JPH07500725A - 組換え毛様体向神経因子およびｃ−末端切断毛様体向神経因子の精製ならびに末梢神経障害の処置方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換え毛様体向神経因子およびＣ−末端切断毛様体向神経因子の精製ならびに末 梢神経障害の処置方法発明の背景 本発明は、同神経因子およびとくに毛様体向神経因子（ＣＮＴＦ）　、ならびに ＣＮＴＦの精製方法および組換えＣＮＴＦの製造方法に関する。

重篤な精神的および身体的疾廃は中枢神経系の神経またはダリア細胞の死によっ て生じる。神経またはダリア細胞の死は、アルツハイマー病やパーキンソン病な らびに多発性硬化症のような神経変性疾患、卒中による虚血。

または自然の老化過程によって起こりうる。

同神経因子とは、神経またはダリア細胞の生残および機能的活動性を促進する１ 群の分子である。上に列挙した状態によって生じる神経またはダリア細胞の死ま たは機能不全を防止するための処置として、同神経因子が有用であることを示唆 する証拠がある（　Ａｐｐｅｌ、　１９８１．　Ａｎｎ。

Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　１０：４９９）　。

このような同神経因子で性質が最もよくわかっているものは、神経成長因子（Ｎ ＧＦ）である、　ＮＧＦは、アルツハイマー病においてまた加齢とともに死滅す る前脳コリン作動性神経細胞に対する同神経因子であることが明らかにされてい る。これらの神経細胞の喪失は一般に、アルツハイマー病および老齢化に伴う多 くの認知欠損の原因と考えられている。

動物実験により、　ＮＧＦは外傷後の前脳コリン作動性神経細胞の死滅を防止し また加齢によって生じる認知喪失を回復できることが証明されている（　Ｈｅｆ ｔ１　＆　Ｗｅｔｎｅｒ、１９８６、Ａｎｎ、Ｎｅｕｒｏｌｏ　ｙ　２０：２７ ５；　Ｆｉｓｈｅｒら、　１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ、　３２９：６５）　、　 これらの結果は、この同神経因子が、ヒトにおいて、疾患、外傷または加齢によ る前脳コリン作動性神経細胞の死滅によって起こる認知喪失の処置に臨床的に有 用である可能性を示唆するものである。

向神経因子の使用上の問題点は２合致した膜受容体を有する神経細胞の亜集団の みに対するそれらの特異性である。生体内の大部分の神経細胞はＮＧＦ受容体を 欠き。

この向神経因子には明らかに応答しない、したがって。

ＮＧＦが支持しない様々の種類の神経またはダリア細胞の生残を支持することが できる新しい向神経因子の発見がきわめて重要である。

新しい向神経因子は、　ＮＧＦに応答しない培養神経細胞の生残を支持する能力 によって探索されてきた。広く用いられたスクリーニングアッセイの一つは、骨 格筋および平滑筋を刺激する毛様体神経節運動ニューロンの生残を促進する因子 を発見するように設計されている。これらの毛様体神経節神経細胞は副交感神経 系に属し、それらの生残はＮＧＦによっては支持されない。

毛様体神経節神経細胞の生残を促進する因子の存在は。

様々な組織および種で報告されてきた。これらの毛様体神経節句神経活性の多く は、以下の類似の化学的および生物学的性質を有する。すなわち　（１）活性は 坐骨神経に高濃度に存在する；（２）同神経活性は、　ＳＤＳポリアクリルアミ ド還元ゲル上での電気泳動時に、イオン性界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム （５ＤＳ）および還元剤、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）またはジチオス レイトール（ＤＴＴ）に暴露しても残存する；（３）このようなゲル上で活性は 見掛けの分子１１２４〜２８ｋｄで移動する（Ｃｏｌｌｉｎｓ。

１９８５、　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０９：２５５− ２５８；Ｍａｎｔｈｏｒｐｅら、１９８６．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、３ ６７：２８２−２８６）これらの類似の性質に基づき１通常「毛様体向神経因子 」またはｒ　ＣＮＴＦＪと呼ばれる同一または密接に関連した分子が２毛様体神 経節向神経活性の原因であるとすることが提起されてきた。すなわち、　ＣＮＴ Ｆの語は、培養毛様体神経節神経細胞の生残を促進する上述の性質をもつ物質を 指す機能的定義として使用された。

ＣＮＴＦには広範な科学的興味がもたれているにもかかわらず、天然起源からの 実質的な量の精製が難しく、またヒトＣＮＴＦが入手できないために、疾患時ま たは外傷後に神経細胞の生存能を維持するその価値を明らかにする試みは妨げら れてきた。これまでのラットＣＮＴＦの精製の試みでは、粗神経抽出物に対し比 活性で８００倍程度にまで濃縮されている（　Ｍａｎｔｈｏｒｐｅら、１９８６ ．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、３６７：２８２−２８６）　。

しかしながら、比活性での約８００倍の上昇は単−蛋白種の製造には不十分であ った。すなわち、　Ｍａｎｔｈｏｒｐｅらによって報告された方法で得られた。

活性の上昇を示す生成物は、多数の蛋白種を含んでいて不十分であった。

適当な生物活性をもつ単−蛋白種が得られるようにＣＮＴＦの精製を達成するこ とが望まれたのである。

公開ＰＣＴ出願（ＰＣＴ／ＵＳ９０１０００２２．国際出願番号：　ＷＯ９０１ ０７３４１）にＣｏ１１ｉｎｓらはウサギ坐骨神経抽出物からのＣＮＴＦの精製 を報告し、ウサギおよびヒトＣＮＴＦをコードする核酸配列ならびにウサギおよ びヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列を発表している。　Ｃｏ１１ｉｎｓの引例にはま た１両動物におけるＣＮＴＦの組換え製造および細菌発現系が記載されている。

この公開出願はこの記述によりとくに本明細書に導入される。

本発明はさらに、様々な疾患および医学的状態の予防および処置方法を記述する ０本明細書に記載の方法による予防および処置に適当な疾患および医学的状態に 共通の要素は、末梢神経系に対する障害である。

末梢神経系は、を髄および脳の外部に軸索を広げるそれらの神経細胞により構成 される。末梢神経系における主要な種類の神経細胞は、骨格筋を刺激して運動を 制御する一次運動ニューロン、心脈管系および他の内臓を刺激してそれらの機能 を調節する自律神経ニューロン（交感および副文感両神経）、ならびに体内全体 の感覚受容体を刺激して痛みおよび固有受容を含めた感覚を伝える感覚ニューロ ンである。

１または２以上のこれらの種類の末梢神経細胞の生残および適切な機能を危うく する状態が末梢神経障害を生じる。このような障害は物理的傷害によっても起こ る。

これらは傷害部位またはその近傍を通過する末梢神経細胞の軸索に変性を生じる 。このような傷害は神経毒素。

たとえば癌およびエイズ化学療法剤、それぞれシスブラチナムおよびジデオキシ シチジン（ｄｄｅ）への意図的または偶発的な暴露によっても起こる。この種の 傷害はまた慢性的代謝病、たとえば糖尿病または腎機能不全からも起こる。この ような傷害は、神経変性疾患、たとえば−次運動ニューロンの変性、その結果運 動機能不全を生じる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）でも起こる。

上述のように、明瞭に特徴づけられるこのような末梢神経傷害は、末梢神経細胞 およびそれらの軸索の機能および／または生残を危うくする１本発明は、末梢神 経細胞を肋できる処置、すなわち１通常末梢神経傷害を導（状態の効果に逆らっ て末梢神経細胞の正常機能および生残を促進するか、または末梢神経傷害の効果 を逆転もしくは最小限にする処置に関する。

末梢神経細胞傷害を処置する本明細書に記載の方法は。

ヒト蛋白毛様体同神経因子（ＣＮＴＦ）の投与を包含する。

ＣＮＴＦは、細胞培養で、！歯類胚またはヒナ胚の末梢交感および副交感自律神 経ニューロンならびに末梢感覚ニューロンの生残を支持することが、これまでに 示されている　（Ｍａｎｔｈｏｒｐｅら、１９８９．Ｃ１１ｉａｒｙ　Ｎｅｕｒ ｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒｓ。

Ｎｅｒｖｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ、Ｒ，Ａ、Ｒｕ５ｈ編、Ｊｏｈｎ　 Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ。

Ｌｔｄ、）　、動物末梢神経細胞に対する唯一の実験で、　ＣＮＴＦは、新生仔 ラットにおいて、脳運動神経をその軸索の傷害後に回復させ得たことが示唆され ている（　５ｅｎｄｔｎｅｒら１１９９０、Ｎａｔｕｒｅ　３４５：４４０）　 、　ＣＮＴＦが動物で自律または感覚神経細胞を支持できることを示す結果は報 告されていない、また９本発明以前には、　ＣＮＴＦが爽懲動物において何らか の種類の末梢神経細胞を支持しうろことの証明はなされていない。

末梢神経傷害の予防または処置のためのＣＮＴＦの適切な用量および投与経路に 関する有用な情報がほとんどまたはまったく知られていないことは明白である。

動物で行われた唯一の実験では、単回用量のＣＮＴＦが実験的に傷害を与えた神 経の切断端に直接適用されている（Ｓｅｎｄｔｎｅｒら、　１９９０．焦ａｔｕ 駐３４５：４４０）　、末梢神経傷害の大部分は。

単一の神経の切断が関与するものではな（、生体全体の神経細胞およびそれらの 軸索に広がり、それらが関与するものである。これらの全身的状態の処置には、 　ＣＮＴＦは全身的または局所的に投与されることが必要で、単純に単一神経の 切断端に投与されるものではない、したがって、　５ｅｎｄｔｎｅｒの報告にお ける用量および投与経路の情報は、実用的な使用には、極めて限られた意味しか ない。

今日まで、末梢神経傷害の予防または回復に有効な用量でのＣＮＴＦの全身的ま たは局所的送達方法に関する報告は皆無である。

本発明においては、　ＣＮＴＦの全身的ならびに局所的投与方法が提供され、こ れらの方法によって使用されたＣＮＴＦが成熟動物において末梢神経傷害の予防 および回復に有効であることを最初に証明するものである。各種形態の末梢神経 傷害の処置に必要な、　ＣＮＴＦの適切な投与経路および適切な用量も開示され る。これらの方法は、疾患の種類によって、主としてＣＮＴＦの投与方法および 使用される用量の点で相違する。

発明の要約 本発明の目的は、Ｃ−末端のアミノ酸が切断されている図１に示すようなアミノ 酸配列を有する組換えヒト毛様体向神経因子蛋白質を提供することにある。　Ｃ ＮＴＦの好ましい切断型では、２個または６個のアミノ酸が切断されている。

本発明はまた。　ＣＮＴＦのＣ−末端切断型をコードするＤＮＡ配列からなる発 現ベクター、ならびにそれらの細菌および好ましくは大腸菌発現系での発現を提 供する。

さらに９本発明は、　ＣＮＴＦの切断型を実質的に含まない組換えヒトＣＮＴＦ を提供する。

さらにまた２本発明は、（ａ）可溶性ＣＮＴＦ蛋白質を含有する細胞ライゼート を、　ＣＮＴＦを可逆的に結合するアニオン交換カラムに適用し、（ｂ）アニオ ン交換カラムに結合したＣＮＴＦ蛋白質を塩で溶出してＣＮＴＦからなる分画を 集め。

（ｃ）ＣＮＴＦ蛋白質を含む分画をカチオン交換カラムに適用し、　（ｄ）ＣＮ ＴＦ蛋白質を約７から約８．５のｐＨ勾配で溶出してＣＮＴＦからなる分画を集 め、（ｅ）ＣＮＴＦ蛋白質を含む分画をアニオン交換カラムに適用し、ついで（ ｆ）実質的に精製されたＣＮＴＦ蛋白質を塩勾配で溶出する工程からなる。実質 的に精製されたＣＮＴＦの製造方法を提供する。

処置方法、末梢神経傷害の予防または処置に適当な医薬の製造のための治療有効 量のＣＮＴＦの使用、ならびに治療有効量のＣＮＴＦからなる末梢神経傷害の予 防または処置のための薬剤を包含する。とくに１本発明は、末梢神経傷害の予防 または回復のために、治療有効量のＣＮＴＦを治療に有効な投与経路で投与する 方法を提供する９本発明はまた。様々な原因による末梢神経傷害の予防または回 復のためにこれらの方法が適切であることを証明する。

