JPH07118264A

JPH07118264A - ピロリンカルボン酸誘導体の金属錯体及びその用途

Info

Publication number: JPH07118264A
Application number: JP26512893A
Authority: JP
Inventors: Hisami Matsunaga; 久美松永; Yukio Kimura; 行男木村; Chisako Itami; 千佐子伊丹
Original assignee: OSAKA GOSEI YUKI KAGAKU KENKYU; OSAKA GOSEI YUKI KAGAKU KENKYUSHO KK
Current assignee: OSAKA GOSEI YUKI KAGAKU KENKYU; OSAKA GOSEI YUKI KAGAKU KENKYUSHO KK
Priority date: 1993-10-22
Filing date: 1993-10-22
Publication date: 1995-05-09

Abstract

(57)【要約】【構成】２−（２−ピリジル）−１−ピロリン−５−
カルボン酸又はそのエステルもしくはそれらの塩と遷移
金属塩（但し、２価鉄の塩を除く）との反応生成物から
なるピロリンカルボン酸誘導体の金属錯体、及び２−
（２−ピリジル）−１−ピロリン−５−カルボン酸又は
そのエステルもしくはそれらの塩と遷移金属塩との反応
生成物からなるピロリンカルボン酸誘導体の金属錯体を
有効成分として含有してなるスーパーオキシドジスムタ
ーゼ様作用組成物。【効果】本発明の金属錯体は、水に溶けやすく、強力
なＳＯＤ様活性を有する。従って、取り扱いが容易であ
り、活性酸素が関与すると考えられる各種疾患の予防又
は治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ピロリンカルボン酸誘
導体の金属錯体及びその用途に関する。より詳細には、
本発明は、強力なスーパーオキシドジスムターゼ様活性
を有する２−（２−ピリジル）−１−ピロリン−５−カ
ルボン酸又はそのエステルと遷移金属イオンとの金属錯
体に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−２−（２−ピリジル）−１−ピロリ
ン−５−カルボン酸は、シマン(Shiman)とニーランズ(N
eilands)によってピリミンと命名された公知の化合物で
あり、この化合物は、ハイルブキング(Heilbking) とヴ
ィスコンチニ(Viscontini)がプロフェロロサミンと命名
したものや、ファイスナー(Feistner)らがプロフェロロ
サミンＡと命名したものと同一の化合物である。

【０００３】また、２価鉄に３モルのピリミンが配位し
て形成された金属錯体は、赤紫色色素として公知であ
る。２価鉄に３モルのＤ−２−（２−ピリジル）−１−
ピロリン−５−カルボン酸が配位して形成された金属錯
体も、ネオプルプラチンという名称で公知の赤紫色色素
である。ネオプルプラチンに関しては、食用色素として
の基礎的諸性質（例えば、溶解性、ｐＨ安定性、熱安定
性等）及び安全性等が検討されており、マウスの雄性に
よる急性毒性試験を経口及び静脈内投与で行った結果
は、７日間判定で経口の場合のＬＤ₅₀値は１０ｇ／kg以
上、静脈内投与の場合のＬＤ₅₀値は3.141mg/kgであり、
突然変異誘発性試験を行った結果は、エイムス試験にお
いて突然変異誘発を認めず、Ｓ−９添加による代謝活性
化試験においても陰性であったと報告されている（「微
生物の産生する赤紫色物質ネオプルプラチンの食用色素
としての評価」日本食品工業学会誌30巻、５号、270〜2
75頁、1983年参照）。

【０００４】しかしながら、ネオプルプラチンがスーパ
ーオキシド様活性を有することに関する報告はなされて
いない。活性酸素とは、大気中の通常の酸素よりも活性
な状態にある酸素種のことをいい、酸素分子にさらに１
個の電子が入ったスーパーオキシドアニオン（Ｏ₂ ^-）、
酸素分子の２個の不対電子が対をなして一方の酸素原子
のπ軌道に入り、他方の軌道が空になった一重項酸素（
¹Ｏ₂）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、過酸化水素
（Ｈ₂Ｏ₂）及び種々の酸素ラジカルがある。

