JP2627308B2 - 酵素を用いる化学発光免疫測定法 - Google Patents
酵素を用いる化学発光免疫測定法Info
- Publication number
- JP2627308B2 JP2627308B2 JP14151488A JP14151488A JP2627308B2 JP 2627308 B2 JP2627308 B2 JP 2627308B2 JP 14151488 A JP14151488 A JP 14151488A JP 14151488 A JP14151488 A JP 14151488A JP 2627308 B2 JP2627308 B2 JP 2627308B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- chemiluminescence
- enzyme
- enzymes
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （発明の技術分野） 本発明は、酵素を用いる化学発光免疫測定法に関す
る。
る。
（従来の技術） 従来、酵素を用いる化学発光免疫測定法としては、
標識酵素としてPODを用い、基質としてH2O2及びルミノ
ールを用いるEIA法、アクリジンエステルを標識体と
して用い、H2O2で発光させるCLIA法及び基質として例
えば （式中、Adはアダマンチル基である。） を用いる化学発光EIA法（PCT公開WO8800695号）が知ら
れている。
標識酵素としてPODを用い、基質としてH2O2及びルミノ
ールを用いるEIA法、アクリジンエステルを標識体と
して用い、H2O2で発光させるCLIA法及び基質として例
えば （式中、Adはアダマンチル基である。） を用いる化学発光EIA法（PCT公開WO8800695号）が知ら
れている。
（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、従来の方法のの場合、低濃度のリガ
ンド測定に対して定量性がなく、の場合はラベル体自
体の増幅ができない等の欠点を有していた。これらの欠
点を前記の方法は、解決することができたものの、よ
り高度の測定を目指すためにより多くの光量をもった測
定法の開発が望まれていた。
ンド測定に対して定量性がなく、の場合はラベル体自
体の増幅ができない等の欠点を有していた。これらの欠
点を前記の方法は、解決することができたものの、よ
り高度の測定を目指すためにより多くの光量をもった測
定法の開発が望まれていた。
（問題点を解決するための手段） 本発明者等は、従来の欠点を克服すべく検討した結
果、酵素を用いた化学発光免疫測定法において多くの光
量をもって測定できる方法を見出し本発明を完成した。
果、酵素を用いた化学発光免疫測定法において多くの光
量をもって測定できる方法を見出し本発明を完成した。
本発明は、ホスファターゼ標識酵素及び一般式 （式中、Adはアダマンチル基、Ｒは低級アルキル基であ
り、Arは芳香族基である。）で表されるジオキセタン誘
導体を基質として用いpH4〜10.5において酵素反応させ
た後、更に、pH11〜14において酵素反応を行う化学発光
免疫測定法に関する。
り、Arは芳香族基である。）で表されるジオキセタン誘
導体を基質として用いpH4〜10.5において酵素反応させ
た後、更に、pH11〜14において酵素反応を行う化学発光
免疫測定法に関する。
本発明の基質として使用する前記一般式（１）で表さ
れるジオキセタン誘導体は、例えばヨーロッパ特許公開
254051、PCT公開WO8800695号、Tetrahedron Lett.,28,1
155−1158（1987）に記載の方法ないしは同様にして製
造することができる。前記一般式中のＲとしては、メチ
ル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等の低級アルキ
ル基を、Arとしては、フェニレン基、ナフチル基、アン
トラニル基等の芳香族基を例示することができる。
れるジオキセタン誘導体は、例えばヨーロッパ特許公開
254051、PCT公開WO8800695号、Tetrahedron Lett.,28,1
155−1158（1987）に記載の方法ないしは同様にして製
造することができる。前記一般式中のＲとしては、メチ
ル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等の低級アルキ
ル基を、Arとしては、フェニレン基、ナフチル基、アン
トラニル基等の芳香族基を例示することができる。
本発明で測定できる抗原としては、血清あるいは尿な
どに含まれる薬物、ホルモンあるいは各種疾患に由来す
る微量成分などである。
どに含まれる薬物、ホルモンあるいは各種疾患に由来す
る微量成分などである。
本発明に使用する抗体は、公知の方法に従い取得し、
そのものを使用することができる。
そのものを使用することができる。
例えば、兎、山羊、馬、モルモット、ニワトリなどの
温血動物に、リガンド又は酵素を体重1kg当り0.3〜2mg
程度１〜数回背中皮下、フットパッド、大腿筋等にアジ
ュバントとともに注射して当該動物の体内に抗体を形成
させることができる。この抗体はペプシン等の蛋白分解
酵素でＦ（ab′）2,Fab′,Fabなどに分解して用いるこ
とができる。
温血動物に、リガンド又は酵素を体重1kg当り0.3〜2mg
