JPH0764874B2

JPH0764874B2 - 化学修飾されたアレルゲン類およびそれらの調製方法

Info

Publication number: JPH0764874B2
Application number: JP2268253A
Authority: JP
Inventors: ファラギアンパオロ; ブレンナオレステ; ミストレロジョバンニ
Original assignee: ラボラトリオフアルマスーテイコロフアルマソシエタアレスポンサビリタリミタータ
Priority date: 1989-10-06
Filing date: 1990-10-05
Publication date: 1995-07-12
Anticipated expiration: 2010-07-12
Also published as: DE69014541D1; DE69014541T2; CA2026610C; IT1237475B; DK0421949T3; ES2067725T3; HK1003979A1; CA2026610A1; IT8948431A0; AU6315590A; ATE114477T1; EP0421949B1; JPH03151400A; US5354848A; EP0421949A1; AU637404B2

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、化学的に修飾されたアレルゲン類およびそれ
らの製造方法に関するものである。更に特定的には、本
発明はアレルゲン性疾患の治療に有効な新規な型の化学
修飾されたアレルゲン類、ならびにそれらの製造方法に
関するものである。

多くの人々がアレルギー型の病気に悩まされていること
が既に知られており、最も一般的な症状は、ぜんそく、
枯草熱および結膜炎、じんましんである。このような病
気を起こす機構は、例えば花粉、ハウスダストダニ類、
菌類の胞子等の遍在性アレルゲンに対するIgEクラスの
抗体類の過剰産生に存するアレルギー性感作状態による
ことが多い。IgEクラスの抗体類は、通常、他のクラス
の抗体類によって及ぼされるような保護的役割を何ら及
ぼさず、しかしながら更に、それらに対するアレルゲン
に反応した場合にそれらは複雑な細胞反応を引き起こ
し、それらが粘膜の肥満細胞の膜および好塩基性白血球
に結合する能力を有するのため、前記反応は、血管作動
性アミン類（例えばヒスタミン）およびアレルギー反応
の実際の媒介物であり、またそれに応答性の他の化合物
の放出を引き起こす。

アレルギー性の病状を軽減または除くために、長年、特
異的感受性減衰療法が行なわれてきた。これは、アレル
ギー患者に対して通常皮下的に、該患者が感受性である
アレルゲンを次第に増加させた投与量で注射投与するこ
とからなり、このようなアレルゲンは、あらかじめ診断
により同定しておかれる。伝統的なアレルゲン性抽出物
は、中性に近いpH値（pH7.0-7.4）および血清と同等の
浸透圧を有している。

前記特異的感受性減退両方を介してアレルギー症状を低
減し、または解消する機構は、多様であり、それらのう
ち最も良く知られ、また実際に最も重要なものは、以下
のものである：アレルゲンの反復注射は、生物内に“阻
害抗体類”と称されるアレルゲン特異性のIgGクラス抗
体を誘発し、これはアレルゲンと反応し、該アレルゲン
が、先に略述した病原性反応を起こすIgE類と反応する
ことを防止し得る。

前記特異的感受性減退療法が有効であるためには、注射
すべきアレルゲンの全投与量はかなりな量が必要であ
る。

これは、その有効性のために一般に受け入れられている
が、前記特異的感受性減退療法は、アレルゲンの注射に
続いて起こり得る望ましくない反応によるある種の障害
を示す。事実、注射部位における局所反応（大きい赤
斑、赤化、かゆみ等）、または全身反応（鼻炎またはぜ
んそく、およびアナフィラキシーショック）が起こり得
る。

このような望ましくない反応を低減し、特異的感受性減
退療法を安全なものとするために、貯蔵型のアレルゲン
抽出物、すなわち緩吸収アレルゲン抽出物が近年実現さ
れており、このアレルゲンの抽出物は、水酸化アルミニ
ウム、チロシンまたはリン酸カルシウムにより沈殿され
るか吸着されて生体への吸収が遅く、従って反応性が低
減されており、このような型の抽出物によって、患者は
該抽出物の接種により良く耐抗でき、望ましからぬ反応
が減少する。

このような貯蔵型のアレルゲン抽出物は、改善を示す
が、しかしながらある割合の患者は、それらに対しても
局所的および全身的な望ましからぬ反応を示し、従って
それらは、最適とは言えずまた問題の決定的解決ではな
い。このような障害を回避する試みにおいて、それらの
アレルゲン反応を実質的に低減し（すなわち組織肥満細
胞に結合するIgEとの反応性、および病原性反応を生じ
る能力の低減）、一方においてそれらの免疫原としての
能力を保つ（すなわち、IgGクラスの阻害抗体類の形成
を誘発する能力を保つ）等のアレルゲンの化学修飾が試
みられている。ある患者は、このような修飾されたアレ
ルゲン類を示すために“アレルゴイド”なる用語を用い
た。

部分的に所望の特徴を有する修飾アレルゲンを生成する
ために提案された方法は、8M尿素を用いる変性方法であ
る。実際、尿素の8M溶液の解離作用に対して、Ambrosia
elatiorの花粉（米国に生育する極めて重要なアレルゲ
ン性植物）の抗原Ｅを曝すことにより、このような抗原
はIgEに対する反応性をかなり失い、しかしながらそれ
は治療のための注射後の感受性減退能力を保つことが示
された。しかしながら、マウスに対して行なわれたこの
ような実に奨励となる実験に続いて、ヒト対象における
試験は、対立する結果を与えた。更には、上述の方法
は、8M尿素等の解離剤の変性作用に対して特に敏感な２
個のポリペプチドサブユニットが非共有結合的に集まっ
て形成されるAmbrosia elatiorの抗原Ｅに対してのみ採
用可能であると考えられる。