【０００５】生体は、これらの活性酸素により生じる障
害に対して、極めて優れた防御システムを構築して自ら
を守っている。これらの防御システムの１つとして、生
体内において何らかの酸化反応や酸素添加反応によって
生じたこれらの活性酸素は、細胞内外に存在する低分子
・高分子ラジカルスカベンジャーにより消去される。こ
のような生体内ラジカルスカベンジャーには、例えばス
ーパーオキシドジスムターゼ（以下、ＳＯＤと略す）、
α−トコフェロール、カタラーゼ、グルタチオン−ペル
オキシダーゼ及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ
等がある。

【０００６】しかしながら、虚血−再灌流あるいは炎症
等により浸潤した白血球の呼吸爆発等によって大量の活
性酸素が発生した場合、生体内の活性酸素消去能では処
理できなくなり、その結果蓄積した活性酸素は、生体膜
及び組織を攻撃して種々の反応を起こしてそれらを傷害
し、病的状態を引き起こすものと考えられている。攻撃
されるものは一般に脂質、糖、蛋白質及び核酸であり、
脂質及び糖の過酸化、蛋白質の変性、酵素の不活性化、
ＤＮＡ鎖の切断、及び核酸塩基の修飾等が起こる。一
方、活性酸素は殺菌及び制ガン的にも働き、生体に有益
な一面も有している。このように、活性酸素は種々の疾
患の発症・進展に深く関わっていることが知られてい
る。

【０００７】そこで、過剰の活性酸素の攻撃から生体を
守るために、ラジカルスカベンジャーを医薬として用い
ることが考えられており、ラジカルスカベンジャーとし
て作用する（即ち、ＳＯＤ様活性を有する）低分子化合
物や高分子化合物の研究・開発が進められている。ＳＯ
Ｄ様活性を有する低分子化合物としては、例えば脳及び
心臓の虚血性疾患領域で開発中のエブセレン；脳代謝改
善作用を有し、脳代謝・精神症状改善剤として臨床使用
されているイデベノン；アスコルビン酸誘導体；及び動
脈硬化症及び高脂質血症等の治療剤として臨床使用され
ているプロブコール等が知られている。また、種々の非
ステロイド性抗炎症剤（例えば、ピロキシカム及びケト
プロフェン等）がヒト末梢血好中球でのスーパーオキシ
ド産生を抑制することが報告されている。最近では、抗
リウマチ剤として臨床使用されているスルファサラジン
においても、抗リウマチ作用の１つとして抗酸化作用が
提唱されている。

【０００８】更に、ＳＯＤ様活性を有する低分子化合物
として、近年、デスフェリオキサミン(Desferrioxamin
e) −マンガン錯体〔フリドビィチ(Fridovich）ら、Ach
iv. of Biochem. and Biophys., 271, 149-156, 1989
〕、テトラキス−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−（２−ピリジ
ルメチル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）−鉄（II）錯
体（長野ら、J. Biol. Chem., 244, 6049-6055, 1989)
、及びセイレン(Salen) −マンガン錯体〔ブドリ−(Bu
dry）ら、Biochem. Biophys. Res. Comun., 192, 964-9
68, 1993 〕が報告されている。

【０００９】ＳＯＤ様活性を有する高分子化合物として
は、ヒトあるいはウシ由来の種々のＳＯＤ製剤が開発さ
れている。これらのＳＯＤ製剤は、心虚血性疾患、リウ
マチ及び膝の変形性関節症の治療剤として用いられてい
る。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ＳＯＤ
製剤には、ＳＯＤが蛋白であるために、そのままでは経
口投与できず、静脈内投与した場合においては、その分
子量(16000×２）が小さいために腎で糸球体濾過されて
血中濃度が速やかに低下し（半減期が数分）、生体内で
有効な抗酸化作用を発現できない等の問題点がある。

