KR100234792B1 - 제감작제 - Google Patents

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Abstract

일본 삼목 화분을 수용성 용매로 추출한 추출물로부터 얻은 분자량 (SDS-PAGE) 약 50,000달톤, 등전점 약 8.8 및 N 말단으로부터의 부분 아미노산 배열 Asp-Asn-Pre-Ile-Asp-Ser-을 가진 삼목 화분 알레르겐을 유효성분으로 함유하는 제감작제 (除感作濟)를 제공한다.

Description

[발명의 명칭]
제감작제 (除感作濟 : hyposensitization agent)
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 제감작제 (際感作濟 : hyposensitization agent) 에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 N 말단으로부터의 순서로 Asp-Asn-Pro-Ile-Asp-
Ser- 의 부분 아미노산 배열을 가진 삼목 화분 (杉木 花紛) 알레르겐 (cedar polle
n allergen)을 함유하는 제감작제에 관한 것이다.
삼목화분증 (cedar pollinosis) 은 삼목이 개화 (開花) 시에 흩날리는 삼목화분으로 인해 일어나는 알레르기성 질환이다.
현재 일본에서는 삼목의 조림 면적이 증가함에 따라 삼목 화분증 환자가 점차 증가하고 있다. 삼목 화분증은 계절병은 아닐지라도 공중위생상 무시할 수 없는 질환이다.
이에 대한 통상의 치료는, 예컨데 스테로이드 호르몬이나 디소디움 크로몰리케이트 (disodium cromolicate)를 투여하는 것이다. 이러한 치료는 환자의 증후를 일시적으로 완화하는 증상 치료이다.
한편, 삼목 화분증을 진단한다거나 삼목 화분증을 근치하는 시도의 하나로서 삼목 화분증 환자에게 삼목 화분 알레르겐 그 자체를 투여하는 제감작하는 진단·치료 방법이 주목을 받고 있다. 그러나 현행의 제감작 요법 등에 있어서는 여전히 일본 삼목의 화분을 수성매체중에서 추출하여 적당히 희석했을 뿐이어서 극히 조잡한 상태의 삼목 화분 알레르겐이 그대로 환자에게 투여되고 있다. 이러한 추출물은 동일한 추출방법이더라도 원료인 화분 나름데로의 조성이나 약효가 대폭적으로 쉽사리 변동하여 일정한 제감작 효과를 얻을 수 없는 결점이 있다.
이러한 상황에서 삼목 화분증을 정확히 진단하기 위해서도, 그리고 삼목 화분증을 안전하고도 효과적으로 치료하기 위해서도 삼목 화분 알레르겐을 모두 단리하여 그 성질과 성상을 해명함으로써 제감작제를 제공하는 것이 사계의 급선무로 되어 있다.
본 발명자들은 삼목 화분증을 예방하고 치료하는데 사용할 수 있는 새로운 제감작제를 개발하기 위하여 삼목 화분 알레르겐에 대하여 연구를 계속한 결과, 말단으로부터의 순서로 Asp-Asn-Pro-Ile-Asp-Ser- 의 부분 아미노산 배열을 가진 삼목 화분 알레르겐을 함유하는 제감작제가 본 발명의 목적을 달성할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 명세서에서 사용하는 각 부호는 다음과 같은 아미노산 잔기를 나타낸다.
Ala : 알라닌 잔기
Arg : 아르기닌 잔기
Asn : 아스파르긴 잔기
Asp : 아스파라트산 잔기
Gln : 글루타민 잔기
Gly : 글리신 잔기
Ile : 이소로이신 잔기
Lys : 리신 잔기
Met : 메티오닌 잔기
Pro : 프롤린 잔기
Ser : 세린 잔기
Trp : 트립토판 잔기
위의 각 아미노산 잔기는 L-배열을 이루고 있다.
본 발명에 있어서, 삼목 화분 알레르겐은 일본 삼목 (Cryptomeria japonica
), 예컨데 오모테 삼목 (Omote Sugi : 일본 삼목 원종), 우라 삼목 (Ura Sugi : 일
본 삼목 이종) 의 화분으로부터 만든 것들을 포함하며, 이들은 N-말단에서 순서로 Asp- Asn-Pro-Ile-Asp-Ser-, 특히 Asp-Asn-Pro-Ile-Asp-Ser-X-Tr
p-Arg-Gly-Asp-Ser-Asn-Trp-Ala-Gln-Asn-Arg-Met-Lys-(X는 Ser
, Cys, Thr 또는 His) 의 부분 아미노산 배열을 가진 알레르겐이 좋다.
본 발명의 삼목 화분 알레르겐은 인간을 비롯한 포유류에 있어서 삼목 화분증을 야기하는 성질이 있다. 이 성질에 의하여 본 발명의 삼목 화분 알레르겐은 종래 공지의 삼목 화분 추출물과 마찬가지로 포유류에 투여하면 삼목 화분 알레르겐에 대해 현저한 제감작 효과를 발휘하여 삼목 화분증을 진단·치료하기 위한 제감작제로서 광범한 용도를 가진 것으로 된다.