アレルゲン類の化学修飾を行なうために既に知られてい
る他の方法は、アルデヒド類による処理であり、これら
のうち最も多く使用されるものは、ホルムアルデヒドま
たはグルタルアルデヒドである。アルデヒド官能基と蛋
白質アミノ基との間の反応は、例えばR.E.Feeny、G.Bla
nkenhornおよびH.B.F.DixonのAdv.Prot.Chem.29、135-2
03、1975に記述されており、またほとんど全てのアレル
ゲン類は、化学的に糖蛋白質分子から成り、蛋白質部分
が免疫学的特異性の特徴を与える関連部分であることに
注意しなければならない。

Lolium perenneおよびAmbrosiaのアレルゲンをホルムア
ルデヒドを用いて処理することにより、天然アレルゲン
に比べて100-10,000倍アレルゲン活性が低下することが
示されている。該化学修飾のための条件は、Marshによ
って“The Antigens"III巻、317頁、Sela M.編、Academ
ic Press、New Yorkに記述されている。このようにして
得られた生成物は、治療目的で注射投与された場合に満
足な免疫原性を保っているが、その反応性が患者毎に大
きく異なり、従ってある患者に最適であった投与量およ
び投与方法も他の患者に適するとは限らない。

グルタルアルデヒドは、二官能性アルデヒドであるた
め、これを用いた反応は、種々の分子量を有する重合体
の混合物の形成を起こす（例えば、R.PattersonのJ.Imm
unol.110、1413、1973参照。これにおいては、Ambrosia
の抗原Ｅがグルタルアルデヒドを用いた重合に付され、
10-100倍アレルゲン活性が低下した生成物が得られてい
る。あるいは、D.M.MoranおよびA.W.WheelerのInt.Arch
s.Allergy and Applied Immnology、50、693、1976参
照。これにおいては、同様な方法がPhleum pratenseの
アレルゲンに適用されている）。しかしながら、グルタ
ルアルデヒドを用いた重合化は、２種の障害を示す：１）生物から巨大分子を除去するために用いた方法（２
×10⁵から２×10⁷ドルトン）が困難であって、このため
毒性が高いものと思われる;2）反応を停止するための、
グリシン、リジンまたは他のアミノ酸あるいは少なくと
も１個のアミノ基を有する化合物の最終的な添加は、グ
リシンとグルタルアルデヒドの間の合成生成物を生じ、
該生成物は、天然アレルゲンと何ら関連がなく、治療効
果には役に立たない新たなアレルゲン決定基をもたらす
ものと思われる。

アレルゲン修飾のための他の化学的方法は、英国特許12
82163号の目的であって、これにはGramineae花粉アレル
ゲンの無機シアネートを用いた、またはポリアルデヒド
もしくはカルボジイミドを用いた反応工程が記述されて
いる。この方法の目的は、実質的に不溶性であるか、部
分的に水に可溶性である修飾アレルゲンの調製にある。

アルカリ性シアネート法は、酸性媒体中、特にpH5にお
いて行なわれる。起こる反応は、アレルゲンのアミノ基
と、アレルゲン自体のカルボキシル基（シアン酸により
無水物の形態で活性化されている）との縮合である（Me
thod in Enzymology25、579、1972）。いずれにせよ、
英国特許第1,282,163号に開示された方法によれば、ア
レルゲン物質は、水または水溶液に不溶性となるまで重
合される。

上述した先行技術の方法は、いずれの場合にもアレルゲ
ンの重合誘導体の形成を常に生じ、それらはIgEクラス
の特異的抗体に関してより低い結合価をもって特徴付け
られる。

本発明の目的は、対応する天然アレルゲンに対するIgG
クラスの特異的抗体類を誘発する能力を有すると共に、
高度に低減された反応性を有し、更には前述したいわゆ
る“アレルゴイド”の特徴である障害を何ら有していな
い新規な型の化学修飾されたアレルゲンを提供すること
にある。

この限りにおいて、発明者等は天然アレルゲン分子に存
在するある化学基を選択に修飾し、これによって該アレ
ルゲン自体の重合を起こさずに細胞受容体に結合される
IgE類との親和性を修飾する考えを有している。このこ
とは、アレルゲン分子をその蛋白質部分の第一アミノ
基、特に末端アミノ基およびリジン残基のイプシロン−
アミノ基のカルバミル化（またはチオカルバミル化もし
くはグアニジン型の基の形成）に付すことによって得ら
れた。

蛋白質分子のカルバミル化反応は、それ自体当業者に公
知であるが、チロシンの水酸基、システインのスルフィ
ドリル基、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボ
キシル基およびヒスチジンのイミダゾール基等の蛋白質
鎖に存在する他の化学基においても進行し得る（Method
s in Enzymology、25、579、1982）。生理学的pHの条件
においては、これらのすべての誘導体は不安定であり、
その一方、アルファーおよびイプシロン−アミノ基のカ
ルバミル化反応生成物は、逆に極めて安定である。

本発明により示唆されるアレルゲンのアルバミルおよび
チオカルバミル誘導体類は、グアニジン型誘導体も加え
て対応する天然抽出物に対するIgGクラスの特異的抗体
類を誘発し得ることが示され、また、それらは以下の開
示からも明確となるように、天然抽出物に比べて顕著に
低い反応性を示した。

従って、本発明の特定の目的は、アレルゲン活性が該反
応する天然アレルゲン物質に比べて低減され、前記天然
アレルゲン物質に対する特異的抗体類を誘発し得るもの
であって、該天然アレルゲンの蛋白質分子の第一アミノ
基類の大部分が、次の構造、式中、ＸはＯまたはＳを表わし、そしてR₁はＨまたはメ
チル基を表わすを帯するように化学修飾され、かつ重合されておらず、
水性媒体に可溶性であり、ならびにトリプシンの作用に
抵抗性であることを特徴とする化学修飾されたアレルゲ
ン類にある。

