JPH07121237B2 - 化学発光反応を利用する酵素の測定法 - Google Patents

化学発光反応を利用する酵素の測定法

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JPH07121237B2
JPH07121237B2 JP5187042A JP18704293A JPH07121237B2 JP H07121237 B2 JPH07121237 B2 JP H07121237B2 JP 5187042 A JP5187042 A JP 5187042A JP 18704293 A JP18704293 A JP 18704293A JP H07121237 B2 JPH07121237 B2 JP H07121237B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は試料中に単独に、或は
他の物質と結合して存在する酵素を、化学発光を利用し
て測定する方法において、水性緩衝液中において酵素を
カチオン性界面活性剤の存在下で、安定な化学発光性
１，２−ジオキセタンと反応させることを特徴とする測
定法に関するものである。上記した１，２−ジオキセタ
ンは酵素により活性化可能なオキシド基（ＯＸ基）を有
するアリール基を置換基として含み、Ｘを除去されると
不安定なオキシド中間体の１，２−ジオキセタンを経て
２個のカルボニル含有化合物に分解すると同時に光を発
光する。
【０００２】
【従来の技術】
１．発光の機序…発熱化学反応は、反応過程においてエ
ネルギーを放出する。実質上全ての場合において本エネ
ルギーは、振動励起または熱の形で放出される。しかし
ながら若干の化学反応過程では熱の代わりに光、つまり
化学発光が生ぜしめられる。光発生の機序には、高エネ
ルギー物質（１，２−ジオキセタンのような有機過酸化
物である場合が多い。）の熱分解或は接触分解により三
重項または一重項電子励起状態の反応生成物が生ぜしめ
られる過程が含まれる。一重項励起状態の反応生成物か
らの蛍光は、いわゆる直接発光である。この化学発光の
量子収率は、一重項化学励起の量子収率と発光の量子収
率との積である。これらの量は効率でもつて表現される
場合が多く、ここに効率（％）＝Φ×１００である。三
重項または一重項励起状態の生成物から蛍光受容体への
エネルギー移動は、間接化学発光を生じさせるために利
用できる。間接化学発光の量子収率は、三重項または一
重項化学励起の量子収率とエネルギー移動の量子収率と
エネルギー受容体の発光の量子収率との積である。
【化３】
【０００３】２．生物発光におけるジオキセタン中間体
…１９６８年にマツクカプラ（ＭｃＣａｐｒａ）は、
１，２−ジオキセタン類が蛍の系統を含む種々の生物発
光反応において重要な高エネルギー中間体であろうと提
唱した。（Ｆ．ＭｃＣａｐｒａ：Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕ
ｎ．，１５５（１９６８））。この中間体は全く不安定
であつて単離もされておらず分光学的に観測されてもい
ないが、生物発光反応における本中間体の明白な証拠が
酸素１８標識実験によつて与えられている（Ｏ．Ｓｈｉ
ｍｏｍｕｒａ ａｎｄ Ｆ．Ｈ．Ｊｏｈｎｓｏｎ：Ｐｈ
ｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．３０，８９（１
９７９））。
【化４】
【０００４】３．信頼できる１，２−ジオキセタン類の
最初の合成…１９６９年のコペッキイ（Ｋｏｐｅｃｋ
ｙ）とマンフォード（Ｍｕｍｆｏｒｄ）は、β−ブロム
ヒドロペルオキシドの塩基触媒環化によるジオキセタン
（３，３，４−トリメチル−１，２−ジオキセタン）の
最初の合成について報告した（Ｋ．Ｒ．Ｋｏｐｅｃｋｙ
ａｎｄ Ｃ．Ｍｕｍｆｏｒｄ：Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．
４７，７０９（１９６９））。マックカプラ（ＭｃＣａ
ｐｒａ）によって予測されたようにこのジオキセタンは
実際に、５０℃に加熱するとアセトン及びアセトアルデ
ヒドに分解しつつ化学発光を生じた。しかしこの過酸化
物は比較的不安定であり、常温（２５℃）で保存すると
急速に分解してしまう。また化学発光の効率が非常に低
い（０．１％以下）。
【０００５】バートレツト（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）及びシ
ヤープ（Ｓｃｈａａｐ）とマツアー（Ｍａｚｕｒ）及び
フツテ（Ｆｏｏｔｅ）は各独自に、１，２−ジオキセタ
ン類のより容易な別の合成法を開発した。分子酸素と感
光色素との存在下で正当に置換されたアルケン類を光酸
化することによつて、ジオキセタン類が高収率で生成さ
れる（Ｐ．Ｄ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｓ
ｃｈａａｐ：Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９２，
３２２３（１９７０）及びＳ．Ｍａｚｕｒ ａｎｄ
Ｃ．Ｓ．Ｆｏｏｔｅ：Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．９２，３２５５（１９７０））。この反応の機序に
は、アルケンと２＋２環化付加を行なつてジオキセタン
を生成する一重項酸素として知られている準安定化合物
の光化学的発生が含まれる。研究の結果、この反応を用
いて各種のジオキセタン類を製造できることが示されて
いる（Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ，Ｐ．Ａ．Ｂｕｒｎｓ，ａ
ｎｄＫ．Ａ．Ｚａｋｌｉｋａ：Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．９９，１２７０（１９７７）、Ｋ．Ａ．Ｚ
ａｋｌｉｋａ，Ａ．Ｌ．Ｔｈａｙｅｒ，ａｎｄ Ａ．
Ｐ．Ｓｃｈａａｐ：Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
１００，３１８（１９７８）、Ｋ．Ａ．Ｚａｋｌｉｋ
ａ，Ｔ．Ｋｉｓｓｅｌ，Ａ．Ｌ．Ｔｈａｙｅｒ，Ｐ．
Ａ．Ｂｕｒｎｓ，ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ：Ｊ．
Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１００，４９１６（１９
７８）、Ｋ．Ａ．Ｚａｋｌｉｋａ，Ｔ．Ｋｉｓｓｅｌ，
Ａ．Ｌ．Ｔｈａｙｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｂｕｒｎｓ，ａｎｄ
Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ：Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔ
ｏｂｉｌｏ．３０，３５（１９７９）、及びＡ．Ｐ．Ｓ
ｃｈａａｐ，Ａ．Ｌ．Ｔｈａｙｅｒ，ａｎｄ Ｋ．Ｋｅ
ｅｓ：Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ II ，４９（１９７６））。この
研究の過程で、光酸化用のポリマー結合増感剤が開発さ
れた（Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ，Ａ．Ｌ．Ｔｈａｙｅｒ，
Ｅ．Ｃ．Ｂｌｏｓｓｅｙ，ａｎｄ Ｄ．Ｃ．Ｎｅｃｋｅ
ｒｓ：Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９７，３７４
１（１９７５）、及びＡ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ，Ａ．Ｌ．
Ｔｈａｙｅｒ，Ｋ．Ａ．Ｚａｌｉｋａ，ａｎｄ Ｐ．
Ｃ．Ｖａｌｅｎｔｉ：Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．１０１，４０１６（１９７９））。この新しいタイ
プの増感剤は特許され、商標名「ＳＥＮＳＩＴＯＸ」で
販売されている（１９８２年２月１６日発行の米国特許
Ｎｏ．４，３１５，９９８、及び１９７９年１２月１９
日発行のカナダ特許Ｎｏ．１，０４４，６３９）。この
製品の使用についての報告が、５０を越える文献でなさ
れている。
【化６】
【０００６】４．立体障害のアルケン類から誘導される
安定なジオキセタン類の製造…ウインバーグ（Ｗｉｎｂ
ｅｒｇ）は、アダマンチリデンアダマンタンのような立
体障害のアルケン類の光酸化によつて極めて安定なジオ
キセタン類が提供されることを発見した（Ｊ．Ｈ．Ｗｉ
ｅｒｉｎｇａ，Ｊ．Ｓｔｒａｔｉｎｇ，Ｈ．Ｗｙｎｂｅ
ｒｇ，ａｎｄ Ｗ．Ａｄａｍ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ．１６９（１９７２））。ターロ（Ｔｕｒｒ
ｏ）及びシヤープ（Ｓｃｈａａｐ）による共同研究によ
りこのジオキセタンについて、分解のための活性化エネ
ルギーが３７ｋｃａｌ／モルであり常温（２５℃）での
半減期が２０年を越えることが示された（Ｎ．Ｊ．Ｔｕ
ｒｒｏ，Ｇ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｈ．Ｃ．Ｓｔｅｉｎｍ
ｅｔｚｅｒ，Ｇ．Ｒ．Ｆａｌｅｒ，ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｓ
ｃｈａａｐ：Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９７，
７１１０（１９７５））。実際上、これが今まで文献で
報告された最も安定なジオキセタンである。アダム（Ａ
ｄａｍ）とウインバーグ（Ｗｉｎｂｅｒｇ）は最近、官
能化されたアダマンチリデンアダマンタン１，２−ジオ
キセタン類が生物医学上の用途に対し有用であろうこと
を示唆している（Ｗ．Ａｄａｍ，Ｃ．Ｂａｂａｔｓｉｋ
ｏｓ，ａｎｄ Ｇ．Ｃｉｌｅｎｔｏ：Ｚ．Ｎａｔｕｒｆ
ｏｒｓｃｈ．３９ｂ，６７９（１９８４）、Ｉｎ Ｂｉ
ｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕ
ｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｍ．Ａ．ＤｅＬｕｃａ ａｎｄ
Ｗ．Ｄ．ＭｃＥｌｒｏｙ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１年発行、第６８７
頁、及びＪ．Ｃ．Ｈｕｍｍｅｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．Ｌｕｉｄ
ｅｒ，ａｎｄ Ｈ．Ｗｙｎｂｅｒｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３３Ｂ，５３１（１９８
６））。しかしこの異常に安定な過酸化物を化学発光性
標識として使用したとすると、１５０−２５０℃の検出
温度が必要となる。これらの条件は明らかに、水性媒体
中での生物学的被分析物の検出に対し不適当である。マ
ツクカプラ（ＭｃＣａｐｒａ）、アダム（Ａｄａｍ）、
及びフーテ（Ｆｏｏｔｅ）は、スピロ結合の環式或は多
環式のアルキル基をジオキセタンと組合せると、この立
体的にかさばつた基が存在しないとすれば比較的不安定
であるジオキセタンを安定化するのに役立つことを、見
出した（Ｆ．ＭｃＣａｐｒａ，Ｉ．Ｂｅｈｅｓｈｔｉ，
Ａ．Ｂｕｒｆｏｒｄ，Ｒ．Ａ．Ｈａｎｎ，ａｎｄ Ｋ．
Ａ．Ｚａｋｌｉｋａ：Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅ
ｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，９４４（１９７７）、Ｗ．Ａｄａ
ｍ，Ｌ．Ａ．Ａ．Ｅｎｃａｒｎａｃｉｏｎ，ａｎｄ
Ｋ．Ｚｉｎｎｅｒ：Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１１６，８３９
（１９８３）、Ｇ．Ｇ．Ｇｅｌｌｅｒ，Ｃ．Ｓ．Ｆｏｏ
ｔｅ，ａｎｄＤ．Ｂ．Ｐｅｃｈｍａｎ：Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，６７３（１９８３）、Ｐ．Ｌｅ
ｃｈｔｋｅｎ：Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１０９，２８６２
（１９７６）、及びＰ．Ｄ．Ｂａｒｔｅｔｔ ａｎｄ
Ｍ．Ｓ．Ｈｏ：Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９
６，６２７（１９７４））。
【化７】
【０００７】５．ジオキセタン化学発光に対する置換基
の効果…ジオキセタン類の安定性と化学発光効率は、特
定の置換基をペルオキシド環に付加することによつて変
更することができる（Ｋ．Ａ．Ｚａｋｌｉｋａ，Ｔ．Ｋ
ｉｓｓｅｌ，Ａ．Ｌ．Ｔｈａｙｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｂｕｒｎ
ｓ，ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ：Ｐｈｏｔｏｃｈｅ
ｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．３０，３５（１９７９）、
Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐａｎｄ Ｓ．Ｇａｇｎｏｎ：Ｊ．
Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４，３５０４（１９