삼목 화분증을 치료하기 위한 제감작제에 배합할 경우에는 본 발명의 삼목 화분 알레르겐을 당류와의 복합체로 하는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용할 수 있는 당류는 호모-글리칸 (homo-glycan) 및 헤테로-글리칸, 예컨데 전분, 아밀로오스, 덱스트란, 폴리수크로오스, 풀룰란, 엘시난, 쿠르들란, 아라비아 고무, 트라가칸트 고무, 구아르 고무, 크산탄 고무, 카라기이난 (carrageenan), 펙틴, 셀롤로오스, 글루코만난, 키토산 및 지방 다당류(lipopolysa
ccharide) 와 이들의 유도체 및 부분 가수분해물인데, 이들은 500∼10,000,000, 바람직하게는 10,000∼1,000,000의 평균 분자량을 갖는다.
풀룰란, 엘시난 및 이들의 부분 가수분해물 등의 말토트리오스(maltotriose
) 잔기를 반복 단위로 하는 수용성 비이온성 다당류에 화분 알레르겐을 공유 결합시킴으로써 된 제감작제는 원래의 삼목 화분 알레르겐으로부터 야기될 수 있는 과민증을 방지함과 아울러 삼목 화분증에 대한 탁월한 효능의 제감작제를 용이하게 제조할 수 있다.
미생물, 예컨데 대장균(E. coli), 살모넬라(Samonella) 또는 세라티아(Serratia) 로부터 유도된 지방 다당류와 이들의 부분 가수분해물 등의 헤테로-글리칸에 공유 결합된 삼목 화분 알레르겐을 함유하는 제감작제는 점막 등의 조직에 우수하게 결합하기 때문에 경피 투여 및 점막 투여용의 제감작제로 유용하다.
본 발명에 있어서, 삼목 화분 알레르겐과 당류 사이에 공유 결합을 형성할 수 있는 방법이면 어떤 방법이라도 사용할 수 있는데, 예컨대 디아조 결합, 펩티드 결합, 알킬화 결합, 가교 결합, 2 황화물 결합, 아미도 결합 및 고요오드산 산화법(period
ate-oxidation) 등이 있다.
디아조 결합법에서는 방향족 아미노기 [예 : p-아미노벤질기, p-아미노벤조일기, m-아미노벤질기, m-아미노벤조일기, m-아미노아니솔기, m-아미노벤질옥시메틸기, 3-(p-아미노페녹시)-2-히드록시프로피오닐기, 3-(p-아미노-m-메틸 아닐리노)-5-클로로트리아지날기 등]를 통상의 방법으로 당류에 도입하여 수득한 활성화 당류와 삼목 화분 알레르겐을 반응시킨다.
펩티드 결합법에서는 당류 카보네이트 및 브롬화 시아노겐-활성화 당류 등의 활성화 당류 (이들은 아지드, 산염화물, 카르보디이미드 또는 이소시아네이트와 반응시켜 수득하는 카르복실기 함유 당류 유도체이다) 와 삼목 화분 알레르겐을 반응시킨다.
알킬화 결합법에 있어서는 클로로아세틸기, 브로모아세틸기, 요오도아세틸기, 트리아지닐-할라이드 등의 기를 도입한 당류의 알킬 할라이드 유도체와 삼목 화분 알레르겐을 반응시킨다.
가교 결합법에서는 다기능제 (예 : 글루타르알데히드, 글리옥살, 숙신알데히드, 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 톨루엔-2, 4-디이소시아네이트, 비스-아조벤지딘, N, N′-에틸렌-비스-말레이미드 등) 와 함께 당류와 삼목 화분 알레르겐을 반응시킨다.
아미드 결합법에 있어서는 아미드기 함유 당류와 할로아실할라이드 (예 : 브로모아세틸브로마이드, 클로로부티릴클로라이드, 플루오로프로피오닐플루오라이드, 요오드발레릴아이오다이드 등)를 반응시켜 수득한 활성화 당류와 삼목 화분 알레르겐을 반응시킨다.
공유 결합에 사용되는 당류에 대한 삼목 화분 알레르겐의 중량비는 통상 1 : 0.001∼1 : 1,000, 바람직하게는 1 : 0.01∼1 : 100이다.
생성하는 삼목 화분 알레르겐-당류 공유 결합물이 삼목 화분 알레르겐에 특이적인 이뮤노글로불린 G 및 이뮤노글로불린 M 항체의 생산성을 실질적으로 저해하지 않고, 과민증과 알레르기를 야기하는 이뮤노글로불린 E 항체의 생산성을 감소시킬 수 있는 반응 조건이라면 어떠한 반응 조건이라도 이용할 수 있으며, 반응은 통상 온도 약 0℃∼100℃ 및 pH 약 3∼12에서 0.1∼50시간 실시한다.
이와 같이 하여 수득한 삼목 화분 알레르겐-당류 공유 결합물을 통상의 방법, 예컨대 여과, 세척, 원심분리, 염석, 투석 (dialysis), 이온 교환 수지에 의한 흡착 및 탈착, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그라피, 친화성 크로마토그라피 및 전기 영동 등의 방법으로 분리 정제한 후 용액과 시럽으로 회수하거나, 필요에 따라 건조하여 분말성으로 회수함으로써 삼목 화분증 제감작제를 제조할 수 있다.
