出可能な物質の形成を
もたらす、ある種のエステルの使用を開示している一群
の参照文献が存在する。英国特許第1,128,371 号（'37
1）は、体液中の加水分解酵素の検出に有用な色原体と
してインドキシル及びチオインドキシルエステルの使用
を開示している。この酵素は、このエステルを開裂して
遊離のインドキシルを生成させ、続いてこれが酸化され
て、容易に観察可能な青色染料である、二量体生成物の
インディゴを形成する。数ある酵素の中で、このような
活性は、コリンエステラーゼによるものであると言われ
ている。上記特許'371はまた、エステル基質のインドキ
シル部分に加えて酸基（acid radical）を選択すること
も検出すべき酵素に特に言及して教示している。例え
ば、酸基は、エステラーゼ又はリパーゼの検出のため
に、各々酢酸エステル、ラウリン酸エステル又はステア
リン酸エステルであってよいと記載されている。ホスフ
ァターゼ又はスルファターゼのような酵素を検出するた
めには、アシル基は無機の基であってよい。即ち'371
は、エステル分解酵素を測定する際の基質として色原性
エステル（このようなエステルは、エステルのアルコー
ル残基としてインドシキル又はチオインドキシルよりな
り、アシル残基は測定すべき特定の酵素に対応して調製
されている）の使用を教示している。
【０００６】注意深いアシル基の選択の効果は、アシル
基がＮ保護アミノ酸又はペプチドよりなるエステルのエ
ステラーゼ特異性を証明する２つの文献において非常に
明白に例示されている。Janoffらの Proc. Soc. Exper.
Biol. Med. 136: 1045-1049(1971)は、アラニンエステ
ルがヒト白血球から得られたエステラーゼに対して特異
的な基質であることを教示している。具体的には、Jano
ffは、ヒト顆粒白血球の抽出物がＮ−アセチル−Ｌ−ア
ラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニンメチルエステルを
加水分解できることを教示している。更に、Ｌ−アラニ
ン−ｐ−ニトロフェニルエステルが、同様に加水分解さ
れて、黄色のｐ−ニトロフェノール着色型を生成した。
【０００７】同様に、Sweetmanらの Jour. Hist. Soc.,
22:327-339 は、エステラーゼの存在を証明するため
の、１−ナフチル−Ｎ−アセチル−ＤＬ−アラニン、１
−ナフチル−Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニ
ル−Ｌ−アラニン及び１−ナフチルブチラートの使用を
教示している。
【０００８】ベーリンガー・マンハイム社（Boehringer
Mannheim GmbH）に譲渡された米国特許第4,278,763 号
は、これらの知見を組合せて、白血球エステラーゼ活性
に対する従来の色原性基質の更に別の例として、アミノ
酸又はペプチドのインドキシル又はチオインドキシルエ
ステルに到達している。Janoff及びSweetmanのように、
ベーリンガーの特許は、そのエステル分解傾向における
プロテアーゼとエステラーゼの等価性を教示している。
【０００９】エステル加水分解反応は、無数のアルコー
ルを含む多くの求核試薬の存在により活性化されうるこ
とが知られている。例えば、酢酸フェニルと酢酸ｐ−ニ
トロフェニルのエステラーゼによる加水分解の速度は、
メタノール又はブタノールの添加により２．５〜５．５
倍に上昇する(GreenzaidとJencks, Biochemistry, 10
(7), 1210-1222(1971)) 。加えて、この作用は、ｎ−ア
ルキル基の長さに伴い増大する(WynneとShalatin, Eur.
J. Biochem., 31:554-560(1972)) 。
【００１０】特に、このアルコールの活性化作用は、ア
ミノ酸のエステルに関して観察されてきた。ｐ−ニトロ
フェニル−Ｎ−アセチル−Ｌアラニンの加水分解は、メ
タノールの存在により活性化（加速）される(Fastrezと
Fersht, Biochemistry, 12(11), 2025-2034(1973))。高
分子量アルコールは、ｐ−ニトロフェニル−ｔ−ＢＯＣ
−Ｌ−チロシンのエステラーゼ誘導性の加水分解速度を
上昇させる(Ashe とZimmerman, Biochem. and Biophys.
