JPS63228067A - イムノアッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はイムノアッセイ技法に関し、さらに詳しくは酵
素ラベルされた免疫結合反応において検出可能なシグナ
ルを発生せしめるための新規な系に関する。この発明は
また、この新規な系を使用し、そしてそれを機能せしめ
るための方法に関する。

〔従来の技術〕

ヒト又は動物の体液中の物質の測定は臨床化学及び医療
において非常に重要である。定量的であり、特異的であ
りそして鋭敏である新規なアッセイ法の必要性の増加が
、リガンドーリセブター、すなわち抗原抗体相互作用に
基礎を置く競争的結合アッセイの開発をもたらした。は
とんどの酵素イムノアッセイ法は、限定された数の抗体
（リセプター）に対するサンプルリガンドとシグナル発
生リガンド例えば酵素ラベルされた抗原との競争に基く
。ラベルされたリガンドを結合するために利用できる抗
体部位の濃度がサンプル中のラベルされていないリガン
ド分析対象の濃度に逆の関係で関連する。

しかしながら、遊離の及び免疫結合したシグナル発生成
分の間の直接分別が常に可能であるとは限らず、そして
それ故にリセプターに結合したラベルされたリガンドを
結合していないリガンドから物理的に又は化学的に分離
する必要がある（不均一イムノアッセイ）。この操作は
時間を要し、不便であり、そして測定誤差に有意に寄与
する場合がある。不均一型の酵素イムノアッセイの広範
な記載が文献中にすでに存在する。最も有用なものはＥ
ｄｗａｒｄ　Ｔ、Ｍａｇｇｉｏ　Ｅｎｚｙ＋ｇｅ−１ｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ＋　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　１９８１
に見られる。Ｕａｎ　Ｗｅｅｍｅｎ等、ＦＥＢＳ。

Ｌｅｔｔｅｒ　１４．２３２　（１９７１）による発表
、及び酵素を用いるイムノアッセイに関するＥｎｇｖａ
ｌｌ等、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　８．８
７１　（１９７１）による発表も興味深い。さらに、米
国特許１１ｋｈ３，６５４，０９０を参照のこと。

均一酵素イムノアッセイは分離の問題を回避する工つの
技法である。均一酵素イムノアッセイは通常、ラベルさ
れた抗原に抗体が結合した場合の特異的マーカー活性の
変化に依存する。例えば、マーカーが酵素だと仮定すれ
ば、前記変化はある酵素基質に対する結合した酵素の反
応性に関連する。従って、分離されないアッセイ混合物
の活性は、抗体がそれに結合した酵素ラベルされた抗原
の比率に対応し、従って分離段階を必要としない。

この技法は、薬剤のごとき小ハブテン分子の測定に好結
果に適用されている。これは酵素増幅イムノアッセイ法
（ｅｎｚｙｍｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ　ｉｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）として一般に知られて
おり、そしてこの種の系は商品名ＥＭＩＴ　（Ｓｙｖａ
、　Ｍａｉｄｅｎｈｅａｄ＋英国）のちとに商品化され
ており、これはまずＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ等、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｎ＋ｕｎ、　
４Ｌ　８４６（１９７８）により記載された。さらに米
国特許１１ｈ３，８１７，８３７及び隘４．２３３．４
０１を参照のこと。

均一酵素イムノアッセイ原理の４種類の異る変形が考案
されそして商業的に開発されている。

土）最も初期のＥＭＩＴ系は酵素ラベルとしてリゾチー
ムを使用し、そしてこの技法は薬物の誤用のアッセイに
おいて今日なお使用されている。この方法においては、
効果は抗体結合の結果としての酵素−ハブテン抗合体の
活性の阻害のそれである。

この系はまた、Ｒｏｗｌｙ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、　２５０゜３７３９　（１９７５）により記載されて
いるように療法剤のアッセイのためにマレート・デヒド
ロゲナーゼ及びグルコース−６−ホスフェート・デヒド
ロゲナーゼのでとき、より小さい基質を要求する酵素を
用いて示された。さらに、米国特許１１ｍ４，２３３．
４０１及びＣｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、　２２．１１８５　（
１９７６）を参照のこと。