삼목 화분증을 치료, 예방함에 있어 본 발명의 제감작제는 원래의 그대로 사용하거나 필요에 따라 안정제, 방부제, 보조제 또는 부형제와 함께 배합하여 사용할 수 있다.
종래의 삼목 화분 알레르겐에 비하여 본 발명의 제감작제는 원래의 삼목 화분 알레르겐에 특이적인 이뮤노글로불린 G 및 이뮤노글로불린 M 항체의 생산성을 현저하게 증대시키는 반면, 이 알레르겐에 특이적이고 과민증 및 알레르기를 야기하는 이뮤노글로불린 E 항체의 생산성을 현저히 감소시킨다. 삼목 화분증 환자에게 제감작제를 투여하면, 이 알레르겐에 특이적인 이뮤노글로불린 E 항체량을 최소 수준으로 감소시킬 수 있다.
원래의 삼목 화분 알레르겐에 비하여 본 발명의 제감작제는 다음과 같은 이점이 있다. 즉, 본 발명의 제감작제는 유리용기나 금속용기 등의 용기에 흡착되지 아니하므로 낭비가 거의 없고, 안정성이 높으며 과민증 유발의 우려없이 투여할 수 있고, 제감작 기간을 약 1/3∼1/200로 단축할 수 있다.
본 발명의 제감작제는 통상 주사제, 예컨대 동결 건조 주사제 또는 주사액제로 제조하여 피내, 피하, 근육내 또는 복강내에 0.01∼100,000ng/1 회/성인의 양으로 1주간에 1∼2회 투여하여 약 1∼12 개월 치료하여 기대 효과를 달성한다.
또한, 본 발명의 제감작제는 경피 투여 또는 점막 투여에 적합한 형태, 예컨대 트로치, 설하제, 정제, 점안제, 비강내 분무제, 젖은 찜질제, 크림제 또는 로우션제 등으로 제제화 할 수 있다. 그 투여량과 투여 회수는 기대하는 감퇴 효과에 따라 선택할 수 있다.
경피 투여 또는 점막 투여 등의 국부 투여에 있어서 본 발명의 제감작제는 삼목 화분 알레르겐과 삼목 화분증 환자의 조직에 결합되어 있는 이뮤노글로불린 E 항체 사이의 결합을 차단할 수 있다. 이러한 작용은 본 발명의 제감작제가 투여된 부위에서 즉시에 국부적으로 나타나서 환자의 고통을 즉시 완화시킬 수 있다.
본 발명의 제감작제는 삼목 화분증 뿐만아니라 노송나무 (Chamaecyparis obtusa) 의 화분증의 예방제와 치료제로서 효과적으로 사용할 수 있다.
이하, 실험에 의해 본 발명을 구체적으로 설명한다.
[실험 Ⅰ-1]
[삼목 화분 알레르겐 제조]
일본국 지바껜 지방에서 생장하는 일본 삼목 (Omote Sugi) 으로부터 채취한 삼목 화분에 중량으로 15배량의 0.125M 탄산 수소 나트륨 수용액 (pH 8.0)을 가하고, 혼합액을 4℃에서 1시간 동안 천천히 교반하여 추출한 후 원심 분리하였다. 잔류물을 위와 마차가지 방법으로 추출 처리하고 원심 분리하였다. 수득한 상청액 (supernatants)을 한데 모아 여기에 황산 암모늄을 가하여 염석하여 80% 포화액을 형성시키고, 생성된 침전물을 투석하여 여과하였다.
여액을 칼럼 크로마토그라피 (사용 수지 :
Figure kpo00001
, Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden) 로 처리하였다. 비흡착 획분을 모아 다시 칼럼 크로마토그라피 (사용 수지 :
Figure kpo00002
, Pharmacia LKB Bio-technology AB, Uppsala, Sweden) 처리하고, 인산염 완충 용액 (pH 7.0) 으로 용출시킨 다음, 수득한 용액을 칼럼 크로마토그라피 (사용 수지 : Mono
Figure kpo00003
S, Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden) 처리한 후, 트리스-HC1 완충액 (pH 7.0) 으로 용출함으로써 삼목 화분증 환자의 이뮤노글로불린 E 항체에 강한 친화력을 나타낼 뿐 아니라 항 (anti) 삼목 화분 알레르겐 마우스 모노클로날 항체에도 강한 친화력을 나타내는 정제된 삼목 알레르겐액을 원료인 삼목 화분에 대하여 고형물당 약 0.02%의 수율로 얻었다.
이 삼목 화분 알레르겐은 SDS-폴리아클릴아미드 겔 전기 영동법에 의해 약 50,000 ± 5,000 달톤의 분자량을 나타내었고, 그 등전점은 약 8.8 이었다.
삼목 화분 알레르겐의 부분 아미노산 배열은 기상 단백질 시퀀서(gas-phase protein sequencer) 로 시료를 분해하고 고속 액체 크로마토그라피로 확인하여 조사하였다 [참조 : The Journal of Biological Chemistry, Vol. 256, pp.7990-7997 (1981)]. 그 결과, 삼목 화분 알레르겐의 부분 아미노산 배열은 Asp-Asn-Pro-Ile-Asp-Ser-, 더욱 상세하게는 Asp-Asn-Pro-Ile-Asp-Ser-X-Trp-Arg-Gly-Asp-Ser-Asn-Trp-Ala-Gln-Asn-Arg-Met-Lys- (X는 Ser, Cys, Thr 또는 His 임) 임이 확인되었다.