Res. Comm., 75(1), 194-199(1977))。米国特許第4,29
9,917 号は、ある種の金属錯体、ピリジン誘導体及びイ
ミダゾールのような公知の他のエステル加水分解活性化
剤を記載している。
【００１１】フェノール及び偽フェノールとカップリン
グしてアゾ染料を生成する、ある種のジアゾニウム塩の
使用も当該分野で公知である(Martinet とDornier, Com
pt.Rend., 170, 592(1920))。インドキシルエステルが
エステラーゼにより加水分解されてインドキシルを生成
し、次にこれがジアゾニウム塩とカップリングして対応
するアゾ染料を形成するこのような方法は、エステラー
ゼの分析に使用されている(Holt とHicks, J. Cell Bio
l. 29, 261-366(1966); Gossrau, Histochemistry, 57,
323-342(1978); 西ドイツ特許公開第30 17 721 号
（１９８０年５月９日出願）) 。
【００１２】白血球、エステラーゼ、又はプロテアーゼ
を検出するための組成物中のカップリング剤として使用
するための公知のジアゾニウム塩は、ジアゾ陽イオンに
対する外来の陰イオンに依存する。更に、これまで検討
された処方は、各々、ジアゾニウム塩と反応性の、試料
中に存在するフェノール性又は他の化合物の存在により
干渉又は不正確さを少なくともある程度まではこうむ
る。このような干渉が、偽陰性の測定結果をもたらすこ
とになる。
【００１３】Skjold（米国特許第4,637,979 号）は、色
原体エステル、ジアゾニウム塩カップリング剤の使用
と、反応促進剤を、使用の簡便なディップ−アンド−リ
ード（dip-and-read）試験組成物及び試験具に組み合わ
せた。白血球、エステラーゼ、又はプロテアーゼの存在
下で、このエステルは加水分解されて、酸とフェノール
になる。次にこのフェノールが自由にジアゾニウムとカ
ップリングして色の変化をもたらす。
【００１４】しかし、Skjoldの組成物と試験具は、酵素
が媒介する加水分解及び、それに続くジアゾニウムと放
出されたフェノールとのカップリングに最も適した塩基
性ｐＨでは、常に正確な結果を提供するとは限らなかっ
た。具体的には、反応混合物の塩基性が上昇するにつれ
て加水分解とジアゾニウムカップリングが増大する一方
で、混合物中の他の成分とのジアゾニウムのバックグラ
ウンド反応性も上昇するため、高いｐＨでは色変化の結
果は不正確であった。そして約８．８〜９．０のｐＨで
は、しばしば酵素の非存在下で色変化が起こった。これ
らのバックグラウンドの色変化は、水酸化物イオンによ
るジアゾニウム塩への求核攻撃が増大することによっ
て、反応混合物のｐＨの上昇とともに起こることが示唆
されている。酵素媒介加水分解とジアゾカップリングを
充分に促進するｐＨで使用され、同時にこのような酵素
の非存在下でのジアゾニウムの安定性を促進する、白血
球、エステラーゼ又はプロテアーゼ検出用試薬組成物に
対するニーズが明かに存在する。更に、製造工程でジア
ゾニウム塩が安定に保たれる試薬組成物に対するニーズ
も存在する。
【００１５】ジアゾニウム化合物は、医学及び工業にお
いて種々に応用される。従って、求核攻撃及び他の型の
分解に対してこのような化合物を安定化するための種々
の試みがなされてきた。安定化の試みは、有機塩基、界
面活性剤、有機ホウ酸塩、抗酸化剤、酸安定化剤、及び
塩化亜鉛のような化合物の使用を含んでいた。しかし、
これらの試みのどれも白血球検出のために処方された試
薬組成物中のジアゾニウム塩を安定化するために企画さ
れたものではなかった。更に、どれもこのような組成物
中で有効ではなかった。塩化亜鉛は、エステラーゼ及び
プロテアーゼ酵素の反応性を低下させるため、有効では
ない。ジアゾニウムの反応性と酵素活性を促進するため
に酵素検出組成物が塩基性である必要があるため、酸安
定化剤は有効でない。界面活性剤、抗酸化剤、及び有機
ホウ酸塩は、試験されたが、ジアゾニウムの安定化には
ほとんど効果がなかった。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】先行技術に前述の制限
があるため、求核攻撃に対してジアゾニウムを安定化
し、同時に酵素の存在下で効率的なジアゾカップリング
を促進するために組成物を８．８〜９．０の間のｐＨに
する方法への明白なニーズがある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明は、白血球細胞中
に含有されるエステラーゼ及びプロテアーゼのような加
水分解酵素の存在を検出することにより、体液試料中の
白血球を測定するための、新規な組成物、試験具、及び
方法を提供する。本発明の組成物は、酵素により加水分
解されると、ジアゾニウム塩とカップリングして検出可
能な色変化を起こし得る物質を生成するエステルを含
む。この組成物は、更にアルカリ土類金属の塩を含む。
この金属塩がジアゾニウムを安定化し、それによりバッ
クグラウンドの反応性を低下させる。これにより、酵素
の存在下でのジアゾニウムの反応性を促進する、より塩
