JPH05506722A - 酵素結合抗体免疫吸着アッセイを改善するために変性した伝播体タンパク質 - Google Patents

酵素結合抗体免疫吸着アッセイを改善するために変性した伝播体タンパク質

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素結合抗体免疫吸着アブセイを改善するために変性した伝播体タンパク質 発明の背景 発明の分野 本発明は、改善された特性を有する酵素結合抗体免疫吸着ア・Iセイに関する。
特に、本発明は、組換え融合タンパク質における伝播タンパク質に対する試験試 料の結合が、試料を変性形態の伝播タンパク質と予備混合することにより抑制さ れる検定に関する。本発明の改善された方法は、広範囲の各種物質を分析するた めの広範囲の各種酵素結合抗体免疫吸着アッセイに使用されて良い。
背景の説明 多くのタイプの酵素結合抗体免疫吸着アッセイ[エライザ(ELISλ)コは、 生物学的液体中の抗原と抗体のような物質の分析に対して公知である。酵素結合 抗体免疫吸着アッセイにおいて、分析体(分析されるべき物質)の濃度は、分析 体に特定の結合親和性を有するタンパク質である反応物と分析体を結合すること により測定される。分析体の濃度は、分析体に対して特定の結合親和性を有する 反応物に、又は分析体と同じである反応物の一定量に、酵素で標識付けすること により測定される。酵素標識は、一般的に、極めて敏感な標識であり、その理由 は、酵素が、酵素反応を介して弱い濃度信号を増幅できるからである。
免疫検定は、抗原と抗体の両方に対する分析に使用され得るけれども、免疫検定 は、以下抗原に対する分析に関して説明されるだろう。酵素結合抗体免疫吸着ア ッセイは、均−検定又は不均一検定のいずれかとして分類される。均一検定にお いて、検定溶液の酵素活性は、抗体結合抗原を未結合抗原から分離しないで測定 され得るが、その理由は、抗体結合抗原の酵素活性が、未結合抗原の酵素活性と 著しく異なるからである。不均一検定において、検定溶液の酵素活性は、抗体結 合抗原を分離した後、一般的に、固定化により未結合抗原から分離した後に測定 される、一般的に、均一検定は、実施と自動化が容易であるが、不均一検定はよ り敏感である。
均一酵素結合抗体免疫吸着アッセイにおいて、既知量の酵素標識付は抗原が、既 知制限量の抗体に対して試験試料抗原と競合して、酵素標識付は抗原/抗体複合 体を形成する。酵素mW付は抗原/抗体複合体の存在は、立体障害又はアロステ リック阻害の為に、複合体が極めて少ない酵素活性を有するようにさせられる。
検定溶液の酵素活性は、試験試料抗原の量に直接的に比例する。
競合する均一酵素結合抗体免疫吸着アッセイは、図式的に以下に説明するが、図 式においてAnは抗原であり、Abは抗体であり、かつEzは酵素である。
Ab Ab 均一酵素結合抗体免疫吸着アッセイの精度と正確さは、放射線免疫検定のような 他の免疫学的方法、及びガスクロマトグラフィー、高圧液クロマトグラフィー、 及び薄層クロマトグラフィーのような他の非免疫学的方法の精度と正確さに匹敵 する。他のタイプの均一酵素結合抗体免疫吸着アブセイは、酵素モジュレータ− を使用する検定、酵素補欠分子基を使用する検定、蛍光性酵素基質を使用する検 定、アポ酵素標識付は配位子に対する配座の抗体導入制限に基づく検定、酵素チ ャネリングを使用する検定、リポソーム−閉込酵素を使用する検定、及び試薬ス トリップ媒体を使用する検定のようなものが公知である。
不均一酵素結合抗体免疫吸着アッセイの原理と方法は、本質的に、放射線免疫検 定に対するものと同じである。例えば、競合不均一酵素結合抗体免疫吸着アッセ イにおいて、既知量の可溶性酵素標識付は抗原は、既知制限量の固定化抗体に対 して試験試料と競合する。反応後、結合酵素標識付は抗原を含む固定化抗体相は 、試験試料抗原の量に逆比例する。競合不均一酵素結合抗体免疫吸着アッセイを 、図式的に以下に説明するが、図式中、紅は抗原であり、Abは抗体であり、E zは酵素であり、かつ相は固定比相である。
抑制不均一酵素結合抗体免疫吸着アッセイにおいて、既知量の固定化抗原は、既 知制限量の可溶性酵素−標識付は抗体に対して試験試料抗原と競合する。
反応後、結合した酵素−標識付は抗体を含む固定化抗原相は、可溶性相から分離 される。酵素−標識付は抗体/固定化抗原相の酵素活性は、試験試料抗原の量に 逆比例する。
サンドイッチ不均一酵素結合抗体免疫吸着アッセイは、多重エピトープ(抗体に 付着する抗原の部位又は決定子)を有する抗原の、又は多重パラトープ(抗原に 付着する抗体の部位)を有する抗体の分析に使用される。直接サンドイッチ検定 において、多重エピトープを有する試験試料抗原は、過剰の固定化抗体−1と反 応される。結合抗原を含む固定化抗体−1相の反応と分離の後、過剰の又は既知 量の酵素標識付は抗体−2が、固定比相に添加されて更に抗原と反応する。酵素 ff1m付は抗体−2/抗抗原/固定化体−1相の酵素活性は、試験試料抗原の 量に直接に比例する。
An + ^b、 −> xb、−b ] I b2 間接的サンドイッチ不均一酵素結合抗体免疫吸着アッセイは、病原体に応答して 生産される特定抗体の血清レベルを測定するのに使用される。間接サンドイッチ 検定において、多重パラトープを有する試験試料抗体−1は、過剰の固定化抗原 と反応される。結合抗体−1を含む固定化抗原相の反応と分離の後、過剰の又は 既知量の酵素標識付は抗種免疫グロブリン抗体−2が、固定死相に添加されて、 更に抗体−1と反応される。酵素標識付は抗体−27抗体−17固定化抗原相の 酵素活性は、試験試料中の抗体量に直接的に比例する。
An+Ab、−>An−Ab+ [I b2 サンドイッチ検定において、第一免疫化学反応は、分析体が低濃度で存在する時 のように第二反応に対して望ましいよりも大きな容量で実施される得る。更に、 第一反応における生物学的液は、第二免疫化学反応、接合体で存在する酵素、又 は続いて起こる酵素検定反応を逆に慶すであろう物質を含んで良い。
不均一酵素結合抗体免疫吸着アッセイの他のタイプは。免疫酵素測定法の検定、 捕捉酵素配位子抱合検定、立体障害検定、イソ酵素検定、及び増幅された酵素標 識検定のようなものとして公知である。酵素結合抗体免疫吸着アッセイは、酵素 仲介免疫検定、エヌゴとレーンホフ(?1go and Lenhoff)(編 集者)、「酵素仲介免疫検定二大要」、第3〜32頁、ニューヨーク、ブリナム 出版社、(1985年)中に詳細に概説されており、この開示記載は、この明細 書に引用して糺み込まれている。
ジュール(Schuur)等に対して1982年7月20日発行された米国特許 第3.654゜090号再審特許公報には、抗原−抗体反応における成分の測定 方法を記載しており、この方法は、試験試料に固定化された形態の一つの成分の 一定量と酵素に共有結合した他の成分の調節した量とを添加することからなる。
反応後、未結合成分を酵素結合標識付き成分から分離して2つのフラクションを 形成し、次いで一つのフラクションの酵素活性を測定し、この測定は、試料中の 試験成分の量の測定である。