【００１１】そこで、ＳＯＤ製剤を局所投与したり、血
中半減期を延長すべくＳＯＤを化学修飾すること等が試
みられているが、それによって活性が低下したり、絶体
的な化学構造が不明になる等の問題点が残されている。
また、ＳＯＤ製剤には、それが例えばウシ由来のような
ヒトと異種のものに由来するときアレルギー発現の可能
性を完全には否定できず、高分子に由来する副作用があ
ることや、ヒト由来のＳＯＤにおいては薬効が弱い等の
問題点もある。

【００１２】一方、ＳＯＤ様活性を有する公知の低分子
化合物においては、何れも水にやや難溶性であり、その
モル当たりのＳＯＤ様活性も天然のＳＯＤに比べると低
い等の問題点がある。ＳＯＤ様活性を有する化合物は、
活性酸素が関与していると考えられる各種疾患の予防又
は治療に有用であるために、モル当たりのＳＯＤ様活性
がより強く、水に易溶である化合物の開発が望まれてい
る。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を鑑み鋭意研究を重ねた結果、優れたＳＯＤ様活性を
有し、かつ水に易溶性である、２−（２−ピリジル）−
１−ピロリン−５−カルボン酸又はそのエステルと遷移
金属イオンとの金属錯体を見い出し、本発明を完成する
に至った。

【００１４】本発明によれば、２−（２−ピリジル）−
１−ピロリン−５−カルボン酸又はそのエステルもしく
はそれらの塩と遷移金属塩（但し、２価鉄の塩を除く）
との反応生成物からなるピロリンカルボン酸誘導体の金
属錯体が提供される。また、本発明によれば、２−（２
−ピリジル）−１−ピロリン−５−カルボン酸又はその
エステルもしくはそれらの塩と遷移金属塩との反応生成
物からなるピロリンカルボン酸誘導体の金属錯体を有効
成分として含有してなるスーパーオキシドジスムターゼ
様作用組成物が提供される。

【００１５】２−（２−ピリジル）−１−ピロリン−５
−カルボン酸（以下、ＰＰＣと略す）又はそのエステル
にはＤ型及びＬ型の２種の光学活性体が存在し、本発明
には、これらの光学活性体やラセミ混合物と遷移金属イ
オンとの金属錯体も包含される。本発明の金属錯体は、
遷移金属イオンに対する２−（２−ピリジル）−１−ピ
ロリン−５−カルボン酸又はそのエステルの配位数が異
なる２種以上の金属錯体の混合物であってもよく、遷移
金属イオンが異なる２種以上の金属錯体の混合物であっ
てもよい。

【００１６】本発明の２−（２−ピリジル）−１−ピロ
リン−５−カルボン酸のエステルの好ましい例として
は、酸素原子が介在していてもよい脂肪族炭化水素ある
いは芳香族炭化水素の水素原子を水酸基で置換したアル
コールから誘導されるエステルが挙げられる。本発明に
おけるＰＰＣ又はそのエステルの塩としては、例えばア
ルカリ金属塩（例えばリチウム、カリウム、ナトリウム
等）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム、カル
シウム等）、無機塩（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫
酸塩、硝酸塩、リン酸塩等）、及び有機塩（例えば酢酸
塩、酒石酸塩、クエン酸塩、フマール酸塩、マレイン酸
塩、トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩等）が
挙げられる。

【００１７】本発明における遷移金属塩としては、ＰＰ
Ｃ又はそのエステルと錯体を形成しうる遷移金属の塩
で、かつ水性媒体中で所望の遷移金属イオンを放出しう
る塩であれば、特に限定されない。遷移金属塩の好まし
い例としては、例えば硫酸鉄（ＦｅＳＯ₄）、塩化第二
鉄（ＦｅＣｌ₃）、硫酸銅（ＣｕＳＯ₄）、塩化第一銅
（ＣｕＣｌ）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ₂）、塩化コバ
ルト（ＣｏＣｌ₂）、硫酸ニッケル（ＮｉＳＯ₄）、塩化
亜鉛（ＺｎＣｌ₂）等が挙げられる。これらの遷移金属
塩は、無水物であってもよく、水和物であってもよい。