基性の組成物ｐＨを可能にする。
【００１８】本発明は、また、白血球、エステラーゼ又
はプロテアーゼの存在を測定するための試験具を提供す
る。該試験具は、該組成物を含浸した担体マトリックス
よりなる。この担体マトリックスは、濾紙、ガラス、フ
ェルト又は木のような適切な物質から作られてよい。
【００１９】本発明は更に、白血球細胞、体液中のエス
テラーゼ又はプロテアーゼを測定するための方法を提供
する。この方法は、試料を、試薬組成物又は組成物を組
み込んだ試験具と接触させて、次に色変化のような検出
可能な応答を観察し測定することよりなる。
【００２０】
【発明の実施の形態】本発明は、試料中の白血球、エス
テラーゼ又はプロテアーゼの存在を測定するための組成
物を提供する。更に具体的には、本発明は、バックグラ
ウンドの反応を低下させながら分析対象物の充分な検出
を可能にする組成物を提供する。この組成物は、エステ
ル、ジアゾニウム塩、及びアルカリ土類金属塩を含む。
これらの成分は自由に選択できるが、最良の結果、即
ち、短時間に高度の検出可能な応答の発現を得る、各々
に好適な実施態様がある。この最適化は、該組成物に促
進物質を含有することにより、更に促進することができ
る。「検出可能な応答」という表現は、本明細書では、
直接の観察又は装置により認識可能であって、そして水
性試料中の特異的な分析対象物の存在の関数である、試
験手段系内の変化又はパラメータの発生を意味する。好
適な検出可能な応答は、色、蛍光、反射率、化学発光及
び赤外スペクトルの変化又は出現である。
【００２１】この組成物は、芳香族又は擬似芳香族フェ
ノールと酸とのエステルを含有する。更に、このエステ
ルは、白血球、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在下
で触媒反応により加水分解されて、フェノール又は偽フ
ェノールを生成し、次に、これらがジアゾ双性イオンと
自由にカップリングすることができるようなものであ
る。
【００２２】本発明の使用に適した幾つかのエステル
は、インドキシルアセタート、インドキシルブチラー
ト、インドキシルラウリアート、インドキシルステアラ
ート、並びにＮ−保護アミノ酸又はペプチドのインドキ
シルエステル及びこれらに対応するチオインドキシルエ
ステルを含む。ｐ−ニトロフェノール−Ｎ−トシル−Ｌ
−アラニン及びα−ナフチルアラニンも含まれる。好適
なエステルは、乳酸エステルである。この乳酸エステル
は、白血球エステラーゼにより加水分解されてヒドロキ
シピロール化合物を生成し、次にこれがジアゾニウム塩
と相互作用して、アゾ染料を形成する。本発明の乳酸エ
ステルは、エステラーゼにより容易に加水分解されて、
約６０〜約１２０秒以内に測定可能な色の遷移又は他の
検出可能な応答を発生する。
【００２３】エステラーゼを検出することができ、従っ
て白血球細胞を検出することのできる、本発明の好適な
組成物は、一般構造式（Ｉ）：
【００２４】
【化４】
【００２５】〔式中、Ａは、アルコール保護基であり；
そしてＢは、この構造式（Ｉ）の乳酸エステルが加水分
解されて化合物Ｂ−ＯＨを生成する時に、検出可能な応
答、好適には色原体応答を与えることのできる部分であ
る〕を有する乳酸エステルよりなる。この乳酸エステル
は、Ｄ体、Ｌ体、又は、Ｄ体とＬ体のラセミ混合物であ
ってよい。Ｌ体が好ましい。
【００２６】構造式（Ｉ）の化合物のＢ−Ｏ−部は、化
合物Ｂ−ＯＨの残基として定義される。従ってＢ−Ｏ−
部のＢは、例えば、置換又は非置換のピロール、チオフ
ェン又はフランであってよい。残基Ｂ−Ｏ−を有する他
の化合物の例は、アゾレソルシノールエステル、フェノ
キシエステル（酸化性カップラーとの）、ロイコインド
フェノールエステル、アゾ染料エステル、５−（４−ヒ
ドロキシ−３，５−ジメトキシフェニルメチレン）−２
−チオキソチアゾリン−３−酢酸、WO 90/00618 及びEP
399 490（両者とも本明細書に参照により組み込んだ）
に開示されている２−置換−６−ヒドロキシ−ベンゾチ
アゾール誘導体、ω−ニトロスチリルエステル、レソル
フィンエステル、アクリジノン、メロシアニン、８−ヒ
ドロキシ−２Ｈ−ジベンズ−（ｂ，ｆ）アゼピン−２−
オン、ジベンゾアゼピノン、ジベンゾチアゼピノン、ク
マリンエステル、又は本明細書に参照により組み込まれ
たEP 254 051に開示された化学発光性化合物が含まれる
が、これらに限定されない。
【００２７】好適な乳酸エステルは、一般構造式（I
I）：
【００２８】
【化５】
【００２９】（式中、Ａは、アルコール保護基であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ2 であり；Ｒは、アリール又は低
級アルキルであり；Ｒ1 は、水素又は低級アルキルであ
り；そしてＲ2 は、水素、低級アルキル又はアリールで
ある）を有する。この一般構造式（II）の乳酸エステル
は、酵素白血球エステラーゼにより加水分解されて、ヒ
ドロキシピロールのようなヒドロキシ化合物を生成す
る。
【００３０】乳酸エステル（II）は、約０．５〜約２mM