修飾された第一アミノ基の平気百分率は、75％〜100％
の間であるべきであり、好ましくは約90％であるべきで
ある。実際、一方において置換の程度が75％未満である
と、化学修飾されたアレルゲン物質の反応性が高すぎ、
他方において、化学的処理が激しい条件で行なわれた場
合にのみ、全部の置換を達成することが可能である。

化学修飾に供せられるアレルゲン抽出物は、異種蛋白質
の混合物からなるため、修飾の程度は平均値にすぎず、
従って75％未満の値であることは、ある種のアレルゲン
蛋白質が高いアレルゲン活性を保つ程度のわずかな修飾
を受けるのみであろうことを意味する。

本発明に基づいて修飾されたＸ＝０またはＳの場合のア
レルゲン類は、アルカリ性雰囲気におけるアルカリ性シ
アネート（KCNOまたはNaCNO）を用いた処理により、ま
たは有機性イソシアネート（R₁‐NCO）を用いた処理に
より、または有機性イソチオシアネート（R₁‐NCS）を
用いた処理により調製され得る。シアネートによる処理
の場合、非置換カルバミル基により修飾されたアミノ基
が得られ、一方、他の２種の試薬を用いることによりそ
れぞれ置換カルバミル誘導体または置換チオカルバミル
誘導体が得られる。該反応は、７〜11の間、好ましくは
９〜9.6の間の範囲のpH値であり、一方、アルカリ性シ
アネートによる処理の場合に、温度は室温〜50℃の間、
好ましくは35℃〜40℃の間の範囲である状態で起こり、
全反応時間は、12〜36時間、好ましくは16〜24時間の間
で変化する。

有機性イソシアネートまたはイソチオシアネートを用い
る化学修飾の場合には、両者ともにより高い反応性を有
し、反応は室温またはそれ以下の温度、好ましくは０℃
〜５℃の間で行なうことが適当であり、一方全反応時間
は、30分間〜８時間、好ましくは２〜４時間の間で変化
し得る。

置換グアニジン型構造を生じるために好適な試薬を用い
て行なわれる修飾の場合には、反応時間、温度および存
在し得る有機溶媒は、当業者によって最適な方法で選択
され得る。

本発明による方法に供されるアレルゲン物質は、花粉、
ダニ、ふけ、菌類、昆虫毒等のアレルゲンを含む物質か
ら、通常は水媒体である適当な溶媒を用いて周知の方法
により物質自体を抽出することにより得られる。得られ
たアレルゲン抽出物は、主として蛋白質類または糖蛋白
質類からなり、これは通常、遊離の炭水化物および色素
等の不純物と混合されており、該抽出物は、例えば透
析、沈殿またはゲルろ過等によりこれらから精製され
る。

使用することができる他の抽出方法は、アレルゲンまた
はその水抽出物をフェノール溶液を用いて処理すること
からなり、該アレルゲンは、次いでフェノール相から回
収される。このような目的を達成するための利用可能な
技術の多くの記述が、J.N.NewellのJ.Allergy、13、11
7、1942に見出せる。

得られたアレルゲン物質は、適当な手段で精製した後に
本発明の目的である方法により処理され得る。本願の知
見の対象である化学修飾は、全抽出物について、半精製
もしくは純粋アレルゲンについて、混合物もしくは単一
に処理された状態で同等に行なうことができる。

これから誘導した化学修飾されたアレルゲン物質は、ど
のみち非重合物質からなっている。

シアネートを用いた処理の場合、例えばアレルゲン抽出
物に固体KCNO（新たに再結晶されたもの）を、最終濃度
が0.1M〜1.5Mの間、好ましくは0.4〜0.8Mの間になるよ
うに加えることができる。該溶液のpHは、ナトリウムテ
トラボレートを固体で加えてアレルゲン抽出物を該塩に
ついて0.1Mとし、必要に応じて1M NaOHにより調節する
ことにより所望の値に保たれる。

有機性イソシアネートまたはイソチオシアネートによる
修飾の場合には、このような化合物は時には水性媒体に
易溶性ではないため、適合する有機溶媒を用いることも
できる。

反応終了後には、化学修飾されたアレルゲン抽出物をゲ
ルろ過にかけて過剰に存在する化学試薬を生じ得る分解
生成物と共に除去し、該抽出物を適当な塩溶液によって
平衡化する。

得られた置換の程度は、アレルゲン蛋白質1mgあたりに
存在するアミノ基を、修飾反応の前後でトリニトロベン
ゼンスルホン酸滴定の方法（HabeebのAnal.Biochem.、1
4、328、1966に記載のとおり）により測定し、あるいは
更に正確には（修飾がアルカリ性シアネートを用いて行
なわれた場合には）、修飾アレルゲンの蛋白質加水分解
物からのリジンの消滅、およびホモシトルリンの出現を
分析することにより決定される（G.R.StarkおよびD.G.S
mithのJ.Biol.Chem.238、214、1963）。

本発明の目的である化学修飾を受けた、例えば卵アルブ
ミン等のアレルゲン性を与えられた蛋白質の、ドデシル
硫酸ナトリウムの存在下におけるポリアクリルアミドゲ
ルによる電気泳動分析（SDS-PAGE）は、天然蛋白質に対
応する分子量（45,000ドルトン）を有する単一の蛋白質
バンドの存在を示し、アレルゲンの重合が完全に回避さ
れたことが示された。