程度１〜数回背中皮下、フットパッド、大腿筋等にアジ
ュバントとともに注射して当該動物の体内に抗体を形成
させることができる。この抗体はペプシン等の蛋白分解
酵素でＦ（ab′）2,Fab′,Fabなどに分解して用いるこ
とができる。
一方、これらの抗体はモノクローナル抗体として取得
することもできる。その場合には、マウスに前記のリガ
ンドあるいは酵素をアジュバントとともに数回腹腔等に
注射し、脾臓細胞を取り出してポリエチレングリコール
等を用いてマウスミエローマ細胞と融合させる。そし
て、この融合細胞のなかから当該抗体を産生するものを
クローニングによってモノクローン細胞として増殖さ
せ、得られたモノクローン細胞をマウス腹腔中で増殖さ
せることによってモノクローナル抗体を大量に製造する
ことができる。
することもできる。その場合には、マウスに前記のリガ
ンドあるいは酵素をアジュバントとともに数回腹腔等に
注射し、脾臓細胞を取り出してポリエチレングリコール
等を用いてマウスミエローマ細胞と融合させる。そし
て、この融合細胞のなかから当該抗体を産生するものを
クローニングによってモノクローン細胞として増殖さ
せ、得られたモノクローン細胞をマウス腹腔中で増殖さ
せることによってモノクローナル抗体を大量に製造する
ことができる。
本発明に使用できる免疫測定のための方法としては、
「酵素免疫測定法」医学書院（1987年版）に記載の各方
法、例えば固定化抗体上に抗原を反応させその抗原に酵
素標識した抗体を反応させ測定する方法等を採用するこ
とができる。
「酵素免疫測定法」医学書院（1987年版）に記載の各方
法、例えば固定化抗体上に抗原を反応させその抗原に酵
素標識した抗体を反応させ測定する方法等を採用するこ
とができる。
本発明を実施するにあたっては、上記文献に記載のい
ずれかの測定法を採用し、ホスファターゼの指摘pH4〜1
0.5、例えばアルカリホスファターゼの場合にはおよそp
H9.5において、前記基質を加えホスファターゼによる酵
素反応を行った後に、測定する抗原その他の条件によっ
ても異なるがおよそ５〜60分後に、pHを11〜14に設定す
ることにより化学発光を増大させ免疫測定を行うもので
ある。
ずれかの測定法を採用し、ホスファターゼの指摘pH4〜1
0.5、例えばアルカリホスファターゼの場合にはおよそp
H9.5において、前記基質を加えホスファターゼによる酵
素反応を行った後に、測定する抗原その他の条件によっ
ても異なるがおよそ５〜60分後に、pHを11〜14に設定す
ることにより化学発光を増大させ免疫測定を行うもので
ある。
pHを変化させるには、NaOH,KOH,Mg（OH）２などのア
ルカリ金属あるいはアルカリ土類金属の水酸化物、水酸
化アンモニウム、エタノールアミン等の水酸化物イオン
を有する化合物を系中に添加することにより行うことが
できる。
ルカリ金属あるいはアルカリ土類金属の水酸化物、水酸
化アンモニウム、エタノールアミン等の水酸化物イオン
を有する化合物を系中に添加することにより行うことが
できる。
尚、前記一般式（Ｉ）で表されるジオキセタン誘導体
の陽イオンとしてはナトリウム、カリウム等のアルカリ
金属、アンモニウム、 （式中、R2は、メチル、エチル等のアルキル基、ベンジ
ル等のアラルキル基を表わす。）で表される四級アンモ
ニウムを例示することができる。
の陽イオンとしてはナトリウム、カリウム等のアルカリ
金属、アンモニウム、 （式中、R2は、メチル、エチル等のアルキル基、ベンジ
ル等のアラルキル基を表わす。）で表される四級アンモ
ニウムを例示することができる。
以下実施例により本発明を更に詳細に説明する。
実施例１ ３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−
４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−1,2−ジオ
キセタン２ナトリウム塩（以下AMPPDを記す。） 溶液（５×10-2μg/ml AMPPD,10mMトリス塩酸,1mM Mg
Cl2,0.1mM ZnCl2,pH8.0）100μに牛小腸由来アルカリ
ホスファターゼ溶液（0.2mg/ml10mMトリス塩酸,1mM MgC
l2,0.1mM ZnCl2 pH8.0）を加え、30秒後に添加後のpHが
8.6,9.5,10.3,11.7,12.6になるように1Mジエタノールア
ミン溶液300μ加え、直ちにベルトールドルミノフォ
トメーターで発光量をカウントした。図１にその結果を
示した。
４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−1,2−ジオ
キセタン２ナトリウム塩（以下AMPPDを記す。） 溶液（５×10-2μg/ml AMPPD,10mMトリス塩酸,1mM Mg
Cl2,0.1mM ZnCl2,pH8.0）100μに牛小腸由来アルカリ
ホスファターゼ溶液（0.2mg/ml10mMトリス塩酸,1mM MgC
l2,0.1mM ZnCl2 pH8.0）を加え、30秒後に添加後のpHが
8.6,9.5,10.3,11.7,12.6になるように1Mジエタノールア
ミン溶液300μ加え、直ちにベルトールドルミノフォ
トメーターで発光量をカウントした。図１にその結果を
示した。