（ミリモル）、好適には約０．８〜約１．５mMの濃度で
試薬組成物中に存在する。この濃度範囲の中で、痕跡量
の白血球細胞を検出するのに充分な色遷移又は他の検出
可能な応答を与えるのに充分な量の乳酸エステルが試薬
組成物中に存在する。
【００３１】本明細書中で使用される「低級アルキル」
という用語は、１〜約６個の炭素原子を含有するアルキ
ル残基をいう。低級アルキル基の例は、メチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、sec −
ブチル、tert−ブチル及びペンチルとヘキシルの全ての
異性体を含むが、これらに限定されない。この低級アル
キル基は、非置換であってもよく、或はこの低級アルキ
ル基は、置換基が白血球細胞、エステラーゼ又はプロテ
アーゼを検出する組成物又は試験具の能力を妨害しない
のであれば置換されていてもよい。アルキル基の置換基
の例は、１〜６個の炭素原子を有するアルコキシ、ハ
ロ、ニトロ、アリール、及びアミノがあるが、これらに
限定されない。
【００３２】アルコール保護基自体、即ち一般構造式
（Ｉ）の乳酸エステルのＡは、特に限定されず、そして
アルコール残基を保護するために典型的に使用される、
本質的にはどのような保護基からでも選択することがで
きる。
【００３３】このアルコール保護基Ａは、典型的にはス
ルホン酸塩化物又はカルボン酸塩化物（即ち、アシルク
ロリド）の残基であり、構造式（III ）又は（IV）：
【００３４】
【化６】
【００３５】（式中、Ｒ3 は、３〜約２２個の炭素原
子、好適には３〜約６個の炭素原子を有するアルキル基
であるか、又はＲ3 は、アリール基である）を有する。
Ｒ3 がアルキル基である時、このアルキル基は官能基化
されたもの（例えば、メトキシ−スクシニル）であって
もよい。
【００３６】本明細書で使用される、Ｒ、Ｒ2 及びＲ3
に関する「アリール」という用語は、どのような芳香族
環系をも意味する。「アリール」という用語の例は、ピ
ロリル、フェニル及びピリジルのような５員及び６員芳
香族環系、並びにナフチルのような縮合芳香族環系を含
むが、これらに限定されない。この芳香族環系は、複素
環又は炭素環であってよく、白血球細胞、エステラーゼ
又はプロテアーゼの存在下で色原体乳酸エステルが加水
分解する能力を、置換基が妨害しないのであれば、置換
していても或は非置換であってもよい。置換基の例は、
アルキル、ハロ、アシル、アリール、ヒドロキシ、アル
コキシ、スルフリル及びアミノがあるが、これらに限定
されない。このアリール基は、好適には、非置換のフェ
ニル基であるか、或は、ハロ基又は１〜約１０個の炭素
原子を有する、アルキル若しくはアルコキシ基のような
比較的非反応性の基で置換されているフェニル基であ
る。
【００３７】アルコール保護基の例は、塩化ｐ−トルエ
ンスルホニル（塩化トシル又はＴｓＣｌ）、塩化ｎ−プ
ロピルスルホニル（ｎ−ＰｒＳＯ2 Ｃｌ）、塩化ベンゾ
イル（ＰｈＣＯＣｌ）、塩化カルボメトキシエタンスル
ホニル及び塩化チオフェンスルホニルの残基があるが、
これらに限定されない。多くの他の特異的アルコール保
護基が、当該分野の当業者には公知であり、本発明の乳
酸エステルのＡ成分として使用することができる。例え
ば、多くのアルコール保護基は、本明細書に参照により
組み込まれるT.W. Greene らの Protecting Groups in
Organic Chemistry, 2d Ed., (1991) に開示されてい
る。
【００３８】好適なアルコール保護基Ａは、構造式（II
I ）を有し、スルホニル残基を含む。本発明を充分有効
に利用するために、この構造式（III ）のアルコール保
護基は、Ｒ3 としてフェニル基を有し、このフェニル基
はメチル又はメトキシ残基で置換されている。
【００３９】本発明の好適な乳酸エステルは、Ｘが、Ｎ
Ｒ2 であり；Ｒが、フェニルであり；そしてＲ1 が、水
素である、構造式（Ｉ）の乳酸エステルのＬ体である、
構造式（Ｖ）：
【００４０】
【化７】
【００４１】を有する色原体化合物である。Ａ及びＲ2
は、前記と同義である。更に好適な実施態様において、
この色原体乳酸エステルは、上記（Ｖ）式中、Ｒ2 が、
水素であり、そしてＡが、ｐ−トルエンスルホニル（即
ち、Ｔｓ）である、構造式（VI）：
【００４２】
【化８】
【００４３】の化合物、即ち、Ｘが、ＮＨであり；Ａ
が、Ｔｓであり；Ｒが、フェニルであり；そしてＲ1
が、Ｈである、構造式（II）の乳酸エステルのＬ体であ
る。
【００４４】好適な乳酸エステルの合成方法は、米国特
許出願第293,723 号（１９９４年８月２２日出願、イン
ディアナ州のマイルズ社（Miles Inc ）に譲渡された）
に詳細に記載されている。
【００４５】本発明の組成物は、エステルに加えて、種
々の促進物質を含むことができる。「促進物質」という
表現は、本明細書に記載された色原体エステルの加水分
解の速度を増大させる任意の化合物をいう。ピリジン、
イミダゾール及びこれらの誘導体；ある種の金属錯体；
及びアルコールのような化学的に多様な物質が含まれ
る。適切なアルコールは、１〜約１５個の炭素原子を有