り他のタイプのアッセイは、チロキシン−マレート・デ
ヒドロゲナーゼ抗合体により示される様に、抗体がハブ
テン接合体に結合した場合の阻害された酵素−ハブテン
接合体の活性の刺激又は回復を用いる。この場合、酵素
活性は接合体の形成の後実質的に阻害される。しかしな
がら、該接合体が抗体に結合した場合に酵素阻害は逆転
される。

これは旧１ｍａｎ等、ＢｉｏｃｈｉＩＩｌ、Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、Ａｃｔａ、　６６．５６７（１９７９）に記載さ
れている。

■）リガンド分析対象に結合する・ラベルとして補欠分
子族（ＦＡＤ）を用いるハブテンのための均一イムノア
ッセイが存在し、この補欠分子族はコーファクターとし
て適切なアポ酵素と結合して対応するホロ酵素系を再生
することができ、この酵素系が検出を可能にする。

ラベルされたリガンドがその抗体と複合体を形成する場
合に、活性ホロ酵素を再生する補欠分子族残基の能力が
実質的に阻害されるので、抗体に結合したラベルを遊離
ラベルから分離することなくイムノアッセイが行われる
。従って、系を作用可能にするために特異的結合反応が
開始され、過剰のアポ酵素が添加され、そして生ずるホ
ロ酵素の活性が溶液中のラベルされていないリガンドの
量によって変えられる。この系はＭｏｒｒｉｓ等、＾ｎ
ａｌ。

Ｃｈｅｗ、　５３．６５８（１９８１）により記載され
ている。

ｉ）前記の３つの系は小分子のためのアッセイを記載す
るものであるが、しかし１９７９年以来蛋白質の測定の
ために均一イムノアッセイが適用されている。この方法
においては、酵素ラベルされた抗原への抗体の結合のコ
ンホーメーション効果を利用するのではなく、抗体結合
による大分子基質の立体的排除が用いられる。酵素β−
ガラクトシダーゼ（マーカー）が蛋白質分析対象に接合
され、抗体がその上に結合し、そして疏水性スペーサー
を介してのデキストランキャリヤーへの付着により大分
子形に転換されている基質Ｏ−ニトロフェニルガラクト
シドに対して過剰なマーカーを排除する。抗体の過剰の
結合の結果として８０％までの酵素の阻害が観察され、
遊離抗原の均一アッセイのための基礎が与えられた。こ
の技法はＧｉｂｂｏｎｓ等、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、、　
２７．１６０２　（１９７９）に記載されている。開示
されているがしかし本質的により複雑であり、そしてそ
れ故に設計及び操作において高価である均一イムノアッ
セイの他の変法は：土）酵素増強イムノアッセイ　（ｅ
ｎｚｙｍｅ　ｅｎｈａｎｃｅ−ｍｅｎｔ　ｉｎｕｗｕｎ
ｏａｓｓａｙ）である。この方法においては、抗体がラ
ベルされ、そしてこの系は、光散乱により検出し得る免
疫複合体からの不溶性酵素生成物の形成に依存する。遊
離酵素により形成される生酸物は不溶性であり、それ故
に試験中の抗原の量が光散乱の程度を変更する。これは
Ｇｉｂｂｏｎｓ等、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、２７．１
６０２　（１９８１）　、及び米国特許Ｎ１４，２８１
，０６１に記載されている。

１）酵素チャンネリングイムノアッセイ。この方法にお
いては免疫反応は２つの酵素によって行われ、これらは
密接に関連する逐次反応を触媒し、生成物の転換が促進
される。反応はＮＡＤＨの生成によりモニターされる。

Ｌｉｔｍａｎ等、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１０６．２２３　（１９８０）。さらに、米国特許隘４
．２３８．５６５を参照のこと。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記の技法は利点を有し、そして生物分析の多くの分野
において好結果に利用されるが、複雑な媒体の分析にお
ける増強された選択性、検出限界を改良するための増強
された感受性、及び専門化されていないオペレーターに
よりキットの形で広範に使用されるための改良された単
純さを提供するイムノアッセ・イ系及び方法の必要性が
なお存在する。