ジュール等に対して発行された米国特許再審第31.006号公報には、特定結 合タンパク質問の反応成分の証明と測定を記載している。この方法は、測定され るべき成分を不溶化形態の結合相手と反応させ、反応混合物の固相を液相から分 離し、ある酵素に対する反応成分の一つと特異的に反応できるある物質を結合す ることにより得られる結合生成物と前記同相を反応させ、次いで得られた反応混 合物の液相又は固相の酵素活性を測定することからなり、この測定は、測定され るへき物質の量の測定である。
例えば、多くの異なるタイプの酵素結合抗体免疫吸着アッセイが、生物学的府中 の抗原と抗体を分析するために公知である。多くのこれらの方法により達成でき る感度と特異性にかかわらず、今なお、病気の初期段階における病原体、又は低 い結合親和性に対する結合対応体を有する物質に応答して生産される微量の抗体 のような多くの物質を検出できない。分析されるべき物質を濃縮する方法は、骨 か折れることであり、かつその結果は、一般的に、なお不満足なものである。従 って、低濃度の抗原と抗体を分析するための改善された検定方法が望まれる。本 発明は、高い特異性で抗原と抗体の分析のためのかかる改善された酵素結合抗体 免疫吸着アッセイを提供するものである。本発明の改善された方法は、広範囲の 物質を分析するために、広範囲の酵素結合抗体免疫吸着アッセイに使用されて良 い。
発明の摘要 一つの実施態様において、本発明は、結合対応体の間の反応における反応物であ る分析体を分析するための均一酵素結合抗体免疫吸着アッセイに関するものであ り、ここで対応体は、結合可能な物質と結合物質からなり、この検定は次の諸工 程からなる: (a)組換え融合タンパク質として分析体の結合相手である第一反応物を付与し 、この融合タンパク質は、第一反応物の免疫学的活性を有する第一 タンパク質 と、第一タンパク質に融合された伝播体タンパク質である第二タンパク質とから なり、 (b)酵素標識付けされた反応物である第二反応物を付与し、この酵素ff1m 付けされた反応物は、酵素に連結された分析体と同しである反応物からなり、( c)有効量の変性伝播体タンパク質と共に分析体の溶液を形成することにより、 分析体の希溶液を調製して組換え融合タンパク質中の伝播体タンパク質に対して 分析体の結合を制限し、 (d)工程(c)からの分析体の希溶液を、工程(a)からの組換え融合タンパ ク質反応物と工程(b)からの酵素−標識付けした反応物と反応させて反応混合 物を形成し、この酵素−標識付けした反応物は、既知量で存在し、かつ組換え融 合タンパク質は、分析体と酵素−標識付けした反応物との総量と反応するのに不 充分な既知量で存在し、次いで (e)反応混合物中に存在する分析体の量に直接的に比例する反応混合物の酵素 活性を分析する。
もう一つの実施態様において、本発明は、結合相手の間の反応における反応物で ある分析体を分析するための不均一酵素結合抗体免疫吸着アッセイに関し、この 相手は、結合可能な物質と結合物質とからなり、この検定は次の諸工程からなる : (a)組換え融合タンパク質として分析体の結合相手である第一反応物を付与し 、この融合タンパク質は、第一反応物の免疫学的活性を有する第一タンパク質と 、第一タンパク質に融合された伝播体タンパク質である第二タンパク質とからな り、 (b)固体組上の融合タンパク質を固定化するために、組換え融合タンパク質の 水溶液を固体相と接触させることにより、工程(a)からの組換え融合タンパク 質反応物を固定化し、 (c)工程(b)における固体相からの水溶液を分離して、固定化反応物を調製 し、 (d)酵素Fm付けされた反応物である第二反応物を付与し、この酵素標識付け された反応物は、酵素に連結された分析体と同じである反応物からなり、(e) 有効量の変性伝播体タンパク質と共に分析体の溶液を形成することにより、分析 体の希溶液を調製して組換え融合タンパク雪中の伝播体タンパク質に対して分析 体の結合を制限し、 (f)工程(e)からの分析体の希溶液を、工程(c)からの組換え融合タンパ ク質反応物と工程(d)からの酵素−標識付けした反応物と反応させて反応混合 物を形成し、この酵素−標識付けした反応物は、既知量で存在し、かつ組換え融 合タンパク質は、分析体と酵素−標識付けした反応物との総量と反応するのに不 充分な既知量で存在し、 (g)固定比相と液相を分離し、次いで(h)反応混合物中に存在する分析体の 量に逆比例する固定比相の酵素活性を分析する。
更にもう一つの実施態様において、本発明は、結合相手の間の反応における反応 物である分析体を分析するための不均一サンドイッチ酵素結合抗体免疫吸着アッ セイに関し、この相手は、結合可能な物質と結合物質とからなり、この検定は次 の諸工程からなる。
(a)組換え融合タンパク質として分析体の結合相手である第一反応物を付与し 、この融合タンパク質は、第一反応物の免疫学的活性を有する第一タンパク質と 、第一タンパク質に融合された伝播体タンパク質である第二タンパク質とからな り、 (b)固体組上の融合タンパク質を固定化するために、組換え融合タンパク質の 水溶液を固体相と接触させることにより、工程(a)からの組換え融合タンパク 質反応物を固定化し、 (c)工程(b)における固体相からの水溶液を分離して、固定化反応物を調製 し、 (d)有効量の変性伝播体タンパク質と共に分析体の溶液を形成することにより 、分析体の希溶液を調製して組換え融合タンパク雪中の伝播体タンパク質に対し て分析体の結合を制限し、 (e)工程(d)からの分析体の希溶液を、工程(c)からの組換え融合タンパ ク質反応物と反応させて第−固定比相と第一液相とを有する第一反応混合物を形 成し、この固定化反応物は、総ての分析体と反応するのに充分な量で存在し、( f)第−固定比相と工程(e)における第一液相とを分離し、(g)酵素標識付 けされた反応物である第二反応物を付与し、この酵素標識付けされた反応物は、 酵素に連結された分析体に対する第二結合相手である反応物からなり、 (h)工程(f)からの第−固定比相と工程(g)からの酵素−標識付は反応物 を反応させて、第二固定比相と第二液相とを有する第二反応混合物を形成し、こ の酵素−標識付は反応物は、既知量で存在し、(1)工程(h)における第二固 定比相と第二液相を分離し、次いで(j)反応混合物中に存在する分析体の量に 直接的に比例する工程(1)における第二固定化生成相の酵素活性を分析する。
発明の詳細な説明 本発明は、結合相手の反応における反応物である試験試料又は分析体を分析する ための酵素結合抗体免疫吸着アッセイに関するものである。結合相手は、抗原又 はハブテンのような結合可能な物質と、抗体又は特定結合タンパク質のような結 合物質からなる。改善された検定において、分析体の結合相手である第一反応物 は、組換え融合タンパク質として付与される。組換え融合タンパク質は、結合相 手のアミノ酸配列と免疫学的反応性とを有する第一タンパク質と、伝播体タンパ ク質即ち運搬体タンパク質である第二タンパク質からなる。第−及び第二タンパ ク質は、相互に融合される。第二反応物が、酵素に共役される分析体と同じであ る反応物からなる酵素−標識付は反応物として付与される。分析体の希溶液が、 変性伝播体タンパク質の有効量と共に分析体の溶液を形成することにより調製さ れて、組換え融合タンパク質における伝播体タンパク質に対する分析体の結合を 抑制する。次いで分析体と酵素−標識付は第二反応物との希溶液が、分析体の検 定に対して、組換え融合タンパク質第−反応物と競合的に反応させられる。