８２）、Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ，Ｓ．Ｇａｇｎｏｎ，ａ
ｎｄ Ｋ．Ａ．Ｚａｋｌｉｋａ：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ Ｌｅｔｔ．，２９４３（１９８２）、及びＲ．Ｓ．
Ｈａｎｄｌｅｙ，Ａ．Ｊ．Ｓｔｅｒｎ，ａｎｄ Ａ．
Ｐ．Ｓｃｈａａｐ：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ．，３１８３（１９８５））。次に示す二環式系につ
いての結果は、ジオキセタン類の特性に対する種々の官
能基の有意義な効果を例証している。すなわち２，３−
ジアリール−１，４−ジオキセタンから誘導されたヒド
ロキシ置換ジオキセタン（Ｘ＝ＯＨ）は、常温（２５
℃）での分解による半減期が５７時間であり、加熱によ
る昇温下で非常に低いレベルの蛍光を発生する。しかし
対照的に、このジオキセタンを−３０℃で塩基と反応さ
せると青い光の閃光を発生する。動力学的な研究によつ
て脱プロトン化したジオキセタン（Ｘ＝Ｏ- ）が２５℃
におき、プロトン付加型（Ｘ＝ＯＨ）よりも５．７×１
０6 倍も速く分解することが示されている。
【化８】
【０００８】これらの２つのジオキセタンの特性の差異
は、分解についての２つの拮抗する機序に由来する
（Ｋ．Ａ．Ｚａｋｌｉｋａ，Ｔ．Ｋｉｓｓｅｌ，Ａ．
Ｌ．Ｔｈａｙｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｂｕｒｎｓ，ａｎｄ Ａ．
Ｐ．Ｓｃｈａａｐ：Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂ
ｉｏｌ．３０，３５（１９７９）、Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａ
ｐ，Ｓ．Ｇａｇｎｏｎ，ａｎｄ Ｋ．Ａ．Ｚａｋｌｉｋ
ａ：ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，２９４３（１
９８２）、及びＲ．Ｓ．Ｈａｎｄｌｅｙ，Ａ．Ｊ．Ｓｔ
ｅｒｎ，ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ，Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３１８３（１９８５））。た
いていのジオキセタンは、Ｏ−Ｏ結合のホモリシス及び
ビラジカルの形成を含む過程によつて開裂する。開裂に
関する別の機序は、Ｏ- のように低い酸化電位を有する
置換基を持つジオキセタンについてのものである。すな
わち開裂は、置換基からペルオキシド結合の反結合軌道
への分子内電子移動によつて開始せしめられる。
【０００９】６．ジオキセタン類の化学的な誘発…文献
中で最初の例は、上述した報文（Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ
ａｎｄ Ｓ．Ｇａｇｎｏｎ：Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．１０４，３５０４（１９８２））に記載さ
れている。しかしヒドロキシ置換ジオキセタン及びジア
リール−１，４−ジオキセタンから誘導された他のどの
ようなジオキセタンも、あまりに不安定すぎて如何なる
用途にも使用できない。これらのジオキセタンは２５℃
で只の数時間の半減期をもつに過ぎない。ジオキセタン
だけでなくその前駆体アルケンも、誘導体を生成するの
に必要な条件をのり切れない。さらにこれらの非安定化
ジオキセタン類は少量のアミン（Ｔ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ
ｎｔ．Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．：Ｃｈｅｍ，Ｓｅｒ．Ｔｗｏ，
９，２６５（１９７６））及び金属イオン（Ｔ．Ｗｉｌ
ｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｌａｎｄｉｓ，Ａ．Ｌ．Ｂａｕｍｓｔ
ａｒｋ，ａｎｄ Ｐ．Ｄ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ：Ｊ．Ａｍ
ｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９５，４７６５（１９７
３）、及びＰ．Ｄ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ａ．Ｌ．Ｂａｕ
ｍｓｔａｒｋ，ａｎｄ Ｍ．Ｅ．Ｌａｎｄｉｓ：Ｊ．Ａ
ｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９６，５５５７（１９７
４））により破壊され、酵素による誘発のために必要な
水性緩衝液中で用いえなかつた。
【００１０】７．均質溶液中でのジオキセタン類を包含
するエネルギー移動化学発光…ジオキセタン類を包含す
るエネルギー移動化学発光に関する最初の例は、ウイル
ソン（Ｗｉｌｓｏｎ）及びシヤープ（Ｓｃｈａａｐ）に
よつて報告された（Ｔ．Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ａ．
Ｐ．Ｓｃｈａａｐ：Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
９３，４１２６（１９７１））。極めて不安定なジオキ
セタン（シスージエトキシジオキセタン）を熱分解する
ことにより、一重項励起及び三重項励起の両者のギ酸エ
チルが生じた。９，１０−ジフエニルアントラセンと
９，１０−ジブロモアントラセンを付加することによつ
て、一重項−一重項エネルギー移動及び一重項−三重項
エネルギー移動によりそれぞれ増強された化学発光が生
じた。本技術は次いで数多くの他の研究者らにより、各
種のジオキセタン類の熱分解によつて生ぜしめられる化
学励起生成物の収率を測定するのに利用された（例えば
Ｗ．Ａｄａｍ，Ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘ
ｃｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，Ｗ．Ａｄａｍ ａｎｄ
Ｇ．Ｃｉｌｅｎｔｏ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２年発行、第４章参
照）。しかも均質溶液中でのエネルギー移動は、電子的
な励起状態にあるジオキセタンの半減期が短いことから
して高濃度のエネルギー受容体を必要とする。かかる高
濃度はセルフクエンチング（自己消光）と再吸収といつ
た問題を生じさせる。
【００１１】８．ミセル中での分子間エネルギー移動を
利用したジオキセタンからの増強された化学発光…種々
の化学反応の速度を、水溶液中においてミセルにより促
進することができる（例えばＥ．Ｈ．Ｃｏｒｄｅｓ ａ
ｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｄｕｎｌａｐ：Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅ
ｓ．２，３２９（１９６９）参照）。ミセルのプソイド
相（ｐｓｅｕｄｏｐｈａｓｅ）中での基質の可溶化及び
静電的、疎水性或は極性の因子に基いて触媒作用が生じ
る。ミセル水溶液は、化学的に誘発されるジオキセタン
の割合を高めるのに利用されて来ている（Ａ．Ｐ．Ｓｃ
ｈａａｐ，Ｆｉｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏ
ｒｔ ｔｏ ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｎａｖａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８７年，第１６頁）。化学発
光の効率を高めるために蛍光性の共存性界面活性剤のよ
うな蛍光性化合物を用いる実験は、何ら報告されていな
い。
【００１２】いくつかの報文が、ミセルを用いた環境中
での化学反応に基づく増強された化学発光について記載
している。しかしミセル中で安定化されたジオキセタン
については、全く研究されていない。ゴトウ（Ｇｏｔ
ｏ）は中性、アニオン性、及びカチオン性界面活性剤の
存在下でのルシフエリンの化学酸化について研究してい
る（Ｔ．Ｇｏｔｏ ａｎｄ Ｈ．Ｆｕｋａｔｓｕ，Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，４２９９（１９６
９））。水溶液におけるのと対比して、ミセル中におい
ては化学発光が増強されることからして反応生成物の発
光効率の向上がみられた。アルカリ性水溶液中でのアク
リドンエステルの化学発光反応に対する臭化セチルトリ
メチルアンモニウムのミセルの効果が、報告されている
（Ｆ．ＭｃＣａｐｒａ：Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．
９，２０１（１９７６））。しかし本報文は、ミセルを
用いた環境が「励起反応を助けることはしない」ことを
示している。むしろミセルは、競合する非発光性の加水
分解反応の速度を減少させることによつて発光収率を高
めると、考えられている。類似してニコカボウラス（Ｎ
ｉｋｏｋａｖｏｕｒａｓ）及びガンダマン（Ｇｕｎｄｅ
ｒｍａｎｎ）は、ルシゲニン及びルミノールの各誘導体
の化学発光反応に対するミセルの効果について研究して
いる（Ｃ．Ｍ．Ｐａｌｅｏｓ，Ｇ．Ｖａｓｓｉｌｏｐｏ
ｕｌｏｓ，ａｎｄＪ．Ｎｉｋｏｋａｖｏｕｒａｓ，Ｂｉ
ｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕ
ｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８１年発行，第７２９頁、及
びＫ．Ｄ．Ｇｕｎｄｅｒｍａｎｎ，同書、第１７頁）。
シンカイ（Ｓｈｉｎｋａｉ）は、不安定な非単離性のジ
オキセタンの化学発光収率を水と対比してのミセル中で
高めうることを、観察した（Ｓ．Ｓｈｉｎｋａｉ，Ｙ．
Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｏ．Ｍａｎａｂｅ，ａｎｄ Ｔ．Ｋ
ｕｎｉｔａｋｅ，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１５２３（１
９８１））。これらの研究者は、励起状態の収率は水中
でよりもミセルの疎水性核中での方がより高いであろう
ことを、示唆した。
【００１３】酵素によつて誘発される化学発光を界面活
性剤によつて増強することについての唯一の文献とし
て、発光性飛翔昆虫のルシフエラーゼ系に関するクリク
カ（Ｋｒｉｃｋａ）及びデルカ（ＤｅＬｕｃａ）の報文
がある（Ｌ．Ｊ．ｋｒｉｃｋａａｎｄ Ｍ．ＤｅＬｕｃ
ａ：Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２１
７，６７４（１９８３））。非イオン性の洗剤とポリマ
ーが、酵素の転換を増すことにより全体としての発光収
率を高めた。臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴ
ＡＢ）のようなカチオン性の界面活性剤は実際上、ルシ
フエラーゼの触媒活性を完全に阻止した。
【００１４】ルミノール／ペルオキシダーゼ反応の化学
発光収率を、６−ヒドロキシベンゾチアゾール誘導体ま
たはパラ置換フエノールの添加によつて高める方法があ
る（Ｇ．Ｈ．Ｇ．Ｔｈｏｒｐｅ，Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋ
ａ，Ｓ．Ｂ．Ｍｏｓｅｌｅｙ，Ｔ．Ｐ．Ｗｈｉｔｅｈｅ
ａｄ：Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３１，１３５５（１９８
５）、Ｇ．Ｈ．Ｇ．Ｔｈｏｒｐｅ ａｎｄ Ｌ．Ｊ．Ｋ
ｒｉｃｋａ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ １３３，３３１（１９８６）、及びＬ．Ｊ．Ｋｒ
ｉｃｋａ，Ｇ．Ｈ．Ｇ．Ｔｈｏｒｐｅ，ａｎｄ Ｒ．
Ａ．Ｗ．Ｓｔｏｔｔ：Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅ
ｍ．５９，６５１（１９８７））。収率向上の機序は知
られていないが、分子内エネルギー移動は包含しない。
【００１５】共存ミセル性の蛍光プローブが、ミセルの
動的特性を研究するために利用されて来ている（Ｙ．Ｋ
ｕｂｏｔａ，Ｍ．Ｋｏｄａｍａ，ａｎｄ Ｍ．Ｍｉｕｒ
ａ：Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．４６，１０
０（１９７３）、Ｎ．Ｅ．Ｓｃｈｏｒｅ ａｎｄ Ｎ．
Ｊ．Ｔｕｒｒｏ：Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９
６，３０６（１９７４）、及びＧ．Ｗ．Ｐｏｈｌ：Ｚ．
Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．３１ｃ，５７５（１９７
６））。しかしこれらの発光物質を、ミセル中でエネル
ギー移動過程により化学発光反応を促進するように用い
た例を開示する文献は、見当らない。
【００１６】９．化学発光免疫測定…酵素基質としての
ジオキセタン或は酵素結合アツセイにおけるジオキセタ
ンの利用に関する報告は、１９８６年７月１７日付の米
国特許出願Ｎｏ．８８７，１３９の出願日前には存在し
ない。ウインバーグ（Ｗｙｎｂｅｒｇ）は、免疫測定用
の「熱化学発光性」標識として安定なジオキセタン類を