上述の一般的記載および以下の詳細な説明は例示および説明のみのためのもので 、請求の範囲に記載された本発明を限定するものではないことを理解すべきであ る。

図面の簡単な説明 図１は、ヒトＣＮＴＦのＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す、ヒトＣＮＴ Ｆコード配列はアミノ酸３８と３９の間に位置する単一の約１．３−ｋｂイント ロンによって中断されている。この部位におけるスプライスアクセプター／ドナ ー配列ｉｔ　：　［ＧＴＡＡＧＴ、、、１．３ｋｂ、、、ＴＴＴＣＣＴＧＴＡＴ ＣＣＴＣＧＧＣＣＡＧ］である０発現ベクターの構築に用いられた内部Ｈｉｎｄ ｍおよびＮｈｅ１部位は、クローニングに使用したオリゴヌクレオチドとともに 下線を付した。

図２は、ヒト、ウサギおよびラットＣＮＴＦの推定アミノ酸配列を示す、アミノ 酸配列は単一文字記号で示す、右側の番号はヒト配列における位置を指示する。

配列が３種のすべてで同一な領域には陰影を付した。推定ウサギ蛋白質はヒトま たはラットＣＮＴＦよりアミノ酸１個短いので、アラインメントを最大にするた めに、ウサギの配列にはギヤツブ（ダッシュで示す）を導入した。

図３は、最初のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換クロマトグラフィーカラム（ 工程３）から溶出された選ばれた分画のＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析を示す、細胞抽出 液をＱ−３ｅｐｈａｒｏｓｅのカラム（１，５Ｘ　２０ｃｍ）上クロマトグラフ ィーに付した。クロマトグラムを２　ｍ１７分で展開し２ｍ１分画を集めた０選 ばれた分画を５ＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ゲルをＣＢＢで染色した。電気泳動には 、サンプル（１５μｌ、レーン１および２．または３０μｍ、レーン３〜２８） を５ＤＳ−サンプル緩衝液（最終濃度＝１０％グリセ０−／ｌ／、１％ＤＤＴ、 　０．５％ＳＤＳ、　０．００２％ブロモフェノールブルーおよび２５ｍＭ　Ｔ ｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ６，８）中に希釈し、２分間煮沸した。ゲルレーンの説 明：１および２＝それぞれＰＥＩ処置前後の粗抽出物；３〜２Ｂ＝１２〜６２か らの偶数番号分画、左端の数字は同時に電気泳動した標準蛋白のＭｒ値（Ｘ　１ Ｏ−２）を示す、　ＣＮＴＦはトリプシノーゲン標準（Ｍｒ＝　２４．０００） と共移動し、　ＣＮＴＦブールは分画１８〜５０である。

図４は、　Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換クロマトグラフィー（工程４）を 示す、第一のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから得られたＣＮＴＦブールを透析 して、第二のＱ−３ｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ｉ、ｓｘ　１５０１１１）　上ク ロマトグラフィーに付した。クロマトグラムを２ｍｌ／分で展開し２ｍ１分画を 集めた０選ばれた分画を電気泳動用に調製し、　５ＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ゲル を銀染色した。挿入図はＣＮＴＦブールの電気泳動分画（分画１１４〜１３０） の蛋白質含量を示す、レーンの説明：ｌ〜９＝それぞれ１１４．１１６．１１８ ．１２０．１２２および１２４の５μｍ分画ならびに１．２６，１２８および１ ３０の１０μｍ分画、左端の数字は同時に電気泳動した標準蛋白のＭｒ値（×ｌ ０−３）を示す。

図５は、　Ｓ−３ｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換クロマトグラフイー（工程５）を 示す、工程４からのＣＮＴＦブールを透析して。

Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＩＸｌｏｃｍ）上クロマトグラフィーに付した 。クロマトグラムを２　ｍ１７分で展開し、４ｍｌの分画を集めた０選ばれた分 画を電気泳動用に調製し、　５ＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ゲルを銀染色した。挿入 図はＣＮＴＦブールの電気泳動分画（分画１１４〜１３０）の蛋白質含量を示す 、レーンの説明：１〜５＝それぞれ１５μｍの分画２５．２６．２７．２８およ び２９．左端の数字は同時に電気泳動した標準蛋白のＭｒ値（×１Ｏ−２）を示 す。

図６は、　Ｚｎ”−アフィニティークロマトグラフィー（工程６）を示す、工程 ５からのＣＮＴＦプールを透析し、　Ｚｎ＝−ＩＤＡ−アガロースカラム（ｌ　 ｘ　Ｌｏａｍ）上クロマトグラフィーに付した。クロマトグラムを１．５ｍｌ／ 分で展開し、３ｍｌの分画を集めた０選ばれた分画を電気泳動用に調製し。

５ＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ゲルを銀染色した。挿入図はＣＮＴＦプールの電気泳 動分画（分画３０〜３８）の蛋白質含量を示す。

レーンの説明：１〜９＝それぞれ２５μｌの分画３０，３１，３２゜３３、３５ ．３６．３７および３８゜ 図７には、精製組換えヒ）　ＣＮＴＦのＲＰ−）ＩＰＬＣ分析を示す。

ＣＮＴＦ、　５μｇ（Ａ）および５０μｇ（Ｂ）を、０．１％ＴＦＡで平衡化し たＳｙｎＣｈｒｏｍ　ＲＰ−８逆相）ＩＰＬｃカラム（２５０Ｘ　４．６ｍｍ） に適用した。蛋白質は０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルの直線勾配で溶出した （１％アセトニトリル／分、流速１　ｍ１７分）。

図８はＣＮＴＦの多重型を示す、精製ヒト組換えＣＮＴＦ　（１２μｇ）を、　 ＳＤＳサンプル緩衝液中で予め１００℃に２分間加熱（Ａ）または加熱せず（Ｂ ）に５ＤＳ−ＰＡＧＥに付した。蛋白質をセルロース膜にトランスプロットし、 −次抗体（ウサギ抗−ＣＮＴＦ）および二次抗体（ヤギ抗−ウサギＩｇＧ−アル カリホスファターゼ）で処理した。

図９は２組換えヒ）　ＣＮＴＦの紫外吸収スペクトルを示す。

紫外吸収スペクトルはＢｅｃｋｍａｎ　Ｄｔｌ−５０スペクトロフオトメーター で記録し、　ＣＮＴＦの濃度（１，２８ｍｇ／ｍｌ）をアミノ酸分析で測定した 。

図１０はビヒクルのみまたは０．２５ｍｇ／ｋｇヒト組換えＣＮＴＦ含有ビヒク ルを日−２〜＋１１に毎日皮下注射で投与した成熟ラットの坐骨神経圧潰（日０ ）後の皮膚感覚の回復速度を例示する。

図１１はビヒクルのみまたは０．２５ｍｇ／ｋｇヒト組換えＣＮＴＦ含有ビヒク ルを日−２〜＋１１に毎日皮下注射で投与した成熟ラットの坐骨神経圧潰（日０ ）後の運動機能の回復速度（足指１〜５を広げる能力の回復で測定）を例示する 。

好ましい実施態様の詳細な説明 現時点で好ましい本発明の実施態様の詳細を以下に示すが、これは以下の実施例 とともに１本発明の詳細な説明するのに役立つものである。

本出願はヒト毛様体向神経因子（ＣＮＴＦ）の組換え製造方法を包含する。また 本発明は各種ヒ１−Ｃ−末端切断ＣＮＴＦを包含する９本発明の好ましい実施態 様においては、Ｃ−末端切断ＣＮＴＦは図１に示す完全長ヒｌ−ＣＮＴＦと同一 であるが、Ｃ−末端において２または６アミノ酸残基切断されている０本発明の Ｃ−末端切断ＣＮＴＦは、好ましくは、　ＣＮＴＦをコードする遺伝子を含有す るベクターの発現により、ヒ）　ＣＮＴＦの細菌発現時に製造される。このよう なＣ−末端切断ＣＮＴＦは同様に、Ｃ−末端切断ＣＮＴＦをコードする遺伝子を 含有するベクターの発現によっても製造される０本発明はまた２組換え製造系か ら得られた実質的に精製されたＣＮＴＦを得るための精製方法を包含する。

ウサギ坐骨神経からのＣＮＴＦの精製は、　Ｃｏ１１ｉｎｓらのＰＣＴ出願ＷＯ ９０１０７３４１（ＰＣＴ／ＵＳ９０１０００２２）に記載されている。

Ｃｏ１１ｉｎｓの出願にはＣＮＴＦをフードするウサギおよびヒト遺伝子ならび に哺乳動物および細菌発現系からの組換えヒトＣＮＴＦの製造についての記載を 包含する。ＷＯ９０１０７３４°１の出願は、この記述により、限定なくすべて の定義および実験操作を含めて、その全体をとくに本明細書に導入する。

組換えヒ）　ＣＮＴＦの製造および精製の新規な方法は以下の例１に示す、さら にこの例には。

１、細胞を含まない抽出物の製造 ２、抽出物からの核酸の除去 ３、　Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換クロマトグラフィー４、第２のＱ−ｓ ｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換クロマトグラフィー５、５−ｓｅｐｈａｒｏｓｅイ オン交換クロマトグラフィーおよび６、　Ｚｎ２＋−アフィニティークロマトグ ラフィーからなる６エ程の組換えヒトＣＮＴＦの精製方法が包含される。これら の操作によれば、非ＣＮＴＦ蛋白質含量０．１％未満のＣＮＴＦ組成物が得られ る。

以下の例２に教示されるヒト組換えＣＮＴＦの精製の好ましい方法は、（ａ）可 溶性ＣＮＴＦ蛋白質を含有する細胞ライゼートをＣＮＴＦを可逆的に結合するア ニオン交換カラムに適用し、（ｂ）アニオン交換カラムに結合したＣＮＴＦ蛋白 質を塩で溶出してＣＮＴＦを含む分画を集め、（Ｃ）　ＣＮＴＦ蛋白質を含有す る分画をカチオン交換カラムに適用し。

（ｄ）　ＣＮＴＦ蛋白質を約７から約８．５までのｐｉ勾配で溶出してＣＮＴＦ を含む分画を集め、（ｅ）　ＣＮＴＦ蛋白質を含む分画をアニオン交換カラムに 適用し、ついで（ｆ）実質的に精製されたＣＮＴＦ蛋白質を塩勾配で溶出するこ とからなる。

ＣＮＴＦの別法による精製が以下の例２に記載されるが。

この場合には、Ｃ−末端切断ＣＮＴＦが単離、同定される。Ｃ−末端切断ＣＮＴ Ｆは、完全長ヒ）　ＣＮＴＦをコードする遺伝子を含むベクターの細菌発現から 単離される。このようにして単離されるＣ−末端切断ＣＮＴＦは９図１に示すヒ トＣＮＴＦと同一であるが、Ｃ−末端において２または６アミノ酸残基が切断さ れている。また、Ｃ−末端切断ＣＮＴＦからＣＮＴＦを。

およびＣ−末端切断ＣＮＴＦを実質的に含まない実質的に精製されたＣＮＴＦを 単離する方法が記載される。この出願の範囲内には、　ＣＮＴＦ関連生物活性を 維持するすべてのＣ−末端切断ＣＮＴＦが包含される６ また１例２の記載に従って製造される組換えＣＮＴＦは。

付加的なりロマトグラフィ一工程を用いることによりさらに精製できることが見 出された。以下の例３に述べるように、精製ＣＮＴＦ溶液から非−ＣＮＴＦ蛋白 質の量を低下させるのに有効であることが見出されたカラムには、ヒドロキシア パタイト樹脂、ブチルＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）樹脂および Ｚｎ−ＩＭＡｃ　（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）樹脂が包含 される。

上述のように９本発明はさらに、末梢神経傷害罹患患者のその傷害の予防および 処置方法に関する。これらの方法は、末梢神経傷害のある患者もしくは末梢神経 傷害の危険がある患者への、治療有効量の毛様体向神経因子（ＣＮＴＦ）の投与 経路からなる。

末梢神経細胞および／またはそれらの軸索の生残または機能が危機に瀕している 場合は、疾患または医学的徴候は末梢神経傷害であると考えるべきである。好ま しい実施態様においては、以下の状態の一つの結果として。

患者は、末梢神経傷害の危険にあるかまたは現実に末梢神経傷害を有する。すな わち、１）傷害部位またはその近傍を通る末梢神経細胞の軸索の変性を生じる物 理的傷害。

２）癌やエイズの化学療法剤たとえばそれぞれシスプラチンムおよびジデオキシ ンチジン（ｄｄｅ）のような二二一口トキシンへの暴露、３）慢性代謝性疾患、 たとえば糖尿病または腎機能不全、ならびに４）−次運動二二−ロンの変性、そ の結果として運動機能不全を生じる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、末梢 神経傷害が関与する状態の非限定的なリストには、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病 性末梢性多発ニューロパシー、癌化学療法剤、タキソールまたはシスプラチンも しくはビンクリスチンによって生じる中毒性末梢性二二一ロノくシー、エイズ化 学療法剤。