〔問題点を解決するための手段〕

上記の目的は、溶液中の生物活性リガンド種（Ａｇ）　
、特に体液中の蛋白質、核酸及び他の大分子を、該リガ
ント′種に対して特異的な適当な免疫パートナ−（Ａｂ
）との複合体の形成の際に免疫対Ａｇ／＾ｂを形成する
ことにより確認するための均一イムノアッセイにおける
分析的測定手段として使用される、ホロ酵素／アポ酵素
対及び対応するコーファクターを含む酵素反応体の系で
あって、該アッセイが、Ａｇ又はＡｇ様分子を適切なシ
グナル発生成分と接合せしめることにより得られたラベ
ルされた試薬Ａｇ０を用い、このラベルされた試薬Ａｇ
“はＡｂと競争的に反応して対応する免疫対Ａｇ”／Ａ
ｂを形成することができるものであり、前記酵素が前記
シグナル発生成分を構成し、そして該アッセイにおいて
前記コーファクターの存在下での前記ホロ酵素のそのア
ポ酵素からの再成が前記Ａｇ１１に複合した前記Ａｂに
より阻害され、これによって前記コーファクターの添加
の際の再生したポロ酵素の活性の変化が前記分析的測定
の決定因子であることを特徴とする前記の系により達成
される。

要約すれば、本発明は新規なタイプの均一酵素イムノア
ッセイに関し、このアッセイは、前記のごとく、そのコ
ーファクターが除去されておりそしてそれ故に不活性な
酵素であるアポ酵素を用いる。通常、次の反応が成立す
る： ホロ酵素＃アポ酵素＋コーファクター コーファクターは、静電気力、π結合又は電価の移行に
よって蛋白質に結合する金属イオンであることができる
。結合の正確な性質は明らかではない。金属イオン（こ
れは亜鉛、マグネシウム、カルシウム又は遷移金属であ
ることができる）が金属イオン封鎖剤により除去されれ
ば酵素は不活性化されるが、しかし通常、金属イオンの
添加により活性が回復する。この発明のアッセイは、ア
ポ酵素−リガント接合体がａ）溶液中に遊離していると
き、及びｂ）リセプター、例えば抗体に結合していると
きの該接合体の再活性化動態が異ることを利用する。免
疫反応におけるアポ酵素−リガント接合体への抗体の結
合が、複合体中のアポ酵素の再活性化により十分に機能
的にされたホロ酵素の生成の速度に影響を与えることが
見出された。

リガンド（抗原）についての量応答曲線は、均一酵素イ
ムノアッセイ方式においてこのアッセイが使用され得る
ことを示した。この発明においては、リガンド（抗原）
（及びそのリセプターで、ある抗体）の定義は相対的で
ある。なぜなら抗原（リガンド）に対する抗体（リセプ
ター）もまた他のリセブター（抗体）に対するリガンド
（抗原）であり得るからである。従って、抗体及び抗原
なる語は結合対のリガンド対すセブターパートナーにつ
いて相互交換可能に使用され得る。この発明の系におい
て使用される酵素はウシ腸アルカリ性ホスファターゼで
あることができるが、当然、匹敵する性質を有する他の
酵素系であってもよい。これは、ホスホモノエステル及
びピロリン酸を含有する化合物を加水分解することがで
きる非特異的酵素である。アルカリ性ホスファターゼは
亜鉛依存性金属酵素であり、これはまたコバルト及び鉛
イオンにわずかに依存する。酵素活性は、酵素分子の活
性部位におけるコーファクターとしての亜鉛の存在に依
存する。亜鉛はキレート化剤、例えばオルト−フェナン
トロリン（０，Ｐ）、８−アミノキノリン、及びα、α
′−ジピリジルにより非常に容易に酵素から取り出され
て鏡体を形成し、亜鉛陽イオンの除去は完全な不活性化
、すなわちアポ酵素形への転換をもたらす９アポ酵素溶
液に亜鉛を添加することにより完全な且つ急速な再活性
化が示され得る。他の金属、例えばＣｏ、　Ｍｎ、　Ｐ
ｂ、　Ｃｕ。

Ｎｉ、　Ｆｅも酵素活性を回復せしめることができるＣ
Ｄ、Ｊ、Ｐｌｏｃｋｅ等、Ｂｉｏｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ
上（１９６２）　、　１０３９−１０４１）。他のキレ
ート化剤、例えばα、α′−ジピリジル及び８−アミノ
キノリン並びに他の金属イオン封鎖剤がＢ、Ｌ、Ｖａｌ
ｅｅ等、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
　５６　（１９８４）、３０１頁に一開示されている。