用いた（Ｊ．Ｃ．Ｈｕｍｍｅｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．Ｌｕｉｄ
ｅｒ，ａｎｄ Ｈ．Ｗｙｎｂｅｒｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３３Ｂ，５３１（１９
８６））。これらのジオキセタンは、タンパク質のよう
な生物学的物質を標識するのに用いられている。測定は
試料を１００−２５０℃に加熱し、熱的に発生する化学
発光を検出することによつて行なわれる。この技術と、
誘発可能なジオキセタン類を酵素基質として用いること
とは明白に異質である。
【００１７】ルミノール誘導体、アクリジニユウムエス
テル及びルシゲニンが抗原、抗体及びハプテン用の化学
発光性標識として、用いられている（Ｈ．Ｒ．Ｓｃｈｒ
ｏｅｄｅｒ ａｎｄ Ｆ．Ｍ．Ｙｅａｇｅｒ：Ａｎａ
ｌ．Ｃｈｅｍ．５０，１１１４（１９７８）、Ｈ．Ａｒ
ａｋａｗａ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，ａｎｄ Ａ．Ｔｓｕｊ
ｉ：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９，２４８（１９７
９）、及びＨ．Ａｒａｋａｗａ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，ａｎ
ｄ Ａ．Ｔｓｕｊｉ：Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３１，４３
０（１９８５））。また次の刊行物も参照されたい：
Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａａｎｄ Ｔ．Ｊ．Ｎ．Ｃａｒｔｅ
ｒ，Ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉ
ｃｋａ及びＴ．Ｊ．Ｎ．Ｃａｒｔｅｒ編，Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８２
年発行，第８章、Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ，Ｌｉｇａｎｄ
Ｂｉｎｄｅｒ Ａｓｓａｙｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋ
ｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８５年発行、
第７章、Ｆ．ＭｃＣａｐｒａ ａｎｄ Ｉ．Ｂｅｈｅｓ
ｈｔｉ，Ｉｎ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅ ａｎ
ｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ：Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，
Ｖｏｌ．Ｉ，Ｋ．Ｖａｎ Ｄｙｋｅ編、ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄ
ａ，１９８５年発行，第７章，特に第１３章のジオキセ
タンの項、及びＧ．Ｊ．Ｒ．Ｂａｒｎａｒｄ，Ｊ．Ｂ．
Ｋｉｍ，Ｊ．Ｌ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗ．Ｐ．
Ｃｏｌｌｉｎｓ，同書，第７章。
【００１８】酵素で標識された抗原、抗体及びハプテン
を用いるアツセイは、酵素免疫測定（ｅｎｚｙｍｅ ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）と名付けられている。酵素標識
は、色或は発光展開法で検出されて来ていた。より最近
では酵素免疫測定は、アルカリ性条件の下でルミノール
／過酸化水素、ピロガロール／過酸化水素、フオラス・
ダクチラス（Ｐｈｏｌａｓ ｄａｃｔｙｌｕｓ）ルシフ
エリン、或はルミノールを用いて測定されるペルオキシ
ダーゼ共役体に基いている（Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ ａ
ｎｄ Ｔ．Ｊ．Ｎ．Ｃａｒｔｅｒ，Ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ ａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｕｍｉｎｅｓ
ｃｅｎｃｅ，Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ及びＴ．Ｊ．Ｎ．
編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９８２年発行、第８章）。酵素結合アツセ
イに関する文献においてジオキセタン類を、光を発生す
る酵素基質として測定のために使用するようなことは、
何ら記載されていない。
【００１９】１０．発光反応の写真検出…いくつかの化
学発光及び生物発光反応による光放出を記録するのに、
インスタント写真フイルム及びＸ線フイルムが用いられ
て来ている（Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ ａｎｄ Ｇ．Ｈ．
Ｇ．Ｔｈｏｒｐｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ １３３，４０４（１９８６）及び同報文で
の引用文献参照）。また以下の文献も参照されたい：
Ｍ．Ｍ．Ｌ．Ｌｅｏｎｇ，Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，ａｎ
ｄ Ｒ．Ｐａｎｎｅｌ：Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙ
ｔｏｃｈｅｍ．３４，１６４５（１９８６）、Ｒ．Ａ．
Ｂｒｕｃｅ，Ｇ．Ｈ．Ｇ．Ｔｈｏｒｐｅ，Ｊ．Ｅ．Ｃ．
Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｐ．Ｒ．Ｋｉｌｌｅｅｎ，Ｇ．Ｏｇｄ
ｅｎ，Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ，ａｎｄ Ｔ．Ｐ．Ｗｈｉ
ｔｅｈｅａｄ：Ａｎａｌｙｓｔ．１１０，６５７（１９
８５）、Ｊ．Ａ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ａ．Ｂａｔｋｉ，
Ｃ．Ｈｙｎｄｓ，ａｎｄ Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ：Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５１，２０５（１９８５）、
及びＧ．Ｈ．Ｇ．Ｔｈｏｒｐｅ，Ｔ．Ｐ．Ｗｈｉｔｅｈ
ｅａｄ，Ｒ．Ｐｅｎｎ，ａｎｄ Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋ
ａ：Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３０，８０６（１９８４）。
何れの文献中にも、安定化されたジオキセタン類の化学
的或は酵素的な誘発によつて発生する化学発光の写真検
出について、言及するところがない。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】この発明の目的とする
ところは試料中に単独に、或は酵素免疫測定法とかＤＮ
Ａプローブの検出法等におけるように他の物質と結合し
て存在する酵素を、安定な化学発光性１，２−ジオキセ
タンを用いて効率よく測定する新規な酵素測定法を提供
することにある。またこの発明は長期間にわたつて常温
で安定に保存できる１，２−ジオキセタンを用いる新規
な酵素の測定法を提供することも、目的としている。さ
らにこの発明は常温で活性化させ化学発光を生じさせる
ことができる１，２−ジオキセタンを用いる新規な酵素
測定法を提供することも、目的としている。この発明の
他の目的と特徴とするところは、以下の記述及び図面を
参照することによつて明白に理解できる。
【００２１】
【課題を解決するための手段】この発明は試料中に単独
で、又は他の物質と結合して存在する、アリールエステ
ラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ及びアルカリホスファターゼからなる群から選択
される酵素を、化学発光反応を利用して測定する方法に
係り、本測定法は、水性緩衝液中において、カチオン性
界面活性剤の存在下で、一般式
【化９】 〔式中、Ｒ２はＯＸ基で置換されたアリール基であり、
ここで、ＯＸはエステル結合又はグリコシド結合でアリ
ール基Ｒ２と結合している基であって、Ｘは前記酵素と
易反応性の基であり、Ｒ１はアルキル基、アリール基、
アルコキシ基、アリールオキシ基、ジアルキルアミノ
基、トリアルキルシリルオキシ基、アリールシリルオキ
シ基、及びアリール基Ｒ２と一緒になってＯＸ基で置換
されたスピロ結合多環式アリール基（炭素原子に代わり
酸素原子を含む環を有していてもよい。）を形成するア
リール基から成る群から選択されるものであり、Ｒ３及
びＲ４はアルキル基（炭素原子に代わり異種原子Ｎ，
Ｏ，Ｓ又はＰを含んでいてもよい。）であり、これらが
一緒になってスピロ結合多環式アルキレン基を形成して
いてもよい。〕で表される安定な１，２−ジオキセタン
であって、Ｘが除去されると不安定なオキシド中間体の
１，２−ジオキセタン化合物を経て、一般式
【化１０】 （Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じ意味を有す
る）で表される２個のカルボニル含有化合物に分解する
と共に、電子エネルギーを放出して光を発生する、１，
２−ジオキセタンを、前記酵素と反応させ、前記カチオ
ン性界面活性剤の不存在下で反応させる場合よりも、強
い光を発生させる過程を含む。
【００２２】例えば後述するジオキセタン２ｃ（４−メ
トキシ−４−（３−ホスフエートフエニル）スピロ
〔１，２−ジオキセタン〕，二ナトリウム塩）を水性緩
衝液中でアルカリホスフアターゼにより誘発させると、
不安定なオキシド中間体の１，２−ジオキセタン化合物
を経て光が発生する。
【化１１】 この化学発光反応において後述する試験例で、カチオン
性界面活性剤を用いることなしに化学発光を生じさせる
とその量子収率が３．１×１０-6であつたのに対し、カ
チオン性界面活性剤（セチルトリメチルアンモニウム
塩）の存在下で化学発光を生じさせると量子収率が２．
１×１０-4にまで高められた。このように本発明は測定
しようとする酵素によつて安定な１，２−ジオキセタン
を誘発して化学発光を生じさせるのに際し、水性緩衝液
中で酵素を１，２−ジオキセタンと、カチオン性界面活
性剤の存在下で反応させることにより、同活性剤の不存
在下で反応させる場合よりも強い光を発生させるのであ
る。
【００２３】使用可能なカチオン性界面活性剤はアメリ
カ合衆国、ニユーヨークのＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ社１９７５年発行の「Ｍｉｃｅｌｌａｒ ａｎｄ Ｍ
ａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ」中の第
１章「Ｃａｔａｌｙｓｉｓ」の第１−１８頁に記載され
ている。それにはアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ホ
スホニウム塩及びスルホニウム塩が含まれる。
【００２４】式
【化１２】 で表される化合物について説明する。
【００２５】Ｒ1 がＲ2 と結合していないときは、この
Ｒ1 は前記したようにアルキル基、アルコキシ基、アリ
ールオキシ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルシリ
ルオキシ基、アリールシリルオキシ基またはアリール基
である。アルキル基またはアルコキシ基は炭素数１−８
を有する低級のものであるのが好ましい。Ｒ1 はまた、
炭素数６−１４のアリール基、アリールオキシ基または
アリールシリルオキシ基であつてもよい。Ｒ1 がアリー
ル基Ｒ2 と結合して１，２−ジオキセタン環にスピロ結
合する多環式アリール基を形成する場合、その多環式ア
リール基は炭素数３０までのものであるのが好ましい。
この場合の多環式アリール基はキサンテニル基のよう
に、炭素原子に代わる酸素原子を含む環を有するもので
あつてもよい。好ましいスピロ結合多環式アリール基
は、同基のＣ９位で１，２−ジオキセタン環にスピロ結
合するフルオレニル基又はキサンテニル基である。
【００２６】Ｒ２は、Ｘ−オキシ基（ＯＸ基）で置換さ
れたアリール基である。ここで、ＯＸは、エステル結合
又はグリコシド結合でアリール基Ｒ２に結合している。
アリールを含む基はフェニル基、ビフェニル基、結合フ
ェニル基及び他のアリール基であり、６−３０個の炭素
原子を含み、且つ他の置換体を含んでいてよい。
【００２７】Ｘは、安定な１，２−ジオキセタンを分解
させて化学発光を生じさせるためにジオキセタンから酵
素で除去される基である。すなわち例えば酵素が免疫測
定及びＤＮＡプローブの検出において比色基質或は蛍光
基質により検出させるものとして従来から普通に用いら
れているアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、もしくはアリールまたはアセチルコリンエステラー
ゼであるとすれば、ＯＸ基としてリン酸エステル、ピラ
ノシド酸素、もしくは酢酸エステルを選択すればよい。
【００２８】Ｒ3 ，Ｒ4 は前記したようにそれぞれアル
キル基であり、また互に結合して１，２−ジオキセタン