ｄ旧またはｄｄｅによって生じる中毒性末梢性ニューロンくシー、ならびに腕お よび手の圧潰または切断創傷によって生じるような末梢神経に対する物理的傷害 が包含される。

末梢神経傷害の処置には、永久的末梢神経傷害を逆転する能力、および末梢神経 傷害の自然回復過程の加速またはより完全な回復を達成することによって自然回 復過程を増強する能力が包含される。末梢神経傷害の予防には、末梢神経傷害を 通常招来する状態の効果に対して末梢神経傷害を全体的に防止する能力、ならび にこのような状態に伴う末梢神経傷害の程度を減弱する能力が包含される。

一実施態様においては、好ましいＣＮＴＦは天然に存在する蛋白質である。天然 に存在する蛋白質は、一部には。

それによって処置された患者に予期し難い望ましくな０生理学的副作用を生じる 危険が比較的少ないことから。

好ましい０本発明における使用には、ヒトＣＮＴＦが好ましい、しかしながら、 非−ヒトＣＮＴＦも、それらがヒトＣＮＴＦと実質的に均等で均等な生物活性を 有する限り２本発明の範囲内に包含されるものである。

明細書および請求の範囲において、蛋白質またはそれと実質的に均等な蛋白質が 健康なヒトに通常存在することが明らかな場合、それは「天然に存在する」とみ なされる、「天然に存在する」蛋白質には、健康なヒトにおける存在が見出され ている蛋白質の、アミノもしくはカルボキシ末端で部分的に切断された型または デアミデートもしくは他の化学的修飾を受けたアミノ酸を有する型の蛋白質もと （に包含される。「天然に存在する」蛋白質は組換えＤＮＡ法ならびにそれらを 通常産生ずる細胞からの単離により得られる。「天然に存在する」蛋白質にはＮ Ｏ３−末端メチオニル基を含有する蛋白質または大腸菌内での発現の結果として それを欠く蛋白質も包含される。

明細書および請求の範囲を通じて用いられる「実質的に均等」とは、極めて高い アミノ酸残基ホモロジーをもっコＣ！：　（一般ニＭ、Ｄａｙｈｏｆｆ、υ、１ ａｓゴど一堕四↓見柚−Σり匹至現猛−ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、５巻、１ ２４頁、１９７２．Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＢｉｏｃｈｅｍｆｃａｌＲｅｓｅａｒｃ ｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，参照、参考として とくに本明細書に導入する）、ならびに匹敵する生物活性を有することを意味す ると定義される。

本発明のとくに好ましいＣＮＴＦは、　−Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｃ１１ｉａｒｙＮ ｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒｓ−と題する　Ｃｏ１１ｉｎｓらのＰＣ Ｔ出願ＷＯ９０１０７３４１に以前記載された天然に存在する蛋白質である。

ヒトおよび動物ＣＮＴＦをコードする遺伝子の核酸配列およびこのような蛋白質 のアミノ酸配列は＋　Ｃｏ１１ｉｎｓらの出願に記載されている１本発明は、　 ＣＮＴＦの非グリコジル化型ならびにＣｏ１１ｉｎｓらの出願に記載された天然 に存在する蛋白質および組換え蛋白質の切断型を包含する。さらに他の実施態様 においては、　ＣＮＴＦは１または２以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ） または他の反復ポリマー残基の付着によって修飾されている。

天然に存在するまたは修飾されたＣＮＴＦの製造方法もまた９本明細書および上 述の出願に開示されている。開示された一つの方法は、様々な起源たとえば末梢 神経組織から、　ＣＮＴＦを単離するものである。開示された第二の方法は、　 ＣＮＴＦをコードする能力のある遺伝子を単離し、その遺伝子を適当なベクター および細胞種にクローニングし、ついでＣＮＴＦを製造するためにその遺伝子を 発現させる工程からなる。一般的な組換えＤＮＡ法の例である後者の方法は１本 発明の好ましい方法である１組換えＤＮＡ法は、一部には、比較的により高い純 度でより大量の製造を達成できるので好ましい。

上述のＣＮＴＦは、上述の方法によって、「実質的に純粋な」型に製造されるの が好ましい、「実質的に純粋な」の語は、　ＣＮＴＦが非修飾型で比較的に高い 特異的活性を有することを意味する。しかしながら、　ＣＮＴＦの誘導体は異な る特異的活性をもつことがあることを認識すべきである０本発明の好ましい実施 態様においては、　ＣＮＴＦからなる治療用組成物が、末梢神経傷害を有する患 者に有効量で投与される。

好ましいＣＮＴＦの向神経機能はＣＮＴＦ蛋白質の１または２以上の個々の分離 可能な部分によって付与できることから９本発明の方法は、　ＣＮＴＦの向神経 機能を制御するＣＮＴＦの部分（１部分または複数部分）が活性成分を構成する 治療用組成物の投与によって実施可能なことも意図されている。

本発明の治療用組成物は好ましくは、注射により非経口的にまたは移植されたポ ンプからの連続注入で鞘膜内に投与される。また、他の効果的な投与形態、たと えば非経口徐放性処方、吸入用ミスト、経口的に活性な処方。

または全開も意図される。一つの好ましい担体は、生理食塩溶液であるが、他の 医薬的に許容される担体の使用も想定される。一つの好ましい実施態様において は、担体とＣＮＴＦで生理的に許容される徐放性処方を構成することが意図され る。このような担体における一次溶媒の性質は水性でも非水性でもよい、さらに 担体には、処方のｐＨ，浸透圧、粘度、澄明度２色調、滅菌性、安定性、溶出速 度または臭気を改変または維持するための医薬的に許容される他の賦形剤を含有 させることができる。同様に、担体にはさらに、　ＣＮＴＦの安定性、溶出速度 、放出または吸着を改良または維持するための他の医薬的に許容される賦形剤を 含有させることができる。このような賦形剤は、単位用量もしくは多重用量型で の非経口投与用または移植ポンプからの連続的ないしは周期的注入による鞘膜内 送達もしくは周期的注射による鞘膜内投与用剤形の処方に通常および慣用的に使 用される物質である。

治療用組成物が処方されたならば、それは溶液、懸濁液、ゲル、乳化液、固体、 または脱水もしくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル中に保存される。このよ うな処方は、そのまま使用できる里で、あるいは投与直前に再構築を要する型の いずれかとして保存できる。このような処方の好ましい保存条件は、少なくとも ４°Ｃ以下。

好ましくは一７０℃である。　ＣＮＴＦを含有するこのような処方はまた。生理 的ｐＨまたはそれに近いｐＨで保存し、投与されることが好ましい、現時点では 、約５．５以下のｐＨまたは約８．０以上のｐＨの処方中での保存および投与は 望ましくないと考えられる。

ＣＮＴＦを含有する処方の非経口投与様式は、皮下または筋肉内経路が好ましい 、　ＣＮＴＦの所望量の投与を達成するためには、毎日またはもつと低頻度で皮 下または筋肉内注射による投与を反復する。１日用量約０．００１ｍｇ／ｋｇ未 満のＣＮＴＦの投与は無効で、一方、１日用ｊ１１　ｍｇ／ｋｇ以上の投与では 望ましくない副作用を生じると考えられる。

末梢神経傷害の非経口処置のための好ましい投与量範囲は、２４時間あたり患者 の体重１ｋｇにつき約０．０１〜０．２５Ｂで、これが２４時間あたりの１回用 量として投与される。

末梢神経傷害を防止または最小限にするための好ましい様式においては、　ＣＮ ＴＦの投与は１通常、末梢神経傷害を招来する状態または事象の開始前１週まで にＣＮＴＰＯ投与を開始する。たとえば癌化学療法剤による中毒性二ニーロバシ ーを防止する好ましい実施態様においては、　ＣＮＴＦの投与はその化学療法剤 による処置の開始前１週までに開始し、その薬剤への暴露期間中継続する。投与 頻度は。

使用される処方中のＣＮＴＦのファーマコキネティックパラメーターに依存し、 これは本技術分野の熟練者には容易に確認できるものである。

細胞本体がを髄内にある運動細胞および他の傷害神経細胞に対する所望用量のＣ ＮＴＦ投与を達成するためには。

ＣＮＴＦはを髄のクモ膜下腔に鞘膜内投与できる。投与は連続的にまたは周期的 に行い、一定のもしくはプログラム可能な流速での移植ポンプによりまたは周期 的注射により達成できる。

ＣＮＴＦを含有するある種の処方は経口的に投与することも意図される。好まし くは、この様式で投与されるＣＮＴＦはカプセルに封入される。カプセル封入Ｃ ＮＴＦは、固体剤型の調合に慣用的に使用される担体を用いてまたは用いないで 処方できる。好ましくは、カプセルは、生物学的利用性が最大になり全身作用前 の分解が最小になる時に胃腸管内において、処方の活性部分が放出されるように 設計される。　ＣＮＴＦの吸収を容易にする他の賦形剤を包含させることもでき る。希釈剤、フレーバー、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤１錠剤崩壊 剤、および結合剤も使用できる。

投与様式とは無関係に、特定の用量は、患者の大量の体重または体表面積によっ て計算される。上述の各処方が関与する処置に適当な投与量の決定に必要な計算 のさらに精密化は２本技術分野の通常の熟練者によって定常的に行われ、と（に 本明細書に開示された投与量情報およびアッセイを参考に２面倒な実験を行うこ となく、定常的に実施される課題の範囲内にある。これらの投与量は、適当な用 量−反応データとともに用いられる。投与量決定のための確立されたアッセイの 使用によって確認できる。

本明細書に記載されたＣＮＴＦ処方は動物ならびにヒトへの適用に使用されるも のであること、「患者」の語は限定された意味で解釈されるべきでないことに留 意しなければならない、動物への適用の場合も、投与量範囲は上述の特定と同じ である。

特定の問題または環境に対する本発明の教示の適用は。

本明細書に含まれる教示を参考に１本技術分野の通常の熟練者の能力の範囲内に あると理解される０本発明の代表的な使用例は以下の実施例に示す。

以下の例４には９本明細書に記載されたような末梢神経への物理的傷害からの末 梢神経傷害に対する本発明の適用について説明する。この処置と他の形態の末梢 神経傷害患者の処置との間には何らかの差があるとしても。

本技術分野の通常の熟練者によって容易かつ定常的に確認されることである。以 下の実施例に示すような、　ＣＮＴＦの投与による末梢神経への物理的傷害後の 感覚および運動機能の回復の加速能力は１本明細書に定義された他の形態の末梢 神経傷害の予防および処置においてＣＮＴＦ投与が同等に有効であることを示し ている。

現は以前に記載されていて、　Ｃｏ１１ｉｎｓら、　ＷＯ９０１０７３４１は本 明細書に参考として導入される（　Ｃｏ１１　ｉｎｓら、米国特許第５、０１１ ．９１４号およびＣｏ１１ｉｎｓら、米国特許第４．９９７．９２９号も参照） 、括弧内の番号は以下の例１の引用文献と題する項に掲げる参考文献を指す。

ヒトＣＮＴＦ遺伝子のクローニング−ウサギＣＮＴＦのアミノ酸配列に相当する 完全に縮重したオリゴヌクレオチドを合成した［７］、各オリゴヌクレオチドの センスオリエンテーションはその５゛末端が相当するウサギ蛋白質配列（ＮはＡ 、　Ｃ，ＧまたはＴを意味する）　ＣＮＴＦ−１：ＴＡＴ／ＣＧＴＮ　ＡＡＡ／ Ｇ　ＣＡＴ／ＣＣＡＡ／Ｇ　ＧＧ　（Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｉｎ −Ｇｌｙ）　；　ＣＮＴＦ−２：　ＡＡＴ／ＣＡＡＡ／Ｇ　ＡＡＴ／ＣＡＴＴ／ Ｃ／Ａ　ＡＴＴ／ＣＣ／ＴＴ　（Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｌ ｅｕ）　；ＣＮＴＦ−３ａ：ＡＡＡ／Ｇ　ＴＴＡ／Ｇ　ＴＧＧ　ＧＧＮ　ＴＴＡ ／Ｇ　ＡＡ；　ＣＮＴＦ−３ｂ：ＡＡＡ／Ｇ　ＴＴＡ／Ｇ　ＴＧＧ　ＧＧＮ　Ｃ ＴＮ　ＡＡ；　ＣＮＴＦ−３ｃ：ＡＡＡ／Ｇ　ＣＴＮ　ＴＧＧ　ＧＧＮ　ＴＴＡ ／Ｇ　ＡＡ：　ＣＮＴＦ−３ｄ：ＡＡＡ／Ｇ　ＣＴＮ　ＴＧＧＧＧＮ　ＣＴＮ　 ＡＡ　（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ）とともに開始する ように与える。オリゴヌクレオチドＣＮＴＦ−３ａ〜３ｄは縮重を減少させるた めに別個のＰＣＲ反応に使用した。