蛋白質構造に対して錯体形成親和性を有するエチレンジ
アミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又はニトリロ三酢酸（ＮＴＡ
　）のごときキレート化剤はこのケースでは避けるべき
であるが、これらは他の酵素特に金属に対して高い結合
親和性を有する酵素、例えばオキシダーゼと共に使用す
ることができる。アポ形のアルカリ性ホスファターゼが
蛋白質リガンド例えばＩｇＧに結合する場合、免疫反応
において遊離のＴｇＧと競争することができるラベルさ
れた試薬が製造される。このアポ酵素接合体の再活性化
は、免疫化学的反応に関与しなければ行われ得る。

免疫化学的反応とは、免疫対の２つのバートター、例え
ば抗原、又は接合体の免疫グロブリンに対して生じた抗
血清からの抗体、の間の反応を意味する。

参照文献（１）　、ＢＧ−Ａ−２，０２３，６０７（Ｍ
ｉｌｅｓ）は、分析対象中のりガンどの決定のための免
疫反応における競争的免疫試薬としての補欠分子族コー
ファクターでラベルされたリガンドの使用を開示する。

これに対して、本発明の方法においては、ラベルにされ
ていない分析対象と競争するためにアポ−酵素でラベル
された免疫試薬を用いてイムノアッセイが行われる。次
に、未使用のラベル化試薬の活性（ポロ酵素形）を再生
するためにコーファクターが添加され、次に前記未使用
のラベル化試薬は適切な基質に対するその使用により確
認され得る。従って、参照文献１はアポ酵素ラベルを開
示しておらず、そしてそれ故にこの発明とは異る。

参照文献（２）、八ｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　５３＋Ｎ１４，１９８１年４月、６５８−６６
５は、競争的免疫反応におけるリガンドのためのラベル
としてアポグルコースオキシダーゼの補欠分子族フラビ
ン−アデニン−ジヌクレオチド（ＦＡＤ）の使用を開示
する。従って、方式は参照文献（１）におけるものと同
じであり、本発明のものとは異る。

参照文献（３）、ＵＳ−へ一４，４７３，６３８　（デ
ュポン）もまたＦＡＤ−リガンド接合体を用いる。

参照文献（４）　、ＵＳ−４−４，２３１３，５６５（
マイルス・ラボラドリース）は参照文献（２）に対応す
る特許のようである。

参照文献（５）、Ｂｉｏｌｏｇｔｃａｌ　Ａｂｓｔｒａ
ｃｔｓ　８２（１９８６）　、８２　ｏ３３３０３は、
ＮＧ−アミノヘキシル−ＦＡＤでラベルされたＴＢＧを
用いるチロキシン−結合グロブリン（ＴＢＣ）の免疫決
定を開示する。その方式はやはり前記の参照文献のもの
と類似する。

Ｃ具体的な方法〕 この発明を提供する結果をもたらす種々の実験を、次の
様にして行った。

１、　亜鉛イオン封鎖剤の存在下でのアルカリ性ホスフ
ァターゼの不活性化及び再活性化の動態を研究した。

２、免疫グロブリン分子に接合した場合の酵素の不活性
化及び再活性化動態も検討し、そして遊離酵素のそれに
非常に匹敵することが見出された。

３、免疫化学反応に関与する場合の接合体についての不
活性化及び再活性化動態も検討された。特異的抗血清へ
のリガンドのカップリングの後、再活性化がほぼ完全に
ブロックされることが見出される。

さらに詳しくは、酵素の不活性化（すなわちアポ酵素形
への転換）を行うために必要なキレート化剤の量を決定
するため、アルカリ性ホスファターゼ溶液を種々の濃度
のＯ−フェナントロリン（キレート化剤）の溶液と一夜
インキキュベートした。要約すれば、酵素の１０−１°
Ｍ溶液を用いて出発した場合、０−フェナントロリンの
１０−’Ｍ温溶液１アリコートを添加した後に有意な不
活性化が起った。同じ容量の１０−’Ｍ温溶液使用した
場合完全な不活性化が起こった（第１図曲線Ａを参照の
こと）。

１アリコートのｔｏ−”Ｍ　　Ｏ−フェナントロリンに
よりあらかじめ不活性化された酵素の溶液（１０−”　
Ｍ）に増加する量のＺｎ　（硫酸塩又は塩化物の形で）
を添加することにより、アポ酵素の再活性化を行った。

第１図曲線Ｂは、最初の活性の約７０〜８０％を回復す
るために亜鉛イオンの３Ｘ１０−４Ｍ溶液が十分である
ことを示している。さらに高濃度の亜鉛は活性を次第に
その元のレベル（１００％）に近ずけるであろう。