이러한 이화학적인 성질을 가진 일본 삼목 유래의 삼목 화분 알레르겐은 아직까지 알려져 있지 않은 신규물질인 것으로 판단된다.
[실험 Ⅰ-2]
[삼목 화분 알레르겐-풀룰란 (pullulan) 공유 결합물 제조]
2w/v %풀룰란 용액 (평균 분자량 : 300,000) 100㎖에 1.7w/v %시아누릭 클로라이드의 아세톤 용액 2㎖를 가하였다. 이 혼합액을 얼음 냉각수중에서 5℃이하로 유지하면서 5% 탄산 나트륨 수용액을 가하여 pH 7.0으로 조정한 다음 위의 온도와 pH를 유지하면서 2시간 반응시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 pH를 유지하면서 4℃물로 하룻밤 투석함으로써 활성화 풀룰란 용액을 수득하였다. 활성화 풀룰란 용액 30㎖를 약 1㎎/㎖의 정제 삼목 화분 알레르겐 (위의 실험 Ⅰ-1의 방법에 따라 수득한 것)을 함유하는 용액 40㎖에 가하고, 이 혼합물을 교반하면서 pH 7.0, 37℃에서 5시간 교반한 다음, 5℃에서 하룻밤 방치한 후, 6g의 글리신을 가하고 생성 혼합물을 교반하면서 10시간 유지하였다. 이어서, 0.01M 아세테이트 완충액 (pH 5.0) 으로 투석하고, 칼럼 크로마토그라피 (사용 수지 :
Figure kpo00004
) 처리하였다. 비흡착획분을 막여과 (membrane-filter) 하여 알레르겐-풀룰란 공유 결합물을 수득하였다.
수율은 삼목 화분 알레르겐 단백질에 대하여 60%이었다. 이 제품은 원래의 삼목 화분 알레르겐과는 달리 안정성이 높고, 유리용기나 금속용기에 흡착되어 낭비되는 일이 없기 때문에 취급이 용이하다.
[실험 Ⅰ-3]
[동물에 대한 투여 시험]
[실험 Ⅰ-3-1 : 예방 활성 시험]
실험 Ⅰ-2의 방법에 따라 수득한 알레르겐-풀룰란 공유 결합물을 알레르겐으로서 1㎍을 함유하는 생리식염수 0.2㎖를 10∼12 주령 되는 마우스 (BALB/c 암컷) 1군 (6마리) 에 1주 1회씩 3주간 복강내 투여하고, 1주일 경과후 실험 Ⅰ-1의 방법에 따라 수득한 삼목 화분 알레르겐 1㎍과 보조제로서 수산화알루미늄 4㎎을 함유하는 생리식염수 0.2㎖를 위와 같은 방법으로 각 마우스에 투여하였다.
원래의 삼목 화분 알레르겐에 특이적인 이뮤노글로불린 G, 이뮤노글로불린 M 및 이뮤노글로불린 E 항체의 양을 삼목 화분 알레르겐 및 수산화 알루미늄 혼합물의 복강내 투여 직전 채취한 혈액 시료와 혼합물 복강 투여 1주일 후 채취한 다른 혈액 시료로부터 측정하였다.
대조로서 알레르겐-풀룰란 공유 결합물 대신에 실험 Ⅰ-1의 방법에 따라 제조한 삼목 화분 알레르겐 1㎍과 실험 Ⅰ-2에서 사용한 것과 동일한 신선한 풀룰란 40㎍과의 혼합물을 각 마우스에 투여하였다.
또한, 이뮤노글로불린 G 및 이뮤노글로불린 M 항체의 양은 Japanese Journal of Medical Science and Biology, Vol.28, pp.127-138 (1975) 에 기재되어 있는 수동 혈구 응집 반응에 의한 항체가 (antibody titer)로 비교하였고, 이뮤노글로불린 E 항체의 양은 Life Science, Vol.8, Part Ⅱ, pp.813-820 (1969) 에 기재되어 있는 수동 피부 과민 반응에 의한 항체가로 비교하였다. 그 결과는 표 1에 나와 있다.
Figure kpo00005
주 : 각 값은 6마리 마우스를 1군으로 한 이뮤노글로불린 항체의 이뮤노글로불린 항체가의 평균값이다.
표 1에서 명백히 할 수 있는 바와 같이, 삼목 화분 알레르겐과 풀룰란의 혼합물과는 달리 본 발명의 삼목 화분 알레르겐-풀룰란 공유 결합물은 삼목 화분증을 예방하는 제감작제로서 효과가 현저히 크다.
