JPH0816065B2

JPH0816065B2 - 静脈注射用のガンマグロブリンの製法

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Publication number: JPH0816065B2
Application number: JP60503125A
Authority: JP
Inventors: ジユルゲン‐ヂートリツヒフリードリツヒフイーヒトル; ベルンハルトケルナー; ジユルゲンホルツザツプヘル; マルテインプツシユマン; トクスケキムラ; フミオクロス
Original assignee: アルモアファルマゲーエムベーハー
Priority date: 1984-07-07
Filing date: 1985-07-03
Publication date: 1996-02-21
Anticipated expiration: 2011-02-21
Also published as: DK97286D0; DK164023B; DK97286A; JPS61500972A; NO860848L; DE3483784D1; FI84136C; FI84136B; FI860350A; JPH08319241A; EP0168506B1; FI860350A0; NO168943C; EP0168506B2; DK164023C; NO168943B; EP0168506A1; ATE59144T1; WO1986000530A1

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野この発明は、静脈注射に適したガンマグロブリンを含
有する生成物の製造方法に関する。

この発明の背景アメリカ特許4,126,605（シュナイダー）にはコーン
フラクションII ガンマグロブリンから静脈注射に適し
た生成物を製造する方法が説明されている。コーンフ
ラクションIIはpH6.7で緩衝水溶液に溶解されている。
この溶液は水酸化エチル澱粉を含んでいる。その溶液を
ろ過した後、ポリエチレングリコールを加えて10％の濃
度にする。沈澱をろ過した後、更にその溶液にポリエチ
レングリコールを加えて、濃度を20％にする。得られた
沈澱は静脈用に適した、修飾されない改良ガンマグロブ
リンである。

アメリカ特許4,165,370（コバル）はコーンフラク
ションII ガンマグロブリンから静脈注射に適した生成
物を製造する方法を説明している。コーンフラクショ
ンIIはpH4.8−6.5および低イオン濃度を酸を持ち、約30
0−10^-6cm^-1オーム^-1の電導度を持つ溶液に溶かされ、
この溶液をろ過して、分子量4000のポリエチレングリコ
ールを加えて、濃度を先ず40％とし、次いで５％の濃度
にする。この溶液を遠心分離にかけ、沈澱があれば除去
し、その溶液に更にポリエチレングリコールを加え、濃
度を12％にする。得られた沈澱は静脈に用いるに適し、
免疫学的に活性の修飾されないガンマグロブリンであ
る。

上記の方法では、純粋のガンマグロブリンの収率はコ
ーンフラクションIIのガンマグロブリンの約30％であ
る。収率を高める為に変更がなされたが、高められた収
率は純度を犠牲にしてなされるのが普通で、一定の品質
での高められた収率は今まで不可能であった。

この発明の目的は静脈用に適した高純度ガンマグロブ
リンを高収率で分離することである。

発明の要約（ａ）血液又はその生成物から沈澱させたガンマグロブ
リンを溶液に溶かし、（ｂ）その溶液から不溶解沈澱を分離し、（ｃ）分離した溶液にポリエチレングリコールを加え、（ｄ）ポリエチレングリコール溶液から沈澱を分離し、（ｅ）溶液中のポリエチレングリコールの濃度を高く
し、（ｆ）その高濃度ポリエチレングリコール溶液から沈澱
し精製したガンマグロブリンを分離し、（ｇ）その精製ガンマグロブリンを、静脈注射に適した
溶液に溶解する静脈注射用ガンマグロブリンの製造方法
に於いて、（１）ガンマグロブリンの溶解溶液が中性のpHであり、（２）最初のポリエチレングリコール添加工程で、ポリ
エチレングリコールを4.0−5.5重量％の濃度になるよう
に加え、（３）第２のポリエチレングリコール添加工程で、ポリ
エチレングリコールの濃度を、少なくとも９％で16重量
％を超えない様に増大させ、（４）ポリエチレングリコールの添加工程のいずれか１
つのポリエチレングリコール添加の直前に、溶液にクエ
ン酸塩の濃度が５乃至50ミリモル／リットルである緩衝
剤を加えることを特徴とする静脈注射に適したガンマグ
ロブリンの改良製造方法発明の詳細な説明（ａ）血液生成物から沈澱したガンマグロブリンの溶
解。