前記の実験の結果をアルカリ性ホスファターゼでラベル
されたリガンドからのそれと比較するため、ラビット抗
上目ｇＧ抗体との接合体を使用した（この場合、ヒトＩ
ｇＧに対するラビット抗体をリガンドと考える）。第２
図曲線Ａは、０−フェナントロリン（０，Ｐ）の１０−
’Ｍ温溶液効果が有意であり、他方１０−３〜１０４Ｍ
溶液はアポ酵素／リガンド抗合体の酵素活性を全体的に
阻害することを示す。阻害された接合体への亜鉛の添加
は元の活性を部分的にのみ回復せしめる（第２図曲線Ｂ
を参照のこと）が、該接合体の再活性化レベルは、それ
が次に分析的免疫反応においてラベルされた試薬として
使用されるためには十分である。

そこで、アポーアルカリ性ホスファターゼ／ラビッ日ｇ
ｃ接合体（Ａｇ”　）を抗体（Ａｂ）　、すなわちロバ
においてラビットＩｇＧに対して生じた抗血清にカップ
リングせしめた。キレート化剤（１０−２Ｍ　Ｏ，Ｐ、
）による阻害の後、活性の回復のために過剰の亜鉛（３
Ｘ１０−’Ｍ＞を加えた。第３図は、接合体に結合する
抗体の量が減少するに従って回復が増加することを示し
ている。この図において、１００％は全最大回収に対応
し、抗体の非存在下での接合体を参照レヘルとして採用
した（第２図曲線Ｂを参照のこと）。

第４図は、ロバの抗血清（Ａｂ）に対する、ラビットＩ
ｇＧとアポ形アルカリ性ホスファターゼによりラベルさ
れたラビットＩｇＧＯ間の競争イムノアッセイの典型的
な例を示す。八ｇ＊の濃度を一定（２，３Ｘ　１０−’
　Ｍ　）に維持し、キレート剤（０，Ｐ）の濃度を１０
４Ｍとし、回復用Ｉｎ＋−４のそれを３Ｘ１０−３Ｍと
し、そしてラベルされていない抗原の量を２×１０−７
〜２ｘｌＯ−’Ｍで変化せしめた。第４図において、曲
Ｌｍ　Ｉは接合体のブロックが４Ｘ１０−’Ｍに対応す
るＡｂＯ量を用いて行われた状態に関し、曲線■はＡｂ
が４Ｘ１０−’Ｍである場合に関する。

この発明においては、他のホロ酵素／アポ酵素系を使用
することもできる。これらの酵素の下に挙げるがこれら
に限定されない。

幾つかの酸化還元酵素、例えば活性部位においてＣｕ−
及びＺｎ”を１：１：１のモル比で含有するスーパーオ
キシドディスムターゼ、及びＣｕ−を１＝１のモル比で
含有するガラクトースオキシダーゼ。

トランスフェラーゼ、例えばＺ゛を６：ｌのモル比で結
合するアスパルテート・トランスカルバミラーゼ。

ヒドロラーゼ：主としてｌｎ＋４を４＝１のモル比で含
有するアルカリ性ホスファターゼ。Ｚｎ″“を２＝１の
モル比で含有するロイシンアミノペプチダーゼ。亜鉛イ
オンの代りにＣＯ〜が導入される場合、回復した酵素は
１５倍以上活性である。サーモライシンはＺｎ〜を１：
１のモル比で取り込み、そしてＣｕ−を４：１のモル比
で取り込む。

リアーゼ：アルドラーゼは酵素モル当り１モルのＺｎ”
＋を含有し；カルボニックアンヒドラーゼもまた酵素モ
ル当り１モルの亜鉛を含有し；亜鉛の代りにＣｏ″０を
用いることもできる（Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎＥｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ　５６　（１９８４）　２８３を参照のこ
と〕。

スＡし１部 酵素アッセイ：すべでの場合に測定系は、分析用キュベ
ツト中、１４５０μｌの酵素基質、すなわちＩ　Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ／Ｈ（Ｊ　　（ｐＨ８，０）中１　ｍＭ　ＰＮＰ
Ｐ（ｐ−二トロフェノールホスフエート）への５０μ！
の酵素又は酵素／リガンド状接合体溶液の添加を用いた
。