出願人は、一定量の非特異性結合が、試験試料と組換え融合タンパク質の伝播体 タンパク質との間でしばしば起こり、正確でない明白な応答を与え、かつそれに より、検定の特異性を削減することを突き止めた。 自然の伝播体タンパク質を 競合阻害体としての試験試料の添加は、この非特異性結合を抑制しない。出願人 は、試験試料溶液に変性伝播体タンパク質を添加することにより組換え融合タン パク質の伝播体タンパク質部分が抑制されることを発見した。
本願発明の改善された方法は、広範囲の各種物質を分析するための広範囲の各種 酵素結合抗体免疫吸着アッセイの特異性を増大するのに使用されて良い。
本発明の範囲内の酵素結合抗体免疫吸着アッセイは、均一検定と不均一検定を包 含する。均一酵素結合抗体免疫吸着アッセイは、酵素モジュレータ−を使用する 検定、酵素補欠分子基を使用する検定、蛍光性酵素基質を使用する検定、アポ酵 素標識付は配位子に対する配座の抗体導入制限に基づ(検定、酵素チャネリング を使用する検定、リポソーム−閉込酵素を使用する検定、及び試薬スト!/yプ 媒体を使用する検定であって良い。不均一酵素結合抗体免疫吸着アッセイは、競 合検定、阻害検定、直接及び間接サンドイッチ検定、免疫酵素測定法の検定、捕 捉酵素配位子抱合検定、立体障害検定、イソ酵素検定、及び増幅酵素レベル検定 であって良い。好適な実施態様において、免疫検定は、競合検定、阻害検定、直 接サンドイッチ検定、及び間接サンドイッチ検定のような不均一検定である。更 に好適な実施態様において、免疫検定は、均一直接サンドイッチ検定、又は不均 一間接サンドイッチ検定である。最も好適な実施態様において、不均一免疫検定 は、間接サンドイッチ検定である。
本発明の酵素結合抗体免疫吸着アッセイにおける分析されるべき分析体又は物質 は、結合相手間の反応における反応物である。この結合相手は、相互に特定の結 合親和性を有するタンパク質である。一つの結合相手は、抗原とノ1ブテンから なる群から選択される結合可能な物質である。好適な結合可能な物質は、抗原で ある。他の結合相手は、抗体と特定結合タンパク質からなる群から選択される結 合物質である。好適な結合物質は抗体である。
抗原は、適切な条件下に、抗体の形成を誘発し、かつこのようにして誘発された 抗体である検出可能な方法において特異的に反応できる物質である。抗原は、ト キシンと異タンパク質のような可溶性物質、又は細菌又は組繊細胞のような粒状 物質であって良い。一般的に、抗原は、単純かつ共役タンバグ質及び炭水化物の ような高分子量物質である。
結合可能な物質はまた、ハブテンのような低分子量物質であっても良い。
ハプテンは、抗体の特定結合基と相互作用できる化学的立体配置を有する特定タ ンパク質のない物質であるが、然し乍ら、抗原決定基と異なり、それ自体で検出 可能な量の抗体の形成を引き出さない。ハブテンが運搬体タンパク質と共役され て接合体を形成する場合、ハプテンは、免疫応答を引き出すことができる。体液 性免疫において、抗体特異性は、主としてハブテンにおいて導かれる。細胞仲介 免疫において、抗体特異性は、ハプテンと運搬体タンパク質の両方において導か れる。
本発明における結合可能な物質は、天然源からの物質であるか、又は合成又は組 換え手段により調製された物質であっても良い。好適な実施態様において、結合 可能な物質は、組換えタンパク質と合成ペプチドからなる群から選択される抗原 である。更に好適な実施態様において、抗原は、肝炎Cウィルス(HCV)とヒ ト免疫不全ウィルス(HIY)からなる群から選択される。
抗体は、特定アミノ酸配列が抗原とのみ相互作用できる特定アミノ酸配列を有す る免疫グロブリン分子であり、その抗原の合成は、リンパ系組織中で、又は抗原 に近縁の抗原により誘導される。免疫グロブリンは、2つの軽い鎖と2つの重い 鎖から構成されたタンパク質である。
結合物質もまた、未付着受容体タンパク質又は輸送タンパク質のような特定結合 タンパク質であって良い。受容体タンパク質は、抗体のような細胞に付着したま まのタンパク質と、血清に放出されかつ特定結合親和性を保持する未付着タンパ ク質とを包含する。輸送タンパク質は、細胞中に、かつ細胞から、及び生物学的 器官中の上皮層を越えて物質を移動するタンパク質である。
結合物質は、天然源からの物質であって良く、又は合成又は組換え手段により調 製される物質であっても良い。好適な実施態様において、結合可能な物質は、組 換えタンパク質と合成ペプチドからなる群から選択される抗体である。更に好適 な実施態様において、抗体は、肝炎Cウィルス抗体とヒト免疫不全ウィルス抗体 からなる群から選択される。
分析体が生ずる媒体は、血清、血漿、尿、細胞培養媒体、又は滑液のようなどの 生物学的液であっても良い。分析体は、生物学的液中で直接に分析されて良く、 液と濃縮物から抽出されて良く、又は競合反応の影響を削減するために希釈され て良い。
一般的に、生物学的液又は試験試料のpH値は、免疫化学的反応を最適化するp 11値に調節されるのが良い。例えば、試験試料のpH値は、約5から約9.5 、好適には約8゜5から約9.5まで調節されるのが良い。試験試料のpH値は 、液に少量の濃縮された緩衝溶液、又は乾燥緩衝塩を添加することにより調節さ れるのが良い。代表的緩衝システムは、ホウ酸塩緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン 酸緩衝剤、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝剤、イミダゾール緩衝 剤、及び炭酸塩緩衝剤を包含する。
上記説明したように、本発明における試験試料の結合相手である反応物は、組換 え融合タンパク質として付与される。組換え融合タンパク質は、結合相手の免疫 学的反応性を有する第一タンパク質と、第一タンパク質に融合された伝播体であ る第二タンパク質とからなる。組換え融合タンパク質中の伝播体タンパク質は、 第一タンパク質に融合して、収率、安定性、及び組換え融合タンパク質の単離が 容易性を促進しかつ検定感度を改善するために適したどのタンパク質でも良い。
組換え融合タンパク質とこのようなタンパク質を調製する方法は、1989年、 9月19日に公告された欧州特許第318.216号公報に詳細に検討されてお り、これはこの明細書中に引用して組込まれている。
本発明によると、組換え融合タンパク質中の伝播体タンパク質への試験貿の結合 は、変性形態の伝播体タンパク質の希溶液を試験試料に予備混合することにより 抑制される。希溶液中の伝播体タンパク質は、組換え融合タンパク質中の、同じ 伝播体タンパク質、又は同じタイプの伝播体タンパク質であろう。
伝播体の制限されない実施例は、スーパーオキシドジスムターゼ(超過酸化物不 均化酵素)、β−ガラクトシダーゼ、及びラクタマーセを包含する。好適実施態 様において、伝播体タンパク質は、スーパーオキシドジスムターゼ及びβ−ガラ クトシダーゼからなる群から選択され、更に好適な実施態様において、伝播体タ ンパク質はスーパーオキシドジスムターゼである。