上記方法により化学修飾されたアレルゲン抽出物は、水
性形態に調製され、非経口的、もしくは舌下的、もしく
は経鼻的、もしくは経口的経路によって、または適当な
吸入装置による気管支経路によって、あるいは再構成さ
れ、適当な水性形態として投与されるべき凍結乾燥物と
して、あるいはリポゾーム類もしくは他の“薬剤分配
系”中において経口、非経口もしくは吸入経路を通して
投与されるべき凍結乾燥物として、あるいは、例えばラ
クトース等の不活性賦形剤と組合せられ、適当な吸入装
置により経鼻的もしくは気管支的経路で投与されるべき
粉末として、あるいはラクトース等の不活性賦形型と組
合せられ、かつ適当な方法で腸内分泌物に対して抵抗性
を与えられ得る錠剤に調製された経口投与のための粉末
として調製され得る。

本発明により修飾されたアレルゲン抽出物は、別法とし
てＬ−チロシン、水酸化アルミニウムもしくはリン酸カ
ルシウム等の化合物により、または他の徐放性担体に吸
着されるかもしくは共沈されて、注射部位からの活性主
剤の緩慢な放出がなされる非経口経路により投与され
る。

前記修飾アレルゲン抽出物の調製は、油性懸濁物、シロ
ップ、または液剤の形態で、賦形剤または経口投与に適
した味覚を与える化合物を添加して行なうこともでき
る。

本発明による修飾アレルゲン抽出物の特徴的な単量単位
の性質は、同抽出物を非経口投与に対してのみならず、
経鼻的、経口的、舌下的経路もしくは、活性主剤の粘膜
を通しての適当な吸収を与えるすべてのいかなる投与経
路に対しても、それらの効率を及ぼすために有用であ
る。実際に、高分子量分子（例えばホルムアルデヒド、
グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコール等によっ
て重合されたアレルゲン抽出物）は、上述した構造的解
剖学的障壁に著しく妨げられるか、あるいは横切ること
ができない。

本発明の目的である方法による修飾アレルゲンの経口投
与を与える治療は、特に効果的である。実際に、アレル
ゲン抽出物を構成するアレルゲン蛋白質は、脾臓分泌物
に存在する蛋白質分解酵素により著しく分解され不活性
化されるこが知られているが；本発明の規定に従って修
飾されたアレルゲン抽出物は、インビトロの実験に示さ
れるように、対照的にトリプシン処理に対して極めて抵
抗性があることが分かった。従って、それらは多分、重
要な末梢リンパ系器官であるペイヤー（Peyer）のプラ
ークを通して、最適条件において保護型の好ましい免疫
的刺激を与えることが示され得る。

上述した投与方法の各々によると、本発明の目的である
方法に従って修飾された精製アレルゲンおよびアレルゲ
ン混合物の両者を用いて、単独および混合物の両者にお
いて特異的感受性減退療法は予測し得る方法に基づくこ
とが可能となる。

本発明は、以下の実験的試験と共に示される調製例にお
いて、限定を目的とするものではなく、例示のために開
示されるであろう。

例１ Poa pratensis、Phleum pratense、Holcus lanatusの花
粉の混合物からの水性抽出物（５％重量／体積）を、凍
結乾燥後に蒸留水に約10mg蛋白質/ml（Lowryにより測
定）で溶解させた。次いで該溶液をSephadex^R G-25カラ
ム（Pharmacia）上でゲルろ過し、低分子量化合物を除
去すると共に例えば20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.86
等の適当な緩衝液に平衡化させた。こうして得られた溶
液に、次いで、ナトリウム・テトラボレート・デカハイ
ドレート（3.85g/100ml）およびカリウム・シアネート
（4.15g/100ml）を添加した。次いで、これらの塩を攪
拌して溶解させ、1M NaOHを加えてpH値を9.3に調整し
た。得られた溶液を、密封フラスコ中にて40℃の恒温槽
内で20時間、ゆるやかに攪拌を続けた。該溶液のpH値
を、第一の反応時間の間、1Mリン酸の添加により一定に
保った。反応終了後に、得られた溶液を再度Sephadex^R
G-25カラム上でゲルろ過し、これによって使用した過剰
量のシアネートを除去すると共に、例えばpH7.2のリン
酸緩衝食塩水（PBS）等の適当な緩衝液に平衡化した。
次いで、得られた調製物を0.22ミクロンメンブレン
（Millipore）上で無菌的にろ過し、滅菌バイアル中に
４℃にて貯蔵した。置換の百分率は、トリニトロベンゼ
ンスルホン酸法（TNBS）による測定で87％であることが
分かった。

アレルゲン活性のインビボ試験 18-20gの体重の15匹のBalb/cマウス（１群あたり５匹）
を、天然抽出物またはシアネートにより修飾された抽出
物として、Gramineae混合物の花粉抽出物10gを含む0.25
mlを1mgのAl(OH)₃の存在下に腹腔内投与して免疫した。
動物の第３の群は、他の群について記述したプロトコー
ルに従って、0.25mlのPBS＋1mgのAl(OH)₃のみを与え
た。28日後に、第１回の免疫と同じ物質を用いて追加免
疫投与を各動物に施した。１週間後、動物を切開し、所
属する群毎に血液を集め、次いでマウス−ラット受働的
皮膚過敏性（Ovary、Int.Archs.Allergy Appl.Immuno
l.、3、293、1952）により特異的IgEの存在について試
験した。

以下の第１表に示される結果は、Gramineae混合物の化
学修飾抽出物の特異的IgE誘発能力が、その非修飾抽出
物について示されるものに比べて有意に低減される（0.
01未満のｐ）ことを明らかに示している。

注：生理的溶液＋1mgのAl(OH)₃により、または10マイク
ロｇのGramineae混合物の花粉の天然抽出物＋1mgのAl(O
H)₃により、または10マイクロｇのGramineae混合物の花
粉の修飾抽出物＋1mgのAl(OH)₃により処理されたマウス
の血清の、生理的溶液における100マイクロｌの連続希
釈物を、Sprague-Dowleyラットに皮内的に注射した;48
時間後にこれらの動物に、Gramineae混合物の天然抽出
物1mgおよびEvan Blue 5mgを含む1mlの生理的容液を、
静脈内注射した。1/2時間後に、該動物を切開し、それ
らの背の皮膚を裏返して特徴的斑点の存在を評価した。
7mmの大きさの斑点を与え得る、血清の最終希釈度がPCA
力価として考慮される。