酵素はｐ−二トロフェノールホスフェート（基質）の黄
色生成物であるｐ−ニトロフェノールへの加水分解を触
媒し、この生成物が通常の手段により色度計により分析
される。４０５ｎｍにおける反応の速度を５分間にわた
って読み取った。亜鉛による再活性化の場合、１５００
１Ｉ７の反応容量に５０μｌの後記の濃度の亜鉛を１分
間後に添加して再活性化を惹起し、そして次に対応する
速度を測定した。

ＰＮＰＰ　（酵素基質）溶液中１０−”　Ｍ濃度のスト
ック酵素を天然酵素活性の標準速度として使用した。

酵素をこの濃度でキレート化剤、すなわち１０−　”　
Ｍ〜１０−’Ｍの範囲の濃度のＯ−フェナントロリン（
０，Ｐ）の存在下で一夜インキエベートした。第１図曲
線Ａに見られるように、キレート剤は１０１Ｍの濃度に
おいて酵素活性を全体的に阻害した。

再活性化を測定するため、１０−”Ｍのｏ、ｐの存在下
でのアポ酵素を基質溶液に添加した。１分間後、３Ｘ１
０−’Ｍ〜３Ｘ１０−”Ｍの濃度の亜鉛を前記反応容量
を含む一連のキエベット加え、そして反応速度に対する
即時的効果を測定した。第１図曲線Ｂに示されるように
、ｔｏ−’ＭのＯ１２中でのインキュベーシヨンにより
完全に廃止された活性が３Ｘ１０−’Ｍ　Ｚｎ″１の添
加により即座にそしてほとんど完全に回復することが見
出された。

酵素がリガンド分子に接合した場合の阻害及び再活性化
についての動態データーを得るため、同じ実験を行った
。この場合、ラビット抗−ヒトＩｇＧ抗体に接合したア
ルカリ性ホスファターゼを使用した。この生成物はダコ
（ＯＡＫＯ）デンマークから購入した。ストック接合体
（２，３Ｘｌ０−’Ｍ）の１　／１５０稀釈物が上で使
用した天然酵素稀釈物のそれに類似する速度応答を与え
ることが見出された。やはり、第２図曲線Ａに示される
ように、１０−”Ｍ？１度のＯｏＰが、ＩｇＧに接合さ
れた場合の酵素の活性を全体的に阻害することが見出さ
れた。

反応混合物に亜鉛を添加した後、不活性化されていない
接合体のレベルまでの酵素接合体の活性の回復は観察さ
れなかった。４Ｘ１０−’ＭのＯ１２の存在下でアポ酵
素接合体溶液に３Ｘ１０−”Ｍの亜鉛が添加された場合
の最大活性は、第２図曲線Ｂに示すように接合体の正常
値の１０〜２０％に過ぎなかった。これは次のことを示
している。すなわち、類似の大きさの蛋白質への酵素の
接合（ＩｇＧの分子１１＝１５０，０００　、ウシ腸ア
ルカリ性ホスファターゼの分子ｉ１　＝　１４０．００
０）が、アポ酵素のみの再活性化動態と比較して、亜鉛
によるその再活性化の動態を変化せしめた。

それにもかかわらず、再活性化は、対応する免疫複合体
（後記参照のこと）のそれと比べて、その後の免疫試験
において競争的ラベル化試薬（Ａｇ“）としてこのアポ
酵素接合体を用いるために十分であった。

すなわち、上記のアポーアルカリ性ホスファターゼ／ラ
ビット抗−ヒトＩｇＧ接合体をロバにおいてラビットＩ
ｇＧに対して生じさせた抗血清〔スト−／　’）溶液（
１０−’Ｍ）　（７）稀釈１／ｌＯａ〜１／２〕と共に
免疫複合体を形成せしめた。ロバ抗−ラビット抗血清の
逐次稀釈物を、前記のごとき１０−　”　Ｍの０、Ｐの
存在下でアポ酵素／ラビットＩｇＧ接合体と共にインキ
ュベートした。この後亜鉛を３Ｘ１０−３Ｍの濃度で添
加し、そして回復した活性を測定した。結果を第３図に
示す。