10秒間積算カウント（最大カウントから10秒間） pH 相対比 12.6 21092 714％ 11.7 19166 650％ 10.3 16344 550％ 9.5 9558 320％ 8.6 2945 100％ 実施例２ （TSHの化学発光EIA） 15μのTSHを含むサンプル（０〜１μU/ml）に抗TSH
Fab′を結合したアルカリホスファターゼ（コンジュゲ
ート）135μ（0.5μg/mlのコンジュゲート,0.1Mトリ
ス塩酸,2％BSA1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2 pH7.5）を混合
し、これに抗TSHマウスIgGをコートしたプラスチックビ
ーズ２個（直径1/8インチ）添加し、室温で２時間放置
した。このビーズを蒸留水で３回洗浄し、AMPPD170μg/
mlを含む基質液（A:0.1M Tris−HCl,1mM MgCl2,0.1M Zn
Cl2 pH9.8）200μを加え室温で80分間反応させた。こ
の反応液に4N NaOH100μ加え（Ｂ）（pH13.5）と、ま
た100μの蒸留水を加え（Ａ）直ちにベルトール社の
ルミノメーターで発光量をカウントした。10秒間の積算
値で表示した。NaOH添加（pH13.5）した系（Ｂ）では１
μU/ml TSHではカウント値は完全にメジャーオーバーし
ている。また0.5μU/ml TSHでもNaOH添加系ＢではＡの5
0倍のカウント量となり発光量が増大しているのが分
る。
Fab′を結合したアルカリホスファターゼ（コンジュゲ
ート）135μ（0.5μg/mlのコンジュゲート,0.1Mトリ
ス塩酸,2％BSA1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2 pH7.5）を混合
し、これに抗TSHマウスIgGをコートしたプラスチックビ
ーズ２個（直径1/8インチ）添加し、室温で２時間放置
した。このビーズを蒸留水で３回洗浄し、AMPPD170μg/
mlを含む基質液（A:0.1M Tris−HCl,1mM MgCl2,0.1M Zn
Cl2 pH9.8）200μを加え室温で80分間反応させた。こ
の反応液に4N NaOH100μ加え（Ｂ）（pH13.5）と、ま
た100μの蒸留水を加え（Ａ）直ちにベルトール社の
ルミノメーターで発光量をカウントした。10秒間の積算
値で表示した。NaOH添加（pH13.5）した系（Ｂ）では１
μU/ml TSHではカウント値は完全にメジャーオーバーし
ている。また0.5μU/ml TSHでもNaOH添加系ＢではＡの5
0倍のカウント量となり発光量が増大しているのが分
る。
（発明の効果） 本発明の化学発光免疫測定法は、従来当分野において
使用可能な化合物から得られる化学発光に比べ数〜数10
倍の化学発光が得られる効果的な測定法である。
使用可能な化合物から得られる化学発光に比べ数〜数10
倍の化学発光が得られる効果的な測定法である。
図１はpH8.0でAPMMDをアルカリホスファターゼで全分解
し、pHをシフトさせた時の発光量と時間を示した図であ
る。 図２はTSHの化学発光EIAの結果であり、図中、ＡはpHを
変化させない時で、ＢはpHを9.5から13.5へ変化させた
時の例である。
し、pHをシフトさせた時の発光量と時間を示した図であ
る。 図２はTSHの化学発光EIAの結果であり、図中、ＡはpHを
変化させない時で、ＢはpHを9.5から13.5へ変化させた
時の例である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−500901（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−724（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- 【請求項１】標識酵素としてホスファターゼ及び一般式 で表されるジオキセタン誘導体を基質として用いpH4〜1
0.5において酵素反応させた後、更に、pH11〜14におい
て反応を行うことからなる、化学発光免疫測定法（式中
Adはアダマンチル基、Ｒは低級アルキル基であり、Arは
芳香族基である。）。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14151488A JP2627308B2 (ja) | 1988-06-10 | 1988-06-10 | 酵素を用いる化学発光免疫測定法 |
| KR1019890008021A KR900000483A (ko) | 1988-06-10 | 1989-06-10 | 화학발광 측정방법 |
| AU36340/89A AU610406B2 (en) | 1988-06-10 | 1989-06-13 | Methods of chemiluminescence assay |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14151488A JP2627308B2 (ja) | 1988-06-10 | 1988-06-10 | 酵素を用いる化学発光免疫測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01311272A JPH01311272A (ja) | 1989-12-15 |
| JP2627308B2 true JP2627308B2 (ja) | 1997-07-02 |
Family
ID=15293735