【００１８】本発明の金属錯体は、一般には、下記一般
式（Ｉ）

【００１９】

【化２】〔式中、Ｒは水素原子、又は酸素原子が介在していても
よい脂肪族炭化水素残基あるいは芳香族炭化水素残基
を、Ｍｅは遷移金属イオン（但し、２価鉄の塩を除く）
を、ｎは１〜４の整数を、ｍは２〜６の整数を示す〕で
表わされる金属錯体からなる。

【００２０】一般式（Ｉ）の各定義において、詳細は次
の通りである。まず、Ｒの定義を詳細に説明する。「酸
素原子が介在していてもよい脂肪族炭化水素残基」にお
ける脂肪族炭化水素残基の好ましい例としては、アルキ
ル基、アルケニル基及びシクロアルキル基等が挙げられ
る。また、これらの脂肪族炭化水素残基は、酸素原子が
介在していてもよい。酸素原子が介在している脂肪族炭
化水素残基の好ましい例としては、アルキルオキシアル
キル基、アシルオキシアルキル基等が挙げられる。

【００２１】上記「アルキル基」の好ましい例として
は、直鎖状もしくは分枝鎖状の炭素数１〜８を有するア
ルキル基が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、プ
ロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチ
ル、tert−ブチル、ｎ−アミル、イソアミル、ヘキシ
ル、ヘプチル、オクチル等が挙げられる。上記「アルケ
ニル基」の好ましい例としては、１個の二重結合を含有
する直鎖状もしくは分枝鎖状の炭素数２〜８を有するア
ルケニル基が挙げられ、具体的には、ビニル、プロペニ
ル（例えばアリル等）、ブテニル、メチルプロペニル、
ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル等が
挙げられる。

【００２２】上記「シクロアルキル基」の好ましい例と
しては、炭素数３〜８を有するシクロアルキル基が挙げ
られ、具体的には、シクロプロピル、シクロブチル、シ
クロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シク
ロオクチル等が挙げられる。上記「アルキルオキシアル
キル基」の好ましい例としては、例えばメトキシエチ
ル、エトキシメチル、プロピルオキシメチル、ブチルオ
キシメチル、ペンチルオキシメチル、ヘキシルオキシメ
チル等が挙げられる。

【００２３】上記「アシルオキシアルキル基」の好まし
い例としては、例えばピバロイルオキシメチル、アセト
キシメチル等が挙げられる。「芳香族炭化水素残基」の
好ましい例としては、炭素数６〜12を有するアリール基
及びアラルキル基等が挙げられる。上記「アリール基」
の好ましい例としては、例えばフェニル、トリル、キシ
リル、クメニル、メシチル、ビフェニリル、ナフチル等
が挙げられる。

【００２４】上記「アラルキル基」の好ましい例として
は、例えばベンジル、フェネチル等が挙げられる。これ
らの基は、生体内で無毒性であるのが好ましい。一般式
（Ｉ）の定義中、Ｒとしては、水素原子及び低級アルキ
ル基（炭素数１〜８を有するアルキル基）が好ましく、
それらのなかで、水素原子及びメチル基が特に好まし
い。

【００２５】次に、一般式（Ｉ）のＭｅで示される遷移
金属イオンの好ましい例としては、１価の銅イオン、２
価の銅イオン、２価のマンガンイオン、４価のマンガン
イオン、２価のニッケルイオン、２価のコバルトイオ
ン、２価の亜鉛イオン及び３価の鉄イオン等が挙げられ
る。これらの遷移金属イオンうち、１価の銅イオン、２
価の銅イオン、３価の鉄イオンが特に好ましい。