希溶液中の伝播体タンパク質の量は、組換え融合タンパク質中の伝播体タンパク 質に対する分析体の結合を抑制するのに有効な量である。伝播体タンパク質の有 効な量は、使用される伝播体タンパク質のタイプと結合親和性、検定されるべき 試験試料の量とタイプ、及び望まれる特異性のレベルのような因子に対する好み の内容事項である。例えば、伝播体タンパク質の正確な量は、最終生成物におい て望まれる結果を得るために変化されて良く、かつこのような変化は、適切でな い実験を必要とせずに、当業者の能力の範囲内にある。好適な実施態様において 、伝播体タンパク質は、希溶液の重量に基づいて、約30ug/r11から約3 00ug/mlまで、好適には約1100u/mlから約200ug/mlまで 、更により好適には約1100u/mlの量における希溶液で存在するであろう 。
一般的に、希溶液のpH値は、免疫化学的反応を最適化するまで調節されるだろ う。例えば、希溶液のpH値は、約5から約9.5、好適には約6から約8まで 、更により好適には約7.3に調節されて良い。希溶液のpfl値を調節するの に使用できる代表的緩衝システムは、上述されている。
希溶液はまた、特別な応用に合う各種の性質を提供する従来の配合成分で処方さ れて良い。これに制限されずに、このような配合成分は、防腐剤、溶液のイオン 強度を増大するための塩類、及び界面活性剤、酵母エキス、カゼイン、並びにウ シ血清アルブミンのような試験試料の非特異性結合を削減するための各種タンパ ク質を包含する。
希溶液中の伝播体タンパク質は、どの従来の方法においても、変性されて良い。
例えば、伝播体タンパク質は、変性剤(例えば、カオトロピック剤)を使用して 変性されて良く、又は還元、加熱により、又は界面活性剤により変性されて良い 。伝播体タンパク質を変性する方法は、当技術分野で周知である。
−変調製されれば、試験試料と変性伝播体タンパク質の希溶液との予備混合が、 広範囲の各種物質を分析するため、どの均−又は不均一酵素結合抗体免疫吸着ア ッセイも使用されて良い。
均一酵素結合抗体免疫吸着アッセイにおいて、希溶液中の試験試料の予備混合物 は、組換え融合タンパク質として付与される結合相手の既知量に対して、試験試 料と同じである酵素標識付は反応物の既知量と競合する。特定実施態様において 、本発明は、結合相手の間の反応における反応物である分析体を分析するための 酵素結合抗体免疫吸着アッセイに向けられ、この相手は、結合可能な物質と結合 物質からなり、酵素結合抗体免疫吸着アッセイは、次の諸工程からなる。
(a)組換え融合タンパク質として分析体の結合相手である第一反応物を付与し 、この融合タンパク質は、第一反応物の免疫学的活性を有する第一タンパク質と 、第一タンパク質に融合された伝播体タンパク質である第二タンパク質とからな り、 (b)酵素標識付けされた反応物である第二反応物を付与し、この酵素標識付け された反応物は、酵素に連結された分析体と同じである反応物からなり、(c) 有効量の変性伝播体タンパク質と共に分析体の溶液を形成することにより、分析 体の希溶液を調製して組換え融合タンパク質中の伝播体タンパク質に対して分析 体の結合を制限し、 (cl)工程(c)からの分析体の希溶液を、工程(a)からの組換え融合タン パク質反応物と工程(b)からの酵素−標識付けした反応物と反応させて反応混 合物を形成し、この酵素−標識付けした反応物は、既知量で存在し、かつ組換え 融合タンパク質は、分析体と酵素−標識付けした反応物との総量と反応するのに 不充分な既知量で存在し、次いで (e)反応混合物中に存在する分析体の量に直接的に比例する反応混合物の酵素 活性を分析する。
不均一酵素結合抗体免疫吸着アッセイにおいて、希溶液中の試験試料の予備混合 物は、組換え融合タンパク質として付与される固定化反応物と反応される。特定 実施態様において、本発明は、結合相手の間の反応における反応物である分析体 を分析するための酵素結合抗体免疫吸着アッセイに同けられ、この相手は、結合 可能な物質と結合物質からなり、酵素結合抗体免疫吸着アッセイは、次の諸工程 からなる: (a)組換え融合タンパク質として分析体の結合相手である第一反応物を付与し 、この融合タンパク質は、第一反応物の免疫学的活性を有する第一タンパク質と 、第一タンパク質に融合された伝播体タンパク質である第二タンパク質とからな り、 (b)固体組上の融合タンパク質を固定化するために、組換え融合タンパク質の 水溶液を固体用と接触させることにより、工程(a)からの組換え融合タンパク 質反応物を固定化し、 (c)工程(b)における固体用からの水溶液を分離して、固定化反応物を調製 し、 (d)酵素標識付けされた反応物である第二反応物を付与し、この酵素標識付け された反応物は、酵素に連結された分析体と同じである反応物からなり、(e) 有効量の変性伝播体タンパク質と共に分析体の溶液を形成することにより、分析 体の希溶液を調製して組換え融合タンパク質中の伝播体タンパク質に対して分析 体の結合を制限し、 (f)工程(e)からの分析体の希溶液を、工程(c)からの組換え融合タンパ ク質反応物と工程(d)からの酵素−標識付けした反応物と反応させて反応混合 物を形成し、この酵素−標識付けした反応物は、既知量で存在し、がっ組換え融 合タンパク質は、分析体と酵素−標識付けした反応物との総量と反応するのに不 充分な既知量で存在し、 (g)固定比相と液相を分離し、次いで(h)反応混合物中に存在する分析体の 量に逆比例する固定比相の酵素活性を分析する。
好適な実施態様において、不均一検定中の固定化反応物は、反応物を約0゜05 から約1.0までのイオン強度値を有する水溶液と混合し、次いで混合物を固体 用と接触させて固体組上の反応物を固定化することにより調製される。反応物溶 液のpH値は、免疫化学的反応を最適化するまで調節されて良い。
反応物混合物のイオン強度値は、固体用に対する反応物のイオン結合を最小化す るのに充分に高い値であり、それにより検定の後の段階の間のタンパク質浸出を 減少する。反応物混合物のイオン強度値はまた、タンパク質の溶解性に逆作用し ないように充分に低くされねばならなず、又はそれてなければ、固体用に対する 反応物の結合を妨げる。正確なイオン強度値は、反応物のタイプか固定化され、 かつ使用される固体用のタイプか反応物を固定化するような因子に支配される。
例えば、イオン強度値は、最終検定において望まれる結果を得る為に変化されて 良く、かつこのような変化は、適切でない実験を必要とせずに、当業者の能力の 範囲内にある。一般的に、固定化されるべき反応物の混合物のイオン強度値は、 約0.05から約1.0まで、好適には約0.1から約1まで、かつ更により好 適には約0.25から約1までである。約2から約5までのイオン強度値は、検 定の感度に対して負効果を有する傾向がある。
イオン強度は、電解液中のイオン間の平均静電相互作用の測定値である。
イオン強度工は、下記に設定するように、各々のイオン濃度にイオンの原子価の 二乗を掛けることにより得られる値の合計の半分に等しい。
、■=1721121′の合計 式中、ll11は各々のイオンのモル濃度、かつzlはイオンの原子価である。