オリゴヌクレオチド１（センス１）および３８〜３ｄ（アンチセンス）はヒトゲ ノムＤＮＡとのＰＣＨにプライマーとして使用した。ポリメラーゼ連鎖反応は、 各反応に１．７５＋ｎＭＭｇＣ１２，１００ｎＨの各オリゴヌクレオチド、およ び胎盤がら調製したヒトゲノムＤＮＡ　［２］　０．５μｇを含有させたほかは 従前の報告［１］に従って実施した。　ＣＮＴＦ遺伝子から増幅されたＤＮＡバ ンドの同定には、　ＰＣＲ産物のＤＮＡ　（サザン）プロットをウサギ遺伝子中 オリゴヌクレオチドエのすぐ下流に存在するオリゴヌクレオチド２［７コの３２ ｐ−標識体で調べた。増幅されたＤＮＡの単一の約４００−ｂｐバンドが。

ヒトゲノムＤＮＡからのＰＣＲ産物のサザンプロットにおいてこのプローブにハ イブリダイズした。このバンドはＣＮ　ＴＦ−３ｄを用いた反応で最も強度が高 かった。このバンドをクローン化して配列決定したところ２図１のオリゴヌクレ オチド１および３の間のヒトＣＮＴＦ遺伝子のＤＮＡ配列を与えた。

ヒトゲノムＤＮＡから増幅された約４００−ｂｐフラグメントをランダムブライ ミングによって３２　ｐで標識し、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーの高緊縮条件 でのスクリーニングに使用した。ヒトゲノムＤＮＡライブラリーは５ａｕ３ＡＩ で部分消化したゲノムＤＮＡ［１８コを、　Ｃｈａｒｏｎ　３０のＢａｍＨＩ部 位にクローニングすることによって構築した［３］。

１×１０６のクローンから９個の陽性クローンが単離された。これらのクローン の２つについて配列を決定し、残りはＤＮＡ　（サザン）プロット分析に基づき 、これらと類似すると考えられた。配列決定したクローンはオープンリーディン グフレームを含有しく図１）、これはウサギＣＮＴＦコード配列［７コ　と８９ ％同一であった。さらに、各リーディングフレームは、ヒトゲノムＤＮＡからＰ ＣＨによって増幅されたフラグメントと同一のセグメントを含有した。ヒトゲノ ムＤＮＡクローンからの制限エンドヌクレアーゼフラグメントは、ヒトゲノムＤ ＮＡのＤＮＡ　（サザン）プロット解析で観察されたフラグメントに相当し、こ れから、これらのクローンはゲノムＤＮＡ中のＣＮＴＦ遺伝子の構成の典型であ ることが指示された。

ＣＮＴＦ発現用ＤＮＡの調製：ファージＣｈａｒｏｎ　３０内のＣＮＴＦのヒト ゲノムＤＮＡクローンを制限酵素５ａｌｌおよびＨｊｎｄＩｆｆで消化して、　 ４．３ｋｂ−フラグメントをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳＭ１３（−）ブラシミ ドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングした。このフラグメン トはコード配列中、Ｈｉｎｄｍ部位の上流にＣＮＴＦコード配列を含有する（図 １）、この４，３ｋｂ−フラグメントはまた。単一の約１．３　ｋｂゼインロン も含有する（図１）、細菌細胞内での発現を可能にするために、このイントロン は１合成オリゴヌクレオチド：５°−ＧＡ　Ｔ　ＧＴＴＣＴＴ　ＧＴＴＣＡ　Ｇ Ｇ　ＣＣＣＴ　ＧＡ　ＴＧ　ＣＴＴＣＡ　ＣＡ　ＴＡＧＧＡ　ＴＴ　ＣＣＧＴ　 Ａ　Ａ　Ｇ`Ｇ ＣＡＧＴＣＡＧＧＴＣＴＧＡＡＣＧＡＡＴＣＴＴＣＣ−３°を用いてインビトロ での特定部位の突然変異によりて除去し［４］、ファージミド１が製造された。

ファージミド１中のＣＮＴＦコード配列の５゛末端を、その発現ベクターへのク ローニングおよび大腸菌中での発現効率を上昇させることが見出されている変化 を行うために再構築した。ファージミド１はヒトＣＮＴＦフード配列中のアミノ 酸２２−２３における単一のＮ　ｈｅ　Ｉ部位を含有する（図１）、３°Ｎ　ｈ ｅ　Ｉオーバーハングを含有する部分重複相補性オリゴヌクレオチド（５−ＧＡ ＴＣＣＧＡＴＣＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＴＧＧＣ丁丁ＴＣＡＣ丁ＧＡ ＡＣＡＣ丁Ｃ丁ＣＣＧＣ丁ＧＡＣＣＣＣＧＣＡＣＣＧＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＴＧ ＣＡＧＣＣＧＣＴＣＴＡＴＣＴＧＧ−３°１５°−ＣＴＡＧＣＣＡＧＡＴＡＧＡ ＧＣＧＧＣＴＧＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＴＣＡＧＣＧＧ ＡＧＡＧＴＧＴＴＣＡＧＴＧＡＡＡＧＣＣＡ　ＴＴＴＡＡＴＣＡＴＣＣＴＣＣＡ ＡＧＡＴＣＧ〜３′）を合成し、−緒にアニーリングし、ＮｈｅＩ−切断ファー ジミド１にリゲートして、ファージミド２を製造した。これらのオリゴヌクレオ チドは。

アミノ酸配列を変えないでヒトコドン使用を大腸菌で好んで用いられるもの［５ 〕に変えていて、ファージミド２中にＢａｍＨＩ部位を作る５’ＢａｍＨＩオー バーハングを含有する。オリゴヌクレオチド２および３はまた大腸菌内での効率 的な翻訳を促進する多種間カプラーを含有する［６］。

７フージミド２　ＤＮＡは、ついでＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｍで消化し、大腸 菌での発現に適当で、Ｈｉｎｄｍ部位の上流にヒトＣＮＴＦをコードするＤＮＡ を配列（図１）含有する。

ＣＮＴＦ−３ｙｎｌと呼ばれるＤＮＡフラグメントを放出させた。

発現構築体の３°末端を調製するには、ファージＣｈａｒｏｎ３０内のＣＮＴＦ のヒトゲノムＤＮＡクローンヲ制限ｒｌｌ　素Ｈ１ｎｄＩＩＩで切断し、Ｈ４ｎ ｄｍ部位下流のＣＮＴＦコード配列を含有する２、　１−ｋｂフラグメントをＨ ｉｎｄｍ切断プラスミドｐＥＭＢＬａ中にサブクローニングした［７］０合成オ リゴヌクレオチド４（５°−ＡＴＧ　ＴＡＧ　ＣＡＧ　ＴＴＡ　ＧＴＣＡＣＴ　 ＡＧＴ　ＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＣＴ−３’　）を用いて、　ＣＮＴＦ配列をコー ドする停止コドンの１３塩基対下流の特定オリゴヌクレオチドの突然変異により 、５ｐｅＩ部位ヲ２．１ｋｂ−インサートＤＮＡ中に挿入した。

この変異プラスミドをＨｉｎｄｍおよび５ｐｅＩで切断して。

ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ２と呼ばれるＤＮＡを放出させた。

ＣＮＴＦ−３ｙｎｌおよびＣＮＴＦ−Ｓｙｎ２をＨｉｎｄｌＩＩオーバーハング でリゲートしてＣＮＴＦ−Ｓｙｎｌ／２を作成し、これをＢａｍＨＩ−および５ ｐｅｌ−切断ファージミド発現ベクター、　ｐＪＵ１００３［８］中にサブクロ ーニングしてｐＪＵ１００３−ｈｕｃＮＴＦを製造し、これを大腸菌ＢＬ２１　 （ＤＥ３）株［９］にトランスフオームした。これにより、　Ｔ７フアージプロ モーターの制御下。

イソプロピルβ−ローチオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による誘導によっ て［２４］　、　ＣＮＴＦインサートの発現が起こる。　ＩＰＴＧでの誘導後に ＣＮＴ　Ｆを産生ずる一つのトランスフォーマント、　ＣＮＴＦ−Ａを選択した 。

組換えヒトＣＮＴＦの発現−１０μｇ／＋ｏ　ｌのテトラサイクリンを補充した Ｌｕｒｉａブロス［１０］中にＣＮＴＦ−Ａの一夜培養液を調製した。これらの 培養液を同じメジウムで希釈して（１＝　５０）　、Ａ　６＋）０が１．０に達 するまで（３〜４時間）増殖させた。　ＣＮＴＦの発現は、ＩＰＴＧを最終濃度 ０．５ｍＭになるように加え、４時間インキュベートすることによって達成され た。細胞を遠心分離によって（９，０ＯＯＸ　ｇ、　５分）収穫し、　５０ｍＭ リン酸ナトリウム、　ｐＨ８，０で洗浄し、再遠心分離した。細胞ペレットを直 ちに使用するか、または−８０℃で凍結保存した。

組換えヒトＣＮＴＦの精製−すべての精製工程は氷上または４℃で行い、様々な りロマトグラフイー力ラムからの分画は５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。

ト（４〜５ｇ湿重量）を３〜４容量の緩衝液Ａ（５ｍＭＥＧＴＡおよび５ｍＭ　 ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム。

ｐＨ８，０）に懸濁し、　１８，０００１ｂ／ｉｎ２でフレンチプレスセルを通 した。得られた混合物を４８．０ＯＯＸ　ｇで２０分間遠心分離し、上清をガラ スウールで濾過した。

工程２．核酸の除去−上清にＰＥＩを０．２５％（Ｖ／Ｖ）　ノ最終濃度になる ように加え、核酸の除去を容易にした［１１］、　この処置を行わないと、上清 に含まれる核酸はアニオン交換樹脂に結合し、　Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを再生 。

再使用できる回数が減る。１０分間インキュベートしたのち、混合物を上述の場 合と同様に遠心分離し、得られた上清をガラスウールで濾過した。

Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１，５Ｘ　２０ｃｍ）上に負荷した。負荷後カ ラムを緩衝′ｅ、ＡでＡ　２９０がベースラインに達するまで洗浄した。カラム の通過液／洗浄液にＣＮＴＦが検出された。　ＣＮＴＦブールを１０容量の緩衝 液Ｂ　（１０＋ｎＭ　ＮａＣ１゜Ｉ　ｎ＋Ｍ　ＥＧＴＡおよび１　ｍＭ　ＥＤＴ Ａ含有１５ｍＭリン酸ナトリウム。

ｐＨ８，０）に対して２回透析した。

たＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１，５Ｘ　１５ｃｍ）上に負荷した。負荷後 、カラムを緩衝液ＢによりＡ　２８０がベースラインに達するまで洗浄した。結 合した蛋白質を緩衝液Ｂ中１０〜８０ｍＭＮａＣ１の勾配（１５０ｍｌ）で溶出 した。　ＣＮＴＦブールを１０容量の緩衝液Ｃ（０，１ｍＭ　ＥＧＴＡおよび０ ．１ｍ　ＭＥＤＴＡ含有５ｍＭリン酸ナトリウム、　ｐ）！　７．１．）に対し て２回透析した。

工程５．針づ至１リエ旦Ｊじ（！二乙りＪ漿！二三ニー上二乙！二乙／−一：上 記ＣＮＴＦブールを予め緩衝液Ｃで平衡化しておいたＳ−３ｅｐｈａｒｏｓｅカ ラム（ＬＸ　Ｌｏａｍ）上に負荷した。負荷後カラムを緩衝液ＣでＡ２８０がベ ースラインに達するまで洗浄した。結合した蛋白質を緩衝液Ｃ中Ｏ〜０．５ＭＮ ａＣ１の勾配（６０ｍ１）で溶出した。　ＣＮＴＦブールを１０容量の緩衝液Ｄ 　（５０ｍＭ　ＮａＣ１，０，１ｍＭ　ＥＧＴＡおよび０．　ｉｎ＋ＭＥＤＴＡ 含有１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、　ｐＨ７，５）に対して２回透析した。

工程６　、　Ｚｎ２”−アフィニティークロマトグラフイｍ：ＣＮＴＦブールを 、金属イオンキレート剤ＥＧＴＡおよびＥＤＴＡを含まない緩衝液りによって予 め平衡化したＺｎ２゛−アガロースのカラム（ＩＸｌｏｃｍ）上に負荷した。負 荷後。