[실험 Ⅰ-3-2 : 치료 효과 시험]
실험 Ⅰ-1의 방법에 따라 수득한 삼목 화분 알레르겐 1㎍과 보조제로서 4㎎의 수산화 알루미늄의 혼합물을 함유하는 0.2㎖의 생리식염수를 10∼12 주령되는 마우스 (BALB/c 암컷) 6마리 1군에 1주 1회씩 3주간 복강내 투여하였다. 복강내 투여 2주 경과후 실험 Ⅰ-2의 방법에 따라 수득한 삼목 화분 알레르겐-풀룰란 공유 결합물을 알레르겐으로서 1㎍ 함유하는 생리식염수 0.2㎖를 위와 같은 방법으로 각 마우스에 1주 3회, 3주간 투여하였다.
또한, 삼목 화분 알레르겐 및 수산화 알루미늄 혼합물을 마우스에 투여하여 이뮤노글로불린 E 항체의 형성을 증진시켰다.
이뮤노글로불린 G, 이뮤노글로불린 M 및 이뮤노글로불린 E 항체량을 삼목 화분 알레르겐-풀룰란 공유 결합물의 최종 복강내 투여 직전 및 투여 1주일후 마우스로부터 채취한 혈액 시료로 측정하였고, 또한 삼목 화분 알레르겐 및 수산화 알루미늄 혼합물을 복강내 투여하여 이뮤노글로불린 E 항체를 유도한지 1주일 경과후 마우스로부터 채취한 또 다른 혈액 시료로 측정하였다.
대조 시험으로 삼목 화분 알레르겐 및 풀룰란 혼합물을 삼목 화분 알레르겐-풀룰란 공유 결합물 대신 실험 Ⅰ-3-1과 마찬가지로 사용하였다. 그 결과는 표 2에 나와 있다.
Figure kpo00006
주 : 각 값은 6마리 마우스를 1군으로 한 이뮤노글로불린 항체의 이뮤노글로불린 항체가의 평균값이다.
표 2에서 명백히 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 삼목 화분 알레르겐-풀룰란 공유 결합물은 삼목 화분 알레르겐 및 풀룰란의 혼합물과는 달리 삼목 화분증 치료에 있어 제감작제로서의 효과가 현저히 크다.
삼목 화분 알레르겐 및 수산화 알루미늄 혼합물을 투여하여 미리 감작용시켜 이뮤노글로불린 E를 생성시킨 마우스에 삼목 화분 알레르겐-풀룰란 공유 결합물을 함유하는 생리식염수를 구강내 및 비강내에 분무하고, 1시간후에 마우스에 원래의 삼목 화분 알레르겐을 구강내 및 비강내에 다시 분무하여 관찰하였으나 일어나야할 알레르기 반응은 관찰되지 않았다.
상술한 바와 같이 본 발명의 삼목 화분 알레르겐-당류 공유 결합물은 삼목 화분증을 치료 및 예방하는데 효과적인 제감작제로 이용할 수 있는데, 이는 공유 결합물이 과민증 유발할 우려가 없이 높은 제감작 효과를 발휘하기 때문이다.
[실험 Ⅱ-1]
[삼목 화분 알레르겐과 지방 다당류와의 공유 결합물]
10㎎의 지방 다당 (대장균류의 미생물로부터 유도된 것)을 함유하는 10mM 인산 칼슘 용액 1㎖에 100mM 과 요오드산 나트륨 60㎖를 가하고, 이 혼합물을 상온에서 20시간 반응시켜 지방 다당중의 특정한 당쇄 (saccharide chain)을 개열 (開裂) 시킨 다음 반응 혼합물을 4℃에서 1M 글리신-HC1 완충액 (pH 4.4)으로 하룻밤 투석하여 과량의 과요오드산 나트륨을 제거하였다.
수득한 용액을 0.1M 탄산 수소 나트륨 완충액으로 약 pH 9.5로 조절하여 지방 다당 용액을 제조하였다.
실험 Ⅰ-1의 방법에 따라 제조한 삼목 화분 알레르겐 10㎎을 인산염 완충액 1㎖에 용해하고, 이 혼합액에 지방 다당 용액을 가한 다음 삼목 화분 알레르겐 및 지방 다당의 쉬프 염기 (schiff base)를 생성시켰다.
이 반응 혼합물에 소디움 보로하이드라이드를 가하여 결합 반응을 완결시켰다. 수득한 용액을 칼럼 크로마토그라피 (사용 수지 :
Figure kpo00007
G-100, Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden) 처리하고, 삼목 화분 알레르겐-지방 다당 공유 결합물 함유 획분을 회수한 후, 이를 막여과 (membrane-filter) 하여 삼목 화분 알레르겐-지방 다당 공유 결합물을 수득하였다.
생성물의 수율은 삼목 화분 알레르겐 단백질에 대하여 약 40%이었다.
원래의 삼목 화분 알레르겐과는 달리, 이 제품은 유리용기나 금속용기에 흡착되지 않기 때문에 손실이 거의 없고 취급이 용이하다.
[실험 Ⅱ-2]
[동물에 대한 투여 시험]
[치료 효과 시험]
실험 Ⅱ-1의 방법에 따라 제조한 10㎍의 삼목 화분 알레르겐-지방 다당 공유 결합물을 함유하는 생리식염수 1㎖를 10∼12 주령 마우스 (BALB/c 암컷) 6 마리 1 군에 1 주 3 회씩 3 주간 경구 투여하고, 투여 1 주일 경과후 마우스로부터 혈액을 채취하여 원래의 삼목 화분 알레르겐에 특이적인 이뮤노글로불린 A, 이뮤노글로불린 G 및 이뮤노글로불린 E 항체의 양을 측정하였다.