本発明の生成物および方法の出発物質として用いられ
るガンマグロブリンは、この技術分野で良く知られてい
る。

血液からガンマグロブリンを沈澱しそして分離する特
別の方法はコーンの方法（コーン他J.Amer.Chem.Soc.,V
ol.68,459−475頁およびVol.72.,475−4747頁）または
コーンフラクションIIの名称で知られている。

静脈注射用には不都合な、このガンマグロブリン製品
は中性pHで水溶液に溶解される。この水溶液はイオン強
度が低い。この低いイオン濃度は原料ガンマグロブリン
製品中に存在する塩に起因するか、または添加緩衝剤に
帰することができる。生理的に許容性のある塩が緩衝剤
として適当である。それらは燐酸塩、クエン酸塩および
トリヒドロキシ−エチル−アミノ−メタンを含んでい
る。

イオン濃度は0.001−0.015Mol/の範囲内にあること
が出来る。緩衝液を加えるとすれば、その範囲は0.01−
0.015Mol/の間が好ましい。

その溶液のpHは適当な酸または塩基、例えばクエン
酸、クエン酸ナトリウムまたは、必要により、水酸化ナ
トリウムを加えることにより調整できる。本発明ではク
エン酸塩を用いる。

いま、溶液のイオン濃度は出来るだけ高く、その濃度
は出来るだけ低くするべきであることが判った。もし、
附加的な緩衝液を用いないならば、溶液の温度は室温で
あることが出来る。もし、イオン濃度が0.01−0.015Mol
/1であるときは、その温度は５−15℃の間で有るべきで
ある。

ガンマグロブリンは１−７重量％の濃度で溶液に溶か
される。好ましい濃度は3.1−4.9％である。

その溶液には、アメリカ特許4,126,605に公開されて
いるように、ヒドロキシエチル澱粉、デキストローズ、
アルブミン、ポリアルコール、およびポリビニルピロリ
ドンのような「ヒドロコロイド」が存在して良い。

（ｂ）溶液からの非溶解性沈澱の分離。

ガンマグロブリンを溶解した後、不溶性不純物を、例
えば、傾しゃ、ろ過、または遠心分離によって取り除
く。

（ｃ）分離した溶液へのポリエチレングリコールの添
加。

得られた上澄液に分子量2000−6000のポリエチレング
リコール（PEG）を加える。このPEGは4000の平均分子量
であるのがよい。

このPEGは粉末としてバルク状でその上澄液に加えて
よく、PEG溶解溶液のして加えてもよい。PEGは室温で３
−６、殊に4.0−5.5重量％なる濃度になる様に分離溶液
に加える。PEG添加工程の一つのPEG添付の直前にガンマ
グロブリン溶液に緩衝剤を加えることが重要である。有
用な緩衝剤は上に列記した。

緩衝剤添加の後のイオン濃度は0.025−0.25Mol/lであ
る。

（ｄ）PEG溶液沈澱物の分離。

３−６％の濃度になる様に、PEGを加えると、沈澱物
が生成する。沈澱は傾しゃ、ろ過または遠心分離によっ
て除去される。

（ｅ）ポリエチレングリコール濃度の増大。

溶液中のPEG濃度はPEGの添加によって９−16重量％ま
で増大する。この段階の溶液温度は、おそらく０−10℃
に減少するが、室温に維持される。

（ｆ）純粋ガンマグロブリン沈澱物の分離。

PEG濃度を増加することにより沈澱する精製免疫グロ
ブリンを、次いで、温和な分離方法、例えば、傾しゃ、
ろ過、または遠心分離によって分離する。望ましくは、
その分離は遠心分離による。