する。分岐鎖アルコールよりも直鎖状アルコールが好適
であるが、分岐鎖も本発明の範囲に含まれる。８〜１５
個の炭素原子を有するアルコールは、エステラーゼ及び
プロテアーゼで触媒される本明細書で検討されるエステ
ルの加水分解を増大させるのに特に有用である。デカノ
ール、ウンデカノール及びドデカノールが、低分子量の
アルコールに比べて揮発性が低いため、本発明での使用
に特別に好適である。
【００４６】本組成物は、また、カップリング剤として
ジアゾニウム塩を含む。このジアゾニウム塩カップリン
グ剤は、一般構造式：ＡｒＮ+ ≡Ｎ（式中、Ａｒはアリ
ール基である）を有する。更に詳しくは、このジアゾニ
ウム塩は、典型的には一般構造式（VII ）：
【００４７】
【化９】
【００４８】〔式中、Ｒ4 は、個々に、水素、低級アル
キル若しくはアリールであるか、又は、２つの隣り合っ
たＲ4 基が、一緒になって縮合環系を形成するが但し、
Ｒ4 の１つは、−Ｎ+ ≡Ｎである；Ｙは、Ｎ又はＣＲ5
（ここで、Ｒ5 は、水素又は低級アルキルである）であ
り；そしてＤ- は、塩化物イオン、臭化物イオン、又
は、ジアゾニウム残基の対イオンとして好適な他の陰イ
オンである〕を有する芳香族ジアゾニウム塩である。別
の好適なジアゾニウム塩は、式（VIII）：
【００４９】
【化１０】
【００５０】〔式中、Ｆは、水素、低級アルキル又はヒ
ドロキシであり；Ｄは、共有結合した陰イオンであり；
Ｇは、個々に、水素、低級アルキル又はアリールである
か、或は、両方のＧ基は、一緒に縮合環系を形成する〕
で示される構造を有する。
【００５１】本明細書で使用される「縮合環系」という
用語は、１対の炭素原子を共有する２つ以上の芳香族環
を意味する。
【００５２】双性イオンのジアゾニウム塩は、好適なカ
ップリング剤である。この双性イオンのジアゾニウム化
合物は、ジアゾニウム残基の対イオン（即ち、陰イオ
ン）が、環系に共有結合しているジアゾニウム塩の一種
である。このような陰イオンの例は、スルホナート（Ｓ
Ｏ3 ）、カルボナート（ＣＯ2 ）及びホスホナート（Ｐ
Ｏ3 ）のイオンがあるが、これらに限定されない。
【００５３】種々のジアゾニウム塩が、本明細書に参照
により組み込まれるSkjoldらの米国特許第4,637,979
号；Hughらの米国特許第4,806,423 号；及びHuglらの4,
814,271 号に開示されている。本発明の組成物及び方法
に有用なジアゾニウム塩の具体的な例は、１−ジアゾ−
２−ナフトール−４−スルホナート及び１−ジアゾフェ
ニル−３−カルボナートであるが、これらに限定されな
い。ジアゾニウム塩の他の例は、４−ジアゾ−３−ヒド
ロキシ−１−ナフチルスルホナート（ＤＮＳＡ）、４−
ジアゾ−３−ヒドロキシ−７−ニトロ−１−ナフチルス
ルホナート（ＮＤＮＳＡ）、４−ジアゾ−３−ヒドロキ
シ−１，７−ナフチルジスルホナート、塩２−メトキシ
−４−（Ｎ−モルホリニル）ベンゼンジアゾニウムクロ
リド、４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−７−ブロモ−１−
ナフチルスルホナート及び４−ジアゾ−３−ヒドロキシ
−７−〔１−オキソプロピル〕−１−ナフチルスルホナ
ートがあるが、これらに限定されない。
【００５４】本組成物のエステルが、白血球、エステラ
ーゼ又はプロテアーゼにより加水分解されるとヒドロキ
シピロールが遊離し、ジアゾニウム塩と相互作用して鮮
やかなアゾ染料及び色変化を形成することができる。
【００５５】本発明の組成物は、また、アルカリ土類金
属の塩を含有する。好適なアルカリ土類金属は、マグネ
シウム、カルシウム、及びバリウムなどである。好適な
塩は硫酸マグネシウムであるが、全てのアルカリ土類金
属は同様に作用することが期待される。このアルカリ土
類金属は、試薬組成物の製造及び保存中の求核試薬の攻
撃に対してジアゾニウムを安定化し、また体液の試験中
にジアゾニウムのバックグラウンド反応性を低下させ
る。この金属塩は、両方の場合のバックグラウンドの色
変化を低下させる。バックグラウンドの色変化とは、酵
素の非存在下で起こるものである。このような色変化
は、反応混合物の成分によるジアゾニウム塩への求核攻
撃、及び製造工程での他の外因により引き起こされるも
のと推測されている。
【００５６】第１表は、ＭｇＳＯ4 が、バックグラウン
ドの色変化に対して試薬組成物を安定化したことをより
詳しく証明している。
【００５７】第１表の第４欄のデータは、前述の通り処
方された１番目の浸漬溶液にＭｇＳＯ4 を添加した時、
白血球、エステラーゼ又はプロテアーゼの非存在下での
色変化（バックグラウンド）が少なかったことを示して
いる。ＭｇＳＯ4 は、反応混合物中の過剰のＯＨ- と金
属水酸化物を形成し易い。これらの金属水酸化物は、水
酸化ナトリウムより求核性が低く、従ってジアゾニウム
に対して反応性が低い。
【００５８】
【表１】
【００５９】第１表の４欄の数値は、CLINITEK（登録商
標）-200尿化学分析機（Urine Chemistry Analyzer）
（製造元：マイルズ社（Miles Inc.）、インディアナ