この図は、アポ酵素−リガント接合体に対してアッセイ
媒体中の抗体が多（なるに従って酸素活性が低下するこ
とを示している。この状況において、抗血清による特異
的免疫学的結合が、酵素分子が接合する可能性が最も高
いｒｇｃ分子のＰｃ’ｐｌ域に向けられている高い可能
性が存在する。ロバ抗血清の全蛋白質含量は非常に高く
、そして示されるように、高抗血清濃度領域において、
添加された亜鉛による再活性化のレベルの低下が存在す
る。

なお、抗血清の低い濃度において、再活性化は標準の不
活性されていない接合体の値の２０％であることが興味
深い。

なお、抗血清の飽和レベルにおいて酵素の反応性の低下
が存在し、そして接合体への低レベルの特異的結合にお
いて反応性の対応する増加が存在する。この効果は反応
混合物中に存在する高レベル蛋白質含量のためであると
考えられる。そこで、高レベルの非特異的蛋白質を、ｏ
、ｐによる不活性化の後にアポ酵素接合体に加え、そし
て亜鉛の添加による活性の回復を再び測定した。下記の
表に示されるように、試験された４種類の蛋白質、すな
わちヒト血清アルブミン（ａ）、ウシ血清アルブミン（
ｂ）、ラビット抗血清（ｃ）及び非特異的ロバ抗−血清
（ｄ）は亜鉛の添加によるアポ酵素の活性の回復に影響
を与えず、すべての値は接合体に対する抗体を伴わない
アポ酵素接合体の反応性の正常な値について見出される
レベルにもどった。この試験は、観察されるすべての効
果がＩｇＧ分子に接合したアポ酵素の領域における抗体
の結合について特異的であるという証拠である。下記の
表において、活性は天然接合体を１００％としたもので
ある。