アレルゲン活性のインビトロ試験（RAST阻害）ポリスチレンビーズを活性化し、Gramineae混合物の花
粉天然抽出物を、適当な方法に基づいて固定化した（西
ドイツ特許、DE3338759C1）。

Gramineae花粉に対してアレルギー性の患者の血清20マ
イクロｌを20℃にて試験管中で３時間、Gramineae混合
物の天然抽出物またはそのシアネートで修飾された抽出
物の連続希釈物30マイクロｌと共に前培養した。

次いで、Gramineae混合物の抽出物により感受性を与え
たビーズを各試験管に加え、全部の試験管を室温で一夜
培養し、適当な洗浄後、¹²⁵I−抗−IgE（Sferikit^R、Lo
farma Allergeni、Milan、Italy）の溶液50マイクロｌ
を加え、全部を更に16時間培養した。各試料は、３組調
製した。

培養の終りにビーズの残留放射能をガンマ計数器により
少なくとも１分間の計数時間をもって測定した。相対ア
レルゲンカは、正の血清貯留物のRAST応答の50％をもっ
て阻害可能なアレルゲン抽出物の量により表わされてい
る。

０〜100％の阻害割合は、L.Ymanの式（Develop.Biol.St
andard.29、151、1975）：［（正対照のcpm）−（試料のcpm）］×100/［（正対照
のcpm）−（負対照のcpm）］に従って計算され、ここに
おいて“負”および“正”対照は、それぞれ非特異的放
射能（すなわち、各抽出物により感受性を与えられたビ
ーズの添加前の前培養に対して患者血清に代えてリン酸
緩衝液を加えることによって得られたcpmの値）および
最大放射能（すなわち、阻害試験すべき抽出物の希釈物
に代えてリン酸緩衝液を使用して得た値）を意味する。

アルカリ性媒体中でシアネートにより修飾されたGramin
eae混合物のアレルゲン抽出物は、その非修飾抽出物よ
り有意に力が弱いことが分かった（0.01未満のｐ）。

免疫原活性試験ニュージーランド・ブラック・ラビット（Charles Rive
r、Calco、Como）を、Gramineae混合物の天然または修
飾抽出物3mgをフロイントアジュバント媒体中に含むエ
マルジョンにより免疫した。

21日おきに６回の免疫を行ない、最後の免疫から10日後
に採血をを行ない、Gramineae混合物の天然抽出物によ
り処理されたか、またはGramineae混合物の天然抽出物
の適当な希釈物に対して別々に免疫拡散試験（Octcherl
ony、Progress in Allergy、Ｖ巻、1-78頁、Kallas,P.
編、Karger、New York、1958）にて試験に付した。

参照パラメータとして、アガロースゲル中で沈殿帯を誘
発し得る血清の希釈物を考慮すると、試験した２種の試
料は、何ら差異を示さず、従って、アルカリ媒体中でシ
アネートにより修飾されたGramineae混合物の抽出物
は、その免疫原性（天然抽出物に存在する抗原と交差反
応するIgGを誘発する能力）がほとんど変化していない
という事実が確認された。

毒性分析準慢性毒性 Sprague-Dowley株の20匹のラット（雌10匹および雄10
匹）を、起こり得る毒性評価のために、Gramineae混合
物のシアネート−修飾抽出物を用いて12週間、皮下的経
路により処理し、ここで投与量は臨床的に適当な投与量
の100倍以上であった。

確認のための組織学的レベルにおいてさえも試験された
器官（卵巣、脾臓、肝臓、肺、腎臓、副腎、心臓、胸
腺、脳、リンパ節）には、何らの関連する病的事実は観
察されず、化学修飾が、毒性学的性質を示す誘導生成物
を生するような変化を招かないことが確認された。

ヒトにおける皮膚試験 Gramineae混合物の天然抽出物またはアルカリ性媒体中
でシアネートにより修飾された抽出物の溶液を、適当な
形態で希釈し、次いでGramineae花粉に対してアレルギ
ー性の患者の前腕の手掌側に皮内的に投与した。

この実験の結果は、第２表中に示され、それらは、接種
後15分に行なった紅斑の直径の測定を示している。希釈
溶液を負対照（Coca＋0.03％ヒトアルブミン）として使
用した。

観察されるように、Gramineae混合物の修飾抽出物の反
応性は、その非修飾抽出物より有意に低い（すべての濃
度について0.01未満のｐ）。

例２あらかじめエチルエーテルにより脂質を除去したPariet
aria judaicaの花粉の水性抽出物を、凍結乾燥後、蒸留
水により濃度10mg/ml（マイクロ−ケルダール）として
再度水添した。pH6.86の20mMリン酸緩衝液で平衡化され
たSephadex^R G-25カラム上のゲルろ過後、該蛋白質溶液
を、ナトリウム・テトラボレート・デカハイドレート
（3.85g/100ml）およびカリウム・シアネート（4.15g/1
00ml）の添加により修飾に付した。例１に示したよう
に、pH値の調節後、密封フラスコ中の該蛋白質溶液を恒
温槽内で20時間、ゆるやかな攪拌状態に保った。反応終
了時に、得られた溶液を、過剰な修飾試薬から精製アレ
ルゲン抽出物を分離するために再度Sephadex^R G-25カラ
ム上でのゲルろ過にかけた。選択したクロマトグラフィ
の条件（ゲル体積／試料体積が５より大）は、前記目的
のために適当であり、単純なCoCl₂試験、または例えば
W.R.FearonのBiochem.J.17、84、1923に報告されている
他の試験により明確に証明されるように、過剰のシアネ
ートは、蛋白質分画から全く離れて溶出される。