カラムを同じ緩衝液でＡ　２２ｏがベースラインに達するまで洗浄した。結合し た蛋白質を緩衝液Ｄ（キレート剤を含まない）中０〜５０ｍＭヒスチジンの勾配 （５０ｍ１）で溶出した。最終の精製ＣＮＴＦブールは５０＋ｎＭ　ＮａＣ１， ０，１ｍＭ　ＥＧＴＡおよび０．１　ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭリン酸塩 。

ｐＨ８，０に対して２回透析し、−８０℃で保存した。

ＲＰ　−ＨＰ　Ｌ　Ｃ−注入前にＴＦＡおよびアセトニトリルをそれぞれ最終濃 度が０．１％（ｖ／ｖ）および５％（Ｖ／Ｖ）になるように蛋白質サンプルに添 加した。　ＲＰ−ＨＰＬＣは２５０　Ｘ　４．６ｍｍ５ｙｎＣｈｒｏｐａｋ　Ｒ Ｐ−８カラム（ＳｙｎＣｈｒｏｍ、　Ｉｎｃ、　、　Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、　Ｉ Ｎ）を、溶媒Ａとして０．１％ＴＦＡ水溶液、溶媒Ｂとしてアセトニトリル９０ ．ニ 電気泳動およびプロッティング法−電気泳動は，　１２．５％のポリアクリルア ミドスラブゲル（　１．　５ｍｍ厚）中，５％アクリルアミド付着ゲルとともに ，０．１％（　ｗ／ｖ）　ＳＤＳの存在下４０ｍＡで，　Ｌａｅｍｍｌｉの不連 続緩衝系［１２］を用いて実施した．ゲルを既報［１３］のようにＣＢＢで染色 するか，またはＲａｐｉｄ−Ａｇ−Ｓｔａｉｎ　Ｋｉｔ　（　ＩｃＮ　Ｒａｄｉ ｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌｓ。

Ｉｒｖｉｎｅ．　ＣＡ）を用いて銀染色した．ウェスタンプロットおよび蛋白質 配列決定に先立ち蛋白質を分離するために使用されるゲルは，　２５ｍＭチオグ リコール酸および１０ｍＭＤＴＴの存在下に１　５ｍＡで１６時間予め電気泳動 を行った．これにより、蛋白質サンプルの電気泳動時に起こるアミン末端アミノ 酸基の妨害が防止される［１４］．　ウェスタンブロッティングは，既報［１５ ］のように，　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａ ｔｉｏｎ．Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）またはニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｅｒ 　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．、Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）膜を用いて実施した ．　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎ−Ｐ膜はＣＢＢで染色し，適当な蛋白質バンドを配列決 定のために切り取った．ニトロセルロース膜は，　ＣＮＴＦに対する抗体ついで アルカリホスファターゼ接合ヤギ抗−（ウサギＩｇＧ）　（　Ｃａｐｐｅｌ）に よる処理に付した．第２の抗体は，　Ｐｒｏｍｅｇａ　（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ ）によって供給されているキットを用い，５−ブロモ−４−クロロ−インド−３ −イルリン酸塩およびニトロブルーテトラゾリウムで検出した。

ＣＮＴＦに対する抗体の調製−５０ｍＭ　ＮａＣ１，　０．１ｍＭ　ＥＧＴＡお よび０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ含有１０ｍＭリン酸ナトリウム、　ｐＨ８．０中に。

高度に精製された組換えヒ）　ＣＮＴＦを２容のフロイント完全アジュバントで 乳化し，　Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄウサギの背面多部位に皮下注射した（１羽あ たり１００μｇのＣＮＴＦ）　、以後２〜３週の間隔で，フロインド不完全アジ 二ノ＜ントに乳化したＣＮＴＦ　１００μｇをブースター注射した．最初の注射 から７週後および以後２週間隔で採集した血液から調製した血清を一７０°Ｃで 保存した．抗血清の力価は，　ＥＬＩＳＡ［１６］で測定して３，０００であっ た。

バイオアッセイ−ＣＮＴＦ活性の／＜イオアツセイはＬｉｎら［１０］の記載に 従って実施した．略述すれば，　ＣＮＴＦ活性のインビトロアッセイ［１７］で は，ヒナ胚毛様体神経節（Ｅ８）　、交感神経鎖（Ｅｌｌ）または後根神経節（ 　ＥＩＯ）ニューロンの生残を測定する。９６−ウェル付の皿の各ウェルに２． ０００の精製ニューロンを取り、検定すべきサンプルの希釈系列を添加した。２ ０時間（毛様体神経節ニューロン）または４４時間（交感神経鎖および抜根神経 節ニューロン）後、生体染色ＭＴＴ　（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２ −イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）　（Ｓｉｇｍａ）を還元する生 細胞の能力によってニューロンの生残を評価した。栄養単位（ＴＵ）　／ｍｌで の生物活性力価は、　ＭＴＴアッセイにおける最大ニューロン生残の５０％を与 える希釈度と定義した。たとえば、５０％生残を与えるのに必要な希釈が１：１ ０００の場合は、力価は１．０ＯＯＴＵ／ｍｌと定義された。

ペプチドマツピングおよび蛋白質配列決定−ＣＮＴＦのＣ−末端ペプチドの発生 には、まず蛋白質をヘキサフルオロアセトン水和物中、室温で一夜、　ＣＮＢｒ により消化した。

ペプチドは径の細いＣ８ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ；、　Ｉｎｃ 、。

５ａｎｔａ　Ｃ１ａｒａ、ＣＡ）上、溶媒Ａとして０．０８５％ＴＦＡ水溶液。

溶媒Ｂとして８０％アセトニトリル中０．０８５％ＴＦＡを用いて分離した。つ いで、Ｃ−末端ペプチドをエンドプロテアーゼＡＳＰ−Ｎ　［７］で部分消化） ７．上述のようにして蛋白質を分離した。アミノ酸分析および蛋白質配列決定は Ａｒｍ５＆　Ｆｏｒｎｅｙの記載［１８］に従って実施した。

その他の方法−蛋白質濃度は、　ＣＢＢ染料の結合に基づ＜　ＢｉｏＲａｄマイ クロアッセイ　［１９］またはアミノ酸分析により定量した。　ＵＶ吸収スペク トルはＢｅｃｋｍａｎ　Ｄ−５０スペクトロフオトメーターで記録し、比濁法は ＬＫＢ　ＵｌｔｒａｓｃａｎＸＬレーザーデンシトメーターを用いて実施した。

棒料：Ｓ−およびＱ−３ｅｐｈａｒｏｓｅはＰｈａｒｍａｃｉａから、ＩＤＡ− アガロースはＰｊｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、から、ＩＰＴＧ、　ＰＥ Ｉ、　Ｍｒママ−−およびテトラサイクリンはＳｉｇｍａから購入した。

結果および考察 ヒトＣＮＴＦ遺伝子−ヒトＣＮＴＦをコードするゲノムＤＮＡ配列および推定ア ミノ酸配列は図１に示す、ヒトＤＮＡおよび蛋白質配列はウサギＣＮＴＦ　［７ ］およびラッ）　ＣＮＴＦ　［８］ＤＮＡおよび蛋白質配列とそれぞれ、８９％ および８６％、ならびに８５％および８３％、同一であった。ヒト、ウサギおよ びラットＣＮＴＦの推定アミノ酸配列のアラインメントを図２に示す、各種制限 エンドヌクレアーゼで消化したヒトゲノムＤＮＡのＤＮＡ　（サザン）プロット では、　ＣＮＴＦ−特異的プローブにハイブリダイズする唯一の単一バンドが認 められ（図には示していない）、高い緊縮条件でハイブリダイズするヒトゲノム ＤＮＡにおける唯一の単−遺伝子フオーマントｐＪＵ１００３−ＣＮＴＦ−Ａは 組換えＣＮＴＦを合成した。

培養期間の終了時にはＣＮＴＦは、　ＣＢＢ−染色ゲルのレーザーデンシトメー ター分析で判定して（図３．レーン１）。

細胞抽出物中可溶性蛋白質の約１３％に達した（　２５ｍｇ／Ｌ／Ａ６０（＋単 位）。

粗細胞抽出液からの可溶性物質を比較的イオン強度の高い緩衝液、　ｐＨ８，０ 中のＱ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ上アニオン交換クロマトグラフイーに付すと、　Ｃ ＮＴＦはカラム上でわずかに遅延し、細胞層および他の蛋白質（図３．レーン３ 〜５）の通過直後のカラム通過液ならびに洗浄液中に出現した（図３．レーン６ 〜２２）、これらの条件下には、大腸菌蛋白質の大部分はカラム上に保持された 。第一のカラムからのＣＮＴＦブールを低イオン強度緩衝液、　ｐＨ８，０に透 析すると、　ＣＮＴＦはＱ−３ｅｐｈａｒｏｓｅの第２のカラムには今度は結合 して、塩勾配の適用によって、５５〜６０ｍＭ　ＮａＣ１におけるピークとして 溶出させることができた（図４）。

得られたＣＮＴＦプール（図４．挿入図）を低イオン強度緩衝液、　ｐＨ７，１ 中に透析し、　Ｓ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ上カチオン交換クロマトグラフイーに付 した。樹脂に結合したＣＮＴＦは塩勾配の適用によって、１２５〜２５０ｍＭ　 ＮａＣ１間のピークとして溶出した（図５　）　、　ＣＮＴＦブール（図５．挿 入図）をツいでＺｎ２”−ＩＤＡ−アガロースカラム上、最後のアフィニティー クロマトグラフィ一工程に付した。　ＣＮＴＦは多分、亜鉛とＣＮＴＦが１分子 中に１０個もつヒスチジン残基（表Ｉ）の間の相互作用を介してカラムに結合し たものと思われる。

ＣＮＴＦはヒスチジン勾配の適用によって、　３０〜３５ｍＭヒスチジンで溶出 した（図６）。

組換えヒ）　ＣＮＴＦの精製の要約を表■に示す、　ＣＮＴＦの平均収率は１９ ±１．５％（ｎ＝４）であった、各クロマトグラフィ一工程後に収集された蛋白 質プールの中のＣＮＴＦの百分率はＣＢＢ染色ゲルのレーザーデンシトメーター 分析によって測定した。これらの百分率は、与えられたプール中の総ＣＮＴＦｊ ｌの計算に使用し、これから精製倍率と収率を計算したく表■）、銀による染色 の強度は蛋白質の量とは比例せず、したがって、この方法には信頼できる定量性 がないので、銀染色はこの目的には使用しながった。

しかしながら、銀染色ゲルは、各種プール中に含まれるＣＮＴＦの純度の定性的 な評価に使用した（挿入図２図４゜５および６）。

アミノ酸組成から計算したヒトＣＮＴＦのｐｌは６．４である。

これはウサギ（ｐｌ−５，８）またはラソ）　（ｐｌ＝　５．７）　ＣＮＴＦに ついての計算値［７，８］より有意に高い、　ｐ［計算値におけるこの差は、上 述の注意深＜ｐＨおよびイオン強度が制御されたイオン交換クロマトグラフィー に主として依存する精製プロトコールには、細菌発現系からの組換えう、トまた はウサギＣＮＴＦの精製に使用するためには改変が必要であろうことを示唆して いる。

ＣＮＴＦの純度−上述のようにして精製されたヒト組換えＣＮＴＦのアミノ酸組 成は、ヒトコード配列から予測されたアミノ酸組成（表■）によく一致した。さ らに、精製蛋白質のペプチドマツプおよびアミノ酸配列分析は、　ＣＮＴＦ配列 の存在のみを指示した０組換えヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列は、アミノ末端メチ オニンを検出できなかったことを除いて、ヒトコード配列から期待された配列（ 図１）であった、３つの別個のＣＮＴＦブレバレージョンのアミノ酸配列分析で は、アミノ末端位置におけるメチオニンの期待量の０，１％未満の値しか得られ なかった。細菌における発現中に、アミン末端メチオニンが除去されることは、 　ＣＮＴＦのようにアミン末端メチオニンがアラニン残基に続いている蛋白質の 場合には珍しいことではない。