대조 시험으로서 원래의 삼목 화분 알레르겐과 지방 다당의 혼합물을 삼목 화분 알레르겐-지방 다당 공유 결합물 대신 위와 같은 방법으로 마우스에 경구 투여하였다. 이뮤노글로불린 A 및 이뮤노글로불린 G 항체량을 효소 면역 분석법 [참조 : Journal of Immunological Methods, Vol.6, pp.355-362 (1975)]으로 측정한 항체가와 비교하는 한편, 이뮤노글로불린 E 항체량을 실험 Ⅰ-3-1 에 기재된 수동 피부 과민증 반응에 따라 측정한 항체가로 비교하였다. 그 결과는 표 3에 나와 있다.
Figure kpo00008
주 : 각 값은 6 마리 마우스를 1 군으로 한 이뮤노글로불린 항체의 이뮤노글로불린 항체가의 평균값이다.
표 3에서 명백히 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 삼목 화분 알레르겐-지방 다당 공유 결합물은 삼목 화분 알레르겐 및 지방 다당의 혼합물과는 달리, 삼목 화분증의 예방과 치료에서 효과적인 제감작제로 사용할 수 있다.
미리 삼목 화분 알레르겐 및 수산화 알루미늄의 혼합물을 투여하여 이뮤노글로불린 E 항체 생성을 유발시킨 마우스에 삼목 화분 알레르겐-지방 다당 공유 결합물을 함유한 생리식염수를 구강내와 비강내에 분무하였다. 분무 30 분후 원래의 삼목 화분 알레르겐을 구강내와 비강내에 다시 분무하고 관찰하 바, 알레르기성 반응은 유발되지 않았다.
삼목 화분 알레르겐-지방 다당 공유 결합물과 같은 삼목 화분 알레르겐-헤테로 글리칸 공유 결합물은 삼목 알레르겐-풀룰란 공유 결합물과 같은 삼목 화분 알레르겐-호모글리칸 공유 결합물 보다 점막에서의 흡수성이 뛰어나다.
그 이유는 삼목 화분 알레르겐-지방 다당 공유 결합물은 비교적 장기간 점막에 흡착되기 때문이다. 이러한 이유로 삼목 화분 알레르겐-헤테로 글리칸 공유 결합물은 경구 투여와 비강내 투여 등의 피하 또는 점막하 투여에서 효과적인 제감작제로 사용된다.
다음에 실시예를 통해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
[실시예 1]
[실시예 1 (1)]
[삼목 화분 알레르겐의 제조]
일본국 아끼다껜 지방에 생장하는 일본 삼목 (Ura Sugi) 으로부터 채취한 삼목 화분을 실험 Ⅰ-1 의 방법에 따라 처리하여 정제된 삼목 화분 알레르겐 용액을 제조하였다. 그 수율은 원료 삼목 화분에 대하여 고형물당 약 0.015%이었다. 정제 삼목 화분 알레르겐은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 의한 분자량이 약 50,000±5,000 달톤이었고 등전점이 약 8.8 이었다.
실험 Ⅰ-1 의 방법에 따라 삼목 화분 알레르겐의 부분 아미노산 배열을 조사한바, N-말단에서 시작하는 20번째 까지의 아미노산 잔기로 이루어진 부분 아미노산 배열은 실험 Ⅰ-1 에 기재한 일본 삼목 (Omote Sugi) 으로부터 제조한 화분 알레르겐과 동일하였다.
[실시예 1 (2)]
[제감작제]
평균 분자량 약 140,000의 풀룰란 5g을 400㎖의 물에 용해하고, 수득한 용액을 1N NaOH용액으로 pH 10.7 되게 조정한 다음, pH를 유지하면서 3g의 시아노겐 브로마이드를 서서히 용액에 가하여 1시간 반응을 시켰다. 반응 혼합물을 1N HC1로 pH 5.0 되게하고 pH를 유지하면서 냉수로 투석하여 활성화 풀룰란 용액을 수득하였다.
활성화 풀룰란 용액에 실시예 1 (1) 의 방법에 따라 제조한 삼목 화분 알레르겐 용액 200㎖를 가하고 이 혼합액을 실온에서 24시간 반응시켰다. 반응이 완결된 후 반응 혼합물에 아세톤 (1 : 3의 용량비)을 가하여 침전을 석출시키고, 침전물을 모아 0.01M 아세테이트 완충액 (pH 5.0) 에 용해시킨 다음 불용성 물질을 원심 분리하여 제거하였다. 상청액을 칼럼 크로마토그라피 (사용 수지 : CM-
Figure kpo00009
) 처리하고 비흡착 획분을 모아 막여과하였다. 여액을 앰플에 담아 삼목 화분 알레르겐-풀룰란 공유 결합물을 함유하는 액체 제감작제를 제조하였다.
수율은 삼목 화분 알레르겐 단백질에 대하여 약 70% 이었다. 이 제품은 과민증 현상을 유발할 염려없이 탁월한 감퇴 작용을 나타내기 때문에 삼목 화분증의 예방 및 치료에 효과적으로 사용할 수 있다.