次いで、該調製物を0.22ミクロンメンブレン（Millipor
e）上で無菌的にろ過し、滅菌バイアル中に４℃にて貯
蔵した。Parietaria judaica花粉の抽出物に存在する色
素が、TNBS試験を著しく妨害するため、置換百分率は、
ホモシトルリンに基づいて計算し、85％であることが分
かった。

アレルゲン活性のインビボ試験体重18-20gのBalb/c株の15匹のマウス（１群あたり５
匹）を、1mgのAl(OH)₃の存在下で、10マイクロｇのPari
etaria花粉の天然抽出物またはそのシアネートにより修
飾された抽出物を含む0.25mlを用いて、腹腔内投与によ
り免疫した。第３群の動物は、他の２つの群について既
に記述したプロトコールに従って、0.25mlのPBS＋1mgの
Al(OH)₃のみを投与された。

28日後に、第１回の免疫と同じ物質を用いて追加免疫投
与を各動物に施した。

１週間後に動物を切開し、それらの血液を属する群毎に
集め、貯蔵し、各々の血清についてマウス−ラット受働
的皮膚過敏性により特異的IgEの存在を試験した。

以下の第３表に示される結果は、Parietariaの修飾抽出
物の特異的IgE誘発能力が、Parietariaの非修飾抽出物
により示されるものに比べて有意に低減されていること
が示されている（0.01未満のｐ）。

注：生理的溶液＋1mgのAl(OH)₃により、または10マイク
ロｇのParietariaの花粉の天然抽出物、または10マイク
ロｇのParietariaの花粉の修飾抽出物により処理された
マウス血清の生理的溶液における100マイクロｌの連続
希釈物を、Sprague-Dowley株のラットに皮内的に注射し
た:48時間後にこれらの動物に、Parietariaの花粉の天
然抽出物1mgおよびEvan Blue 5mgを含む1mlの生理的溶
液を静脈注射した。1/2時間後に、該動物を切開し、そ
れらの背の皮膚を裏返して特徴的斑点の存在を評価し
た。7mmの大きさの斑点を与え得る血清の最終希釈度がP
CA力価として考慮される。

アレルゲン活性のインビトロ試験ポリステレンビーズをグルタルアルデヒドにより活性化
し、Parie taria judicaの天然抽出物を適当な方法（西
ドイツ特許、DE3338759C1）により固定化した。Parieta
ria judicaの花粉に対してアレルギー性の患者の血清20
マイクロｌを、20℃にて試験管内で３時間、Parietaria
の天然抽出物またはそのアルカリ性媒体中でシアネート
により修飾された抽出物の連続希釈物30マイクロｌと共
に前培養した。次いで、例１に記載したように感受性を
与えたビーズを各試験管に加え、全部の試料を室温にて
一夜培養し、適当な洗浄後、¹²⁵I−抗−IgEの溶液50マ
イクロｌを加え、20℃における培養を更に16時間行なっ
た。

各試料についてビーズの残留放射能をガンマ計数器によ
り、少なくとも１分間の計数時間をもって測定した。

相対アレルゲンカは、正の血清貯留物のRAST応答の50％
をもって阻害可能なアレルゲン抽出物の量により表わさ
れている。

０〜100％の阻害割合は、L.Yman式（Develop.Biol.Stan
dard.29、151、1975）：［（正対照のcpm）−（試料のcpm）］×100/［（正対照
のcpm）−（負対照のcpm）］に従って計算され、ここに
おいて“負”および“正”対照は、それぞれ非特異的放
射能（各抽出物により感受性を与えられたビーズの添加
前の前培養に対して患者血清に代えてリン酸緩衝液を加
えることによって得られた）および最大放射能（阻害試
験すべき抽出物の希釈物に代えてRAST緩衝液を使用して
得た）を意味する。

Parietaria花粉の修飾抽出物は、天然形態である場合の
同抽出物より有意に力が弱いことが分かった（0.01未満
のｐ）。

免疫原性試験ニュージーランド・ブラック・ラビット（Charles Rive
r、Calco、Como）を、Parietaria花粉抽出物3mgを含む
エマルジョンを用いて免疫し、前記抽出物はフロイント
アジュバント媒体中の天然またはシアネートによる修飾
物であった。

３週間おきに６回の免疫を行ない、最後の免疫から10日
後に採血を行ない、Parietaria花粉の天然抽出物により
処理されたか、またはシアネートにより修飾された同抽
出物により処理されたラビットから採取した血清を、Pa
rietaria花粉の天然抽出物の適当な希釈物に対して別々
にOctcherlonyの方法に従って免疫拡散試験に供した。

参照パラメータとしてアガロースゲル中に沈殿帯を誘発
し得る血清の希釈物を考慮すると、試験された２種の試
料の間に何らの有意な差異が観察されず、従って、本発
明の目的である方法に従ってシアネートにより修飾され
たParietaria花粉の抽出物の免疫原性は、ほとんど変化
されずに保たれているという事実が確認された。

毒性分析：準慢性毒性 Sprague-Dowley株の20匹のラット（雌10匹および雄10
匹）を、シアネートにより修飾されたParietaria花粉抽
出物の250マイクロｇに対応する投与量（臨床的使用の
ために設定される投与量の100倍以上の投与量に相当す
る）をもって12週間、皮下的経路により処理した。