例えば、塩化ナトリウム[NaC1]の1.0モル溶液のイオン強度は、次のよ うに計算される: I = 1/2(1,0X1)2+ 1/2(1,0)(1)2= 1硫酸アル ミニウム[A1□(SOn)3]の1.0モル溶液のイオン強度は、次のように 計算される I = 1/2(2,0)(3)2+ 1/2(3,0)(2)” = 15本 発明に有用な塩のタイプは、固体相に対して反応物の結合を妨げないで、又はそ れでなければ検定の感度に逆に作用しなしで反応物の混合物のイオン強度値を増 大できる塩である。使用される塩の正しいタイプは、固定化される反応物のタイ プと濃度、及び使用される固体相のタイプのような因子に支配される好みの事項 である。本発明で使用されて良い適切な塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金 属塩など、及びこれらの混合物からなる群から選択されて良い。好適な実施態様 において、塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及びこれらの混合物からなる 群から選択されて良い。更により好適な実施態様においで、塩は塩化すHラムで ある。塩は、固体形態で又は溶液形態で添加されて良い。
反応物が結合されかつ固定化される固体相は、一般的にこの目的で使用されるど の市場で入手可能な固体相であって良い。代表的固体相は、チューブ又は容器中 の固体相粒子のみならずマイクロウェルを包含する。一般的に、固体相は、イオ ン性と疎水性との相互作用力の組合せにより反応物を結合しかつ固定化するであ ろう材料から作られる。固体相に適切な材料は、ポリスチレン、スルホン化ポリ スチレン、照射した(修飾した)スルホン化ポリスチレン、ラテックス、及びこ れらの混合物からなる群から選択されるこれらのポリマーのような疎水性と親水 性との部位を有するポリマー材料である。
水性反応物の混合物は、反応物が固体組上に結合されかつ固定化されるのに充分 な時間の間固体相と接触される。一般的に、水性反応物の混合物は、周囲温度で 、約1時間から6時間までの間固体相と接触されるだろう。反応物の混合物が充 分時間の間固体相と接触された後、水性混合物は、吸引又はデカンテーションの ようなどんな従来の手段によっても固体相から分離されて、固定化反応物を調製 する。固体相を、任意的に、界面活性剤で洗浄して、どんな非固定化又は可溶性 の反応物も除去するのが良い。
固体相中の固定化反応物は、任意的に、結合相手の反応において、非反応物であ る過剰のタンパク質の水性溶液と処理されて良い。非反応物は、固体組上のどの 残留結合部位又は活性部位とも反応し又は飽和するであろうタンパク質であるが 、然し続いて起こる免疫アッセイ反応と反応したり又はそれを阻害しないだろう 。非反応物のタンパク質による固体相の処理は、固体相に対する分析体の非特異 性結合を防止するのに役立つ。適切な非反応物のタンパク質は、ウシ血清アルブ ミン(BSA)、ゲラチン、及び卵白アルブミンを包含する。
非反応物のタンパク質は、溶液ml当たり約111gから3鳳gまでの濃度にお いてのように、固体相中での総ての活性部位を結合するのに過剰量で存在するで あろう。次いで非反応物の水溶液は、固体相から分離され、次いで固体相は、乾 燥されて固定化反応物を調製する。
この実施態様において、検定は、競合検定又は抑制検定であって良い。競合検定 において、分析体の結合相手である反応物は、本発明の方法により固体相に固定 化される。次いで酵素接合体が、酵素と分析体と同じ化学構造を有する反応物と 共役することにより調製される。次いで分析体は、既知量の酵素接合体と混合さ れ、次いで既知量の固定化反応物と反応されて固定比相と液相を有する反応混合 物を形成する。分析体と酵素接合体は、制限量の固定化反応物と競合する。既知 制限量の固定化反応物は、総ての分析体と酵素接合体と反応するのに充分でない 量に相半する。次いで固定比相と液相とを分離する。固定比相の酵素活性は、分 析体の量に逆比例する。
阻害検定において、分析体と同じである反応物は、本発明の方法により固体相中 で固定化される。次いで酵素接合体は、酵素と分析体の結合相手である反応物を 共役することにより調製される。次いで分析体を既知量の固定化反応物と混合し 、次いで既知制限量の酵素接合体と反応させて固定比相と液相を有する反応混合 物を形成する。分析体と固定化反応物は、制限量の酵素接合体と競合する。既知 制限量の酵素接合体は、総ての分析体と固定化反応物と反応するのに充分でない 量に相当する。次いで固定比相と液相を分離する。固定比相の酵素活性は、分析 体の量に逆比例する。
酵素接合体は、酵素結合抗体免疫吸着アッセイと酵素における反応物の共役牛銭 物である。酵素は、阻害しない、又は免疫化学的化学反応により作用されないど の酵素であっても良い。酵素の正しい選択は、酵素接合体の合成の容易さ、酵素 の特定結合活性(高い変換速度は、検定の特異性を高める)、及び酵素検定の単 純性のような因子に支配される。
酵素接合体に使用して良い適切な酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−グ ルクロニダーゼ、β−B−グルコシダーゼ、β−叶ガラクトシダーゼ、ウレアー ゼ、グルコース−オキシダーゼ、ガラクトース−オキシダーゼ、及びアルカリホ スファターゼのようなカタラーセ、ベルオキシダーからなる群から選択されて良 い。好適な実施態様において、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−D− ガラクトシダーセ、及びアルカリホスファターゼからなる群から選択されて良い 。更により好適な実施態様において、酵素は、西洋ワサビベルオキシダーセであ る。
酵素接合体の調製は、特定酵素と特定結合タンパク質の性質のような因子に支配 されるどの従来の方法によっても実施されて良い。酵素接合体は、カルボジイミ ド、ジイソシアネート、ゲルタールアルデヒド、及びビスージアゾベンシジンの ような試薬で調製されて良い。酵素接合体の調製は、タンパク質の結合性質又は 酵素の活性に重大に作用すべきでない。
固定化相中の酵素接合体の活性は、固定化酵素接合体を酵素基質と反応させ、次 いで変換速度又は酵素の活性を測定することにより測定されて良い。適切な酵素 基質は、1.2−フェニレンジアミン(オルソ−フェニレンジアミン)、2.2 −アジノビス(3−エチルベンゾチアプリン−6−スルホン酸)ジアンモニウム 塩(ABTS)、及び3.3’ 、 5.5−テトラメチルベンジジン(TIE )を包含する。酵素の活性は、分光測光、蛍光分析法、又は比色定量によるよう などの従来の方法によっても測定されて良い。
もう一つの実施態様において、本発明は、結合相手の間の反応における反応物で ある分析体を分析するためのサンドイッチ酵素結合抗体免疫吸着アッセイに向け られ、この相手は、結合可能な物質と結合物質とからなり、この酵素結合抗体免 疫吸着アッセイは次の諸工程からなる:(a)組換え融合タンパク質として分析 体の結合相手である第一反応物を付与し、この融合タンパク質は、第一反応物の 免疫学的活性を有する第一タンパク質と、第一タンパク質に融合された伝播体タ ンパク質である第二タンパク質とからなり、 (b)固体組上の融合タンパク質を固定化するために、組換え融合タンパク質の 水溶液を固体相と接触させることにより、工程(a)からの組換え融合タンパク 質反応物を固定化し、 (c)工程(b)における固体相からの水溶液を分離して、固定化反応物を調製 し、 (d)有効量の変性伝播体タンパク質と共に分析体の溶液を形成することにより 、分析体の希溶液を調製して組換え融合タンパク質中の伝播体タンパク質に対し て分析体の結合を制限し、 (e)工程(、f)からの分析体の希溶液を、工程(c)からの組換え融合タン パク雪反応物と反応させて第−固定比相と第一液相とを有する第一反応混合物を 形成し、この固定化反応物は、総ての分析体と反応するのに充分な量で存在し、 (f)第−固定比相と工程(e)における第一液相とを分離し、(g)酵素標識 付けされた反応物である第二反応物を付与し、この酵素標識付けされた反応物は 、酵素に連結された分析体に対する第二結合相手である反応物からなり、 (h)工程(f)からの第−固定比相と工程(g)からの酵素−標識付は反応物 を反応させて、第二固定比相と第二液相とを有する第二反応混合物を形成し、こ の酵素−[W付は反応物は、既知量で存在し、(1)工1(h)における第二固 定比相と第二液相を分離し、次いで(j)反応混合物中に存在する分析体の量に 直接的に比例する工程(i)における第二固定化生成相の酵素活性を分析する。