州）により測定された組成物のパーセント反射率を表
す。この組成物でコートした試薬ストリップのパーセン
ト反射率は、波長５７０ナノメートルで測定し、６９０
ナノメートルの標準で測定した反射率で割り、１０００
倍して求めた。パーセント反射率は、色変化と逆比例し
ているため、パーセント反射率の数値が小さいほど色変
化が大きく、従って酵素の非存在下での偽陽性が大き
い。
【００６０】第１表の第５欄のデータは、金属塩が保存
中の試薬組成物を安定化したことを証明している。白血
球、エステラーゼ及びプロテアーゼの検出は、保存中に
ジアゾニウム塩の分解が少ないほど増強される。具体的
には、第５欄の数値は、４２白血球細胞/ml の試験溶液
の存在下での組成物の反応性を示している。表に見られ
るように、保存１週間後には、ＭｇＳＯ4 が試薬混合物
中に存在した時、白血球の存在下での色変化が大きかっ
た。ここで、パーセント反射率を測定したため、数値が
小さいほど白血球の存在下での色変化が大きいことを再
び言及したい。
【００６１】第２表は、６０℃で４週間の保存模擬実験
後のＭｇＳＯ4 によるジアゾニウムの安定化の効果を示
す。
【００６２】
【表２】
【００６３】４２細胞/ml の試験溶液の存在下で、Ｍｇ
ＳＯ4 を含有する試薬組成物は、対照溶液に比べて大き
な色変化を示した。この色変化は、酵素加水分解とジア
ゾニウムカップリングに最適なｐＨであるｐＨ８．９５
で最も著しかった。
【００６４】保存の間ジアゾニウムを安定化することに
加えて、アルカリ土類金属イオンはまた乾燥機（drying
oven ）中で生成した湿気を吸収し易い。湿気は、水分
子とジアゾニウム塩との反応によるバックグラウンドの
色変化を引き起こし易い。第３表は、試薬組成物中にＭ
ｇＳＯ4 が存在する時にこの組成物が高湿度に曝された
時、バックグラウンドの色変化が少なかったことを証明
している。
【００６５】
【表３】
【００６６】従って、本発明の試薬組成物へのアルカリ
土類金属塩の添加は、２つの基本的な点で白血球検出を
増強したようである。第１は、体液の試験中、この金属
塩は、試薬組成物中の異質の成分による求核攻撃に対し
てジアゾニウムを保護したと考えられる。従って、白血
球の非存在下での色変化（バックグラウンド）が低下す
る。第２は、この金属塩は、製造の乾燥工程において湿
気を吸収し、組成物と試験具の保存期間を延ばしたと考
えられる。ジアゾニウムの分解が少ないため、この試験
組成物は白血球に対してより感受性である。
【００６７】本発明の組成物は、緩衝剤を含んでもよ
い。この緩衝剤は、水性の試料と接触すると、反応に適
したｐＨを与える化合物である。好適には、この緩衝剤
は、約８．８〜９．０の範囲のｐＨを生成することがで
きる。前述のように、後者のｐＨ範囲は、エステラーゼ
とプロテアーゼによる加水分解、及びジアゾニウムカッ
プリングを促進するため、白血球、エステラーゼ、又は
プロテアーゼの存在下で最も劇的な色変化を可能にす
る。この金属塩は、白血球、エステラーゼ、又はプロテ
アーゼの非存在下での色変化である、バックグラウンド
の色変化を防御する。
【００６８】本発明の試薬組成物中に、約２００〜約６
００mMの濃度で緩衝剤を含むことができるが、特定の状
況では、この緩衝剤の濃度は、この範囲より上又は下で
あってもよい。
【００６９】従って、本発明の試薬組成物は、炭酸；Ｂ
ＩＣＩＮＥ；ＣＨＥＳ；ホウ酸塩；リン酸塩；２，２−
ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２”−ニトリロ
トリエタノール；３，３−ジメチルグルタル酸；３−Ｎ
−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）；１，３
−ビス〔トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ〕プ
ロパン（Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ）；トリ（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）；トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン−マレイン酸（ＴＲＩＳ−マレイン
酸）；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−マロ
ン酸（ＴＲＩＳ−マロン酸）；３−Ｎ−（トリスヒドロ
キシメチル）メチルアミノ−２−ヒドロキシプロパンス
ルホン酸（ＴＡＰＳＯ）；２−（〔トリス（ヒドロキシ
メチル）メチル〕アミノ）エタンスルホン酸（ＴＥ
Ｓ）；Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２
−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）；及び当該分野で公
知の他の緩衝剤、又はこれらの組合せのような緩衝剤に
より適切なｐＨに緩衝化される。好適な緩衝剤は、ホウ
酸−ＮａＯＨである。
【００７０】上述の組成物は、白血球、エステラーゼ又