ラベル化されていない抗原分析対象について量応答実験
を行った。これは単純なタイプのイムノアッセイ方式で
あって、この方式においては、アポ酵素形のアルカリ性
ホスファターゼによりラベルされた抗原すなわちラビッ
トｒｇＧがラベルされていない競争的なラビットＩｇＧ
の濃度の増加によって複合体から排除される。このラベ
ルされていないラビットＩｇＧはラビット抗血清の一連
の稀釈物の形で存在する。このラベルされていない抗原
の逐次稀釈物、すなわちラビットＩｇＧ（２ｘｌＯ−’
〜２Ｘ１０−’Ｍ）をまず抗体（４×１０弓Ｍ又は４×
１０−’Ｍ）と共に３０分間インキヱベートした。次に
、ラベルされた抗原（ラビットＩｇＧに接合したアポ酵
素、２　Ｘｌ０−’Ｍ）を添加し、そしてインキュベー
ションを２時間行った。３つの反応体の最終濃度を第４
図に示す。すなわち、２つの固定された抗体濃度を、ラ
ベルされていない逐次稀釈物及び固定された濃度のラベ
ル化抗原の存在下で試験した。第４図は、ラビフ目ｇＧ
アフセイについてのＳ字形の量応答曲線を示す。いずれ
の場合も、最大利用可能シグナルの約５０％が０．７　
ｎ　Ｍから７０ｎＭのラビットＩｇＧ　濃度範囲にわた
って変化する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、漸増する量の亜鉛キレート剤０−フェナント
ロリンによる不活性化（Ａ）、及び亜鉛陽イオンによる
再活性化（Ｂ）の際のアルカリ性ホスファターゼのｐ−
ニトロフェニルホスフェートに対する酵素活性の変化を
示すダイアグラムである。 第２図は、第１図のそれと類似するダイアグラムである
が、アルカリ性プロテアーゼでラベルされた酵素、すな
わち免疫グロブリン−酵素接合体に関する。 第３図は、アポ−アルカリ性ホスファターゼ／リガンド
接合体のＺｎによる活性回復の変化を、そのリガンドに
対して特異的な抗体との免疫複合体形成の程度の関数と
して示したダイアグラムである。 第４図は、オルト−フェナントロリンによる不活性化後
の亜鉛による酵素活性の再生を用いる試験における、ラ
ベルされていないリガンド（分析対象へｇ）とアルカリ
性アポ−ホスファターゼでラベルされたリガンド（Ａｇ
”　）との間の競争的イムノアッセイを示すダイアグラ
ムである。 以下余白 ＦＩＧ、　３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、溶液中の生物活性リガンド種（Ａｇ）、特に体液中
   の蛋白質、核酸及び他の大分子を、該リガンド種に対し
   て特異的な適当な免疫パートナー（Ａｂ）との複合体の
   形成の際に免疫対Ａｇ／Ａｂを形成することにより確認
   するための均一イムノアッセイにおける分析的測定手段
   として使用される、ホロ酵素／アポ酵素対及び対応する
   コーファリターを含む酵素反応体の系であって、該アッ
   セイが、Ａｇ又はＡｇ様分子を適切なシグナル発生成分
   と接合せしめることにより得られたラベルされた試薬Ａ
   ｇ＾＊を用い、このラベルされた試薬Ａｇ＾＊はＡｂと
   競争的に反応して対応する免疫対Ａｇ＾＊／Ａｂを形成
   することができるものであり、前記酵素が前記シグナル
   発生成分を構成し、そして該アッセイにおいて前記コー
   ファリターの存在下での前記ホロ酵素そのアポ酵素から
   の構成が前記Ａｇ＾＊に複合した前記Ａｂにより阻害さ
   れ、これによって前記コーファクターの添加の際の再生
   したポロ酵素の活性の変化が前記分析的測定の決定因子
   であることを特徴とする前記の系。 ２、前記酵素がアルカリ性ホスファターゼであり、そし
   て前記コーファクターが亜鉛イオンである、特許請求の
   範囲第１項に記載の系。 ３、溶液中の生物活性リガンド種（Ａｇ）、特に体液中
   の蛋白質、核酸及び他の大分子を、該リガンド種に対し
   て特異的な適当な免疫パートナー（Ａｂ）との複合体の
   形成の際に免疫対Ａｇ／Ａｂを形成することにより確認
   するための均一イムノアッセイにおける分析的測定手段
   として使用される、ホロ酵素／アポ酵素対及び対応する
   コーファリターを含む酵素反応体の系であって、該アッ
   セイが、Ａｇ又はＡｇ様分子を適切なシグナル発生成分
   と接合せしめることにより得られたラベルされた試薬Ａ
   ｇ＾＊を用い、このラベルされた試薬Ａｇ＾＊はＡｂと
   競争的に反応して対応する免疫対Ａｇ＾＊／Ａｂを形成
   することができるものであり、前記酵素が前記シグナル
   発生成分を構成し、そして該アッセイにおいて前記コー
   ファリターの存在下での前記ホロ酵素のそのアポ酵素か
   らの再成が前記Ａｇ＾＊に複合した前記Ａｂにより阻害
   され、これによって前記コーファクターの添加の際の再
   生したポロ酵素の活性の変化が前記分析的測定の決定因
   子である前記の系により分析対象のイムノアッセイを実
   施する方法であって、前記酵素のハロ形を分析されるべ
   き物と連結することによりラベルされた抗原を調製し、
   該接合体のコーファクターを除去して対応するラベルさ
   れた抗原のアポ形を得、後者を前記分析対象との混合物
   の形で前記イムノアッセイにおける競争的試薬として既
   知量の抗体（Ａｂ）と共に使用し、過剰のコーファクタ
   ーを添加し、そして再生したホロ酵素シグナル発生成分
   の活性を測定し、該活性が前記分析対象溶液中の前記種
   の量に比例的であることを特徴とする方法。 ４、前記酵素がコーファクターとして亜鉛イオンを含む
   アルカリ性ホスファターゼであり、そして該酵素のその
   アポ酵素への不活性化がキレート化前によって行われる
   、特許請求の範囲第３項に記載の方法。 ５、前記キレート化剤がオルト−フェナントロリン、８
   −アミノキノリン及びα，α′−ジピリジルから選択さ
   れる、特許請求の範囲第３項に記載の方法。 ６、前記ラベルされた抗原が、酵素と分析されるべき種
   又は類似のリガンドとの共有結合により調製されること
   を特徴とする特許請求の範囲第３項に記載の方法。 ７、分析されるべき種が免疫グロブリン又はそれに対す
   る抗体であることを特徴とする特許請求の範囲第３項に
   記載の方法。 ８、前記免疫グロブリンがヒト、ラビット又はロバ由来
   のＩｇＧであることを特徴とする特許請求の範囲第７項
   に記載の方法。 ９、Ａｇ種と酵素シグナル発生成分との接合が、抗原に
   より酵素が立体的にブロックされるのを防止するのに十
   分な長さの共有結合架橋を含むことを特徴とする特許請
   求の範囲第１項に記載の系。