【００２６】本発明における金属錯体は、以下のように
して形成さすことができる。まず、ＰＰＣは、公知の方
法、例えばシマンらの方法（Biochemistry,4, 2233-223
6,1965）に従って、ピコリン酸メチルとＮ−トリチル−
Ｌ−グルタミン酸メチルをクライゼン縮合する方法等に
よって化学的に合成することができる。また、ＰＰＣ
は、ピリミンの金属錯体を生産する公知の菌株（例え
ば、Biosci. Biotech. Biochem., 57, 495-496, 1993及
びPeptide Chemistry 1992 ,589-592 ，1993参照）から
得ることもできる。

【００２７】ＰＰＣのエステル体は、例えばブレンナー
(Brenner) とフッバー(Hubber)の方法（M. Brenner及び
W. Hubber、Helv. Chim. Acta., 36, 1109, 1953）に
従って、ＰＰＣを、そのエステル体を形成さすのに用い
るアルコールに懸濁し、その懸濁液に塩化チオニルを添
加する方法等によって合成することができる。このよう
にして合成されたＰＰＣのエステル体は、例えば逆相高
速液体クロマトグラフィー〔カラム：YMC-Pack ODS SH-
343、移動相：メタノール／水（90/10)〕によって精製
することができる。上記のようにして合成されたＰＰＣ
又はそのエステルは、所望により、当該分野で一般的に
用いられている常法に従って、その塩に変換することが
できる。

【００２８】この発明の金属錯体は、ＰＰＣ又はそのエ
ステルもしくはそれらの塩と遷移金属塩とを、水性媒体
中で混合することによって形成さすことができる。具体
的には、例えば水性媒体中に予めＰＰＣ又はそのエステ
ルもしくはそれらの塩を溶解させて、その溶液に固体の
遷移金属塩又は固体の遷移金属塩を水性媒体に溶解させ
た溶液を加えて混合する方法や、あるいは上記のような
固体の遷移金属塩又は固体の遷移金属塩を水性媒体に溶
解させた溶液に、ＰＰＣ又はそのエステルもしくはそれ
らの塩を水性媒体に溶解させた溶液を加えて混合する方
法等がある。

【００２９】水性媒体としては、例えば水、ｐＨ２〜８
の緩衝液、水と水溶性有機溶媒との混合液等が挙げられ
る。使用する水溶性有機溶媒としては、ＰＰＣのエステ
ルを溶解することができる水溶性有機溶媒であれば特に
限定されない。水溶性有機溶媒の好ましい例としてはア
ルコールが挙げられ、アルコールの好ましい例として
は、メタノール、エタノール、プロパノール等が挙げら
れる。また、水と混合する水溶性有機溶媒の量は、混合
液の総容量に対して約５〜５０％（Ｖ／Ｖ）が適切であ
り、約１０％（Ｖ／Ｖ）が好ましい。

【００３０】使用するｐＨ２〜８の緩衝液の好ましい例
としては、例えばリン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、
トリス塩酸塩緩衝液等が挙げらる。ＰＰＣ又はそのエス
テルもしくはそれらの塩が水に難溶性である場合には、
予め少量の水溶性有機溶媒に溶解させ、それを水又はｐ
Ｈ２〜８の緩衝液等に加えるのが好ましい。

【００３１】また、遷移金属塩が水性媒体に難溶性の場
合には、固体の遷移金属塩を直接ＰＰＣ又はそのエステ
ルもしくはそれらの塩の溶液（以下、ＰＰＣ溶液と略
す）に加えることができ、混合後、完全に遷移金属塩が
溶解するまで攪拌することが必要である。遷移金属塩が
水性媒体に溶けやすい場合には、固体の遷移金属塩を直
接ＰＰＣ溶液に加えてもよく、遷移金属塩を水性媒体に
溶解させた溶液をＰＰＣ溶液に加えてもよい。