環にスピロ結合する多環式アルキレン基を形成していて
もよい。多環式アルキレン基は６−３０の炭素原子を含
むものであり、また炭素原子に代わる異種原子（Ｎ，
Ｏ，Ｓ又はＰ）を含んでいてもよい。好ましい多環式ア
ルキレン基はアダマンチル基である。Ｒ3 ，Ｒ4 は１，
２−ジオキセタンに対し安定性を付与する機能のもので
あり、同機能を特に阻害する置換基でない限り置換基を
有していてもよい。
【００２９】本発明で用いる安定な１，２−ジオキセタ
ンは酵素で反応を誘発できるけれども、常温（２０−３
５℃）で比較的長い半減期をもつ。従来技術に係る化合
物は全て、常温で不安定であるか、或は熱分解するのに
ほとんどの用途で実用的でない５０℃またはそれより高
い温度を必要とする。
【００３０】１，２−ジオキセタンは分解して、カルボ
ニル含有化合物と光とを生成する。不安定な１，２−ジ
オキセタンとして、次の一般式のものが形成される。
【化１３】
【００３１】一般にアリールオキシ基で置換された１，
２−ジオキセタン類は、適当したアルケンに酸素を付加
することによつて形成される。これらのアルケン類は、
一般式
【化１４】 のアルキル及び／またはアリール置換カルボニル含有化
合物を経て合成される。これらの物質は極性有機溶媒、
特にテトラヒドロフラン中において水素化アルミニウム
リチウム或は他の金属水素化物の存在下でハロゲン化遷
移金属塩、特に塩化チタン、及び第三アミン塩と反応す
る。この反応は通常、還流するテトラヒドロフラン中で
行なわれ、普通約４−２０時間で完了する。
【００３２】安定化された１，２−ジオキセタンの製造
と化学的誘発 熱的に安定なジオキセタンを必要に応じ化学的及び酵素
的な方法で誘発して化学発光を発生させうることが、見
出された（Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐによる１９８６年７月
１７日付けの米国特許出願Ｎｏ．８８７，１３９、Ａ．
Ｐ．Ｓｃｈａａｐ Ｒ．Ｓ．Ｈａｎｄｌｅｙ，ａｎｄ
Ｂ．Ｐ．Ｇｉｒｉ：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ．，９３５（１９８７）、Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ，
Ｔ．Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ｒ．Ｓ．Ｈａｎｄｌｅｙ，Ｒ．Ｄｅ
Ｓｉｌｖａ，ａｎｄ Ｂ．Ｐ．Ｇｉｒｉ：Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１１５５（１９８７）、及び
Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ，Ｍ．Ｄ．Ｓａｎｄｉｓｏｎ，ａ
ｎｄ Ｒ．Ｓ．Ｈａｎｄｌｅｙ：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ Ｌｅｔｔ．，１１５９（１９８７））。これを行な
わせるため、次のような鍵となる特徴をもつジオキセタ
ン類を製造するために新たな合成法が開発された。
（１）．スピロ結合アダマンチル基の安定化作用を、常
温で数年間の「貯蔵寿命（ｓｈｅｌｆ ｌｉｆｅ）」を
もつジオキサン類を提供するのに利用する。（２）．構
造中に、カルボニル開裂生成物からの直接化学発光を得
させる部分を挿入する。（３）．安定化されたジオキセ
タンの化学発光分解を誘発するための新しい方法を提供
する。
【００３３】必要なアルケン類はＴＨＦ（テトラヒドロ
フラン）中で三塩化チタン／ＬＡＨ（水素化アルミニウ
ムリチウム）を用い、２−アダマンタノンを芳香族エス
テル類またはケトン類と反応させることによつて製造さ
れる（Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐによる１９８６年７月１７
日付の米国特許出願Ｎｏ．８８７，１３９）。これは、
マクマリー（ＭｃＭｕｒｒｙ）法を用いてジビニルエー
テル類を生成するためのケトン類とエステル類の分子間
縮合についての最初の報告である。マクマリーはかつて
ケトンとエステルの官能基の分子内反応について研究し
たが、この方法によつては環式ケトン類が製造されジビ
ニルエーテル類は製造されていない（Ｊ．Ｅ．ＭｃＭｕ
ｒｒｙ ａｎｄ Ｄ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ：Ｊ．Ａｍｅ
ｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５，１６６０（１９８
３））。
【化１５】
【００３４】これらのジビニルエーテル類を光酸化する
と、所望の熱安定性をもち取扱いが容易であるジオキセ
タン類が提供される。例えば次に掲げるジオキセタン
は、活性化エネルギーが２８．４ｋｃａｌ／モルで２５
℃での半減期が３．８年である。ｑ−キシレン中での本
ジオキセタン試料は研究室のベンチの上に放置しておい
て数か月間、検出可能な分解を示さないままに残され
た。
【化１６】
【００３５】しかしながらこのジオキセタンの化学発光
分解を都合良く常温で、シリル基保護マスクをフツ化物
イオンを用いて除去し不安定なアリールオキシドを生成
させることにより誘発でき、生成されたアリールオキシ
ドは開裂して強い青色光を生じる。アリールオキシド置
換ジオキセタンの半減期は、２５℃で５秒である。ＤＭ
ＳＯ（ジメチルスルホキシド）中での化学発光からのス
ペクトルは４７０ｎｍで極大を示したが、これは本条件
下でのエステル開裂生成物（３−ヒドロキシル安息香酸
メチル）の化学発光及び費消ジオキセタン溶液の発光と
一致する。アダマンタノン発光に由来する化学発光は、
何ら生ぜしめられないようである。フツ化物で誘発した
分解の化学発光量子収率をルミノール対照標準と対比し
て測定し、０．２５を得た（化学発光効率でいうと２５
％）。本条件下でのエステルの発光量子収率（ΦF ＝
０．４４）を用い補正して、一重項励起のエステルの生
成効率が５７％と求められた。この値は、研究室で調製
されたジオキセタンについてこれ迄報告されたものの中
で最も高い一重項化学励起効率である。
【化１７】
【００３６】１，２−ジオキセタンの酵素的誘発 酵素を包含する免疫測定及び核酸プローブ検出等の生物
学的アツセーは、酵素と反応すると色を形成する（クロ
モゲン性）か或は蛍光を発生する（蛍光性）様々な基質
を利用する。シヤープ（Ａ．Ｅ．Ｓｃｈａａｐ）による
１９８６年７月１７日付の米国特許出願Ｎｏ．８８７，
１３９は、化学発光性の酵素基質として機能しうる最初
のジオキセタン類を開示している。次の文献も参照され
たい：Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ，Ｒ．Ｓ．Ｈａｎｄｌｅ
ｙ，ａｎｄ Ｂ．Ｐ．Ｇｉｒｉ：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ Ｌｅｔｔ．，９３５（１９８７）、Ａ．Ｐ．Ｓｃｈ
ａａｐ，Ｔ．Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ｒ．Ｓ．Ｈａｎｄｌｅｙ，
Ｒ．ＤｅＳｉｌｖａ，ａｎｄＢ．Ｐ．Ｇｉｒｉ：Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１１５５（１９８
７）、及びＡ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ，Ｍ．Ｄ．Ｓａｎｄｉ
ｓｏｎ，ａｎｄ Ｒ．Ｓ．Ｈａｎｄｌｅｙ：Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１１５９（１９８７）。生
物学的な組成中でこれらの過酸化物を使用するために
は、酵素反応の温度で熱的に安定であり水性緩衝液中で
迅速に自発分解しないジオキサン類が必要となる。先に
述べたスピロ結合アダマンチルジオキサン類は、かかる
要求を満たす。酵素的に修正されてアリールオキシド形
を生成しうる官能基をもつ１，２−ジオキセタン類を作
製した。不安定なアリールオキシド中間体の分解によつ
て蛍光が発生する。アリールエスラーゼ、アセチルコリ
ンエステラーゼ及びアルカリホスフアターゼを含む種々
の酵素によつて分解反応を誘発できる１，２−ジオキセ
タン類を合成した。ホスフアターゼ試料は、この酵素が
酵素結合免疫測定及び核酸プローブ検出において広く用
いられていることからして特に有意義である。
【００３７】例えば、アルカリホスフアターゼによる酵
素的な分解誘発が、３−ヒドロキシ−９Ｈ−キサンテン
−９−オンと２−アダマンタノンとから誘導した１，２
−ジオキセタンについて認められた。このジオキセタン
は熱的に安定であり、３０．７ｋｃａｌ／モルの活性化
エネルギーと２５℃での１２年間の半減期を有する。本
ジオキセタンは有機溶媒中で安定であるだけではなく、
水性緩衝液中で極くゆつくりとした自発分解しか行なわ
ない。
【化１８】
【００３８】ウシの腸粘膜〔３．２Ｍの（ＮＨ4 ）2 Ｓ
Ｏ4 中に１ｍｌあたり５．３ｍｇのタンパク質（１１０
０単位／ｍｇタンパク質）の懸濁液〕とリン酸塩保護の
ジオキセタンを用い、０．７５Ｍの２−アミノ−２−メ
チル−１−プロパノール緩衝液中においてｐＨ１０．３
で誘発実験を実施した。リン酸塩−ジオキセタン貯蔵溶
液の５０μｌ画分（０．０１３μｍｏｌ）を３７℃で３
ｍｌの緩衝液に加えて、ジオキセタンの最終濃度を４．
２×１０-6Ｍとした。この溶液にアルカリホスフアター
ゼ３ｍｌ（タンパク質の最終濃度＝１．８μｇ／ｍｌ）
を注入すると、化学発光が突発し３分間で減衰した。こ
の期間中、緩衝液中のジオキセタンのゆつくりとした非
酵素的加水分解に基づく発光によるバツクグランドは、
酵素的過程で生ぜしめられる発光の僅かに０．２％量で
あつた。合計の光放出量は、ジオキセタンの濃度に直線
的に依存することが認められた。光放出の減衰速度は酵
素濃度の関数であり、他方、合計の光放出量は酵素の転
換からして酵素濃度に無関係である。ホスフアターゼに
よる触媒分解についての化学発光スペクトルを、緩衝溶
液中において常温で試験して測定した。この化学発光ス
ペクトルを費消反応混合物の蛍光スペクトル及び緩衝液
中のヒドロキシキサンタノン開裂生成物の蛍光スペクト
ルと比較して、光放出がジオキセタン中のリン酸基の酵
素的開裂によつて誘発されて不安定なアリールオキシド
ジオキセタンが産成され、それがヒドロキシキサンタノ
ンの一重項励起アニオンを生じさせることが示された。
【００３９】
【明細な説明】図１は、キシレン中でのリン酸塩置換ジ
オキセタン２ｃの熱分解についてのアレニウスプロツト
を示している。
【００４０】図２はジオキセタン２ｂの塩基誘発反応の
化学発光量子収率を、臭化セチルトリメチルアンモニウ
ム（ＣＴＡＢ）の濃度の関数とみてプロツトした平面座
標を示している。図１７は、蛍光性の共存界面活性剤及
びＣＴＡＢ界面活性剤でもつて理想化されたジオキセタ
ン構造を示している。
【００４１】図３は、２−アミノ−２−メチル−１−プ
ロパノール（２２１）緩衝液（ｐＨ１０．３）中で３７
℃においてアルカリホスフアターゼを含むヒト血清１０
０μｌを加えた１０-5Ｍのジオキセタン２ｃの化学発光
強度と時間との関係と示すグラフである。
【００４２】図４はジオキセタン２ｃについて、ｌｏｇ
（プラトーでの光強度）とｌｏｇ（血清の量μｌ、１−
１００）との関係を示すグラフである。
【００４３】図５はジオキセタン２ｃについて、ｌｏｇ
（５０秒での光強度）とｌｏｇ（血清の量μｌ）との関
係を示すグラフである。
【００４４】図６は化学発光スペクトルを示すもので、
曲線ＡはＣＴＡＢ及び蛍光性の共存性界面活性剤３の不
存在下において２２１緩衝液中でジオキセタン２ｃを酵
素により誘発した場合の化学発光を、また曲線ＢはＣＴ
ＡＢ及び界面活性剤３の存在下においてジオキセタン２
ｃを酵素により誘発した場合のエネルギー移動化学発光
を、それぞれ表している。
【００４５】図７は、ＣＴＡＢ／蛍光体及び２．７×１
０-15 モルのアルカリホスフアターゼを含む３ｍｌの２
２１緩衝液中でのジオキセタン２ｃについての光強度と
時間との関係を示すグラフである（実験Ｄ）。酵素の不
存在下での試薬のバツクグランドは、時間零（０）での
強度に等しい。
【００４６】図８は、ｌｏｇ（０−３分の間の積分光強
度）とｌｏｇ（アルカリホスフアターゼのモル数）との
関係を示すグラフである。
【００４７】図９は、ＣＴＡＢ／蛍光体及び２．３×１
０-17 モルのアルカリホスフアターゼを含む２００μｌ
の２２１緩衝液中でのジオキセタン２ｃについての光強
度と時間との関係を示すグラフである。酵素の不存在下
での試薬のバツクグランドは、時間零（０）での強度に
等しい。
【００４８】図１０は、ｌｏｇ（０−３０分の間の積分
光強度）とｌｏｇ（アルカリホスフアターゼのモル数）
との関係を示すグラフである。
【００４９】図１１は、ＡＳＡ ３０００ Ｐｏｌａｒ
ｏｉｄ Ｔｙｐｅ ５７フイルムを用いたジオキセタン
２ｃからの化学発光測定の結果を、コンピユーター処理
により線図化して示す図である。アルカリホスフアター
ゼ、ジオキセタン、Ｍｇ（ＯＡｃ）2 、ＣＴＡＢ、及び
フルオレセイン界面活性剤３を含む２２１緩衝液（１０
０μｌ）の溶液を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｉｍｍｕｌｏｎ
（登録商標）ウエル中で３７℃で１時間養生し、次にそ
の温度で１５分間感光させた。アルカリホスフアターゼ
の量はＡ：２７００アトモル、Ｂ：２５０アトモル、
Ｃ：２３アトモル、Ｄ：酵素なしの試薬対照標準（視認
できず）である。
【００５０】図１２は、ＡＳＡ ３０００ Ｐｏｌａｒ
ｏｉｄ Ｔｙｐｅ ５７フイルムを用いたジオキセタン