はプロテアーゼの存在を測定するために使用することが
できる。或はこの組成物は、試験具を形成するために担
体マトリックス中に組み込まれ、これにより分析対象物
の存在の迅速で信頼性のある推定を可能にする。この担
体マトリックスは、通常は濾紙のような多孔性物質であ
るが、必ずしもそうでなくともよい。他のよく知られた
担体マトリックス材は、フェルト、多孔性セラミックス
トリップ、及び織られた若しくはからみあわせた（matt
ed）ガラス繊維（米国特許第3,846,247 号）である。
木、布、スポンジ材及び陶土質物質の使用も考えられる
（米国特許第3,552,928 号）。或は、この担体マトリッ
クスは、種々のポリマーフィルム、ガラスなどのように
非多孔性であってもよい。このような担体マトリックス
物質は全て、他のもの同様に本発明の使用に適してい
る。濾紙が特に適切であることが見い出された。
【００７１】この器具を製造する好適な方法では、濾紙
の一片を緩衝剤と水性アルカリ土類金属塩の水溶液で湿
らせた。この１番目の浸液は、洗剤、ポリビニルピロリ
ドンのようなのり剤及び他の不活性成分などの種々の加
工成分も含有してよい。
【００７２】次にこの浸漬した濾紙を乾燥し、２番目の
浸液、すなわちアセトンとＤＭＳＯ又は他の非水性溶媒
中のジアゾニウム塩、必要ならば促進物質又は追加の緩
衝剤で湿らせた。次にこの２度浸漬した紙を２回乾燥
し、こうして白血球又は他の分析対象物の存在に感受性
の試験具を作成した。全ての必要な試薬を含有する１回
浸漬するのみの溶液（one-dip solution）を利用して濾
紙に浸漬することも可能である。
【００７３】試薬組成物に好適な処方を第４表に示す。
【００７４】
【表４】
【００７５】必要であれば、乾燥した試薬を含んだ担体
マトリックスを、裏材上に張り付けることもできる。例
えば、試験具の好適な実施態様では、濾紙の担体マトリ
ックスに上述のように組成物を浸漬し、一枚の長い透明
ポリスチレンフィルムの一方の側にマトリックスが固定
されるように組み込んだ。このマトリックスを、該ポリ
スチレンフィルムのもう一方の端がハンドルとなるよう
にして、両面粘着テープ（ダブルスティック（Double S
tick）（登録商標）、販売元：３Ｍ社（3M Company））
のような任意の適切な方法によりフィルムに固定した。
使用に当たっては、このような装置を、ポリスチレンフ
ィルム裏材の何もついていない端を掴み、マトリックス
のついた端を試料（例えば、尿）中に浸漬し、迅速に取
り出した。予め決められた時間後に色の形成又は他の検
出可能な応答を観察し、白血球、又はエステラーゼ若し
くはプロテアーゼ活性を有する他の分析対象物の既知濃
度の応答に対応する標準物質と比較した。通常は約１〜
３分間のインキュベーション時間が、試薬含有濾紙で色
の展開を起こすのに充分であることが見い出された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マイケル・ジェイ・プジア アメリカ合衆国、インデイアナ州、46530、 グレンジャー、フォックス・ホロー・コー ト 51621 (72)発明者 メルビン・ディー・スミス アメリカ合衆国、インデイアナ州、46530、 グレンジャー、クウェイル・ポイント・ド ライブ 30517

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 試料中の、白血球、エステラーゼ及びプ
    ロテアーゼよりなる群から選択される分析対象物の存在
    を測定するための組成物であって、ジアゾニウム塩、及
    び、白血球、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在下で
    加水分解されうるエステル、及びアルカリ土類金属の塩
    を含むことを特徴とする組成物。
  2. 【請求項２】 アルカリ土類金属塩が、マグネシウム、
    カルシウム、又はバリウムの塩である、請求項１記載の
    組成物。
  3. 【請求項３】 アルカリ土類金属塩が、マグネシウムの
    塩である、請求項２記載の組成物。
  4. 【請求項４】 塩が、ＭｇＳＯ4 である、請求項３記載
    の組成物。
  5. 【請求項５】 組成物の最適ｐＨが、白血球、エステラ
    ーゼ又はプロテアーゼの存在下でジアゾニウムカップリ
    ングを促進し、その際バックグラウンドのジアゾニウム
    カップリング及び色の変化が、最小に抑えられている、
    請求項１記載の組成物。
  6. 【請求項６】 最適ｐＨが、約８．８〜９．０である、
    請求項５記載の組成物。
  7. 【請求項７】 最適ｐＨが、約８．９５である、請求項
    ６記載の組成物。
  8. 【請求項８】 エステルが、式（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ａは、アルコール保護基である）で示される構
    造を有する乳酸エステルであり、そしてエステラーゼの
    存在下でこの乳酸エステルが、加水分解されて化合物Ｂ