【００３２】上記反応における反応温度としては、約５
〜５０℃が適切であり、約２０〜３０℃が好ましい。反
応時間としては、約２時間以上が適切であり、約１５〜
２０時間が好ましい。使用する遷移金属塩としては、前
述のように、錯体を形成させる遷移金属の塩であれば特
に限定されない。水性媒体中におけるＰＰＣ又はそのエ
ステルの濃度としては、約５０ｍＭ以上が適切であり、
約１００〜２００ｍＭが好ましい。また、水性媒体中に
おける遷移金属塩の濃度としては約５０〜３００ｍＭが
適切であり、約１００〜２００ｍＭが好ましい。

【００３３】水性媒体中におけるＰＰＣ又はそのエステ
ルと遷移金属塩との混合割合は、一般的には形成させる
金属錯体のモル比であり、遷移金属塩を過剰量混合して
もよい。金属錯体の形成は、例えば色、紫外吸収スペク
トル及び逆相高速液体クロマトグラフィー〔カラム：YM
C-Pack ODS AM-312、移動相：メタノール／水(5/95)〕
等によって確認することができる。即ち、例えば２価又
は３価の鉄イオンにおいては、錯体が形成されると無色
の混合液がその錯体固有の赤紫色に着色するので、その
呈色によって金属錯体の形成を確認することができる。
また、一般に金属イオンは紫外領域にほとんど吸収を持
たないので、ＰＰＣの紫外吸収スペクトルのパターンと
異なる紫外吸収スペクトルのパターンが得られることに
よって、金属錯体の形成を確認することができる。更に
は、高速液体クロマトグラフィーで分析して、その保持
時間が、ＰＰＣの保持時間と異なること（一般的に、金
属錯体が形成されると、その保持時間は短くなる）によ
って確認することができる。

【００３４】形成された金属錯体は、例えば、反応液を
そのまま凍結乾燥し、逆相高速液体クロマトグラフィー
〔カラム：YMC-Pack ODS SH-343、移動相：メタノール
／水(0.5/99.5)、波長：210ｎｍ〕に負荷することによ
って主成分を分取し、さらにそれを凍結乾燥する方法等
によって、非結晶性粉末状の金属錯体として得ることが
できる。

【００３５】このようにして形成された金属錯体は、遷
移金属イオンに対するＰＰＣ又はそのエステルの配位数
が異なる２種以上の金属錯体の混合物である場合もあ
る。本発明の金属錯体は、水に溶けやすく、強力なＳＯ
Ｄ様活性を有し、活性酸素が関与する各種疾患の予防又
は治療に有効である。また、本発明者らは、２−（２−
ピリジル）−１−ピロリン−５−カルボン酸又はそのエ
ステルと２価の鉄イオンとの金属錯体が強力なＳＯＤ様
活性を有することを見い出しており、これも本発明にお
けるＳＯＤ様作用組成物の有効成分として好ましい活性
化合物の１つである。

【００３６】本発明の金属錯体を有効成分として含有し
てなるＳＯＤ様作用組成物は、ヒト等の哺乳動物に経口
的又は非経口的に投与することができる。経口投与する
場合の剤形の例としては、例えばＳ錠剤（糖衣錠、フィ
ルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カ
プセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳
剤、懸濁剤等が挙げられる。また、非経口投与する場合
の剤形の例としては、例えば注射剤、注入剤、点滴剤、
坐剤等が挙げられる。

【００３７】本発明の金属錯体を上記の剤形に製造する
方法としては、当該分野で一般的に用いられている公知
の製造方法を適用することができる。また、上記の剤形
に製造する場合には、必要に応じて、その剤形に製する
際に製剤分野において通常用いられる賦形剤、結合剤、
崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、界面活性剤、懸濁化剤、乳化
剤等を含有させて製造することができる。更に、本発明
の金属錯体を上記の剤形に製造する場合には、所望によ
り、製剤分野において通常用いられる着色剤、保存剤、
芳香剤、矯味剤、安定剤、粘稠剤等を添加することがで
きる。