サンドイッチ検定は、直接サンドイッチ検定又は間接サントイブチ検定であって 良い。直接サンドイッチ検定において、抗原分析体に対して第一抗体であり、か つ組換え融合タンパク質として付与される反応物は、固体相中に固定化される。
次いで分析体は、過剰量の固定化反応物と反応されて第−固定比相と第一液相を 有する第一反応混合物を形成する。第−固定比相は、第一液相から分離される。
酵素接合体は、酵素と抗原分析体に特異的親和性を有する第二抗体とを共役する ことにより調製される。次いで固定化抗体反応物に結合される抗原分析体を含む 第−固定比相は、既知量の酵素接合体と反応されて第二固定比相と第二液相を有 する第二反応混合物を形成する。次いで第二固定比相は、第二液相から分離され る。固定比相の酵素活性は、分析体の量に直接比例する。
間接サントイブチ検定において、抗体分析体に対して第一抗体であり、かつ組換 え融合タンパク質として付与される反応物は、固体相中で固定化される。次いで 分析体は、過剰量の固定化反応物と反応されて第−固定比相と第一液相とを有す る第一反応混合物を形成する。第−固定比相は、第一液相から分離される。酵素 接合体は、酵素と第二結合タンパク質とを共役することにより抗体分析体に特異 的結合親和性を有して、抗種抗体として調製される。次いで固定化抗原反応物に 対して結合される抗体分析体を含む第−固定比相は、既知量の酵素接合体と反応 されて第二固定比相と第二液相とを有する第二反応混合物を形成する。次いて第 二固定化用は、第二液相から分離される。、固定比相の酵素活性は、分析体の量 に直接比例する。好適実施態様において、酵素結合抗体免疫吸着アッセイは間接 サンドイッチ検定である。
酵素と第二結合相手とを分析体へ共役することにより調製される、サンドイッチ 検定における既知量の酵素標識付は反応物は、酵素標識付は反応物を固体相に結 合する非特異性結合を最小化するであろう(負信号)、かつ酵素標識付は反応物 と分析体を含む第−固定比相との反応を最小化するであろう(正信号)の予め決 められた量である。酵素結合抗体免疫吸着アッセイにおける検定範囲は、極めて 広く、その理由は、分析体が、高い又は低い量で存在して良いからである。大過 剰の酵素標識付は反応物が、分析体が高い量で存在する場合、総ての分析体と酵 素標識付は反応物との反応に帰着するであろうが、しかし分析体が低い量で存在 する場合、酵素標識付は反応物と固体相との可成の非特異的結合に帰着するであ ろうことを条件にして、これにより検定の感度を減少する。一般的に、分析体が 低い量で存在する場合、総ての分析体の検出は、分析体が高い量で存在する場合 、総ての分析体の検出よりも重要である。従って、酵素標識付は反応物の既知量 は、非特異的結合を最小化し、かつ酵素標識付は反応物と分析体との反応を最小 化するであろう中間量である。酵素mW付は反応物の既知量は、分析体が低い量 で存在する場合、過剰量であり、かつ分析体が高い量で存在する場合、過剰量で なくて良い。
抗原分析体に対して特異的結合親和性を有する第二抗体、又は抗体分析体に対し て特異的結合親和性を有する第二結合タンパク質は、サンドイッチ検定において 第一結合相手と同じタンパク質であって良く、又は異なるタンパク質である第三 反応物であって良い。例えば、第三反応物は、ヒト抗体と反応するマウス抗種抗 体のような他の種からの抗体と反応する抗体である抗種抗体であって良い。好適 実施態様において、間接検定における第二特異的結合タンパク質は、抗種抗体で ある第三反応物である。
この出願を通して、各種文献が引用された。これらの文献における開示は、この 分野の技術状態をより充分に記載するために、この明細書に引用して組み込まれ ている。
本発明を次の実施例により更に説明するが、これは、特許請求の範囲の有効な範 囲を制限することを意図するものでない。実施例中の、及び明細書と特許請求の 範囲を通して、総ての部とパーセントは、他に特定しない限り、最終組成物の重 量に基づいている。
実施例 この実施例は、間接サントイブチ酵素結合抗体免疫吸着アッセイにおける本発明 の改善された方法を立証する。特別には、組換え融合タンパク質における伝播体 タンパク質(スーパーオキシドジスムターゼ)への試験試料(肝炎Cウィルスに 対する抗体)の結合が、試験試料を変性形態の伝播体タンパク質と予備混合する ことにより抑制された。
固定化抗原反応物溶液又は抗原被覆溶液を、次の組換えスーパーオキシドジスム ターゼ(SOD)融合タンパク質で作成した。
C−100−30,5ug/mm1−2u/m1C−220,4ug/mm1− 1u/m1C−200lug/mm1−2u/@l上g己量において、各々の融 合タンパク質を、1.OKの塩化ナトリウム、0.02%のナトリウムアジド、 0.0Of)05Xのフェノールレッド、及び10ug/mlのウシ血清アルブ ミンを含む0.0511[のホウ酸塩緩衝溶液(pH9,0)と混合した。
抗原C−100−3,C−22,及びC−200は、酵母中で抑制された肝炎C ウィルスのための組換えスーパーオキシドジスムターゼ融合タンパク質である。
融合タンパク質C−100−3は、公告された欧州特許出願第388.232号 公報に記載されている。融合タンパク質C−22とC−200の調製と精製は、 公告された欧州特許出願第388、232号公報の第29〜33頁に記載される 通りに実施される。欧州特許出願第388、232号公報の第17図を参照して 、融合タンパク質C−100−3のアミノ酸配列は、アミノ酸番号1569〜1 931であり、融合タンパク質C−22のアミノ酸配列は、アミノ酸番号2〜1 20であり、融合タンパク質C−200のアミノ酸配列は、アミノ酸番号119 2〜1930である。欧州特許出願第388.232号公報からの前記開示は、 明細書中に引用して組み込まれている。
イムロン−1(Immulon−1)マイクロウェルズ(スルホン化ポリスチレ ン、バージニア州、カンチリ、グイナテック社)を、前記抗原被覆溶液の各々の 200ulで被覆し、次いで室温で一晩I!iI’した。被覆溶液を、吸引によ りウェルから除去し、次いでウェルを、リン酸塩緩衝食塩水(PF3S)中のウ シ血清アルブミンで後被覆した。
リン酸塩緩衝食塩水(pH7,3)中の試料希溶液を、次の成分を有して調製し た。