원래의 삼목 화분 알레르겐과는 달리, 이 제품은 유리용기나 금속용기에 흡착되어 낭비되는 것이 거의 없고 안정성이 높기 때문에 취급이 용이하다.
[실시예 2]
평균 분자량 약 10,000의 풀룰란 부분 가수분해물 52g을 110㎖의 디메틸 포름아미드에 가열하면서 용해시킨 다음, 이 혼합액을 실온으로 냉각하고 10㎖의 피리딘을 가하였다. 수득한 혼합액을 교반하면서 여기에 1.0g의 4-니트로 벤조일 클로라이드를 가한 후, 실온에서 17시간 방치한 다음, 이 반응 혼합물에 2배량의 n-프로필 알콜을 가하여 침전을 석출시키고, 침전물을 모아 디메틸 포름아미드에 용해시켰다. 상기 침전 조작을 3회 반복하였다. 생성 침전물을 한데 모아 5w/v% 소디움 히드로술파이트 수용액 100㎖에 용해시켰다. 이 혼합액을 80℃에서 30분간 방치하고, 이어서 활성탄으로 탈색한 후 2배량의 n-프로필 알콜을 가하여 침전시켰다. 침점물을 물에 녹여서 된 용액을 물로 하룻밤 투석한 다음 2℃ 이하로 냉각하고 교반하에 염산을 가하여 약 0.1M의 최종 농도의 용액을 얻었다. 생성 혼합물에 아질산 나트륨을 가하여 농도를 약 1w/v% 되게 하고 30분간 반응시킨 후 2℃ 이하에서 2시간 증류수로 투석하여 활성화 풀룰란의 부분 가수분해물을 수득하였다.
활성화 풀룰란 부분 가수분해물에 실험 Ⅰ-1의 방법에 따라 일본 삼목 (Omote Sugi) 으로부터 수득한 삼목 화분 알레르겐을 함유하는 용액 20㎖를 가하고, 이 혼합물에 탄산 나트륨 수용액을 가하여 pH 8.5 로 조절한 다음, 이 혼합액을 교반하면서 4℃에서 2 시간 결합 반응시킨 후, 실시예 1과 동일하게 정제 처리하여 앰플에 충전함으로써 삼목 화분 알레르겐-풀룰란 부분 가수분해물 공유 결합물을 함유하는 액체 제감작제를 수득하였다.
그 수율은 삼목 화분 단백질에 대하여 약 60% 이었다.
실시예 1의 제품과 마찬가지로 본 실시예의 액체 제감작제는 안정성이 높고 유리용기나 금속용기 흡착에 의한 낭비가 거의 없기 때문에 삼목 화분증을 예방하고 치료하는데 효과적으로 사용할 수 있으며 취급이 용이하다.
[실시예 3]
평균 분자량 약 200,000의 엘시난 10g을 200㎖의 증류수에 교반하면서 용해시킨 다음, 이 용액을 실온으로 냉각하고 5g의 헥사메틸렌디아민을 가하였다. 이 혼합액에 1N NaOH 용액을 가하여 pH 11.0 으로 조절하고 얼음물 냉각하에 20℃ 이하로 방치한 다음, 온도와 pH를 유지하면서 5g 의 시아노겐 브로마이드를 가하였다. 혼합액의 온도와 pH를 유지하면서 30분간 반응시킨 다음, 반응 혼합액을 4℃의 증류수로 1시간 투석하여 활성화 엘시난 용액을 수득하였다.
활성화 엘시난 용액에 25w/v% 글루마트알데히드 2㎖ 와 실험 Ⅰ-1의 방법에 따라 일본 삼목 (Omote Sugi) 으로부터 수득한 삼목 화분 알레르겐을 함유하는 용액 60㎖를 가하고, 또한 여기에 1M 아세테이트 완충액 (pH 5.0) 10㎖를 가하여 4℃에서 24시간 교반하면서 결합 반응시켰다. 반응 혼합액에 글리신을 가하여 1M 농도의 용액을 만들고 실온에서 24시간 방치한 다음 원심 분리하였다. 상청액을 겔 여과하고 삼목 화분-엘시난 공유 결합물을 함유하는 획분을 모아 농축한 후 막여과하였다. 여액을 앰플에 충전하여 동결건조 처리후 밀봉함으로써 삼목 화분 알레르R겐-엘시난 공유 결합물을 함유하는 고체 제감작제를 수득하였다.
그 수율은 삼목 화분 알레르겐 단백질에 대하여 약 50% 이었다.
실시예 1의 제품과 마찬가지로 상기 제품은 취급이 용이하고 삼목 화분증을 예방하고 치료하는데 효과적으로 사용할 수 있다.
[실시예4]
평균 분자량 약 20,000의 1w/v% 카르복시메틸 셀룰로오스 용액 200㎖에 2g의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드-메티오디드를 가하고, 혼합액의 pH를 4.0 으로 조절한 후, 이 pH를 유지하면서 실온에서 교반하에 2시간 반응시켰다.