    −ＯＨを生成する、請求項１記載の組成物。
  9. 【請求項９】 化合物Ｂ−ＯＨのＢが、ピロール、チオ
    フェン、フラン、アゾレソルシノール、フェノール、ロ
    イコインドフェノール、アゾ染料、５−（４−ヒドロキ
    シ−３，５−ジメトキシフェニルメチレン）−２−チオ
    キソチアゾリン−３−酢酸、２−置換−６−ヒドロキシ
    −ベンゾチアゾール誘導体、ω−ニトロスチリルエステ
    ル、レソルフィン、アクリジノン、メロシアニン、８−
    ヒドロキシ−２Ｈ−ジベンズ−（ｂ，ｆ）アゼピン−２
    −オン、ジベンゾアゼピノン、ジベンゾチアゼピノン、
    クマリンエステル、及びこれらの混合物よりなる群から
    選択される、請求項８記載のエステル。
  10. 【請求項１０】 ジアゾニウム塩が、式（VII ）： 【化２】 〔式中、Ｒ4 は、個々に、水素、低級アルキル若しくは
    アリールであるか、又は、２つの隣り合ったＲ4 基が、
    一緒になって縮合環系を形成するが、但し、Ｒ4の１つ
    は、−Ｎ+ ≡Ｎである；Ｙは、Ｎ又はＣＲ5 （ここで、
    Ｒ5 は、水素又は低級アルキルである）であり；そして
    Ｄ- は、塩化物イオン、臭化物イオン、又は、ジアゾニ
    ウム残基の対イオンとして好適な他の陰イオンである〕
    で示される構造を有する、請求項１記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 ジアゾニウム塩が、式（VIII）： 【化３】 〔式中、Ｆは、水素、低級アルキル又はヒドロキシであ
    り；Ｄは、共有結合した陰イオンであり；Ｇは、個々
    に、水素、低級アルキル又はアリールであるか、或は、
    両方のＧ基が、一緒になって縮合環系を形成する〕で示
    される構造を有する、請求項１記載の組成物。
  12. 【請求項１２】 ジアゾニウム塩が、１−ジアゾ−２−
    ナフトール−４−スルホナート、１−ジアゾフェニル−
    ３−カルボナート、４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−１−
    ナフチルスルホナート、４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−
    ７−ニトロ−１−ナフチルスルホナート、４−ジアゾ−
    ３−ヒドロキシ−１，７−ナフチルジスルホナート、２
    −メトキシ−４−（Ｎ−モルホリニル）ベンゼンジアゾ
    ニウムクロリド、４−ジアゾ−３−ヒドロキシ−７−ブ
    ロモ−１−ナフチルスルホナート、４−ジアゾ−３−ヒ
    ドロキシ−７−シアノ−１−ナフチルスルホナート、４
    −ジアゾ−３−ヒドロキシ−７−〔１−オキソプロピ
    ル〕−１−ナフチルスルホナート、及びこれらの混合物
    である、請求項１記載の組成物。
  13. 【請求項１３】 該組成物が、さらに促進剤を含む、請
    求項１記載の組成物。
  14. 【請求項１４】 該促進剤が、８〜１５個の炭素原子を
    有するアルコールである、請求項１３記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 試料中の白血球、エステラーゼ又はプ
    ロテアーゼの存在又は濃度を測定するための試験装置で
    あって、試薬組成物（該試薬組成物は、ジアゾニウム
    塩、及び、白血球、エステラーゼ又はプロテアーゼの存
    在下で加水分解されうるエステル、及びアルカリ土類金
    属の塩を含む）を均一に組み込んだ担体マトリックスを
    含むことを特徴とする試験装置。
  16. 【請求項１６】 該アルカリ土類金属塩が、バックグラ
    ウンドのジアゾニウムカップリング及び色の変化を低下
    させる、請求項１５記載の試験装置。
  17. 【請求項１７】 該組成物が、さらに促進剤を含む、請
    求項１５記載の試験装置。
  18. 【請求項１８】 該促進剤が、約８〜１５個の炭素原子
    を有するアルコールである、請求項１７記載の試験装
    置。
  19. 【請求項１９】 試料中の、白血球、エステラーゼ又は
    プロテアーゼよりなる群から選択される分析対象物の存
    在を測定するための方法であって、試料を、試薬組成
    物、又は、試薬組成物を均一に組み込んだ試験装置（こ
    こで、該試薬組成物は、ジアゾニウム塩、及び、白血
    球、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在下で加水分解
    されうるエステル、及びアルカリ土類金属の塩を含む）
    と接触させて、次いで試薬組成物の検出可能な応答を検
    査することを特徴とする方法。
  20. 【請求項２０】 該検出可能な応答が、色原体、蛍光、
    反射率変化、化学発光、比色、又は分光測光によるもの
    である、請求項１９記載の方法。
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