２ｃからの化学発光測定の結果を、コンピユーター処理
により線図化して示す図である。アルカリホスフアター
ゼ、ジオキセタン、Ｍｇ（ＯＡｃ）2 、ＣＴＡＢ、及び
フルオレセイン界面活性剤３を含む２２１緩衝液（１０
０μｌ）の溶液を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｉｍｍｕｌｏｎ
（登録商標）ウエル中で３７℃で１時間養生し、次にそ
の温度で３０分間撮影した。アルカリホスフアターゼの
量はＡ：２５０アトモル、Ｂ：２３アトモル、Ｃ：２ア
トモル、Ｄ：酵素なしの試薬対照標準（視認できず）で
ある。
【００５１】図１３は、ＣＴＡＢ／蛍光体と１．３ｇの
Ｓ−抗原及び抗体−アルカリホスフアターゼ共役体を含
む１００μｌの２２１緩衝液中でのジオキセタン２ｃに
ついての光強度と時間との関係を示すグラフである。酵
素の不存在下での試薬のバツクグランドは、時間零
（０）での強度に等しい。
【００５２】図１４は、ｌｏｇ（０−１５分の間の積分
光強度）とｌｏｇ（ミクロウエルにコーテイングしたＳ
−抗原の量ｎｇ）との関係を示すグラフである。
【００５３】図１５は、ジオキセタン２ｃ、Ｍｇ（ＯＡ
ｃ）2 、ＣＴＡＢ、及びフルオレセイン界面活性剤３を
含む２２１緩衝液（１００μｌ）を用いたＳ−抗原につ
いての化学発光写真測定の結果を、コンピユーター処理
により線図化して示している。蛍光光度計を用いた実験
に引続いて７個のＩｍｍｕｌｏｎ（登録商標）ウエルに
つき３７℃で３０分間養生し、次にその温度で１５分
間、ＡＳＡ ３０００Ｐｏｌａｒｏｉｄ Ｔｙｐｅ ５
７ フイルムを用い感光させた。下左側から上右側２番
目までのＳ−抗原の量はそれぞれ１１２、５６、２８、
１４、７、３．５及び１．３ｎｇであり、上右側１番目
（視認できず）は試薬だけを含むウエルについてのもの
である。
【００５４】図１６は、Ｓ−抗原についての化学発光測
定の結果を示す写真を、コンピユーター処理により線図
化して示している。４個のウエルに５０ｎｇのＳ−抗原
をコーテイングし、ＭＡｂＡ９−Ｃ６単クローン抗体と
反応させ、抗マウスＩｇＧ−アルカリホスフアターゼ共
役体と反応させ、次に２２１緩衝液（１００μｌ）中の
ジオキセタン２ｃ、Ｍｇ（ＯＡｃ）2 、ＣＴＡＢ及びフ
ルオレセイン界面活性剤３を用いて測定した。ウエルに
ついて４５℃で１時間養生し、次にＡＳＡ ３０００
Ｐｏｌａｒｏｉｄ Ｔｙｐｅ ５７フイルムを用い同温
度で３０秒間、感光させた。中央の対照標準のウエル
（視認できない）は、ＣＴＡＢ／フルオレセイン緩衝液
中にジオキセタンのみを含むものとした。
【００５５】１，２−ジオセタン化合物及び蛍光表面活
性剤の合成
【化１９】
【００５６】機器分析 核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは特に断つていない限
り、内標準としてのテトラメチルシランを有するＣＤＣ
ｌ2 中の溶液としてＮｉｃｏｌｅｔ ＮＴ ３００（商
標名）またはＧｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ＱＥ
３００（商標名）を用いて得た。赤外線（ＩＲ）スペク
トルはＮｉｃｏｌｅｔ（商標名）またはＢｅｃｋｍａｎ
Ａｃｃｕｌａｂ ８（商標名）分光計を用いて得た。
質量スペクトルはＫｒａｔｏｓ（商標名）またはＡＥＩ
ＭＳ−９０（商標名）分光計を用いて得た。紫外線及
び可視光線の吸収スペクトルは、Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒ
ｙ２１９（商標名）分光光度計を用いて得た。蛍光スペ
クトルはＳｐｅｘ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ（商標名）蛍光
分光光度計で記録した。化学発光スペクトルはＳｐｅｘ
Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（商標名）を用いて測定し
た。化学発光の動力学的な測定及び量子収率の測定は、
研究室で組立てた蛍光光度計を用いて行なつた。本装置
は、−７８℃に冷却されたＲＣＡ Ａ−３１０ ３４Ａ
ヒ化ガリウム増倍型光電管とＯｒｔｅｃ 光子計数用電
子計数器を備え、Ａｐｐｌｅ ＩＩｅ（商標名）及びＭ
ａｃｉｎｔｏｓｈ（商標名）コンピユータに結び付け
る。元素分析はアメリカ合衆国、インデイアナポリスの
Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｍｉｃｒｏｌａｂｓが行なつた。融点
はＴｈｏｍａｓ Ｈｏｏｖｅｒ（商標名）毛管溶融装置
で測定し、補正していない。精密質量は、Ｃａｈｎ ｍ
ｏｄｅｌ ４７００（商標名）電子天秤を用いて測定し
た。
【００５７】材 料 ｏ−キシレンはＢｕｒｄｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏ
ｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、入手した状
態のままで動力学的及び分光学的測定のために使用し
た。無水のＤＭＦ及びＤＭＳＯは、水素化カルシウムか
ら真空蒸留により得た。酸化ジユウテリウム、１，４−
ジオキサン−ｄ8 、クロロホルム−ｄ、フルオレセイン
アミン（アイソマ−１）、及び他の化学試薬は、Ａｌｄ
ｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入した。シリ
カ、アルミナ及び他の固体担体は種々の市販源から入手
し、さらに精製することなく使用した。
【００５８】アルケン類の合成 〔（３−ヒドロキシフエニル）メトキシメチレン〕アダ
マンタン（１ａ） ５００ｍｌのフラスコに還流冷却器、１２５ｍｌの滴下
漏斗、及び窒素供給管を取付けた。装置を熱風吹付け及
び窒素による駆除で乾燥させた。乾燥ＴＨＦ（４０ｍ
ｌ）を加え、フラスコを氷浴中で冷却した。ＴｉＣｌ3
（１．５ｇ，１０ミリモル）を迅速に加え、次いでＬＡ
Ｈ（０．１９ｇ，５ミリモル）を攪拌しながら滴下し
た。冷却浴を取去り、黒色の混合物を室温にまで放置し
て暖まらせた。次にトリエチルアミン（０．７ｍｌ，５
ミリモル）を攪拌した懸濁液に加えて、１５分間還流し
た。その後に乾燥ＴＨＦ２０ｍｌ中のメチル−３−ヒド
ロキシ安息香酸（１５２ｍｇ，１ミリモル）及び２−ア
ダマンタノン（３００ｍｇ，２ミリモル）の溶液を還流
中の混合物に対し、１５分間をかけて１滴ずつ加えた。
還流をさらに１５分間継続し、その後で反応物を室温に
まで冷却して１００ｍｌの蒸留水で希釈した。この水溶
液を、３×５０ｍｌ部の酢酸エチルで抽出処理した。有
機性層を水で洗浄し、ＭｇＳＯ4 上で乾燥させ、濃縮し
た。１５％の酢酸エチル／ヘキサンを用いるシリカ上で
のクロマトグラフイーにより、２４０ｍｇ（８９％）の
ヒドロキシアルケン１ａを白色の固体として得た。融点
１３３−４℃。 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ１．６４
−１．９６（ｍ，１２Ｈ）、２．６５（ｓ，１Ｈ）、
３．２４（ｓ，１Ｈ）、３．３２（ｓ，３Ｈ）、５．２
５（ｓ，１Ｈ，Ｄ2 ＯでＯＨ交換）、６．７０−７．３
０（ｍ，４Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ２８．
４５、３０．３６、３２．３６、３７．３０、３９．１
８、３９．３３、５７．８２、１１４．６０、１１６．
１６、１２２．１９、１２９．２４、１３７．２４、１
５５．６２。ＭＳｍ／ｅ（相対強度）２７１（２０，Ｍ
＋）、２７０（１００，Ｍ）、２５３（７．３）、２１
３（３５．１）、１２１（４１．７）、９３（９．
４）。 精密質量：計算値２７０．１６１９、実測値２７０．１
６１６。
【化２０】
【００５９】〔（３−アセトキシフエニル）メトキシメ
チレン〕アダマンタン（１ｂ） ヒドロキシアルケン１ａ（０．７５ｇ，２．８ミリモ
ル）を、Ｎ2 雰囲気中で１０ｍｌのＣＨ2 Ｃｌ2 及びピ
リジン（５．２ｇ，６５．８ミリモル）中に溶解した。
溶液を氷浴中で冷却し、１ｍｌのＣＨ2 Ｃｌ2 中の塩化
アセチル（２．６ｇ，３３ミリモル）溶液を注射器で１
滴ずつ加えた。０℃で５分間たつた後で、２０％の酢酸
エチル／ヘキサンを用いるシリカ上でのＴＬＣ（薄層ク
ロマトグラフイー）により、１ａの完全なアセチル化が
示された。溶媒を除去した後、固体残分を３０ｍｌのエ
ーテルで洗浄した。エーテルを３×２５ｍｌの水で洗浄
し、ＭｇＳＯ4 上で乾燥させ、蒸発乾固した。製品をシ
リカ上で２０％の酢酸エチル／ヘキサンを用いてクロマ
トグラフイー処理し、０．４５ｇの１ｂを油状物として
得た。 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ１．７９−１．９
６（ｍ，１２Ｈ）、２．２７（ｓ，３Ｈ）、２．２６
（ｓ，１Ｈ）、３．２６（ｓ，１Ｈ）、３．２９（ｓ，
３Ｈ）、６．６９−７．３６（ｍ，４Ｈ）。13Ｃ ＮＭ
Ｒ（ＣＤＣｌ3 ）δ２０．９０、２８．１３、３０．０
７、３１．９９、３６．９９、３８．８９、３９．０
１、５７．５９、１２０．３４、１２２．１４、１２
６．５５、１２８．６６、１３２．１９、１３６．９
０、１４２．５９、１５０．４２、１６９．０４。ＭＳ
ｍ／ｅ（相対強度）３１２（１００，Ｍ）、２７０（２
５）、２５５（１９．３）、２１３（２０．７）、１６
３（１２．２）、１２１（３０．７）、４３（３０）。
ＩＲ ３００６、２９２５、２８５６、１７２５、１６
００、１４３８、１３６２、１２１８、１０００ｃ
ｍ-1。Ｃ20Ｈ24Ｏ3 の分析：計算値Ｃ ７６．９２、Ｈ
７．６９，実測値Ｃ ７６．９６、Ｈ ７．８５。
【化２１】
【００６０】〔（３−ホスフエートフエニル）メトキシ
メチレン〕アダマンタン，二ナトリウム塩（１ｃ） ヒドロキシアルケン１ａ（５００ｍｇ，１．５８ミリモ
ル）を、１ｍｌの乾燥ピリジン（塩基性アルミナ上で脱
水）中に溶解した。この溶液を１ｍｌ（１０．７ミリモ
ル）の塩化ホスホリルと５ｍｌの乾燥ピリジンとの冷混
合物に対し、反応温度が５℃よりも低く維持されるよう
な速さでゆつくりと加えた。３０分後に反応を終了し、
ホスホリル二塩素化物製品を２０ｇの氷と１ｍｌの１０
Ｎ水酸化ナトリウムとの混合物に注いだ。混合物を分液
漏斗に移し、３０ｍｌ宛のＣＨ2Ｃｌ2 で５回洗浄し
た。１晩冷蔵後に水溶液部分から製品が沈降した。固形
分を１０ｍｌ宛のＣＨ2 Ｃｌ2 で３回洗浄し、次に１０
ｍｌ宛の冷水で３回洗浄した。次いで白色の固体を減圧
下で乾燥して、４００ｍｇ（１．０２ミリモル，６４
％）のリン酸化アルケン１ｃを得た。 1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ
2 Ｏ／ｐ−ジオキサン−ｄ8 ）δ１．６７−１．８３
（ｍ，１２Ｈ）、２．５０（ｓ，１Ｈ）、３．０４
（ｓ，１Ｈ）、３．１９（ｓ，３Ｈ）、６．７−７．２
（ｍ，４Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ）δ２８．２９、
３０．４４、３２．４５、３６．９９、３８．８９、５
７．９８、１２０．１６、１２０．８５、１２３．７
４、１２８．８９、１３３．１５、１３６．１１、１４
２．６８、１５４．４５。31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ／ｐ−
ジオキサン−ｄ8 ）δ１．５８６。
【化２２】
【００６１】フルオレセイン界面活性剤：５−（Ｎ−テ
トラデカノイルアミノ）フルオレセイン（３）の合成 塩化ミリストリル（２．１８ｇ，８．８３ミリモル）の
ＴＨＦ溶液をＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．から入手したフルオレセインアミン−アイソマ−１
（３．０７ｇ，８．８５ミリモル）の乾燥ピリジン（塩
基性アルミナ上で脱水）溶液に、常温で１２時間をかけ
て攪拌しながら１滴ずつ加えた。２０％ＭｅＯＨ／ベン
ゼンを用いたシリカ上でのＴＬＣ（薄層クロマトグラフ
イー）により、極性がより小さい生成物への変換が示さ
れた。反応物を氷水中に注ぎ、固体沈澱物を濾過により
単離して４ｇの固体状の橙色物質を得た。１０％ＭｅＯ
Ｈ／ベンゼンを用いるカラムクロマトグラフイーによつ
て、５００ｍｇの純粋製品が橙色の固体として得られ
た。融点１８５−１９０℃。 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ3）δ ０．８８（ｔ，３Ｈ）、１．２７（ｍ，２０
Ｈ），１．７４（ｍ，２Ｈ）、２．４２（ｔ，２Ｈ）、
６．５４−８．３２（ｍ，９Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ
Ｃｌ3 ）δ１３．０５、２２．２７、２５．３４、２
８．９０、２９．０１、２９．１７、２９．３１、３
１．６１、３６．６５、１０１．００、１１０．２５、
１１２．４３、１１４．９３、１２４．４１、１２６．
５８、１２７．８６、１２８．７７、１４０．４１、１
４７．００、１５２．８９、１６０．２８、１６９．９
６、１７３．６５。ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｅ（相対強度）
５５８（１０，Ｍ＋１），４０２（１４．７）、３８．
８（１４．２）、３７４（１２．５）、３４８（２８．
１）、３０２（３５．２）、２１３（３６．４）、１６
５（３６．４）、１３３（５０）。本製品３の特性は、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．により市
販されているものについて記載されている特性と一致す
る。
【化２３】
【００６２】１−ヘキサデシル−６−ヒドロキシ−２−