반응 혼합물을 증류수로 하룻밤 투석하여 활성화 카르복시메틸 셀룰로오스 용액을 제조한 다음, 상기 용액에 삼목 화분 알레르겐 (실시예 1 (1) 의 방법에 따라 일본 삼목 (Ura Sugi) 으로부터 수득한 것)을 함유하는 용액 50㎖를 가하고, 활성화 카르복시메틸 셀룰로오스와 삼목 화분 알레르겐을 실온에서 pH 4.5로 유지하고 교반하면서 하룻밤 결합 반응시켰다. 생성된 공유 결합물을 실시예 3의 방법과 마찬가지로 정제하고 앰플에 충전하여, 삼목 화분 알레르겐-카르복시메틸 셀룰로오스 공유 결합물을 함유하는 액제 제감작제를 수득하였다.
그 수율은 삼목 화분 알레르겐 단백질에 대하여 약 30% 이었다.
이 제품은 삼목 화분 알레르겐-풀룰란 공유 결합물 및 삼목 화분 알레르겐-엘시난 공유 결합물 보다 원래의 삼목 화분 알레르겐에 특이적인 이뮤노글로불린 G 및 이뮤노글로불린 M 항체의 생산성은 약간 떨어지지만, 알레르겐에 특이적인 이뮤노글로불린 E 항체를 생성시키지 않기 때문에 취급이 용이하고, 삼목 화분증을 예방하고 치료하는데 효과적인 제감작제로 사용할 수 있다.
[실시예 5]
살모넬라속 (屬) 의 미생물로부터 유도된 지방 다당 100㎎을 약 4℃의 50% 나트륨 아세테이트 포화 용액 25㎖에 가하고, 0.5N NaOH를 가하여 pH 9.0으로 조절한 다음 생성 혼합물에 브로모아세틸브로마이드 20㎕ 및 무수디옥산 1㎖ 의 혼합액 (pH 약 8.5)을 한방울씩 첨가하였다. 이 혼합액에 6N HC1을 가하여 pH를 약 4,5 로 조절하고 4℃의 물로 5일간 투석하여 활성화 지방 다당 용액을 수득하였다. 활성화 지방 다당 용액에 실시예 1 (1)의 방법에 따라 제조한 삼목 화분 알레르겐 용액 40㎖를 가하고, 혼합액의 pH를 4.5 로 유지하고 교반하면서 25℃에서 2일간 반응시킨 후, 반응 혼합물을 실시예 3의 방법과 마찬가지로 정제 처리하고 앰플에 충전하여, 삼목 화분 알레르겐-지방 다당 공유 결합물을 함유하는 액체 제감작제를 수득하였다.
이 제품의 수율은 삼목 화분 알레르겐 단백질에 대하여 약 35% 이었다.
이 제품은 점막 결합성이 우수하고 비교적 장기간 국부 흡수되어 체류하므로 점막에서의 흡수가 용이하고, 경구 투여와 비강내 투여 등의 피하 및 점막하 투여로서 삼목 화분증에 탁월한 치료 효과를 주는 제감작제이다.
이상 설명한 바와 같이 본 발명은 N 말단에 특정의 아미노산 배열을 가진 일본 삼목 유래의 신규한 삼목 화분 알레르겐의 발견에 근거한 것이다. 본 발명은 아미노산 배열의 일부까지가 해명된 삼목 화분 알레르겐을 제공하는 것이고, 이러한 삼목 화분 알레르겐은 인간을 비롯한 포유류에 투여하면 삼목 화분 알레르겐에 대해 안정한 제감작 효과를 발휘한다. 따라서 본 발명의 삼목 화분 알레르겐은 삼목 화분증을 진단·치료하기 위한 제감작제에 유리하게 배합 사용할 수 있을 뿐만아니라 삼목 화분증진단, 치료하기 위한 제감작제의 표준 물질로서도 유용하다. 이렇게도 유용한 삼목 화분 알레르겐은 본 발명의 제조방법에 의하여 비교적 용이하게 소망량을 제조할 수가 있다.

Claims (5)

  1. N 말단으로부터의 순서로 Asp-Asn-Pro-Ile-Asp-Ser- 의 부분 아미노산 배열을 가진 삼목 화분 알레르겐을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 제감작제.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 삼목 화분 알레르겐은 N 말단으로부터의 순서로 Asp-Asn-Pre-Ile-Asp-Ser-X-Trp-Arg-Gly-Asp-Ser-Asn-Trp-Ala-Gln-Asn-Arg-Met-Lys- (단 "X"는 "Ser", "Cys", "Thr" 또는 "His" 이다) 의 부분 아미노산 배열을 가진 것을 특징으로 하는 제감작제.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 삼목 화분 알레르겐은 SDS-PAGE 에서의 분자량이 약 50,000달톤이고 등전점이 약 8.8 인 것을 특징으로 하는 제감작제.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 삼목 화분 알레르겐은 일본 삼목 화분을 수용성 용매로 추출하고, 추출된 삼목 화분 알레르겐을 추출물로부터 채취하여 수득되는 것을 특징으로 하는 제감작제.
  5. 청구항 4에 있어서, 채취단계는 Mono
    Figure kpo00010
    -S 칼럼을 사용하는 칼럼 크로마토그래피 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제감작제.
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