得られた精製ガンマグロブリンは天然のもので、ACA
が低く、静脈注射用に使用するのに適している。

（ｇ）静脈注射用溶液への精製ガンマグロブリンの溶
解。

静脈注射用溶液ガンマグロブリンを２−10％、好まし
くは約５％の濃度で水溶液に溶解するのがよい。溶液は
緩衝剤、例えばクエン酸及び／又は燐酸塩、糖類、例え
ばグルコース、マルトース、サッカロース、及び等張化
剤、例えば塩化ナトリウムを含んでもよい。クエン酸塩
が望ましい。

本発明に用いるクエン酸塩緩衝液は、２−３重量％のグ
ルコースを含むことが好ましい。また、そのpHは７であ
ることが好ましい。緩衝液中のクエン酸塩の濃度は、５
乃至50ミリモル／リットルである。

本発明の方法では、出発物質中のガンマグロブリン量
に対し70％、或はそれ以上の高純度の生成物が得られ
る。生成物の抗補体活性（ACA）の平均値は、約10CH₅₀u
/ml又はそれ以下（プロティン濃度が５重量％で測定）
である。

実施例１コーンフラクションII−粉末を、0.1molの燐酸塩ク
エン酸塩緩衝液（7.00pH、10℃）に注意深く撹拌し乍ら
溶解、3.5％のプロティン濃度にする。ヒドロキシエチ
ル澱粉が0.5％の濃度で存在する。

生成沈澱物を除去し、溶液を一回のろ過工程で、層ろ
過で澄明にする。プロティンの濃度を2.5％に調整し、
燐酸塩クエン酸塩濃度を0.12molに調整し、0.5molの燐
酸塩クエン酸塩緩衝液（mol濃度は燐酸塩／クエン酸塩
の含量に関する）を加えることにより、pHを7.0±0.1に
調節する。溶液の温度を20℃に加熱した後、5.5％の濃
度になるまで固体のポリエチレングリコール（PEG4000
分子量4000）を注意深く撹拌しながら5.5％の濃度にな
るまで加え、完全に溶解した。

その後、上澄液を傾しゃして、生成した沈殿物を除去
し、層ろ過により精製した。

精製上澄液を10℃に冷却し、10℃でPEG4000の0.03mol
の燐酸塩クエン酸塩緩衝液中50％溶液で、撹拌し乍ら、
PEG4000濃度が14％になるまで希釈した。

得られた沈澱（ペースト状）を連続遠心分離によって
集めた。このペーストを20mmolのクエン酸ナトリウム溶
液（pH＝7.0±0.1）に溶解し、2.5％のグルコースを加
える。こうして造られた溶液は次記の特性値を示す。

プロテイン 5.4 ％ pH 7.00±0.05 グルコース 2.5％±0.5 ％滲透度 300−330ミリオスモル／リットル ACA 10 U/ml HPLC:ダイマー＋モノマー 99 ％この溶液を滅菌ろ過し瓶に入れ、場合により凍結乾燥
する。

実施例２〜４の概要 33gのコーンフラクションIIの粉末を撹拌すること
なく、コールドボックス（４−10℃）内の500mlの再構
成緩衝液中に一夜放置することにより溶解した。溶液の
再構成は、蒸留水を最終容量が633mlとなるように加え
て実施した。

非溶解物を３″EKSアスベスト・フィルターを通す濾
過により除去し、それぞれ250mlの再構成緩衝液で前洗
浄した。濾過は25psiで実施し、発泡が起きる前に停止
した。

6g/dlの固体ポリエチレングリコール（PEG）を静かに
撹拌しながら加えて、室温（24−26℃）でヘラを用いて
溶解するまで混合し、さらに５−10分間撹拌し、そして
沈澱するまで１時間放置した。バッチをソルバール・ビ
ーカー遠心分離機内の４リットルのローター中において
4200rpm30分間遠心分離した。沈澱を捨てた。