ベンゾチアザミド（４）の合成 ６−ヒドロキシ−２−ベンゾチアゾアートメチル（６０
ｍｇ，０．３０ミリモル）〔Ｆ．ＭｃＣａｐｒａ ａｎ
ｄ Ｚ．Ｒａｚａｎｉ：Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１
５３（１９７６）参照〕と１−ヘキサデシルアミン（４
３０ｍｇ，１．８ミリモル）を、メタノールに溶解し
た。溶液を２日間還流した後、４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキ
サンを用いる薄層クロマトグラフイーによりベンゾチア
ゾアートが極性のより小さい物質に変換されたことが示
された。メタノールを蒸発させ、次に残分を２％ＥｔＯ
Ａｃ／ヘキサンを用いるクロマトグラフイーにかけて過
剰の１−ヘキサデシルアミンを除去した。引続いて５０
％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いてクロマトグラフイーを
継続し、製品４を白色の固体として得た。３３ｍｇ（２
７％）。融点８２−４℃。 1Ｈ ＮＭＲ（アセトン−ｄ
6 ）δ ０．８３（ｔ，３Ｈ）、１．３２（ｂｒ．２６
Ｈ）、１．６６（ｍ，２Ｈ）、３．４３（ｔ，２Ｈ）、
７．１０−７．８８（ｍ，３Ｈ）、８．１５（ｂｒ．１
Ｈ，Ｄ2 ＯでＯＨを置換）。13Ｃ ＮＭＲ（ベンゼン−
ｄ6 ）δ１４．２９、２３．０５、２７．０８、２９．
５８、２９．６６、２９．７５、２９．８６、３０．１
３、３２．２８、３９．９８，（アセトン−ｄ6 ）δ１
０７．５１、１１７．６９、１２５．６１、１３９．３
３、１４７．８０、１５７．６３、１６０．４８、１６
２．１２。ＭＳ ｍｅ（相対強度）４１８（Ｍ＋，３
３．７）、３６０（１４．１）、２４０（６１．１）、
１７８（７７．３）、１５１（３９．１）、９７（２
８．６）、８３（３４．７）。Ｃ24Ｈ38Ｎ2 Ｏ2 Ｓの精
密質量：計算値４１８．２６５３、実測値４１８．２６
５９。
【化２４】
【００６３】１，２−ジオキセタン類の製造 光酸化法 典型的には５−１０ｍｇのアルケン試料を、光酸化管中
で５ｍｌのＣＨ2 Ｃｌ2 に溶解した。約４０ｍｇのロー
ズベンガル（Ｓｅｎｓｉｔｏｘ １−登録商標）（この
タイプの増感剤についてはＡ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ，Ａ．
Ｌ．Ｔｈａｙｅｒ，Ｅ．Ｃ．Ｂｌｏｓｓｅｙ，ａｎｄ
Ｄ．Ｃ．Ｎｅｃｋｅｒｓ：Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．９７，３７４１（１９７５）を参照）を加え、酸
素噴射器に接続した。溶液に酸素を５分間ゆつくりと通
し、装置をドライアイス／２−プロパノールを含む片面
銀メツキのジユワーびんに浸漬した。連続して酸素を吹
込みながら試料を、２５０Ｗまたは１０００Ｗのナトリ
ウムランプ（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ社のＬ
ｕｃａｌｏｘ）及び紫外線除去フイルタを用いて照射し
た。反応の進行を、薄層クロマトグラフイーにより鑑視
した。普通、極めて安定なジオキセタン類を示すはん点
が検出でき、そのＲｆはアルケンについての値より僅か
に小さかつた。アダマンチル置換ジオキセタン類を常温
で濾過し、回転蒸発器で蒸発させ、適当な溶媒を用いて
再結晶させた。
【００６４】４−（３−ヒドロキシフエニル）−４−メ
トキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′−アダ
マンタン〕（２ａ） ヒドロキシアルケン１ａ（１００ｍｇ）をＳｅｎｓｉｔ
ｏｘ Ｉの存在下で−７８℃において、８ｍｌのＣＨ2
Ｃｌ2 中で１０００ＷのＮａランプにより照射した。ア
ルケンとジオキセタンを２０％の酢酸エチル／ヘキサン
を用いる薄層クロマトグラフイーにかけると、同一のＲ
ｆ値を示す。そこで開裂生成物の痕跡が現れ始めたとき
に反応を停止した。濾過して増感剤を除去し、溶媒を蒸
発させた。出発物質が全て酸化されたことをみるために
は、 1Ｈ ＮＭＲを利用した。ジオキセタン２ａをペン
タン／ベンゼンを用いて再結晶処理し、白色の固体を得
た。融点１３５℃。 1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ１．
０４−２．１０（ｍ，１２Ｈ）、２．２１（ｓ，１
Ｈ）、３．０４（ｓ，１Ｈ）、３．２４（ｓ，３Ｈ）、
６．４８（ｓ，１Ｈ、Ｄ2 ＯでＯＨを置換）、６．９３
−７．３０（ｍ，４Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）
δ２５．８１、２５．９５、３１．４７、３１．５７、
３２．２７、３２．８６、３３．０７、３４．５８、３
６．３０、４９．８３、９５．８８、１１２．０８、１
１６．４６、１２９．３４、１３６．１、１５６．２
１。
【００６５】４−（３−アセトキシフエニル）−４−メ
トキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′−アダ
マンタン〕（２ｂ） アルケン１ｂ（１４０ｍｇ，０．４５ミリモル）を−７
８℃で３０ｍｌのＣＨ2 Ｃｌ2 中において、４００ｍｇ
のＳｅｎｓｉｔｏｘ Ｉを用い１０００Ｗの高圧ナトリ
ウムランプにより照射した。２０％の酢酸エチル／ヘキ
サンを用いるシリカゲル上でのＴＬＣ分析によつて２．
５時間でより極性な物質への完全な変換が示された。濾
過及び溶媒の除去によつて製品２ｂが、油状物として得
られた。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ０．９０−１．
９０（ｍ，１２Ｈ）、２．１５（ｓ，１Ｈ）、２．３１
（ｓ，３Ｈ）、３．０３（ｓ，１Ｈ）、３．２３（ｓ，
３Ｈ）、６．６１−７．４５（ｍ，４Ｈ）。13Ｃ ＮＭ
Ｒ（ＣＤＣｌ3 ）δ２１．００、２５．８２、２５．９
７、３１．５０、３１．６５、３２．２１、３２．８
０、３３．０９、３４．７１、３６．３２、４９．９
２、９５．３４、１１１．５０、１２２．５８、１２
９．１６、１３６．４２、１５０．７２、１６９．１
１。
【００６６】４−メトキシ−４−（３−ホスフエートフ
エニル）スピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′−ア
ダマンタン〕，二ナトリウム塩（２ｃ） アルケン１ｃ（５０ｍｇ）を２ｍｌのＤ2 Ｏ／ｐ−ジオ
キサン−ｄ8 （１：１ｖ／ｖ）中で１０℃において、Ｓ
ｅｎｓｉｔｏｘ Ｉを用い１０００Ｗの高圧ナトリウム
ランプにより照射した。 1Ｈ ＮＭＲ分析によつて、４
５分間でジオキセタン２ｃへの完全な変換が示された。
増感剤を濾過により除去し、濾液を化学発光実験用の貯
蔵溶液として用いた。 1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ／ｐ−ジオ
キサン−ｄ8 ）δ０．９１−１．７０（ｍ，１２Ｈ）、
２．０８（ｓ，１Ｈ）、３．０７（ｓ，３Ｈ）、７．０
０−７．２６（ｍ，４Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ／ｐ
−ジオキサン−ｄ8 ）δ２８．９５、３０．９５、３
２．９８、３７．６５、３９．５３、５８．３１、１２
０．６２、１２１．６４、１２３．５５、１２９．３
１、１３２．４５、１３６．５７、１４３．９８、１５
５．３０。
【００６７】化学発光の動力学的な測定 安定なジオキセタン類の熱分解速度を、曝気溶液からの
化学発光の減衰によつて測定した。磁気攪拌棒を装備し
た円筒状のパイレツクス製バイアルに３−４ｍｌの反応
溶媒を充填し、テフロンライニングのねじキヤツプで密
封して化学発光測定用の蛍光光度計（ルミノメーター）
の恒温試料室中に置いた。外部の循環水浴によつて温度
を制御した。計器利得及び光学スリツト寸法について適
当な値を選定した。熱平衡に到達すると（約３分）、１
０-4Ｍよりも大ではない最終濃度を得させるのに十分な
量のジオキセタン貯蔵溶液を、蛍光光度計の頂部を開放
することによりピペツトで、或はバイアル直上部のカバ
ー中に位置させた光遮断性ゴム隔壁を通し注射器で、加
えた。高温を利用するときはバイアルを、蒸発を阻止す
るようにテフロンライニングのねじキヤツプで密封し
た。信号の測定は、シヤツターを開放することで開始し
た。化学発光の減衰は一般に、少なくとも３回の半減期
について記録した。ｌｎ（強度）対時間データからの一
次速度定数（ｋ）の計算は、標準的な最小自乗法を用い
るコンピユータープログラムによつて行なつた。相関係
数（ｒ）は典型的には少なくとも０．９９９であり、ｋ
は同一試料についての繰返しの測定間で５％よりも小さ
な範囲でのみ変動した。
【００６８】ジオキセタン類の分解に対する活性化パラ
メーターを、ｌｎ ｋ対１／Ｔ（アレニウス式）または
ｌｎ ｋ／ｔ対１／Ｔ（アイリング式）のプロツトから
標準的な最小自乗一次回帰法によつて算出した。８０−
１２０℃の温度範囲内の５から１０の温度での繰返し測
定の結果、０．９９またはそれより高い相関係数を有す
る直線が得られることが判明した。例えば図１はリン酸
塩置換ジオキセタン２ｃのｏ−キシレン中での熱分解に
ついてのアレニウスプロツトを示しており、Ｅａ＝３
２．５ｋｃａｌ／モルでｒ＝０．９９９である。２５℃
での半減期はアレニウス式から、１９年であると算出さ
れる。
【００６９】キシレン中でのジオキセタン類の熱分解の活性化エネルギー ジオキセタン（Ｘ） Ｅａ Ｌｏｇ Ａ ２５℃での ２５℃での ｋ（ｓｅｃ-1） ｔ1/2 ２ａ（ＯＨ） ２８．３ １２．５ ５．３８×１０-9 ４．１年 ２ｂ（ＯＡｃ） ３０．４ １３．６ １．７３×１０-9 １３年 ２ｃ（ＰＯ3 Ｎａ2 ）３２．５ １４．９ １．１９×１０-9 １９年 上の結果は、これらのタイプのジオキセタン類が適当な
化学剤または酵素で誘発される前に極めて高い安定性
（長い半減期）をもつことを、示している。
【００７０】化学発光量子収率の測定 ジオキセタン類の分解についての化学発光量子収率（Φ
CL）は、分解されたジオキセタンのモル数に対する放出
化学発光のアインスタイン値の割合と定義される。反応
中に反応エンタルピー（△ＨR ）及びアレニウス活性化
エネルギー（Ｅａ）からして、カルボニル開裂生成物の
１個を一重項励起状態にもたらすのに十分なエネルギー
が放出される。したがつて最大量子収率は１．０であ
る。関係ある他のパラメターは化学励起量子収率
（ΦCE）であり、これは分解されたジオキセタンに対す
る形成励起状態の割合と定義される。化学励起量子収率
は化学発光量子収率と、ジオキセタン開裂物の発光量子
収率（ΦF ）を介し、つまり方程式ΦCL＝ΦCE×ΦF で
表される関係で関連する。
【００７１】発光減衰の動力学的測定に用いたのと同じ
方法を化学発光量子収率を求めるのに、以下の修正を加
えて用いた。既知濃度のジオキセタン貯蔵溶液の精密に
秤量した一定量を、予め恒温に保つようにした有機溶媒
または水性緩衝液の３ｍｌに加えた。次に適当した化学
試薬または酵素を加えることにより反応を誘発した。合
計の光強度（積分光強度）を、−７８℃に冷却したＲＣ
Ａ Ａ−３１０３４Ａヒ化ガリウム増倍型光電管を用い
光子計数用蛍光光度計により加算して求めた。曝気ＤＭ
ＳＯ中での塩基によるルミノールの化学発光反応につい
て正確に知られている量子収率に基づく検定因数（ｃａ
ｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）を用いて、光強度
を光量子数に換算した。ルミノール反応は、０．０１１
（１．１％）の化学発光量子収率をもつと測定されてい
る（Ｊ．Ｌｅｅ ａｎｄ Ｈ．Ｈ．Ｓｅｌｉｇｅｒ：Ｐ
ｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．１５，２２
７（１９７２）、Ｐ．Ｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ ａｎｄ
Ｌ．Ｒ．Ｆａｕｌｋｎｅｒ：Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４
８，１１８８（１９７６））。
【００７２】化学発光スペクトルの取得 化学的または酵素的に誘発したジオキセタン類の化学発
光スペクトルを、Ｓｐｅｘ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ 蛍光
分光光度計の試料室で１ｃｍ平方の石英製キユベツト中
において常温で反応を行なわせることにより得た。波長
走査中の化学発光の減衰に対する補正は比率モードでス
ペクトルを蓄積することで行なうこととし、合計の信号
を時間の関数として測定する補助検出器（ＥＭＩ ９７
８１Ｂ）からの信号で観測されるスペクトルを割つた。
モノクロメーターの波長帯域は、典型的には１８ｎｍで
あつた。弱い光放出を行なう試料については同一の走査
を数回繰返えし、信号対ノイズ比を改善するように加え
合せた。
【００７３】この発明の酵素の測定法は酵素自体の検出
のため、及びαまたはβ−ｈＣＧのような抗原または抗
体を検出する免疫測定、ウイルス（例えばＨＴＬＶ Ｉ
ＩＩまたはサイトメガロウイルス）またはバクテリア
（例えばＥ．ｃｏｌｉ）を検出するための核酸測定等
に、用いることができる。
【００７４】検出すべき物質が抗体、抗原または核酸で
ある場合には１，２−ジオキセタンのＸ基を除去可能で
ある酵素を、被検出物質と特異的親和性を有する物質
（例えばＤＮＡプローブ）と結合させる。そのためには
通常の方法、例えばカルボジイミドを用いる結合法
（Ｇ．Ｂ．Ｗｉｓｄｏｍ：Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２２，