処理の終りに各動物を切開し、その器官を起こり得る毒
性的損傷の有無を評価するために検査した。

考慮した器官（肝臓、肺、脾臓、心臓、腎臓、副腎、
脳、胸腺、卵巣、リンパ節）において、関連する何らの
巨視的および／または組織学的な病的所見も観察され
ず、Parietaria由来の花粉抽出物の化学修飾が、誘導生
成物に毒性効果をもたらすような変化を誘発しない事実
が確認された。

ヒトにおける皮膚試験天然型または例２に従ってシアネートにより修飾された
Parietaria由来の花粉抽出物を、適当に希釈し、次いで
Parietaria花粉に対してアレルギー性の患者の前腕の手
掌側に皮内的に投与した。

結果は、第４表中に示され、それらは接種後15分に行な
った紅斑の直径の測定を示している。

希釈溶液（Coca＋0.03％ヒトアルブミン）を負対照とし
て使用した。

第４表を観察して導かれるように、アルカリ性媒体中で
シアネートにより修飾されたParietaria花粉抽出物のア
レルゲン反応性は、修飾されていない同抽出物に比べて
有意に低減されている（0.01未満のｐ）。

例３皮癬▲ひ▼亜目のダニ、Dermatophagoides pteronyssin
us（DP）の水性抽出物（重量／体積で５％）を凍結乾燥
により濃縮し、次いで最小体積の20mMリン酸ナトリウム
緩衝液pH6.86に取り、同じ緩衝液で溶出するSephadex^R
G-25によるゲルろ過を行ない、排除されたピークを集め
た。1.92gのナトリウム・テトラボレート・デカハイド
レートおよび2.05gのカリウムシアネート（50％エタノ
ールから50℃以下の温度で新たに再結晶された）を、50
mlの溶液にした。添加した塩を溶解させ、かつ1M NaOH
によりpHを9.3に調節した後、該ゲルろ過抽出物を恒温
槽内で40℃に22時間保った。最初の１時間に1Mリン酸の
添加によりpHを調節した。こうして得られた調製物を、
過剰の試薬を除くために再度ゲルろ過にかけ、0.22ミク
ロンMilliporeメンブレンで無菌化し、滅菌バイアル中
に分別して４℃にて貯蔵した。TNBS試験により評価した
アミノ基の置換百分率は、84％であることが分かった。

アレルゲン活性のインビボ試験体重18-20gのBalb/c株の15匹のマウス（１群あたり５
匹）を、アジュバントとしての1mgのAl(OH)₃の存在下
で、10マイクロｇのDPの天然抽出物またはそのシアネー
トにより修飾された抽出物を含む0.25mlの生理的溶液を
用いて、腹腔内投与により免疫した。第３群の動物は、
上述のプロトコールに従って、0.25mlの生理的溶液＋1m
gのAl(OH)₃のみを投与された。

28日後に、第１回目の免疫に用いたものと同じ物質を用
いて追加免疫を各動物に施した。

１週間後に動物を切開し、それらの血液試料を属する群
毎の貯蔵中に集め、各血清を受動的皮膚過敏性により特
異的IgEの存在に関して試験した。

以下の第５表に示される結果は、アルカリ性媒体中でシ
アネートにより修飾されたDP抽出物の特異的IgE誘発能
力が、非修飾DP抽出物により示されるものに比べて有意
に低減されていることを示している（0.01未満のｐ）。

注：生理的溶液＋1mgのAl(OH)₃により、または10マイク
ロｇの天然DP抽出物＋1mgのAl(OH)₃もしくは修飾DP抽出
物＋1mgのAl(OH)₃により処理されたマウス血清の生理的
溶液における100マイクロｌの連続希釈物を、Sprague-D
owleyラットに皮内的に注射した;48時間後にこれらの動
物に、天然DP抽出物1mgおよびEvan Blue 5mgを含む1ml
の生理的溶液を静脈注射した。1/2時間後に該動物を切
開し、それらの背の皮膚を裏返して特徴的斑点の存在を
評価した。7mmの大きさの斑点を与え得る血清の最終希
釈度がPCA力価として考慮される。

アレルゲン活性のインビトロ試験ポリステレンビーズを活性化し、該天然DP抽出物をこれ
に適当な方法（西ドイツ特許、DE3338759C1）により固
定化した。

該DP抽出物に対してアレルギー性の患者の血清20マイク
ロｌを、20℃にて３時間、試験管内で、該天然DP抽出物
またはそのアルカリ性媒体中でシアネートにより修飾さ
れた抽出物の連続希釈物30マイクロｌと共に前培養し
た。

次いで、該DP抽出物により感受性を与えたビーズ（前述
のようにして）を各試験管に加えた。全部の試料を室温
にて一夜培養し、適当な洗浄後、50マイクロｌのヒト
¹²⁵I−抗IgEを加え、全部の試料を更に16時間培養し
た。

各試料は３組毎調製した。培養の終了時にビーズの残留
放射能を、ガンマ計数器により１分間の計数時間をもっ
て測定した。試験した２種の抽出物の相対的生物学的能
力は、正の対照試料の応答を50％阻害可能な抽出物の量
によって表され、以下のYman式：［（正対照のcpm）−（試料のcpm）］×100/［（正対照
のcpm）−（負対照のcpm）］に従って得られ、ここにお
いて“負”対照および“正”対照は、それぞれ非特異的
放射能（各抽出物が結合されたビーズの添加前の前培養
段階において患者の血清に代えてリン酸緩衝液を加える
ことによって得られた）および最大放射能（阻害試験す
べき抽出物に代えて緩衝液を用いることにより得られ
た）を意味する。