チメロザール 0.02% 塩化ナトリウム 0.5M 変性スーパーオキシドジスムターゼ 3Qug/mm1−300u/111便利 には(100ug/mm1−200u/if)好適には(100ug/ml) トリトンX100 1% 酵母エキス 0.1%〜1% カゼイン 0.1X−LX ウシ血清アルブミン 1%〜3% 試料希溶液中のスーパーオキシドジスムターゼを、SOD(70mg/ml)の 溶液を尿素(420mg/ml)とジチオスレイトール(154mg/ml)と の溶液と混合することにより変性した。次いで得られた溶液を、約2時間、約6 0〜65℃まで加熱した。
洗浄緩衝溶液は、ニューシャーシー州、ラリタン、オルトダイアゴノシュティク スシステムズ社製造の商品名オルl−20X洗浄緩衝濃厚液の下に市場で入手可 能である。安定化タンパク質と共にリン酸塩緩衝食塩水(pH17,4)中の抗 ヒトIpG(モノクロナール)に共役された西洋ワサビペルオキシダーゼである 酵素接合体溶液は、ニューシャーシー州、ラリタン、オルトダイアゴノシュティ クスシステムズ社から市場で入手可能である。過酸化水素と共に、水中のオルト −フェニレンシアミン(OPD)である酵素基質は、基質緩衝(6ml)と混合 された錠剤としてニューシャーシー州、ラリタン、オルトダイアゴノシュティク スシステムズ社から市場で入手可能である。
酵素結合抗体免疫吸着アッセイを次のように実施した。20ul量の分析体、即 ち、試料(血清又は血漿)を、200ulの試料希溶液中に希釈し、次いで前記 抗原被覆マイクロウェルに添加した。マイクロウェルを、37℃で約1時間の間 保温した。次いで試料溶液を、吸引によりウェルがら除去し、次いで洗浄緩衝で 5回洗浄した。
200uL量の酵素接合体溶液を、マイクロウェルに添加し、次いでウェルを3 7℃で1時間の間保温した。次いで接合体溶液を、吸引によりウェルから除去し 、次いでウェルを洗浄緩衝で5回洗浄した。
200ul量の酵素基質溶液を、マイクロウェルに添加し、次いでウェルを室温 で30分の間保温した。次いで50u1の4N硫酸溶液をウェルに添加し、次い でウェルの光学密度(OD)を、49ON+1[で読み取った。反応性を、0. 400+ネガティブ対照光学密度の平均のカットオフで測定した。力γトオフで 又は以上での光学密度を有する試料を、肝炎Cウィルス抗体に対して反応性と見 なした。
変性してない(天然5OD)のスーパーオキシドジスムターゼを含まない(対照 )、及び過剰のスーパーオキシドジスムターゼを含む試料も調製した。検定結果 を下記表1で説明する。
表1 本 変性スーパーオキシドジスムターゼで処理しない場合、試料は、疑似正信号 を発生する。
第1表は、試験試料が変性試料2.4.10.及び11が、スーパーオキシドジ スムターゼで処理しない場合、疑似正信号を発生することを示している。スーパ ーオキシドジスムターゼ融合タンパク質に対する試料の反応により起こった疑似 正信号の番号は、変性したスーパーオキシドジスムターゼを含む試料中で抑制さ れた。疑似正イ貫号の番号は、スーパーオキシドジスムターゼを添加しない対照 中で、又は天然中スーパーオキシドジスムターゼを含む試料中で抑制されなかっ た。これらの試料は、試験試料中の変性したSODの存在が、組換え融合タンパ ク質中の伝播体タンパク質SODに対する試験試料の結合を抑制し、これにより 検定特異性を改善し、かつ検定感度を保持することを示している。
本発明は、特定実施態様に関して特に記載しているが、由業者は、本開示を考慮 して、本発明に基づいて多くの変化と改良今や可能であり、この変化と改良が、 本発明の精神と範囲からの離脱として見なされないことを理解するであろう。従 って、本発明は、次の特許請求の範囲の範囲と精神とによってのみ、広く解釈さ れかつ制限されるべきである。
要約書 本発明は、結合相手の間の反応における反応物である分析体を分析するための酵 素結合抗体免疫吸着アッセイにおいて、前記相手は、結合可能な物質と結合物質 とからなり、酵素結合抗体免疫吸着アッセイは:(a)組換え融合タンバグ質と して分析体の結合相手である第一反応物を付与し、この融合タンパク質は、第一 反応物の免疫学的活性を有する第一タンバグ質と、第一タンパク質に融合された 伝播体タンパク質である第二タンパク質とからなり、(b)酵素標識付けされた 反応物である第二反応物を付与し、この酵素標識付けされた反応物は、酵素に連 結された分析体と同じである反応物からなり、(c)有効量の変性伝播体タンパ ク質と共に分析体の溶液を形成することにより、分析体の希溶液を調製して組換 え融合タンパク質中の伝播体タンパク質に対して分析体の結合を制限し、(d) 工程(c)からの分析体の希溶液を、工程(a)からの組換え融合タンパク質反 応物と工程(b)からの酵素−標識付けした反応物と反応させて反応混合物を形 成し、この酵素−標識付けした反応物は、既知量で存在し、かつ組換え融合タン パク質は、分析体と酵素−標識付けした反応物との総量と反応するのに不充分な 既知量で存在し、次いで(e)反応混合物中に存在する分析体の量に直接的に比 例する反応混合物の酵素活性を分析する、これら諸工程からなることを特徴とす る酵素結合抗体免疫吸着アッセイに関するものである。
国際調査報告

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 1.結合相手の間の反応における反応物である分抗体を分抗するための酵素結合 抗体免疫吸着アッセイにおいて、前記相手は、結合可能な物質と結合物質とから なり、酵素結合抗体免疫吸着アッセイは:(a)組換え融合タンパク質として分 析体の結合相手である第一反応物を付与し、この融合タンパク質は、第一反応物 の免疫学的活性を有する第一タンパク質と、第一タンパク質に融合された伝播体 タンパク質である第二タンパク質とからなり、 (b)酵素標識付けされた反応物である第二反応物を付与し、この酵素標識付け された反応物は、酵素に連結された分析体と同じである反応物からなり、(c) 有効量の変性伝播体タンパク質と共に分析体の溶液を形成することにより、分析 体の希溶液を調製して組換え融合タンパク質中の伝播体タンパク質に対して分析 体の結合を制限し、 (d)工程(c)からの分析体の希溶液を、工程(a)からの組換え融合タンパ ク質反応物と工程(b)からの酵素−標識付けした反応物と反応させて反応混合 物を形成し、この酵素−標識付けした反応物は、既知量で存在し、かつ組換え融 合タンパク質は、分析体と酵素−標識付けした反応物との総量と反応するのに不 充分な既知量で存在し、次いで (e)反応混合物中に存在する分析体の量に直接的に比例する反応混合物の酵素 活性を分析する これら諸工程からなることを特徴とする酵素結合抗体免疫吸着アッセイ。
  2. 2.前記結合可能な物質が、肝炎Cウイルスとヒト免疫不全ウイルスからなる群 から選択される抗原である請求項1記載の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ。
  3. 3.工程(a)の伝播体タンパク質が、スーパーオキシドジスムターゼ、β−ガ ラクトシダーゼ、及びラクタマーゼからなる群から選択される請求項1記載の酵 素結合抗体免疫吸着アッセイ。
  4. 4.工程(a)の伝播体タンパク質が、スーパーオキシドジスムターゼである請 求項3記載の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ。