ＣＮＴＦの純度をさらにＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。２１４ならびに２８０ｎｍ において得られた溶出プロフィル（それぞれ図７ａおよび７ｂ）から、溶出した 総蛋白質の９５±２％および５±２％（ｎ＝３）に相当する２つの対称蛋白質ピ ークが得られた。　ＣＮＴＦの一部のプレバレージョンではＲＰ−ＨＰＬＣ上に 小さい方の型は検出できなかったことから、小さい方の型がクロマトグラフィー 中に大きな方の型から誘導されるものとは考えられなかった２両分画を含有する 蛋白質のペプチドマツプならびにアミノ−およびカルボキシ−末端アミノ酸配列 分析でも、完全長ＣＮＴＦの存在が明らかにされるのみであった。したがって２ つのピークは未知の方式で異なるＣＮＴＦの型を示すものである。これらのＣＮ ＴＦの型はデアミゾ−ジョンの結果かもしれない、第２の可能な説明は、インス リンを含めて他の蛋白質で報告されている［　２２．２３．２４］プロリンの異 性化である。１００μｇ以上の量のＣＮＴＦをＲＰ−ＨＰＬＣに付し、　２１４ ｎｍでモニタリングすると、検出される蛋白質の０．１％未満に相当するビーり が、上述の２つのピークの直前に認められた。この蛋白質はＲＰ−ＨＰＬＣによ る配列分析に十分な量得られなかったので、１００μｇ量の精製ＣＮＴＦを５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥおよびウェスタンプロット分析に付して、どんな蛋白種が全体の約 ０．１％存在するのかの確認を試みた。

このようなゲルのＣＢＢ染色により、ネイティブなＣＮＴＦに加えて、　Ｍｒ＝ ４６，０００．２１，０００．１８，０００および１６．０００に相当する薄い 蛋白質バンドの存在が明らかにされたくデータは示していない）、シかしながら 、これらのバンドはＣＮＴＦに対する抗体を用いたイムノブロッティングでさら に容易に可視化された（図８．レーンＡ）　、ＣＮＴＦのこのプレバレージョン に対して抗血清が産生じたことから。

この観察それ自体、これらのバンドをＣＮＴＦと同定するものではない、　Ｍｒ ＝１１１１．０００および１６．（１００の蛋白質は、電気泳動前に少なくとも ２分間１００°Ｃに加熱するとその時間に応じて増加したことから、加熱によっ て生成するネイティブＣＮＴＦのフラグメントと考えられたく図８のレーンＡお よびＢを比較）　、　Ｍｒ−４６，０００ならびに２１．０００の蛋白質は、　 ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ上に多量に負荷したゲルからプロ、。

トシ、アミノ末端蛋白質配列決定に付した。検出された配列はＣＮＴＦのそれの みであって、これから４６．０００ダルトン種はＣＮＴＦ　（Ｍｒ＝　２３．０ ００ダルトン）のダイマーである可能性を示唆された。サンプルは電気泳動前に ＤＴＴで還元されたことから、二重化がジスルフィド結合の形成によって起こっ たとは考え難い、　４６，０００および２３．０００ダルトン種の開から切り取 ったｉｍｍｏｂｉ　１ｏｎ−ＰのストリップからはＣＮＴＦ配列は検出されなか った。これは、　４６，０００ダルトンレベルでのＣＮＴＦの配列の検出は、ネ イティブなＣＮＴＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥ上へのストリーキングの結果ではない、 　２１，０００ダルトン種は、そのアミノ末端が無傷であることから。

ＣＮＴＦのカルボキシ末端切断型かもしれない（カルボキシ末端ペプチドの配列 決定を行うには量が少なすぎた）。

ＣＢＢ染色ゲルのレーザーデンシトメトリーによれば。

見掛けのダイマーは総蛋白質の約０．０１％、切断ＣＮＴＦは約（１，１％に相 当した。上述の０．１％）ＩＰＬＣビークは一応、　ＣＮＴＦの切断された型と 推定された。　ＣＮＴＦの高度に荷電されたカルボキシ末端（図１）の喪失がＲ Ｐ−ＨＰＬＣにおける移動を変化させることは理論的に考えられる６　これらの 結果は、精製ＣＮＴＦにおける非ＣＮＴＦ蛋白質の夾雑が、明らかに０．１％未 満であることを示している。

ＣＮＴＦの紫外吸収スペクトル−組換えヒ）　ＣＮＴＦの紫外吸収スペクトルを 図９に示す、最大吸収は２９７μｍに認められ、２９０〜２９５に肩があって、 トリプトファンの存在を指示した。これは、　ＣＮＴＦＩモルあたり４モルのト リプトファンの存在を示すアミノ酸組成（表りと一致する。この蛋白質の吸収係 数はその紫外吸収スペクトルおよび蛋白質濃度（アミノ酸分析により測定）から 計算された。

相換えヒトＣＮＴＦの生物活性−細菌発現系から生物学的に活性なＣＮＴＦを製 造するために再フォールディング工程を行う必要はないように思われる。ヒトＣ ＮＴＦには１個のシスティンが存在するのみであるから（図１のアミノ酸１７） 、正しいリフォームを必要にする可能性を生じる分子内ジスルフィド結合はない 、また、　ＣＮＴＦはＳＤＳ、アセトニトリル、およびＴＦＡに暴露後も生物活 性を再獲得できること［１０］から、　ＣＮＴＦはある型の変性後にも自動的に 再フォールディングできるものと思われる。予想されたように、粗細菌ライゼー トも精製組換えＣＮＴＦも、　ＣＮＴＦ生物活性を発揮した。

高度に精製された組換えＣＮＴＦは、培養ヒナ胚副交感神経（毛容体）、交感神 経鎖、および感覚（後板）二ニーロンの生残を促進した（表■）０表■の比活性 は実験誤差の範囲内で、動物（ＣＯ３−７）細胞中で発現された組換えヒトＣＮ ＴＦについて観察された活性（毛様体ニューロン＝１．７±１．’２ＴＵ／ｎｇ （ｎ＝　５　）　；交感神経ニューロン＝７．７±２、ＩＴＵ／ｎｇ（ｎ＝　３ 　））と同等である。これは大腸菌からの精製ＣＮＴＦが完全な生物活性を示す ことを示唆する。　各種組織からの粗または部分精製抽出物が同じ（、上に使用 した３種の培養ヒナ胚ニューロン集団の生残を促進することが報告されている［ 　２５．２６．２７］　、これらの抽出物の活性はＣＮＴＦに帰せられていた０ 本発明者らの結果は。

単一分子のＣＮＴＦがこれらの活性を示すことを実際に証明するものである。

ヒトＣＮＴＦの一次構造は、Ｎ一連結グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓ）を示 さない（図１）、さらに２細菌で発現されたヒトＣＮＴＦは、他の型のグリコジ ル化がたとえインビボで起こったとしても、それがＣＮＴＦの生物活性に必須で はないことを示している。

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Ｇ、＆　Ｂｌａｎｑｕｅｔ、Ｓ、（１９８９）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６．８２４７−８２５１゜ ２１、Ｄａｌｂｏｇｅ、Ｈ，、Ｂａｙｎｅ、Ｓ、＆　Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｊ、（ １９９０）　ＦＥＢＳＬｅｔｔ、２６６．１−３゜ ２２、　Ｈｉｇｇｉｎｓ、に、Ａ、、Ｃｒａｉｋ、Ｄ、Ｊ、、Ｈａｌｌ、Ｊ、Ｇ 、　＆　Ａｎｄｒｅｗｓ。

Ｐ、Ｒ，（１９８Ｂ）Ｄｒｕ　、Ｄｅｓ、Ｄｅｌｔｙ、３．１５９−１７０゜２ ３、Ｋｏｒｄｅｌｊ、、Ｆｏｒｓｅｎ、Ｓ、、Ｄｒａｋｅｎｂｅｒｇ、Ｔ、＆　 Ｃｈａｚｉｎ、Ｗ。

Ｊ、（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９，４４００−４４０９゜２４ 、Ｋｉｅｆｈａｂｅｒ、Ｔ、、Ｑｕａｓｓ、Ｒ，、Ｈａｈｎ、Ｕ、＆　Ｓｃｈｍ ｉｄ、Ｆ、Ｘ。

（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９，３０５３−３０６１゜２５、Ｂ ａｒｂｉｎ、Ｇ、、Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ、Ｍ、＆　Ｖａｒｏｎ、Ｓ、１９８４） 　Ｌ、Ｎ８ｕｒｏｃｈｅｍ、４３．１４６８−１４７８゜２６、　５ａａｄａｔ 、Ｓ、、５ｅｎｄｔｎｅｔ、Ｍ、＆　Ｒｏｈｒｅｒ、Ｈ，（１９８９）　Ｊ、Ｃ ｅ１１、Ｂｉｏｌ、１０８．１８０７−１８１６゜２７、　Ｌｅｈｖａｌｄｅｒ 、Ｄ、、Ｊｅｆｆｒｅｙ、Ｐ、Ｌ、　＆　Ｕｎｓｉｃｋｅｒ、に、（１９８９） 表■ 組換えヒトＣ−ＮＴＦ（７）アミノ酸組成アミノ酸　計算値＜ａ）　期待値＜ｂ ）Ａｓｐ／Ａｓｎ　（Ｄ／Ｎ）　１８−７　１８Ｔｈｒ　（Ｔ）　１１．０　１ ２ Ｓｅｔ　（Ｓ）　１３．６　４３ Ｇｌｕ／Ｇｉｎ　（Ｅ／Ｑ）　２６．０　２６Ｇｌｙ　（Ｇ）　１０．５　１０ Ａｌａ　（Ａ）　１５．５　１５ Ｖａｌ　（＋／）　７．３　８ Ｍｅｔ　（Ｍ）　４．６　４゜ ｌｉｅ　（１）　１１．９　１２ Ｌｅｕ　（Ｌ）　２５．７　２６ Ｔｙｒ　（Ｙ）　５．０　５ Ｐｈｅ　（Ｆ）　６．９　７ Ｌｙｓ　（Ｋ）　８．６　９ Ｈ４ｓ　（Ｈ）　ｎ、ｄ、　１１ ０Ａｒ　（Ｒ）　１２．１　１２ Ｃｙｓ　（Ｃ）　ｎ、　ｄ、　Ｉ Ｔｒｐ　（Ｗ）　ｎ、　ｄ、　４ Ｐｒｏ　（Ｐ）　６．９　７ 総残基　１７６、２　２００ Ｍｒ　２２，９３１ （ａ）　Ａｒ＋ａｅｓ　＆　Ｐｏｒｎｅｙ（１９９０）の記載に従って実施した アミノ酸分析 （ｂ）図１の配列より ｎ、ｄ、＝測定せず （Ｃ）アミン末端メチオニンの不存在に基づく表■ 大腸菌からの組換えヒトＣＮＴＦの精製粗抽出液およびそれに続くプールされた 分画中のＣＮＴＦの百分率は、銀染色ゲルではなく、ＣＢＢのレーザーデンシト メーター分析によって評価した。百分率の値は少なくとも３回の別個の測定の平 均である。

工程　総蛋白質　％ＣＮＴＦ　ＣＮＴＦ−精製収率１゜粗抽出液　４０６１３５ ３　（１）　（１００）２、ＰＥｌ処理　３７０１３４８　（１）　９０３、Ｑ −Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　７２．５３６２６　２．８　４９４、Ｑ−３ｅｐｈａｒ ｏｓｅ　２６５７１４．８　４．４　２８５、Ｓ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　１４７ ６１０．６　５．９　２０６．２ｎ　−１フイーテイー　１０　＞９９．９１０ 　１９栄養単位／ｎｇでの見掛けの比活性を精製ヒｌ−ＣＮＴＦについて記録、 生物活性はヒナ胚Ｅ８毛様体神経節（ＣＧ）　、　Ｅｌｌ交感神経鎖（ＳＣ）お よびＥＩＯ後根伸根神経節ＤＲＧ）ニューロンの生残について測定した。

ＣＮＴＦ比活性（ＴＵ／ｎｇ） ＣＧニューロン　ＳＣニューロン　ＤＲＧニューロン２゜１２±　０．２＜１！ ｌ）　３．５±　ｂ　６　＜ａ）　１．７５　（ｂ）（ａ）二重測定で実施した 用量−反応曲線による５つの別個の実験の平均±Ｓ、　Ｅ。

（ｂ）四重測定で実施した用量−反応曲線による単−実験測定値 例２　：　ＣＮＴＦのＣ−末端切断型の確認ＣＮＴＦの製造および精製の別法に おいて、Ｃ−末端切断型ＣＮＴＦを確認した。

λＭ 株の説明 １）リードＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　（ＣＮＴＦ捕捉）カラムの変更＝Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ社のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｂｉｄ　Ｂｅａｄｓを試験したところ 、良好な結果が得られた１発酵処理：タンクに種培養液を接種し、細胞をＩ　Ｐ ＴＧにより１００Ｄ　（６００ｎ＋＋）で誘導した。細胞は５５０Ｄで遠心分離 により収穫した。細胞スラッジ（５０％固体）は直ちに使用するか、あるいは細 胞を一２０°Ｃで凍結した０通常の製造スケールは１０または１６０Ｌ細胞を解 凍し、水を加えて２０％細胞固体とし、　０．０５ＭＴｒｉｓ−塩基でｐＨを８ ．２に調整した。あるいは新たに収穫した細胞を使用した。全工程を４〜８°Ｃ で行った。