１２４３−１２５５（１９７６））を、利用することが
できる。結合はアミド結合によるのが好ましい。
【００７５】検定は、従来の標準的な方法と同様の方法
を用いて行なえる。すなわち被検出物質を含むと考えら
れる試料を、被検出物質と特異的親和性を有する物質に
対し結合させてある酵素を含む緩衝溶液と接触させる。
その後に溶液をインキユベートして、特異的親和性物質
−酵素結合体の特異的親和性部分に対し被検出物質を結
合させる。ここで特異的親和性物質−酵素結合体の過剰
量を洗滌除去した上で、１，２−ジオキセタンを加え
る。酵素の作用、或は酵素とアルカリ緩衝溶液中の塩基
との作用（加水分解酵素の場合）によりＸ基が除去され
ると、ジオキセタンが２個のカルボニル含有化合物に分
解して化学発光が生じる。この光が例えば光電子増倍管
検出器またはカメラ・ルミノメーター（Ｒ．Ｂｕｎｃｅ
ｅｔ ａｌ：Ａｎａｌｙｓｔ．１１０，６５７−６６
３（１９８５））によつて検出されると、試料中に上述
の被検出物質が存在したことになる。発光強度を測定す
ることで同物質の濃度が検出される（Ｇ．Ｈ．Ｇ．Ｔｈ
ｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ：Ａｎａｌ，Ｃｈｅｍ．Ａｃｔ
ａ．１７０，１０１−１０７（１９８５））。
【００７６】検出すべき物質が酵素自体であれば、上述
したような特異的親和性物質を用いる必要はない。その
代りに、検出すべき酵素によつて除去されうるＸ基を有
するジオキセタンを用いる。したがつて酵素の検出は酵
素含有試料に対し同ジオキセタンを加え、それによつて
生じる発光を酵素の存在及び濃度の指標として測定する
ことによつて、行なわれる。
【００７７】以下に発光試験の結果を示す。
【００７８】ジオキセタン類の化学的誘発 １．ヒドロキシ置換ジオキセタン２ａの塩基による化学
発光の誘発 ＤＭＳＯ中のジオキセタン２ａの１０-4Ｍ溶液を常温で
過剰量のテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヒドロキシド
により処理することによつて、強い青色の化学発光が生
じ数分間で減衰した。この化学発光の極大波長は４７０
ｎｍであつた。開裂生成物（３−ヒドロキシ安息香酸メ
チル、ＭＨＢ）のアニオンの蛍光は、化学発光スペクト
ルに一致する。これらの結果から化学発光過程が、
（ａ）塩基による誘発に基づく不安定なアリールオキシ
ド型のジオキセタンの形成、（ｂ）次いでの本ジオキセ
タンの開裂による一重項励起状態のＭＨＢの生成、
（ｃ）ＭＨＢの蛍光に基づく全体としての量子収率（Φ
Cl）０．２５での発光産生を、包含するものであること
が示される。
【化２５】
【００７９】２．水性ミセル中でのアセトキシ置換ジオ
キセタン２ｂの塩基誘発化学発光に対する触媒作用：分
子間エネルギー移動による化学発光効率の向上 臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）のよう
なカチオン性界面活性剤を、適当に置換されたジオキセ
タン類の水溶液中での化学発光の化学的誘発速度を高め
るために使用することができる。例えばＣＴＡＢは、ア
セトキシ置換ジオキセタン２ｂの塩基誘導開裂に対し触
媒作用を及ぼす。このジオキセタンは界面活性剤によつ
て形成されたミセル中で可溶化され、ＮａＯＨを加える
ことによつて化学発光を開始する。カチオン性の頭部基
と水酸化物アニオンとのクーロン引力によつて、顕著な
触媒作用が与えられる。実験は典型的には〔２ｂ〕＝
９．１×１０-5Ｍ、〔ＣＴＡＢ〕＝２×１０-3Ｍ、〔Ｏ
Ｈ- 〕＝９．１×１０-5Ｍを用い、３７℃で行なつた。
【００８０】ミセル的環境下での高化学発光効率…ＤＭ
ＳＯ中での塩基を用いたジオキセタン２ａ及び２ｂの光
収率は０．２５で極めて高いのに対し、これらのジオキ
セタンの水中での光収率は僅かに８．９×１０-6であ
る。この大幅な収率減少の主な理由は、開裂生成物（Ｍ
ＨＢ）が水中で弱くしか発光しないといつた事実に由来
する。しかしながら次の実験によつて示される通り、ジ
オキセタンをミセル中で誘発することにより発光を高め
ることができる。ジオキセタン２ｂの塩基誘発条件は、
ＣＴＡＢの濃度を０から５×１０-3Ｍに変更した点を除
いては上述したのと同様とした。図２は、ＣＴＡＢの臨
界ミセル濃度（ｃｍｃ≒１×１０-3Ｍ）より高い部分で
の化学発光収率の１９倍の増加（ΦCl＝１．７×１
０-4）を示している。ミセル的環境で向上せしめられる
化学発光効率は、ΦF 及び／またはΦCEの増大の結果で
ある。
【００８１】蛍光性頭部基を有する共存性界面活性剤を
ミセル中に加えることによつて、化学的及び酵素的の何
れによつて誘発されるジオキセタンについても劇的に高
い化学発光収率が与えられる。励起状態の開裂生成物か
ら蛍光界面活性剤へのエネルギー移動は、誘発可能なジ
オキセタンとエネルギー受容体（蛍光体）との両者が図
１７に示されているようにミセル中で極く近接した位置
関係に保たれていることからして、極めて効果的に行な
われる。
【００８２】例えば、フルオレセイン界面活性剤３とジ
オキセタン２ｂとを含むＣＴＡＢミセルを、最終濃度で
１．５×１０-3ＭのＣＴＡＢ、９×１０-5Ｍの界面活性
剤３、９×１０-5Ｍのジオキセタン２ｂといつた組成の
水溶液の形で調製した。３７℃で塩基を加えることによ
つて通常の青色放出ではなく強い黄色の化学発光が生
じ、その化学発光効率は１．４％（ΦCL＝０．０１４）
であり、ＣＴＡＢ及び界面活性剤３の不存在下でのジオ
キセタン２ｂの発光効率と比較して５００倍にもなつ
た。
【００８３】類似の実験を、ベンゾチアミド界面活性剤
４を用いて実施した。化学発光効率は０．３％であり、
λｍａｘは５０６ｎｍであつた。
【００８４】リン酸塩置換ジオキセタン２ｃの酵素によ
る誘発 １．ヒト血清から得たアルカリホスフアターゼによるジ
オキセタン２ｃの化学発光の誘発 ジオキセタン２ｃの貯蔵溶液を、アルケン１ｃの光酸化
によりジオキセタン／水（１：１ｖ／ｖ）の形で作製し
た。新鮮な血液試料を健康な提供者から得、赤血球を遠
心分離により除去して実験用の血清を取得した。０．７
５Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（２
２１）緩衝液（ｐＨ１０．３）中のジオキセタン２ｃの
１０-5Ｍ溶液３ｍｌを、１００μｌの血清により３７℃
で処理することによつて、図３に示す典型的な強度−時
間関係を得た。図３において血清は時間０（零）で注入
した。本条件下で光強度は、約２．３×１０4 カウント
数／秒で一定のレベルに到達する。２ｃの非酵素的加水
分解からするバツクグランド発光信号は、酵素により発
生せしめられた値の０．０５％よりも少ない。プラトー
での光強度は、１００μｌの血清を用いた一連の実験に
よつて示されるように（図４）、酵素の濃度に直接に比
例する。他のどの時間点での光強度も、酵素濃度の直接
的な尺度として利用できる（図５）。
【化２６】
【００８５】２．ウシ腸粘膜から得たアルカリホスフア
ターゼによるジオキセタン２ｃの化学発光の誘発 ウシ腸粘膜から取得したアルカリホスフアターゼをＳｉ
ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から、３．２Ｍの
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 溶液の１ｍｌ当り５．１ｍｇのタン
パク質を含む懸濁液として入手した。典型的な実験では
２２１緩衝液中のジオキセタン２ｃの２．５６×１０-3
Ｍ貯蔵溶液５０μｌを、８．０×１０-4ＭのＭｇ（ＯＡ
ｃ）2 を含む３ｍｌの２２１緩衝液（０．７５Ｍ，ｐＨ
９．１）に加えて、最終ジオキセタン濃度を４．３×１
０-5Ｍとした。溶液中に３７℃で１０μｌ量の希釈酵素
を注入することによつて、量子収率が３．１×１０-5で
ある化学発光が生じた。化学的な誘発の場合と同様に、
ＣＴＡＢ（１．１３×１０-3Ｍ）を加えることによりΦ
Clの２．１×１０-4と約７倍への増加がみられた。酵素
による誘発の動力学的挙動は、界面活性剤の存在によつ
て有意義には変更されなかつた。
【００８６】３．アルカリホスフアターゼによるジオキ
セタン２ｃの化学発光の誘発：水性ミセル中での分子間
エネルギー移動により向上する化学発光効率 酵素により誘発されるジオキセタン２ｃの化学発光の効
率は、ミセル中に共存性のフルオレセイン界面活性剤３
を加えることによつて劇的に向上させることができる。
ジオキセタン２ｃについてアルカリホスフアターゼを用
いた実験を、ジオキセタン２ｃ（４．３×１０-5Ｍ）、
２２１緩衝液（０．７５Ｍ，ｐＨ９．１）、Ｍｇ（ＯＡ
ｃ）2 （８．０×１０-4Ｍ）、ＣＴＡＢ（１．１３×１
０-3Ｍ）、及びフルオレセイン界面活性剤３（５．６×
１０-5Ｍ）を含む３ｍｌの溶液を用いて３７℃で実施し
た。アルカリフオスフアターゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．，ウシの腸粘膜からのもの）を１２ｐ
ｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度が与えられるように加え
ると、４５分間にわたり化学発光が生じた。光放出の全
過程の光強度の積算値（積分光強度）からΦCl＝０．０
１５（化学発光効率でいうと１．５％）と求められ、こ
れはＣＴＡＢ及び界面活性剤３が存在しない場合の酵素
反応と比較して５００倍の増加に相当する。ジオキセタ
ン２ｂの化学的誘発の場合におけるのと同様に化学発光
スペクトルは、通常の青色光放出（図６の曲線Ａ）から
典型的なフルオレセイン光放出（図６の曲線Ｂ）へとシ
フトされ、エネルギー移動過程の包含が示された。界面
活性剤３による青色光の単なる再吸収及び次いでの蛍光
発生はこのような効率向上を生じさせるスペクトルシフ
トの機序とはなりえない点に、留意されるべきである。
【００８７】溶液中のアルカリホスフアターゼの濃度に
関連した本化学発光法の感応性を検べるために、Ｓｉｇ
ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手した市販試料
を希釈して調製した酵素貯蔵溶液を用いて一連の実験を
行なつた。試料中のホスフアターゼ濃度は控え目に、試
料１ｍｌ当り５．１ｍｇのタンパク質が１００％純粋な
アルカリホスフアターゼに相当するとみなして評価し
た。酵素のモル量を計算するのには、分子量１４０，０
００を用いた。実験条件はジオキセタン２ｃ，ＣＴＡＢ
及び蛍光体３については上述したのと同様とし、３ｍｌ
溶液中の酵素の最終量は次のように設定した。 Ａ＝３．６×１０-12 モル Ｂ＝３．３×１０-13 モル Ｃ＝３．０×１０-14 モル Ｄ＝２．７×１０-15 モル Ｅ＝２．５×１０-16 モル Ｆ＝２．３×１０-17 モル これらの条件下で緩衝液／共存性ミセル環境中でのジオ
キセタン２ｃの非酵素的加水分解からするバツクグラン
ド化学発光は極く遅く、数カウント数／秒といつた極く
小さな一定信号にまで上昇する（図７）。試料３ｍｌ当
り２．７×１０-15 モルのホスフアターゼ濃度（実験
Ｄ）での酵素的誘発についての典型的な強度対時間の関
係が、図７に示されている。光強度は酵素濃度に依存し
て３０−６０分の期間にわたり、時間と共に増す。この
期間後に光は、ジオキセタンが費消されつくすまで一定
に留まる。定常状態前の期間は、ジオキセタン及び酵素
を含む試料を蛍光光度計での分析前に３７−４５℃で数
分間養生することによつて無くしうる。
【００８８】積分光強度または特定時間での強度対酵素
量を座標平面上にプロツトすると、高い相関々係が示さ
れる。例えば図８は、ｌｏｇ（０−３分の間の酵素によ
る積分光強度）対ｌｏｇ（アルカリホスフアターゼのモ
ル数）のプロツトを示している。各実験の再現性は４％
よりもよく、図８に示したようなプロツトは０．９９よ
り大きな相関係数を与えた。
【００８９】上述したような酵素による誘発実験は、Ｄ
ｙｎａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手した透明ポリスチレ
ン製のＩｍｍｕｌｏｎ（商標名）ミクロ滴定ウエル中で
も行なつた。ウエルを個別的に用い、恒温制御可能な光
遮断性ホルダー中に置いた。化学発光はウエルの底で、
前述した光子計数蛍光光度計に接続した光フアイバーを
用いて検出した。本実験法によると使用する反応物量が
ずつと少なくて済む。例えば、５×１０-15 モルから２
×１０-18 モル（２アトモル）の範囲のアルカリホスフ
アターゼ量を含む２００μｌの２２１緩衝液中でジオキ
セタン２ｃ、ＣＴＡＢ、及び界面活性剤３を用いる一連
の実験を行なつた。図９は、２．３×１０-17 モルの酵
素を用いて行なつた実験について強度対時間の関係を示
している。酵素試料の純度についてのより実際的な仮定
は１０％であつたかもしれない。ジオキセタン２ｃを用
いる本化学発光法は図１０にみられるように、０．２ア
トモルより少ないアルカリホスフアターゼの検出を可能
とする。
【００９０】ジオキセタン２ｃの酵素的誘発によつて生
ぜしめられる化学発光はまた、Ｘ線フイルム及びインス
タント写真フイルムを用いて写真によつても検出でき
る。例えば図１１及び図１２はそれぞれ、ＡＳＡ ３０
００ Ｐｏｌａｒｏｉｄ（商標名）Ｔｙｐｅ ５７ フ
イルムで記録した化学発光を示している。ジオキセタン
２ｃ（４．３×１０-5Ｍ）、Ｍｇ（ＯＡｃ）2 （８．０
×１０-4Ｍ）、ＣＴＡＢ（１．１３×１０-3Ｍ）、及び
フルオレセイン界面活性剤３（５．６×１０-5Ｍ）を含
む２２１緩衝液（１００μｌ，０．７５Ｍ，ｐＨ９．
１）の溶液を、前述したＡ−Ｆのように量を変更したア
ルカリホスフアターゼを存在させたＤｙｎａｔｅｃｈ
Ｉｍｍｕｌｏｎ（商標名）ウエル中で養生した。ウエル