アルカリ媒体中でシアネートにより修飾されたアレルゲ
ン性DP抽出物は、同非修飾抽出物に比べて有意に力が弱
いことが分かった（0.01未満のｐ）。

例４ 0.05mlのメチルイソシアネートを、0.2Mイミダゾールを
含むpH9.3の0.1Mナトリウムテトラボレート緩衝液中の
卵アルブミン溶液（10mg/ml）5mlに加え、ここで該溶液
は氷浴により０−４℃に冷却されており、添加は、攪拌
しつつ、0.5′、10′および15′に行なった。60分後、
該蛋白質溶液をpH6.86の20mMリン酸緩衝液により平衡化
されたSephadex^R G-25カラムを通してゲルろ過にかけ、
過剰のメチルイソシアネートおよび分解生成物を除去し
た。

TNBS試験により測定した置換程度は、89％であった。RA
ST−阻害試験において、このように修飾された卵アルブ
ミンは、非修飾卵アルブミンより有意に力が弱いことが
分かった。

例５アセトニトリル中のメチルイソチオシアネートの12％
（重量／体積）溶液0.05mlを、攪拌しつつ０′、20′、
40′および80′に、氷浴により０−４℃に冷却された0.
2Mイミダゾール溶液を含むpH9.3の0.1Mナトリウムテト
ラボレート緩衝液中の卵アルブミン溶液（10mg/ml）5ml
に添加した。３時間後に該蛋白質溶液を、前述の例と同
様にゲルろ過にかけた。

TNBS試験により測定した置換程度は、81％であった。

RAST−阻害試験において、修飾卵アルブミンは、非修飾
卵アルブミンより有意に力が弱いことが分かった。

本発明を、その好ましい実施態様について特定的に参照
して開示したが、その修飾および／または変更は、本発
明の精神および範囲を離れることなく当業者により導入
され得るものと理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ジョバンニミストレロイタリア国ミラノ，ビアカドレ，ナンバー６ (56)参考文献特公昭49−35413（ＪＰ，Ｂ１)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アレルゲン活性が対応する天然アレルゲン
物質に比べて低減され、前記天然アレルゲン物質に対す
る親和性を有する特異的抗体を誘発し得る化学修飾され
たアレルゲンであって、前記天然アレルゲンの蛋白質分
子の第一アミノ基の大部分が、次の構造、（式中、ＸはＯまたはＳを表わし、そしてR₁はＨまたは
メチル基を表わす）を帯するように化学修飾され、かつ
重合されておらず、水性媒体に可溶性であり、そしてト
リプシンの作用に抵抗性であることを特徴とする化学修
飾されたアレルゲン。
【請求項２】修飾された第一アミノ基の平均百分率が、
75％〜100％の範囲である請求項１に記載のアレルゲ
ン。
【請求項３】前記百分率が約90％である請求項２に記載
のアレルゲン。
【請求項４】アレルゲン活性が対応する天然アレルゲン
物質に比べて低減され、前記天然アレルゲン物質に対す
る特異的抗体を誘発し得る化学修飾されたアレルゲンで
あって、該対応する天然アレルゲン物質を、アルカリ性
媒体中でアルカリ性シアネート、有機性イソシアネート
または有機性イソチオシアネートにより処理することに
よって得ることができることを特徴とする化学修飾され
たアレルゲン。
【請求項５】前記処理がpH7〜11、室温〜50℃の温度、
および12〜36時間の範囲の全期間にわたりアルカリ性シ
アネートを用いて行なわれる請求項４に記載のアレルゲ
ン。
【請求項６】前記処理を通じて、pHが９〜9.6である請
求項５に記載のアレルゲン。
【請求項７】前記処理を通じて、温度が35℃〜40℃であ
る請求項５に記載のアレルゲン。
【請求項８】前記処理の全時間が16〜24時間である請求
項５に記載のアレルゲン。
【請求項９】前記処理がpH7〜11、室温と同等またはそ
れ以下の温度、および30分間〜３時間の間の全時間にお
いて有機性イソシアネートまたは有機性イソチオシアネ
ートを用いて行なわれる請求項４に記載のアレルゲン。
【請求項１０】前記処理を通じて、pHが９〜9.6である
請求項９に記載のアレルゲン。
【請求項１１】前記処理を通じて、温度が０℃〜５℃で
ある請求項９に記載のアレルゲン。
【請求項１２】前記処理の全時間が２〜４時間である請
求項９に記載のアレルゲン。
【請求項１３】対応する天然アレルゲン物質を、塩基性
媒体中でアルカリ性シアネート、または有機性イソシア
ネート、または有機性イソチオシアネートを用いて処理
することからなる、アレルゲン活性が対応する天然アレ
ルゲン物質に比べて低減され、前記天然アレルゲン物質
に対する親和性を有する特異的抗体を誘発し得る化学修
飾されたアレルゲンであって、前記天然アレルゲンの蛋
白質分子の第一アミノ基の大部分が、次の構造、（式中、ＸはＯまたはＳを表わし、そしてR₁はＨまたは
メチル基を表わす）を帯するように化学修飾され、かつ
重合されておらず、水性媒体に可溶性であり、そしてト
リプシンの作用に抵抗性であることを特徴とする化学修
飾されたアレルゲンの製造方法。
【請求項１４】前記処理がpHが９〜9.6で行なわれる請
求項13に記載の方法。
【請求項１５】前記処理が、室温〜50℃の温度、および
12〜36時間の全時間においてアルカリ性シアネートを用
いて行なわれる請求項13または14のいずれか一つに記載
の方法。
【請求項１６】前記温度が35℃〜40℃である請求項15に
記載の方法。
【請求項１７】前記処理が、室温またはそれ以下の温
度、および30分間〜８時間の全時間において、有機性イ
ソシアネート、または有機性イソチオシアネートを用い
て行なわれる請求項13または14のいずれか一つに記載の
方法。
【請求項１８】前記温度が０℃〜５℃である請求項17に
記載の方法。
【請求項１９】請求項１〜12に記載の化学修飾アレルゲ
ン類を、生理学的に許容される担体または賦形剤と共に
含有する医薬調製物。