PEG4000の50％水溶液を静かに撹拌しながら14g/dlと
なるように加えた。バッチを５分以上撹拌し、少なくと
も１時間静置した。沈澱を上記の条件下で遠心分離によ
り集め、上澄みを捨てた。

沈澱に2.5％グルコース−0.9％塩化ナトリウム溶液を
加え、プロテイン濃度を5g/dlとし、コールド・ボック
ス内で一夜放置した。翌朝、バッチを室温まで温め、静
かに手で揺すって約２時間かけて溶解した。溶液を0.45
および0.2ミクロンの濾布を通して濾過し、レブコ・フ
リーザー（−50℃）内で固形冷凍した。冷凍したサンプ
ルを実験用凍結乾燥機を用いて室温（25℃−30℃）で48
時間かけて凍結乾燥した。

実施例２使用したクエン酸−燐酸塩緩衝液のpHを変化させた。
抗補体活性（ACA）の結果を添付の図１に示す。

グラフ中にプロットしたデータは、pH7.0におけるACA
の顕著な減少を示している。

実施例３ ACAに関するクエン酸ナトリウムの効果を決定するた
め、様々な緩衝液を用いて実験を実施した。結果を下記
表１に示す。

表１のデータは、６種類のバッチにおけるクエン酸
（pH5.0および5.9）、塩化ナトリウムおよび燐酸塩緩衝
剤と比較して、至適濃度を有するクエン酸塩緩衝剤がAC
Aを強力に低下させる作用を有していることを示す。

データが示すところによれば、ACA値は10乃至50mMの
クエン酸ナトリウムを添加することにより減少する。ク
エン酸塩は一定の濃度範囲において、ACAの減少に対す
る至適効果を有していることは明らかである。緩衝剤の
濃度が100mMに上昇すると、ACAが非常に上昇した結果が
得られる。

クエン酸がACAを劣化させるのに対して、塩化ナトリ
ウムと燐酸塩緩衝剤は、ACAに対してポジティブな効果
を全く有していない。

実施例４上記の方法により生産した細胞内ガンマグロブリン
（ivgg）の様々なバッチおよびシュナイダー法（ベント
ナイト）により生産したivggの様々なバッチのACA値を
以下に示す。

表２のデータは、新規なivgg法における有益な低ACA
値が各サンプル間に保持されていることを示している。

実施例５実験を下記のフローチャートに従い実施した。フロー
チャートの手順は、上記実施例２〜４と同様である。

実験は沈澱物２について実施した。商業製品に使用し
たクエン酸−燐酸塩緩衝液を、他のクエン酸塩溶液に置
き換えた。抗補体活性（ACA）の結果を、以下に示すよ
うに燐酸塩および塩化ナトリウムをコントロール緩衝剤
として使用して決定した。