細胞を連続ホモジナイザーで溶解させた。ライゼートは遠心分離によって澄明と し、１０〜１５容の冷水で伝導度がリードカラム平衡化緩衝液のそれと同じにな るように工程１　：　（ＣＮＴＦの捕捉） Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高速流出力ラム工程生成物を、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩ、　ｐＨ８，１および１　ｍＭ　ＥＤＴＡで平衡化した３５ｍ１床容のＱ −３ｅｐｈａｒｏｓｅ高速流出樹脂で充填したアニオン交換カラム（直径５　ａ ｍ、長さ７．１ｃｍ）上に捕捉させた。澄明なライゼートをポンプにより１１ｍ 　１７分の速度で３μＭフィルター、ついでカラムに供給した。

カラムをＯＤ　（２８０ｎｍ）がベースラインに戻るまでカラム平衡化緩衝液に よって同じ流速で洗浄したく約３床容）。

ＣＮＴＦは、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ８，２およびＬ　ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ中に調製した８０＋＊Ｍ　ＮａＣ１により、　３０ｍ１／分の速度でカラ ムから段階的に溶出させた。全ピークをプールし、２倍の水で希釈し、　ｐＨを ０．１Ｎ　Ｈ２ＰＯ４により７．２に調整した。

工程２　：　Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ高速流出力ラム工程（ＣＮＴＦ　Ｃ−末端 切断型１．ＩＩおよび■の分離） プールしたＣＮＴＦを氷水で２倍に希釈し、　２５ｍＭ　ＮａＰＯ，ｐＨ７，１ ，２５＋ｏＭ　ＮａＣ１および０．１＋Ｍ　ＥＤＴＡで平衡化したカチオン交換 （Ｓ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ、　Ｐｈａｒｍａｃｔａ）カラム（直径２．５ｃｍ。

来客２．５００ｍ１）上に、　４．７ｍｌ／分の速度で負荷した。カラムをＯＤ 　（２８０ｎｍ）がベースラインに戻るまで、平衡化緩衝液によって同じ流速で 洗浄した。　ＣＮＴＦは、７．１から８．１へのｐ）ｆ勾配で溶出した。これは ２種の緩衝液で作成した２００ｍ１の勾配によって行われた。低ｐｌ緩衝液の組 成は２５ｍＭ　ＮａＰ＋、　ｐＨ７，１，２５ｍＭ　ＮａＣ１および０．１ｍＭ 　ＥＤＴＡとした。

高ｐｉ（緩衝液の組成は２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐ）１８．１．２５ｔ ｎＭ　ＮａＣ１および０．１而Ｍ　ＥＤＴＡとした。

ＣＮＴＦは１．２ｍｌ／分の流速で勾配溶出した。３つのピークのうち、最後の ピーク（ｐＨ７，８〜８．１）をＯＤ　（２８０ｎｍ）　０．２から０．２まで プールした。

最後のピークは実質的に純粋なＣＮＴＦ　ＩＩＩ型を含有し、これは図１に掲げ た完全アミノ酸配列を含有する。第２のピークはＣ−末端切断ＣＮＴＦ　ＩＩ型 を含有する。これは図１に掲げたアミノ酸配列のＣ−末端の最後の２個のアミノ 酸が切断されている。第１のピークはＣ−末端切断ＣＮＴＦ　Ｉ型を含有し、こ れは図１に掲げたアミノ酸配列のＣ−末端の最後の６個のアミノ酸が切断されて いる。

ＣＮＴＦのＣ−末端切断型１．ｎ、ｍ分離用の別のカラム：Ｔｏｓｏ　Ｈａａｓ からのカチオン交換樹脂（ＴＳＫ　５Ｐ６５０）およびＰｈａｒｍａｃｉａから のＳ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰを使用して良好な結果が得られた。

ＣＮＴＦ　Ｃ−末端切断型１．Ｉｆおよび■はまた。　５０＋ｍＭ！Ｊン酸緩衝 液を用い、　ｐＨ７，１においてＮａＣ１勾配により分離された。

工程３　：　Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高速流出力ラム工程Ｓ−５ｅうｈａｒｏｓ ｅプールのｐＨを０．１Ｎ　ＨＣＩまたはＭａｉｌで８．０に調整した。　ｏ− ５ｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ＞の大きさは。

直径２．５ｃｍ、来客２０＋ｏｌであった。樹脂は１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８ ，ｏ。

５０ｍＭ　ＮａＣｌで平衡化した。カラムに流速３．４＋ａｌ／分で負荷を行い 、　ＯＤ　（２８０ｎｍ）がベースラインに戻るまで平衡化緩衝液で洗浄した。

　ＣＮＴＦは２種の緩衝液からなる２００＋ｎｌの塩勾配により、　１．１ｍｌ ／分の速度で溶出させた。低塩緩衝液は１０ｍＭ　Ｔｒｊｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ８ ，０および５０ｍＭ　ＮａＣ１とした。

高塩緩衝液は１０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐｌ＋８．０および２００＋ｍ Ｍ　ＮａＣ１とした１分画のプールはＯＤ　（２８０ｎｎ＋）　０．３と０．９ の間で行った。

工程４：バルク保存 Ｑカラム溶出液のｐＨはＯ，ＩＮ　Ｈ３Ｐ０ａを用いて７．１〜７．２に調整し た。別法として、　Ａｍ１ｃｏｎ　ＹＨＩＯ膜を用いた限外濾過により、　ＣＮ ＴＦｆｉ度を約８ｍｇ／ｍｌに上昇させた。最後に物質を一７０℃に凍結させた 。

υ：　ＣＮＴＦの更なる生成のプロトコール本クロマトグラフィーの連続工程は Ｑ−−−−Ｓ−−−−Ｑである。この段階でのＣＮＴＦは、ＥＣＰ（大腸菌蛋白 質）に関しては９９．９％またはそれ以上の純度まで精製されている。

さらに、それはＤＮＡおよびエンドトキシンの規格をパスした。これらはそれぞ れ、用量あたりｉｏｏｐｇ　ＤＮＡ未満および１日体重あたり５Ｅ、Ｕ、未満で ある。　ＣＮＴＦの各型の量は通常、　ＣＮＴＦ　Ｃ−末端切断型■、■および Ｉが、それぞれ９７，３および０．１％であった。■は完全サイズのＣＮＴＦで ある。最終製品におけるＥＣＰの量はＥＣＰに対するＥＬＩＳＡで測定して５０ 〜２００ｐｐｍであった。　ＥＣＰの量を２５ｐｐｍ未満にさらに低下させるた めには、さらにカラム処理が必要であった。

処理フローチャートにおけるこの第４のカラムの配ｌｕは、第２　（’Ｓ’）お よび第３　（’Ｑ’）の間とするかまたは第３０カラムの後とすることができる 。以下に、さらに低いＥＣＰ含量の物質の製造を試みた各種カラム樹脂の例を挙 げる。

例Ａ、ヒドロキシアパタイト樹脂 セラミックヒドロキシアパタイト（ＨＡ）樹脂（ＡＩＣ）を充填したカラムを５ 　ｍＭ　ＮａＰｉ、　ｐＨ７，０で平衡化した。負荷液（Ｓ−カラム）のｐＨを ０．ＩＮ　）ＩｃＩで７．０に調整し、負荷液の伝導度がＨＡカラム平衡化緩衝 液の伝導度と等しくなるまで水を加えた。カラムをＯＤ　（２８０ｎｍ）がベー スラインに戻るまで、平衡化緩衝液で洗浄し、　ＣＮＴＦは１０床容のリン酸塩 勾配によって溶出した。低リン酸塩緩衝液は５ｍＭ　ＮａＰｉ、　ｐＨ７，０と した。高リン酸塩緩衝液は１５０ｍＭリン酸塩、　ｐＨ７，０とした０分画は、 それぞれピークの先導およびテーリング端であるＯＤ　（２８０ｎｍ）　０．３ および１．０の間をプールした。　ＥＣＰの混入は２５ｐｐｍ未満に低下した。

セラミックＨＡに加えて、　ＢＤＨからの楕円球状ＨＡでもＥＣＰの除去に成功 したが、これは全工程を通して低リン酸塩濃度を要求した。　ＨＡカラムはまた 。第３のカラムの後に使用することも可能で、この場合には最終バルク製品中に リン酸塩が残留しない。

例Ｂ、ブチル旧Ｃ樹脂 Ｂｕｔｙｌ　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｍ　（Ｔｏｓｏ−Ｈａａｓ）は疎水性 相互作用クロマトグラフィー（）ＩＩｃ）に使用される樹脂である。

ブチルカラム（直径２．５．長さ１０．２ｃｍ）に樹脂５０ｍ１を充填し、　２ ０ｍＭ　ＮａＰｉ　ｐＨ７，５中ｂた。　２００ｍｇ　ＣＮＴＦの負荷液中のＮ ａＣｌおよびリン酸塩濃度をそれぞれ３００＋ｎＭおよび２０ｍＭ　ｐＨ７，５ に調整した。カラムに１分間に９．６＋ｎｌの速度でＣＮＴＦを負荷し、カラム 平衡化緩衝液で洗浄した。　ＣＮＴＦは、　１７５ｍ＋１の２０ｍＭイミダゾー ル緩衝液ｐＨ７，５で段階溶出した。またＣＮＴＦは２０ｍＭ　ＴｒｉｓｐＨ７ ，５または２０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７，５もしくは水中５０％（ｖ／ｖ）エ チレングリコール、または２０ａ＋ＭイミダゾールｐＨ７，５中２０％エタノー ルもしくは１０％グリコールでも溶出できた。

樹脂は６Ｍ尿素で再生し、ついで水で洗浄し、再平衡化した。ビーズサイズ６５ ０Ｍまたは６５０Ｓのブチル樹脂でも同様の結果が期待される。

例Ｃ、Ｚｎ−ＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）樹脂 カラムは直径１ｃｍで、　Ｐｈａｒ＋ｎａｃｉａのキレートＳｅｐｈｒｏｓｅＦ ａｓｔ−Ｆ１ｏｗ４　ｍｌを充填した。カラムは１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ７ ，５および５０ｍＭ　ＮａＣ１で平衡化して、ついで水中に調製した１　ｍｇ　 ＺｎＣｌ２／ｍｌの溶液を用いたチャージング工程を行った。　ＣＮＴＦは容ｆ ｉ　５　ｍｇ／ｍｌの樹脂に３　ｍ１７分で負荷し、ついでカラム平衡化緩衝液 で洗浄した。　ＣＮＴＦは８０ｍ１のヒスチジン勾配により１　ｍ１７分で溶出 させた。勾配はカラム平衡化緩衝液中に調製した０〜７５ｍＭヒスチジンとした 。カラムは１０ｍＭ　ＨｅｐｅｓおよびＩ　Ｍ　ＮａＣ１中５　ｍＭ　ＥＤＴＡ 含有溶液。

ｐＨ７，５で再生し、ついでＩ　Ｍ　ＮａＯＨ中に１時間浸漬した。

ついでカラムを水洗し、再平衡化し、ついで亜鉛で再チャージした。この亜鉛カ ラムの配置はＳカラムおよびＱカラムの後の両者で検討した。他のチャージ金属 としては。

銅、コバルトおよびニッケルがある。

性工：末梢神経傷害後の感覚および運動機能の回復のＣＮＴＦによる促進能の証 明 Ａ、末梢神経傷害作成のプロトコール 体重１２０〜１４０ｇの雌性Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。

坐骨神経に傷害を作成する外科操作は、メトキシフルランで麻酔したラットに実 施した。誘導はベルチャンバー内とし、た、麻酔はノーズコーンによって維持し た。

左後肢の毛皮を大腿から臀部にかけて剃毛した。剃毛した領域をベタジン石鹸で 清浄化し、エタノールで洗浄した。操作にはすべて滅菌技術を用い、大転子と膝 関節の間の線の近位半分に１５ｍｍの皮膚切開を作成した。外側広筋と大腿二頭 筋をプラント離断によって分離し、大臀筋の下から現れ、半膜様半腿様筋上を走 る坐骨神経を露出させた。神経を持上げて、神経の周囲に、大転子から５ｍｍの 距離でＣｒ１ｌｅ止血鉗子を付した。　ＣｒＮｅ止血鉗子は最大限３０秒間閉鎖 させた。筋肉は再び対向させながった。

皮膚は創傷クリップで閉じた。ペニシリンＧブロヵインおよびペニシリンＧベン ザチンを水性懸濁液として筋肉内に１回注射した。

ラットは手術後１０〜１５分で歩行できる。大腿神経は無傷なので、ラットは損 傷後肢で体重を支えることができる。

Ｂ、末梢神経傷害後の感覚および運動機能の回復の評価方法 ｉ、感覚機能：損傷後肢の足裏の表面に対する皮膚感覚の回復を２足裏に電気刺 激を適用して回避反射を誘発することによって調べた。感覚神経が再生したなら ば、後肢の筋肉に接触する反射弓が完全になる。　８００〜３００μＡの範囲で １００μＡずつ低下させた一連の強さの電流を足裏に適用した。電流は定電流発 生装置（５３５００ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、　５ｔｏｅｌ目 ｎｇ、Ｗｏｏｄ　Ｄａｌｅ、　ＩＬ）によって発生させ１／８′離れたボールを 付した二重刺激電極（ＬａｆａｙｅｔｔｅＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、　Ｌａｆａｙ ｅｔｔ、　ＩＮ）で皮膚に伝達させた。ｉＩ流は足指５のすぐ傍の足踵の足裏表 面に適用した。ラットがその後肢の回避によって応答する最低の電流を測定した 。

３００μＡは正常ラットで再現性よく回避を生じる最小の電流であったことから 、これに応答したラットを１００％回復とみなした。

ｆｉ、運動機能：坐骨神経の圧潰は後肢の足指の伸筋の除神経を生じる０足指の 反射は異常亢進して、互いに異常に閉じた状態が維持される８足指の展開の喪失 を坐骨神経圧潰後の運動機能の指標とした０足指の展開は歩行ラットが作る足跡 から測定した。測定結果は、坐骨神経の再生過程におけるＣＮＴＦ−処置および 非処置ラットで比較した。

両後肢の足裏表面を、黒インキに軽く浸したインクパッドに押し付けた。ラット は後肢を先にして２歩行道の入口に置いた１歩行道は底表面を除去した三方が厚 紙のトンネルからなる。ラットの運動方向を指示する役目のトンネルは、白いブ チャー紙片の上に配置した。ラットはトンネル内を目白に移動させた。目的は、 ラットが歩行態様にある間の少なくとも２対の足跡をブチャー紙上に得ることで あった。

足指の展開（ＦＳ）および中間足指間の距離（［Ｄ）の２つのパラメーターを足 跡から測定した。　ＦＳは足指１の中央端から足指５の側端までの最も近いＩで の直線距離である。　ＩＤは足指２の中央端から足指４の側端までの最も近いＩ での直線距離である、各後肢について、　ＦＳおよびＩＤの平均距離を測定した 。各パラメーターについて、損傷左肢と非損傷右肢における測定値から比を計算 した。

すなわち、運動機能が坐骨神経圧潰後の時間の関数として回復するに従い、神経 圧潰後７日には正常の５０％未満であったＦＳまたはＩＤの比は増加し始めて、 正常比の１．０に近づいた。比は１日７に開始して毎日、対の損傷肢と非損傷肢 についての測定値から計算し、各パラメーターについてＣＮＴＦ−処置および非 処置群を比較した。

Ｃ，ＣＮＴＦの投与 ＣＮＴＦは、ラットに、Ｒの領域の背側正中線に皮下注射した。投与したＣＮＴ Ｆは、上述のＣｏ１１ｉｎｓらの特許出願に記載されたようにして製造されたヒ ト組換えＣＮＴＦであった。注射は２８ゲージの針が取り付けられたインスリン シリンジによって行った。注射時には最小限の物理的拘束を要した。注射したＣ ＮＴＦの容量は体重１　ｋｇあたり１．０ｍｌとした。対照ラットには同じ手法 を用いて１体重１　ｋｇあたり１．０Ｉｌｌのビヒクルを注射した。

Ｄ、実験デザイン ＣＮＴＦまたはビヒクルの注射は坐骨神経の傷害前２日に始め、傷害後１１日間 、計１４日継続した。坐骨神経の完全な圧潰は１日３に足裏試験によって試験し た。感覚神経の再生は、神経圧潰後１１日に開始して毎日９足裏試験によって測 定した。

Ｅ、末梢神経傷害後の機能回復に対するＣＮＴＦの効果上述のように２体重１ｋ ｇあたり０．１および０．２５ｍｇの用量でのＣＮＴＦ投与は、感覚（図１０） および運動（図１１）機能の回復速度を加速した。　ＣＮＴＦ−処置ラットでは 、ビヒクル単独処置ラットよりも、２．５０早＜５０％の正常感覚機能を回復し た（図１０）、ビヒクル−処置または非処置ラットは、物理的神経傷害後にも困 難なく感覚および運動機能を回復することに留意すべきである。したがって。

既に急速な回復系と考えられている回復への加速は、Ｎ要な所見である。

Ｆ、ＣＮＴＦ単独の非毒性的性質を示す対照ＣＮＴＦ単独の効果を評価するため には、別の対照を包含させた。　ＣＮＴＦは、末梢神経傷害後の回復を加速する ことが見出された用量において、運動性には全く影響せず。

体重に対しても有意な作用は示さなかった。上述の実験でＣＮＴＦを投与された 動物では、対照の非損傷側の運動および感覚機能には明らかな異常はなかった。

これは、神経傷害がない場合には、　ＣＮＴＦは感覚および運動機能に対して明 白な作用をもたないことを示している。

Ｇ、結論 ＣＮＴＦは、はぼ傷害の時期から毎日皮下注射によって投与された場合、ラット において物理的傷害後の末梢神経傷害からの回復の加速に有効であった。これら の結果は。

皮下注射されたＣＮＴＦが、傷害に対する末梢感覚および運動神経の応答を正の 方向に改変できることを証明する。

同様な治療基準は、末梢神経傷害に罹患している患者に容易に実践することがで きる。

本発明を以上、好ましい実施態様に関連して記述したが１本技術分野の熟練者に は本発明の範囲および精神から逸脱することなく、修飾および改変が可能である と考えられる。したがって、好ましい実施態様に関する上述の説明は限定的な意 味で解釈されるべきものではなく。

本発明は以下の請求の範囲およびそれらの均等範囲によって定義されなければな らない。

Ｏｅｌ　Ｑ　ｅｌ　ＯＮ？　ｌＪ５　（１：　Ｃ１へ　寸　ψ　ω　−−−Ｈ− ヘ 分画番号 ＦＩＧ、４ 分画番号 ＦＩＧ、５ 分画番号 （−）　日力ｌグ％ ト 傷害後日数 傷害後日数 手続補正書（方式） ％式％ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０９ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　１５１０９ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、、ＳＥ）、　ＡＵ、 　ＣＡ、　ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＲ，Ｎ（７２）発明者　マクドナルド、ジ ョン、アール。

アメリカ合衆国８０３０２　コロラド州ポウルダー、メイプルトン　２１３２ ＦＩ ／／（Ｃ１２Ｎ　１５１００　Ａ Ｃ１２Ｒ１：９１） （７２）発明者　フレウンド、アーウィンアメリカ合衆国８０５１３　コロラド 州パーツウド、８０１　ニス、カランティ　ロード（７２）発明者　ウィルヘル ム、ラリ−、ジェイ。

アメリカ合衆国８０３０３　コロラド州ポウルダー、ニス、サーティーナインス 　ストリート３１０ （７２）発明者　ポナム、デュアン、マックアメリカ合衆国８００２０　コロラ ド州ブルームフィールド、ダブリュ、イレブンス　アベニュー　ドライブ　３３ １３

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．図１に示すアミノ酸配列においてＣ−末端の２個のアミノ酸が切断されてい るアミノ酸配列を有する組換えヒト毛様体向神経因子（ＣＮＴＦ）蛋白質。
2. ２．図１に示すアミノ酸配列においてＣ−末端の６個のアミノ酸が切断されてい るアミノ酸配列を有する組換えヒト毛様体向神経因子（ＣＮＴＦ）蛋白質。
3. ３．ＣＮＴＦをコードするＤＮＡ配列からなるベクターの発現によって得られる 「請求項１」による組換えＣＮＴＦ蛋白質。
4. ４．ＣＮＴＦをコードするＤＮＡ配列からなるベクターの大腸菌内での発現によ って得られる「請求項１」による組換えＣＭＴＦ蛋白質。
5. ５．ＣＮＴＦをコードするＤＮＡ配列からなるベクターの発現によって得られる 「請求項２」による組換えＣＮＴＦ蛋白質。
6. ６．ＣＮＴＦをコードするＤＮＡ配列からなるベクターの大腸菌内での発現によ って得られる「請求項２」による組換えＣＮＴＦ蛋白質。
7. ７．図１に示すアミノ酸配列を有し，Ｃ−末端が切断されているＣＮＴＦを実質 的に含まない組換えヒトＣＮＴＦ蛋白質。
8. ８．ヒトＣＮＴＦ蛋白質はＣＮＴＦをコードするＤＮＡ配列からなるベクターの 大腸菌内での発現によって得られる「請求項７」による組換えヒトＣＮＴＦ蛋白 質。
9. ９．（ａ）可溶性ＣＮＴＦ蛋白質を含有する細胞ライゼートを，ＣＮＴＦを可逆 的に結合するアニオン交換カラムに適用し， （ｂ）アニオン交換カラムに結合したＣＮＴＦ蛋白質を塩で溶出してＣＮＴＦか らなる分画を集め，（ｃ）ＣＮＴＦ蛋白質を含む分画をカチオン交換カラムに適 用し， （ｄ）ＣＮＴＦ蛋白質を約７から約８．５のｐＨ勾配によって溶出してＣＮＴＦ からなる分画を集め， （ｅ）ＣＮＴＦ蛋白質を含む分画をアニオン交換カラムに適用し，ついで （ｆ）実質的に精製されたＣＮＴＦ蛋白質を塩勾配で溶出する， 各工程からなる実質的に精製されたＣＮＴＦの製造方法。
10. １０．「請求項９」による方法によって製造された組換えヒトＣＮＴＦ蛋白質。
11. １１．（ａ）ＣＮＴＦをコードする核酸配列を含有する細胞を増殖させ， （ｂ）細胞を収穫し， （ｃ）ＣＮＴＦ蛋白質を可溶化し， （ｄ）可溶性ＣＮＴＦ蛋白質を含む細胞ライゼートを，ＣＮＴＦを可逆的に結合 するアニオン交換カラムに適用し，（ｅ）アニオン交換カラムに結合したＣＮＴ Ｆ蛋白質を塩で溶出してＣＮＴＦからなる分画を集め，（ｆ）ＣＮＴＦ蛋白質を 含む分画をカチオン交換カラムに適用し， （ｇ）ＣＮＴＦ蛋白質を約７から約８．５のｐＨ勾配によって溶出してＣＮＴＦ からなる分画を集め， （ｈ）ＣＮＴＦ蛋白質を含む分画をアニオン交換カラムに適用し， （ｉ）実質的に精製されたＣＨＴＦ蛋白質を塩勾配で溶出し，ついで （ｊ）ＣＮＴＦ蛋白質を塩勾配で溶出する，各工程からなる実質的に精製された ＣＮＴＦの製造方法。
12. １２．治療有効量のＣＮＴＦをそれを必要とする患者に投与することからなる末 梢神経傷害の予防または処置方法。
13. １３．ＣＮＴＦは蛋白質である「請求項１２」の方法。
14. １４．ＣＮＴＦは天然に存在する蛋白質である「請求項１３」の方法。
15. １５．ＣＮＴＦは組換えＤＮＡ法で製造される蛋白質である「請求項１３」の方 法。
16. １６．ＣＮＴＦは実質的に純粋な型である「請求項１２」の方法。
17. １７．ＣＮＴＦは医薬的に許容される担体中において投与される「請求項１２」 の方法。
18. １８．ＣＮＴＦは液体剤形で投与される「請求項１２」の方法。
19. １９．ＣＮＴＦはヒト組換え蛋白質である「請求項１２」の方法。
20. ２０．末梢神経傷害は，物理的傷害，ニューロトキシンヘの暴露，慢性代謝性疾 患，および神経変性疾患からなる群より選ばれる状態によって引き起こされる「 請求項１２」の方法。
21. ２１．末梢神経傷害の予防または処置に適当な医薬の製造のための治療有効量の ＣＮＴＦの使用。
22. ２２．治療有効量のＣＮＴＦからなる末梢神経傷害の予防または治療用薬剤。
23. ２３．ＣＮＴＦのＣ−末端切断型をコードするＤＮＡ配列からなる発現ベクター 。
24. ２４．「請求項２３」の発現ベクターの細菌発現系での発現からなるＣＮＴＦの Ｃ−末端切断型の製造方法。
25. ２５．発現系は大腸菌発現系である「請求項２４」の方法。