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14151488A Expired - Fee Related JP2627308B2 (ja) | 1988-06-10 | 1988-06-10 | 酵素を用いる化学発光免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2627308B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5004565A (en) * | 1986-07-17 | 1991-04-02 | The Board Of Governors Of Wayne State University | Method and compositions providing enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes |
| JP3182527B2 (ja) * | 1996-09-03 | 2001-07-03 | 株式会社ヤトロン | 化学発光の測定方法及びキット |
-
1988
- 1988-06-10 JP JP14151488A patent/JP2627308B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01311272A (ja) | 1989-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Erlandsen et al. | A modification of the unlabeled antibody enzyme method using heterologous antisera for the light microscopic and ultrastructural localization of insulin, glucagon and growth hormone. | |
| EP0238353B1 (en) | Methods of immunoassay | |
| JP3758686B2 (ja) | Ｃペプチド特異的アッセイ法 | |
| AU777117B2 (en) | Immunoassay for measuring human C-peptide and kit therefor | |
| GB1586506A (en) | Immunochemical process and reagents for the determination of haptens | |
| JPH02276969A (ja) | 肝炎の異なるマーカーの同時検出用試薬 | |
| EP0522677B1 (en) | Method of measuring concentration of immunoreactant using electrochemiluminescence | |
| EP0324540B1 (en) | A method for measuring the free fraction of ligands in biological fuids | |
| JPH083489B2 (ja) | 免疫学的検定法 | |
| JP2627308B2 (ja) | 酵素を用いる化学発光免疫測定法 | |
| EP0133464A1 (en) | Iodothyronine immunoassays employing HMS as TBP blocking agent | |
| JPH0667960B2 (ja) | 結合蛋白質に結合した分析質を分離する方法及び血清中のビタミンｂ１２測定用試料準備試薬 | |
| JPS6390763A (ja) | カテコ−ルエストロゲンのイムノアツセイキツド | |
| JP2984282B2 (ja) | エンハンサーを用いる化学発光測定法 | |
| JP3819612B2 (ja) | β−ｈＣＧの免疫学的測定方法 | |
| JP3866763B2 (ja) | 加水分解感受性分子または分子部分を安定化する方法 | |
| US20070178543A1 (en) | Assay methods and materials | |
| JP2996673B2 (ja) | 化学発光の測定方法 | |
| JP2996672B2 (ja) | 化学発光測定法 | |
| AU617334B2 (en) | Cea immunoassay free of human anti-mouse antibody false positives | |
| JPS63228067A (ja) | イムノアッセイ法 | |
| JPH03225277A (ja) | 多項目の免疫化学的測定法 | |
| Baxter et al. | Specificity enhancement of polyclonal antisera by the induction of tolerance to unwanted cross‐reacting determinants | |
| JP7007862B2 (ja) | 化学発光試薬組成物及び化学発光試薬キット | |
| JP3269401B2 (ja) | 免疫測定方法及びその測定試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |