FI84136C

FI84136C - Foerfarande foer framstaellning av gamma-globulin vilket laempar sig foer intravenoest administration.

Info

Publication number: FI84136C
Application number: FI860350A
Authority: FI
Inventors: Juergen-Dietrich Fried Fiechtl; Bernhard Kerner; Juergen Holzapfel; Martin Puschmann; Tokusuke Kimura; Fumio Kurosu
Original assignee: Armour Pharma Gmbh
Priority date: 1984-07-07
Filing date: 1986-01-24
Publication date: 1991-10-25
Also published as: JPS61500972A; DK97286A; EP0168506B1; NO168943B; DK97286D0; WO1986000530A1; ATE59144T1; EP0168506B2; NO168943C; DK164023B; FI860350A; EP0168506A1; JPH0816065B2; DK164023C; FI860350A0; JPH08319241A; FI84136B; NO860848L; DE3483784D1

Description

1 84136

Menetelmä laskimon sisäisesti annettavaksi sopivan gammaglobuliinin valmistamiseksi

Keksinnön alue 5 Tämän keksinnön kohteena on menetelmä laskimon si säisesti annettavaksi sopivan gamma-globuliinin valmistamiseksi.

Keksinnön tausta US-patentti 4 126 605 (Schneider) kuvaa menetelmän 10 laskimon sisäisesti annettavaksi sopivan tuotteen valmistamiseksi Cohn Fraktio II gamma-globuliinista. Cohn Fraktio II liuotetaan puskuroituun vesiliuokseen pH:ssa 6,7. Liuos sisältää hydroksietyylitärkkelystä. Liuoksen suodatuksen jälkeen lisätään polyetyleeniglykolia väkevyyteen 15 10 %. Sakan poistamisen jälkeen lisätään liuokseen vielä polyetyleeniglykolia väkevyyteen 20 %. Saatava sakka on parantunutta, muuntamatonta laskimon sisäisesti käytettäväksi soveltuvaa gamma-globuliinia.

US-patentti 4 165 370 (Coval) kuvaa menetelmän 20 laskimon sisäisesti annettavaksi soveltuvan tuotteen saamiseksi Cohn Fraktio II gamma-globuliinista. Cohn Fraktio II liuotetaan liuokseen, jonka pH on hapan 4,8 - 6,5 ja ionivahvuus vähäinen, so. jonka konduktanssi on noin SOO-lO^cm^ohmi'1. Liuoksen suodattamisen jälkeen polyety-25 leeniglykolia, molekyylipaino 4000, lisätään ensin 4 % väkevöitteeksi, sitten 5 % väkevöitteeksi. Kun liuos on sentrifugoitu ja kaikki sakka poistettu, lisätään liuokseen vielä polyetyleeniglykolia 12 % väkevyyteen. Saatu sakka on immunologisesti aktiivista muuntamatonta laskimon 30 sisäisesti annettavaksi sopivaa gamma-globuliinia.

Yllä mainituissa menetelmissä puhtaan gamma-globuliinin saannot ovat noin 30 % Cohn Fraktio II gamma-globuliinista. Muunnelmia on tehty saantojen suurentamiseksi, mutta suurentunut saanto on yleensä tullut puhtauden kus-35 tannuksella. Suurentunut saanto vakiolaatuisella tuot teella ei ole vielä ollut mahdollinen.

2 84136

Esillä olevan keksinnön kohteena on eristää suurella saannolla erittäin puhdasta, laskimon sisäisesti käytettäväksi sopivaa gamma-globuliinia.

Keksinnön yhteenveto 5 Keksinnön kohteena on menetelmä laskimon sisäisesti annettavaksi sopivan gamma-globuliinin valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää (a) verestä tai verituotteesta seostetun gammaglobuliinin liuottamisen liuokseen; 10 (b) liukenemattoman sakan erottamisen liuoksesta; (c) polyetyleeniglykolin lisäämisen erotettuun liuokseen; (d) sakan erottamisen polyetyleeniglykoliliuokses-ta; 15 (e) polyetyleeniglykoliväkevyyden lisäämisen liuok sessa; (f) saostuneen, puhdistetun gamma-globuliinin erottamisen suurempiväkevyyksisestä polyetyleeniliuokses-ta; 20 (g) puhdistetun gamma-globuliinin liuottamisen laskimon sisäisesti käytettäväksi soveltuvaan liuokseen, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että (1) vaiheessa (a) 3,0 - 7,5 paino-% Cohn Fraktio II gamma-globuliini -jauhetta liuotetaan neutraalissa 25 pH:ssa vesiliuokseen, joka sisältää 0,35 - 1 paino-% hyd-roksietyylitärkkelystä; (2) vaiheessa (c) polyetyleeniglykolia lisätään liuokseen väkevyyteen 4,0 - 5,0 paino-%; (3) vaiheessa (e) polyetyleeniglykolia lisätään 30 liuokseen väkevyyteen 9,5 - 16 paino-%; (4) liuokseen lisätään sitraattipuskuria tai sit-raattia sisältävää puskuria juuri ennen polyetyleeniglykolin lisäystä vaiheessa (c) tai (e).

35 3 84136

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus (a) Verituotteista saostetun gamma-globuliinin liuottaminen liuokseen

Esillä olevan keksinnön mukaiseen menetelmään 5 lähtöaineeksi käyttökelpoinen gamma-globuliini on alalla hyvin tunnettu.

Erityinen menetelmä gamma-globuliinin saostamiseksi ja eristämiseksi verestä on tunnettu nimellä "Cohn-mene-telmä" (Cohn et ai., J. Amer. Chem. Soc., Voi. 68, s. 459-10 475 ja Voi. 72, s. 465-474) tai "Cohn Fraktio II".

Tämä laskimon sisäisesti käytettäväksi sopimaton gamma-globuliinivalmiste liuotetaan vesiliuokseen neutraalissa pH:ssa. Vesiliuoksen ionivahvuus on vähäinen. Pieni ioniväkevyys voidaan johtaa gamma-globuliinilähtö-15 valmisteessa läsnäolevasta suolasta tai se voi johtua lisätystä puskurista. Kaikki fysiologisesti siedettävät suolat ovat sopivia puskureiksi. Näihin kuuluvat fosfaatti, sitraatti ja trihydroksi-etyyli-amino-metaani.

Ioniväkevyys voi olla alueella 0,001-0,015 mol/1. 20 Jos puskuria lisätään, alue on edullisesti 0,01-0,015 mol/1.

Liuoksen pH voidaan säätää arvoon 7,0 ±0,1 lisäämällä sopivaa happoa tai emästä, esimerkiksi sitruunahappoa, natriumsitraattia tai tarvittaessa natriumhydroksi-25 dia; sitraatti on edullinen.

On keksitty, että mitä korkeampi ioniväkevyys, sitä pienempi liuoksen lämpötilan tulisi olla. Mikäli lisäpus-kuria ei käytetä, liuoksen lämpötila voi olla huoneen lämpötila. Jos ioniväkevyys on välillä 0,01-0,015 mol/1, 30 lämpötilan pitäisi olla välillä 5-15°C.

Gamma-globuliini liuotetaan liuokseen väkevyyteen 1-7 paino-%. Edullisesti väkevyys on 3,1 - 4,9 %.

Liuoksessa voi lisäksi olla läsnä "hydrokolloidia" kuten hydroksietyylitärkkelystä, dekstroosia, albumiinia, 4 84136 polyalkoholia ja polyvinyylipyrrolidonia, kuten esitetään US-patentissa 4 126 605.

(b) Liukenemattoman sakan erottaminen liuoksesta

Kun gamma-globuliini on liuennut, liukenemattomat 5 epäpuhtaudet poistetaan liuoksesta esimerkiksi dekantoi-malla, suodattamalla tai sentrifugoimalla.

(c) Polyetyleeniglykolin lisääminen erotettuun liuokseen

Saatuun nesteeseen lisätään polyetyleeniglykolia 10 (PEG), jonka molekyylipaino on välillä 2000-6000. Edullisesti PEG:n keskimääräinen molekyylipaino on 4000.

PEG voidaan lisätä nesteeseen kokonaisuudessaan jauheena tai liuoksena, jossa PEG on liuenneena. PEG lisätään huoneen lämpötilassa erotettuun liuokseen väkevyyteen 15 3-6 paino-%, edullisesti 4,0-5,5 paino-%.

On tärkeätä lisätä puskuri gamma-globuliiniliuok-seen juuri ennen PEG:n lisäämistä jossain PEG:n lisäysvai-heessa. Käyttökelpoiset puskurit on lueteltu yllä. Liuoksen ioniväkevyyden puskurin lisäämisen jälkeen pitäisi 20 olla 0,025-0,25 mol/1.

(d) Sakan erottaminen PEG-liuoksesta

Kun PEG on lisätty 3-6 % väkevyyteen, muodostuu sakka. Sakka poistetaan dekantoimalla, suodattamalla tai sentrifugoimalla.

25 e) Polyetyleeniglykoliväkevyyden lisääminen PEG-väkevyys liuoksessa nostetaan 9-16 paino-%:iin lisäämällä PEG:tä. Liuoksen lämpötila voidaan tässä vaiheessa alentaa välille 0-10 °C, se voi kuitenkin pysyä huoneen lämpötilassa.

30 (f) Puhdistetun, saostuneen gamma-globuliinin erottaminen

Puhdistunut immunoglobuliini, joka saostuu PE-väke-vyyden kasvattamisen jälkeen, erotetaan sitten lievien erotusmenettelyitten avulla, esimerkiksi dekantoimalla, 35 suodattamalla tai sentrifugoimalla. Edullisesti erottaminen tapahtuu sentrifugoinnin avulla.

Il 5 84136

Saatu puhdistettu gamma-globuliini on puhdasta, sen ACA on pieni ja se sopii käytettäväksi laskimon sisäisesti annettaviksi tarkoitetuissa tuotteissa.

(g) Puhdistetun gamma-globuliinin liuottaminen 5 laskimon sisäisesti annettavaksi soveltuvaan liuokseen

Puhdistettu gamma-globuliini liuotetaan edullisesti vesiliuokseen väkevyyteen 2-10 %, edullisesti noin 5 %. Liuokset voivat myös sisältää puskuria, esim. sitraattia 10 ja/tai fosfaattia, sokeria, esim. glukoosia, maltoosia, sakkaroosia ja isotonisuusainetta, esim. NaCl; sitraatti on edullinen.

Edullisia ovat liuokset, jotka sisältävät 2-3 pai-no-% glukoosia ja 5-50 mmol/1 natriumsitraattia pH:n ol-15 lessa 7.

Esillä olevan keksinnön menetelmässä saadaan 70 % tai suuremmat saannot korkealaatuista tuotetta laskettuna lähtöaineessa olleen gamma-globuliinin määrästä. Tuotteen keskimääräinen antikomplementtiaktiivisuus (ACA) on suun-20 nilleen 10 CH50 u/ml tai pienempi (5 % proteiiniväkevöite).

Esimerkki 1

Cohn-Fraktio-II-jauhe liuotetaan 0,01 molaariseen fosfaatti-sitraatti-puskuriin (pH 7,00, 10 °C) huolellisesti sekoittaen proteiiniväkevyyteen 3,5 %. Hydroksietyyli-25 tärkkelystä on läsnä väkevyydessä 0,5 %.

Muodostunut sakka poistetaan ja liuos kirkastetaan kerrossuodatuksin yhdessä suodatusvaiheessa. Proteiini-väkevyys säädetään 2,5 %:ksi ja fosfaatti-sitraattiväke-vyys säädetään 0,12 molaariseksi ja pH säädetään 7,0 ± 30 0,l:ksi lisäämällä 0,5 molaarista fosfaatti-sitraattipus- kuria (molaarisuus suhteessa fosfaatti/sitraatti-pitoi-suuteen). Kun liuos on lämmitetty lämpötilaan 20 °C, lisätään kiinteää polyetyleeniglykolia (PEG 4000, molekyyli-paino 4000) väkevyyteen 5,5 % varovaisesti sekoittaen ja 35 liuotetaan täysin.

6 84136

Neste dekantoidaan muodostuneelta sakalta ja kirkastetaan kerroksittain suodattamalla.

Kirkastettu neste jäähdytetään lämpötilaan 10 °C ja laimennetaan sitten sekoittaen 50 % PEG 4000-liuoksella 5 0,03 molaarisessa fosfaatti-sitraatti-puskurissa 10 °C:ssa PEG 4000 väkevyyteen 14 % saakka. Muodostunut sakka (pasta) kerätään jatkuvasti sentrifugoiden.

Pasta liuotetaan 20 molaariseen natriumsitraatti-liuokseen (pH = 7,0 ± 0,1) ja 2,5 % glukoosia lisätään. 10 Näin valmistetun liuoksen ominaisarvot ovat seuraavat: proteiini: 5,4 % pH: 7,00 ± 0,05 glukoosi: 2,5% ± 0,5 % osmolaarisuus: 300 - 330 mosmol/1 15 ACA: 10 U/ml HPLC, dimeerit + monomeerit: 99 %

Liuos suodatetaan steriilistä ja sijoitetaan lääke-pulloihin ja vapaavalintaisesti lyofilisoidaan.

Esimerkki 2 20 Cohn-Fraktio-II-jauhe liuotetaan huoneen lämpöti lassa ja pH:ssa 7 ruiskeveteen huolellisesti sekoittaen proteiiniväkevyyteen 5 %. Hydroksietyylitärkkelystä on läsnä väkevyydessä 0,5 %.

Muodostunut sakka poistetaan ja liuos kirkastetaan 25 kerroksittain suodattamalla yhdessä suodatusvaiheessa.

Polyetyleeniglykolia (PEG 4000) 40 % liuoksena lisätään huolellisesti sekoittaen väkevyyteen 4,0 %. Sakka poistetaan syvyyssuodatuksella. Kirkkaaseen nesteeseen lisätään 0,3 M fosfaattipuskuria väkevyyteen 10 tilavuus-% ja PEG 30 4000 väkevyys nostetaan 10,4 %:ksi.

Muodostunut sakka (pasta) kerätään jatkuvasti sentrifugoiden.

Pasta liuotetaan 10 mM sitraatti/lOmM fosfaatti-puskuriin (pH 7,0 ± 0,1), joka lisäksi sisältää 0,9 % NaCl 35 ja 2,5 % glukoosia.

7 84136

Uudelleenliuotetun liuoksen ominaisuudet ovat seu- raavat: proteiini: 5,4 % pH: 7,0 ± 0,05 5 glukoosi: 2,5 % ± 0,5 % ACA: 10 U/ml HPLC, dimeerit + monomeerit: 99 %

Liuos suodatetaan steriilisti, täytetään pulloihin ja vapaavalintaisesti pakastekuivataan.

10 Immunoglobuliinisaanto laskettuna immunoglobuliini- prosentista Cohn-Fraktiossa II on yli 70 %.

Claims

1. Menetelmä laskimon sisäisesti annettavaksi so- I pivan gamma-globuliinin valmistamiseksi, joka menetelmä 5 käsittää (a) verestä tai verituotteesta saostetun gammaglobuliinin liuottamisen liuokseen; (b) liukenemattoman sakan erottamisen liuoksesta; (c) polyetyleeniglykolin lisäämisen erotettuun 10 liuokseen; (d) sakan erottamisen polyetyleeniglykoliliuokses- ta; (e) polyetyleeniglykoliväkevyyden lisäämisen liuoksessa; 15 (f) saostuneen, puhdistetun gamma-globuliinin erottamisen suurempiväkevyyksisestä polyetyleeniliuoksesta; (g) puhdistetun gamma-globuliinin liuottamisen laskimon sisäisesti käytettäväksi soveltuvaan liuokseen, 20 tunnettu siitä, että (1) vaiheessa (a) 3,0 - 7,5 paino-% Cohn Fraktio II gamma-globuliini -jauhetta liuotetaan neutraalissa pH:ssa vesiliuokseen, joka sisältää 0,35 - 1 paino-% hyd-roksietyylitärkkelystä; 25 (2) vaiheessa (c) polyetyleeniglykolia lisätään liuokseen väkevyyteen 4,0 - 5,0 paino-%; (3) vaiheessa (e) polyetyleeniglykolia lisätään liuokseen väkevyyteen 9,5 - 16 paino-%; (4) liuokseen lisätään sitraattipuskuria tai sit- 30 raattia sisältävää puskuria juuri ennen polyetyleeniglyko lin lisäystä vaiheessa (c) tai (e).

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään polyetyleeniglykolia, jonka keskimääräinen molekyylipaino on noin 4000.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa (a) gamma-globu- 84136 g liini liuotetaan liuokseen, jonka ioniväkevyys on 0,001 - 0,05 mol/1, lämpötilassa, joka ei ole yli 20 °C. I

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa (a) gamma-globu- 5 liini liuotetaan liuokseen, jonka ioniväkevyys on 0,010 -0,015 mol/1, lämpötilassa, joka ei ole yli 10 °C.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa (a) gamma-globu-liini liuotetaan vesiliuokseen, jossa ei ole lisättyä 10 elektrolyyttiä, lämpötilassa 15 - 30 °C.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puskurin lisäys tapahtuu juuri ennen ensimmäistä polyetyleeniglykolilisäystä ja se lisää liuoksen ioniväkevyyden arvoon 0,06 - 0,25 mol/1.

7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puskurin lisäys tapahtuu juuri ennen toista polyetyleeniglykolilisäystä.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään puskuria, joka on 20 1/10 tilavuutta 0,3 M fosfaattipuskuri.

8 84136

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sitraattifosfaattipuskuria lisättään liuokseen väkevyyteen 0,02 - 0,04 M.

10. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että käytetään puskuria, joka on sitraattipuskuri. !° 84136