表３のデータは、クエン酸塩緩衝剤のACAを強力に低
下させる作用を示している。クエン酸塩を２−20mM添加
すると、ACA値が統計的に有意に減少する。

図面の簡単な説明図１は、クエン酸−燐酸塩緩衝液のpHを変化させた場
合における抗補体活性（ACA）の結果を示すグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ケルナーベルンハルトドイツ連邦共和国デー‐4400 ミユンスターウエスターハイデ 41 (72)発明者ホルツザツプヘルジユルゲンドイツ連邦共和国デー‐3440 エシユベーゲフライヘル‐フオン‐シユタイン- ストラーセ 51 (72)発明者プツシユマンマルテインドイツ連邦共和国デー‐3446 マインハルト１アウフデアクラウス９ (72)発明者キムラトクスケ東京都新宿区早稲田町９ (72)発明者クロスフミオ埼玉県蓮田市大字閏戸 2629 (56)参考文献特開昭52−117414（ＪＰ，Ａ) 特開昭53−20415（ＪＰ，Ａ) 特開昭55−47628（ＪＰ，Ａ) 特開昭55−98117（ＪＰ，Ａ) 特開昭57−32228（ＪＰ，Ａ) 特開昭57−203017（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）血液又はその生成物から沈澱させた
ガンマグロブリンを溶液に溶かし、（ｂ）その溶液から不溶解沈澱を分離し、（ｃ）分離した溶液にポリエチレングリコールを添加
し、（ｄ）ポリエチレングリコール溶液から沈澱を分離し、（ｅ）ポリエチレングリコールをさらに添加して溶液中
のポリエチレングリコールの濃度を高くし、（ｆ）その高濃度ポリエチレングリコール溶液から沈澱
した精製ガンマグロブリンを分離し、（ｇ）その精製ガンマグロブリンを静脈注射に適した溶
液に溶解する静脈注射用ガンマグロブリンの製造方法に
於て、（１）血液または血液製品から析出したガンマグロブリ
ンを中性pHの溶液に溶かし、（２）最初のポリエチレグリコール添加工程で、ポリエ
チレングリコールを4.0乃至5.5重量％の濃度になる様に
加え、（３）第２のポリエチレングリコールの添加工程で、ポ
リエチレングリコール濃度を９乃至16重量％に増大さ
せ、（４）何れか一方のポリエチレングリコール添加工程の
直前に、その溶液にクエン酸塩の濃度が５乃至50ミリモ
ル／リットルである緩衝液を加えること、を特徴とする静脈注射に適したガンマグロブリンの改良
された製造方法。
【請求項２】ポリエチレングリコールの平均分子量が約
4000である特許請求の範囲１の方法。
【請求項３】20℃を超えることのない温度で、0.001乃
至0.05モル／リットルのイオン濃度にガンマグロブリン
を溶解する工程（ａ）の別の改良を含む特許請求の範囲
１の方法。
【請求項４】ヒドロキシエチル澱粉を工程（ａ）の溶液
に加える特許請求の範囲１の方法。
【請求項５】工程（ａ）で、ガンマグロブリンを0.010
乃至0.015モル／リットルの範囲のイオン濃度の溶液に1
0℃を超えることのない温度で溶解する特許請求の範囲
１の方法。
【請求項６】工程（ａ）で、ガンマグロブリンを電解質
を有しない溶液に、15乃至30℃の温度で溶解する特許請
求の範囲１の方法。
【請求項７】緩衝液の添加が最初のポリエチレングリコ
ール添加の直前であり、溶液のイオン濃度を0.06乃至0.
25モル／リットルに上げる特許請求の範囲４の方法。
【請求項８】緩衝液の添加を第２のポリエチレングリコ
ール添加の直前に行う特許請求の範囲５の方法。
【請求項９】クエン酸塩緩衝液のpHが７±0.1である特
許請求の範囲１の方法。
【請求項１０】（ａ）コーンフラクションIIの粉末3.
0乃至7.5重量％を0.35乃至１重量％のヒドロキシエチル
澱粉を含む中性pH水溶液に溶かし、（ｂ）その溶液から不溶解沈澱を分離し、（ｃ）約4000の分子量のポリエチレングリコールをその
溶液に加え、4.0乃至5.0重量％の濃度にし、（ｄ）溶液から沈澱を分離し、その溶液にクエン酸・燐
酸塩緩衝液を加えて0.02乃至0.04Mの濃度にし、（ｅ）約4000の分子量のポリエチレングリコールをその
溶液に加えて、9.5乃至11.0重量％の濃度とし、その溶
液に燐酸塩緩衝液を加えて0.02乃至0.04Mの濃度にし、（ｆ）その溶液から精製ガンマグロブリンを分離し、（ｇ）その精製ガンマグロブリンを静脈注射に適した溶
液に溶解することよりなる特許請求の範囲１の方法。