について３７℃で１時間養生を行ない、次にウエルを光
遮断性の保温器中でフイルム上に直接のせることによつ
て同じ温度で１５分間、感光させた。フイルムに記録さ
れた光強度は明白に、酵素濃度の尺度となる。
【００９１】４．化学発光性の酵素結合検定 適当に置換したジオキセタン類を酵素により誘発するこ
とで、酵素結合生物検定のための極めて感応性大な検出
法が提供される。例えばリン酸塩置換ジオキセタン２ｃ
を、アルカリホスフアターゼを検出用標識として利用す
る酵素結合免疫測定及びＤＮＡプローブ測定に用いるこ
とができる。以前の検出法は、本酵素と反応して色を発
現するか蛍光性のものとなる基質を利用するものであつ
た。ジオキセタン２ｃを用いる化学発光法の感応性を網
膜タンパク質、Ｓ−抗原用の酵素結合免疫吸収検定（Ｅ
ＬＩＳＡ）を例にとつて明らかにする。Ｌ．Ａ．Ｄｏｎ
ｏｓｏの方法（Ｌ．Ａ．Ｄｏｎｏｓｏ，Ｃ．Ｆ．Ｍｅｒ
ｒｙｍａｎ，Ｋ．Ｅ．Ｅｄｅｌｂｅｒｇ，Ｒ．Ｎａｉｄ
ｓ，ａｎｄ Ｃ．Ｋａｌｓａｗ：Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔ
ｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ２６，５６１（１９８５））を用
い、一連の７個のＩｍｍｕｌｏｎ（商標名）ウエルに異
なつた量のＳ−抗原（１１２，５６，２８，１４，７，
３，１．３ｎｇ）をコーテイングし、マウス中で発達さ
れたモノクローナル抗体（ＭＡｂＡ９−Ｃ６）と反応さ
せ、最後にアルカリホスフアターゼに結合した抗マウス
ＩｇＧと反応させた。次に各ウエルについて個別的に化
学発光検定を、Ｍｇ（ＯＡｃ）2 （８．０×１０
-4Ｍ）、ＣＴＡＢ（１．１３×１０-3Ｍ）、及びフルオ
レセイン界面活性剤３（５．６×１０-5Ｍ）を含む１０
０μｌの２２１緩衝液（０．７５Ｍ，ｐＨ９．１）を加
えて実施した。ウエルをミクロ蛍光光度計中に移し、３
７℃で３分間平衡化し、２２１緩衝液中のジオキセタン
２ｃの貯蔵溶液１０μｌを注入してジオキセタン２ｃの
最終濃度を１．３６×１０-4Ｍとした。典型的な化学発
光強度対時間の関係が、図１３に示されている。試薬バ
ツクグランド発光は極く低く、１５−２０カウント数／
秒で一定である（図１３）。図１４に示すように積分光
強度は、ウエルにコーテイングした抗原の量と相関々係
にある。蛍光光度計を用いた実験に引続いて同じ溶液を
次に、写真による検出実験に用いた（図１５）。７個の
ウエルをホルダー中に置き、３７℃で３０分間養生し、
次に同温度でＡＳＡ ３０００ Ｐｏｌａｒｏｉｄ（商
標名）Ｔｙｐｅ ５７ フイルムを用いて光遮断性の保
温器中で１５分間、感光させた。図１５に示すようにフ
イルムに記録された光強度も、ウエルにコーテイングし
たＳ−抗原の量と相関々係にある。写真検定法の再現性
を図１６に示す。５０ｎｇの抗原をコーテイングした４
個のウエルを上述のように緩衝液とジオキセタンで処理
し、４５℃で１時間養生し、次に同温度で３０秒間、フ
イルムに感光させた。両写真検定実験において緩衝液及
びジオキセタンのみを含む対照標準ウエルが視認でき
ず、これによつてもまたジオキセタンの非酵素的分解に
より生じるバツクグランドが極く低いことが示される。
【００９２】５．蛍光性ミセルの存在下でのウレアーゼ
によるヒドロキシ置換ジオキセタン２ａの酵素的誘発 １６０ｍｇのＣＴＡＢと１２．４ｍｇのフルオレセイン
界面活性剤３を２００ｍｌの蒸留水に加えて、溶液を調
製した。尿素溶液を、１００ｍｌの蒸留水に２００ｍｇ
の尿素を溶解しＥＤＴＡを加えて、０．４ｍＭの最終濃
度で作製した。ウレアーゼ実験用の基質溶液を、１０ｍ
ｌの各貯蔵溶液を加えることによつて得た。
【００９３】実験はウレアーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．）を用い、常温で０．５−２時間養生
して行なつた。次に１０μｌの３×１０-3Ｍジオキセタ
ン２ａを注入して、発生する化学発光を蛍光光度計及び
インスタント写真フイルムで鑑視した。化学発光の強度
は、ウレアーゼの濃度の尺度となるものであつた。
【００９４】要 約 好ましい方法及び組成物中でジオキセタンは約１０-2−
１０-6Ｍの量、カチオン性界面活性剤は約１０-4Ｍより
多い量、そして共存性フルオレセイン界面活性剤は約１
０-3−１０-6Ｍの量だけ、用いられる。共存性界面活性
剤は、溶液中でそれを単独に用いると自己消光する。一
般にジオキセタンと蛍光化合物とのモル比は、溶液中か
固体組成物中かを問わず約１０００：１から１：１まで
の間に設定する。
【００９５】緩衝液は、酵素活性を最大とするようにｐ
Ｈを調整するのに用いられる。リン酸塩（Ｘ−オキシ基
として）置換ジオキセタン類に関してはｐＨを９と１０
との間とすると、リン酸基の非酵素的加水分解が極小化
されてバツクグランド発光が低くなる。２−アミノ−２
−メチル−１−プロパノール（２２１）は、好ましい緩
衝液である。他の緩衝剤にはトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン及びカーボナートがある。酢酸マグネ
シウムのような無機塩類も、酵素を活性化するために使
用できる。緩衝系は酵素について、またリン酸塩のよう
にジオキセタンから開裂されるＸ−オキシ基用の受容体
について、最大の触媒活性が附与されるように選択され
る。
【００９６】前述の発光試験の結果から明らかなよう
に、安定な１，２−ジオキセタンを水性緩衝液中で酵素
により誘発して化学発光反応を生じさせる場合、カチオ
ン性界面活性剤の存在下、並びにカチオン性界面活性剤
及びそれと共存性の界面活性剤である蛍光化合物の存在
下の何れにおいても、これらの物質を存在させなかつた
場合と対比して強い光を発生させることができる。そし
てカチオン性界面活性剤単独でなく蛍光化合物を組合せ
て用いると化学発光反応の量子収率が飛躍的に高められ
るが、カチオン性界面活性剤単独でもそれが存在しない
場合と対比して化学発光反応の量子収率を大きく高める
こと、試験結果において実証した通りである。したがつ
てこの発明はカチオン性界面活性剤単独の利用も、発明
範囲に含むものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】リン酸塩置換ジオキセタン２ｃの熱分解につい
て、一次速度定数と時間との関係をアレニウス式に従つ
て座標平面にプロツトした図である。
【図２】ジオキセタン２ｂの塩基誘発反応について、化
学発光量子収率と臭化セチルトリメチルアンモニウム
（ＣＴＡＢ）の濃度との関係を座標平面にプロツトした
図である。
【図３】ヒト血清アルカリホスフアターゼにより誘発し
たジオキセタン２ｃの化学発光について、光強度と時間
との関係を示すグラフである。
【図４】図３の場合と同様の化学発光について、プラト
ーでの光強度と血清量との関係を示すグラフである。
【図５】図３と同様の化学発光について、積分光強度と
血清量との関係を示すグラフである。
【図６】アルカリホスフアターゼにより誘発したジオキ
セタン２ｃの化学発光について、分子間エネルギー移動
を伴なわない場合と伴なう場合とを対比して示したスペ
クトル図である。
【図７】ＣＴＡＢ及び蛍光体の存在下でアルカリホスフ
アターゼにより誘発したジオキセタン２ｃの化学発光に
ついて、光強度と時間との関係を示すグラフである。
【図８】図７の場合と同様の化学発光について、積分光
強度とアルカリホスフアターゼの量との関係を示すグラ
フである。
【図９】ＣＴＡＢ及び蛍光体の存在下でアルカリホスフ
アターゼにより誘発したジオキセタン２ｃの化学発光に
ついて、光強度と時間との関係を示すグラフである。
【図１０】図９の場合と同様の化学発光について、積分
光強度とアルカリホスフアターゼの量との関係を示すグ
ラフである。
【図１１】ジオキセタン２ｃの化学発光により感光させ
たインスタント写真フイルムについて、コンピユーター
処理により光強度を線図化して示した図である。
【図１２】図１１と同様の図で、図１１の場合とは感光
時間を変えた場合についてのものである。
【図１３】ジオキセタン２ｃを用いた免疫検定実験で得
た光強度と時間との関係を示すグラフである。
【図１４】図１３の場合と同様の実験で得た積分光強度
とＳ−抗原の量との関係を示すグラフである。
【図１５】ジオキセタン２ｃを用いるＳ−抗原の検定実
験において化学発光により感光させたインスタント写真
フイルムを、コンピユーター処理により光強度を線図化
して示した図である。
【図１６】ジオキセタン２ｃを用いるＳ−抗原の検定実
験において化学発光により感光させたインスタント写真
フイルムを、コンピユーター処理により光強度を線図化
して示した図である。
【図１７】ミセル中でのジオキセタンとエネルギー受容
体との位置関係を画いたものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｄ 311/90 321/00 Ｃ０９Ｋ 11/06 Ｚ 9280−4Ｈ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 21/76 33/532 Ｂ

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 試料中に単独で、又は他の物質と結合し
    て存在する、アリールエステラーゼ、アセチルコリンエ
    ステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアルカリホスフ
    ァターゼからなる群から選択される酵素を、化学発光反
    応を利用して測定する方法において、 水性緩衝液中において、カチオン性界面活性剤の存在下
    で、一般式 【化１】 〔式中、Ｒ２はＯＸ基で置換されたアリール基であり、
    ここで、ＯＸはエステル結合又はグリコシド結合でアリ
    ール基Ｒ２と結合している基であって、Ｘは前記酵素と
    易反応性の基であり、 Ｒ１はアルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリー
    ルオキシ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルシリル
    オキシ基、アリールシリルオキシ基、及びアリール基Ｒ
    ２と一緒になってＯＸ基で置換されたスピロ結合多環式
    アリール基（炭素原子に代わり酸素原子を含む環を有し
    ていてもよい。）を形成するアリール基から成る群から
    選択されるものであり、 Ｒ３及びＲ４はアルキル基（炭素原子に代わり異種原子
    Ｎ，Ｏ，Ｓ又はＰを含んでいてもよい。）であり、これ
    らが一緒になってスピロ結合多環式アルキレン基を形成
    していてもよい。〕 で表される安定な１，２−ジオキセタンであって、Ｘが
    除去されると不安定なオキシド中間体の１，２−ジオキ
    セタン化合物を経て、一般式 【化２】 （Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じ意味を有す
    る） で表される２個のカルボニル含有化合物に分解すると共
    に、電子エネルギーを放出して光を発生する、１，２−
    ジオキセタンを、前記酵素と反応させ、前記カチオン性
    界面活性剤の不存在下で反応させる場合よりも、強い光
    を発生させる過程を含む測定法。
  2. 【請求項２】 カチオン性界面活性剤がアンモニウム
    塩、ピリジニウム塩、ホスホニウム塩及びスルホニウム
    塩から選択されたものである請求項１の測定法。
  3. 【請求項３】 カチオン性界面活性剤がセチルトリメチ
    ルアンモニウム塩である請求項２の測定法。
  4. 【請求項４】 １，２−ジオキセタンがＯＸ基としてリ
    ン酸塩を有するものであり、酵素がアルカリホスファタ
    ーゼである請求項１の測定法。
  5. 【請求項５】 免疫測定又は核酸プローブ測定の一部と
    して実施される請求項１の測定法。
  6. 【請求項６】 Ｒ2 がメタ−フェニル基である１，２−
    ジオキセタンを用いる請求項１の測定法。
  7. 【請求項７】 １，２−ジオキセタンがＯＸ基としてリ
    ン酸塩を有するものであり、酵素がアルカリホスファタ
    ーゼである請求項６の測定法。
  8. 【請求項８】 免疫測定又は核酸プローブ測定の一部と
    して実施される請求項６の測定法。
  9. 【請求項９】 Ｒ1 がメトキシ基、Ｒ2 がメタ−フェニ
    ル基でありＲ3 とＲ4 が互いに結合してスピロ結合アダ
    マンチル基を形成している１，２−ジオキセタンを用い
    る請求項１の測定法。
  10. 【請求項１０】 ＯＸ基がリン酸塩である１，２−ジオ
    キセタンを用いる請求項９の測定法。
  11. 【請求項１１】 リン酸塩がＯＰＯ3 Ｎａ2 である１，
    ２−ジオキセタンを用いる請求項１０の測定法。
  12. 【請求項１２】 免疫測定又は核酸プローブ測定の一部
    として実施される請求項９の測定法。
  13. 【請求項１３】 カチオン性界面活性剤がアンモニウム
    塩、ピリジニウム塩、ホスホニウム塩及びスルホニウム
    塩から成る群から選択されたものである請求項９の測定
    法。
  14. 【請求項１４】 カチオン性界面活性剤がセチルトリメ
    チルアンモニウム塩である請求項９の測定法。
JP5187042A 1988-07-27 1993-06-29 化学発光反応を利用する酵素の測定法 Expired - Lifetime JPH07121237B2 (ja)

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