  5. 5.結合相手の間の反応における反応物である分析体を分析するための酵素結合 抗体免疫吸着アッセイにおいて、前記相手は、結合可能な物質と結合物質とから なり、酵素結合抗体免疫吸着アッセイは:(a)組換え融合タンパク質として分 析体の結合相手である第一反応物を付与し、この融合タンパク質は、第一反応物 の免疫学的活性を有する第一タンパク質と、第一タンパク質に融合された伝播体 タンパク質である第二タンパク質とからなり、 (b)固体相上の融合タンパク質を固定化するために、組換え融合タンパク質の 水溶液を固体相と接触させることにより、工程(a)からの組換え融合タンパク 質反応物を固定化し、 (c)工程(b)における固体相からの水溶液を分離して、固定化反応物を調製 し、 (d)酵素標識付けされた反応物である第二反応物を付与し、この酵素標識付け された反応物は、酵素に連結された分析体と同じである反応物からなり、(e) 有効量の変性伝播体タンパク質と共に分所体の溶液を形成することにより、分析 体の希溶液を調製して組換え融合タンパク質中の伝播体タンパク質に対して分析 体の結合を制限し、 (f)工程(e)からの分析体の希溶液を、工程(c)からの組換え融合タンパ ク質反応物と工程(d)からの酵素−標識付けした反応物と反応させて反応混合 物を形成し、この酵素−標識付けした反応物は、既知量で存在し、かつ組換え融 合タンパク質は、分所体と酵素−標識付けした反応物との総量と反応するのに不 充分な既知量で存在し、 (g)固定化相と液相を分離し、次いで(h)反応混合物中に存在する分析体の 量に逆比例する固定化相の酵素活性を分析する これら諸工程からなることを特徴とする酵素結合抗体免疫吸着アッセイ。
  6. 6.前記結合可能な物質が、肝炎Cウイルスとヒト免疫不全ウイルスからなる群 から選択される抗原である請求項5記載の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ。
  7. 7.工程(a)の伝播体タンパク質が、スーパーオキシドジスムターゼ、β−ガ ラクトシダーゼ、及びラクタマーゼからなる群から選択される請求項5記載の酵 素結合抗体免疫吸着アッセイ。
  8. 8.工程(b)の水溶液が、約0.05から約1.0までのイオン強度値を有す る請求項5記載の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ。
  9. 9.固体相が、ポリスチレン、スルホン化ポリスチレン、照射スルホン化ポリス チレン、及びラテックスからなる群から選択されるポリマーから作成される請求 項5記載の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ。
  10. 10.工程(i)工程(b)の固定化反応物を、固体相上の活性部位を被覆する 反応における未反応物であるタンパク質の水溶液と接触し、次いで(ii)固定 化反応物から前記水溶液を分離する、これら諸工程を更に含む請求項5記載の酵 素結合抗体免疫吸着アッセイ。
  11. 11.結合相手の間の反応における反応物である分析体を分析するための酵素結 合抗体免疫吸着アッセイにおいて、前記相手は、結合可能な物質と結合物質とか らなり、酵素結合抗体免疫吸着アッセイは:(a)組換え融合タンパク質として 分析体の結合相手である第一反応物を付帯し、この融合タンパク質は、第一反応 物の免疫学的活性を有する第一タンパク質と、第一タンパク質に融合された伝播 体タンパク質である第二タンパク質とからなり、 (b)固体相上の融合タンパク質を固定化するために、組換え融合タンパク質の 水溶液を固体相と接触させることにより、工程(a)からの組換え融合タンパク 質反応物を固定化し、 (c)工程(b)における固体相からの水溶液を分離して、固定化反応物を調製 し、 (d)有効量の変性伝播体タンパク質と共に分析体の溶液を形成することにより 、分所体の希溶液を調製して組換え融合タンパク質中の伝播体タンパク質に対し て分析体の結合を制限し、 (e)工程(d)からの分析体の希溶液を、工程(c)からの組換え融合タンパ ク質反応物と反応させて第一固定化相と第一液相とを有する第一反応混合物を形 成し、この固定化反応物は、総ての分析体と反応するのに充分な量で存在し、( f)第一固定化相と工程(e)における第一液相とを分離し、(g)酵素標識付 けされた反応物である第二反応物を付与し、この酵素標識付けされた反応物は、 酵素に連結された分所体に対する第二結合相手である反応物からなり、 (h)工程(f)からの第一固定化相と工程(g)からの酵素−標識付け反応物 を反応させて、第二固定化相と第二液相とを有する第二反応混合物を形成し、こ の酵素−標識付け反応物は、既知量で存在し、(i)工程(h)における第二固 定化相と第二液相を分離し、次いで(j)反応混合物中に存在する分析体の量に 直接的に比例する工程(i)における第二固定化生成相の酵素活性を分析するこ れら諸工程からなることを特徴とする酵素結合抗体免疫吸着アッセイ。
  12. 12.分析体が、抗体及び特定結合タンパク質からなる群から選択される結合物 質である請求項11記載の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ。
  13. 13.結合物質が、肝炎Cウイルス抗体とヒト免疫不全ウイルス抗体からなる群 から選択される抗体である請求項12記載の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ。
  14. 14.分析体が、抗原とハプテンからなる群から選択される結合可能物質である 請求項11記載の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ。
  15. 15.工程(a)の伝播体タンパク質が、スーバーオキシドジスムターゼ、β− ガラクトシダーゼ、及びラクタマーゼからなる群から選択される請求項11記載 の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ。
  16. 16.工程(b)の水溶液が、約0.05から約1までのイオン強度値を有する 請求項11記載の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ。
  17. 17.固体相が、ポリスチレン、スルホン化ポリスチレン、照射スルホン化ポリ スチレン、及びラテックスからなる群から選択されるポリマーから作成される請 求項11記載の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ。
  18. 18.工程(i)工程(b)の固定化反応物を、固体根上の活性部位を被覆する 反応における未反応物であるタンパク質の水溶液と接触し、次いで(ii)固定 化反応物から前記水溶液を分離する、これら諸工程を更に含む請求項11記載の 酵素結合抗体免疫吸着アツセイ。
  19. 19.工程(g)の分所体に対する第二結合相手が、工程(a)の反応物と異な る第三反応物であり、かつ抗種抗体である請求項11記載の酵素結合抗体免疫吸 着アッセイ。
  20. 20.工程(g)の分所体に対する第二結合相手が、工程(a)の反応物と同じ 物である請求項11記載の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ。
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