【００３８】本発明の金属錯体は、安定かつ低毒性で安
全に使用することができる。その一日の投与量は患者の
状態や体重、遷移金属錯体の種類、投与経路等によって
異なるが、例えば経口投与の場合には、成人１日当たり
の投与量は約 0.1〜２mgが適切であり、約 0.5〜0.6mg
が好ましい。また、静脈注射する場合には、成人１日当
たりの投与量は約0.02〜0.4mg が適切であり、約 0.1〜
0.2mg が好ましい。上記の投与量の範囲では、毒性は見
られない。

【００３９】以下実施例、試験例を示して、本発明をよ
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではないことはいうまでもない。

【００４０】

【実施例】

実施例１ＰＰＣの合成シマンらの方法に従って、以下のようにしてＰＰＣを合
成した。Ｌ−グルタミン酸ジメチルエステルの合成ブレンナーとフッバーの方法に従い、冷却したメタノー
ル（85ml）中に塩化チオニル（20ml）を加えてよく混和
後、Ｌ−グルタミン酸（5.9g）を加え、室温で15時間撹
拌した。反応液を濃縮後エーテルを滴下し、結晶化し
た。さらにアセトンで再結晶し、Ｌ−グルタミン酸ジメ
チルエステル（7.6g）を得た（収率：89.9％）。Ｌ−グルタミン酸ジメチルエステルのトリチル化ゼルバス（Zelvas）とセオドロポーラス（Theodoropoul
ous)の方法に従い、Ｌ−グルタミン酸ジメチルエステル
（6.3g）を乾燥クロロホルム（50ml）に溶解し、トリエ
チルアミン（7.9g）及び塩化トリチル（10.0g)を加え、
室温で６時間振とうした。反応液は水で２回洗浄し乾燥
した。メタノールで再結晶し、Ｎ−トリチル−Ｌ−グル
タミン酸ジメチルエステル（9.8g）を得た（収率：66.2
％）。ＰＰＣの合成ピコリン酸メチルエステル（12.5g)、乾燥ブチルエーテ
ル（3.6ml)及び水素化ナトリウム（3.6g）を加え、窒素
ガス存在中100℃で撹拌した。Ｎ−トリチル−Ｌ−グル
タミン酸ジメチルエステル（9.8g）は、乾燥ブチルエー
テル（30ml）に溶解して徐々に滴下後、１時間撹拌し
た。反応終了後、沈澱はブチルエーテルに溶解し、氷水
を加えて水素化ナトリウムを分解し、さらにブチルエー
テルを加えて副反応物を除き、水層を６Ｎ塩酸でｐＨ７
に調整後、クロロホルムで抽出し、このクロロホルム溶
液に３Ｎ塩酸を加え、２時間還流を続けた。反応液は同
量のベンジルアルコールで副反応物を抽出除去し、水層
を濃縮した。塩酸を加えてアセトンにより結晶化を行
い、粗製ＰＰＣ（1.0g）を得た（収率：20％）。ＰＰＣの精製粗製ＰＰＣは、陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー
（カラム：バイオラド、AG 50W-X4、移動相：水→３Ｎ
塩酸）及び逆相クロマトグラフィー（カラム：YMC-Pack
AM-324-10、移動相：0.01 N 塩酸含有５％メタノー
ル）により分離、精製した。

【００４１】金属錯体混合物の合成上記の方法を繰り返して十分な量のＰＰＣを合成し、Ｐ
ＰＣを塩酸塩に変換した。得られたＰＰＣの塩酸塩と表
１に示される各種の金属塩を用いて、金属錯体混合物を
形成した。まず、表１に示された量のＰＰＣ塩酸塩を水
２mlに溶解し、その水溶液に、金属塩としてＣｕＣｌを
用いる場合にはＣｕＣｌの粉末を加え、他の金属塩を用
いる場合にはその水溶液を加えて混合した。これに、さ
らに水７mlを加えて室温で２時間放置した。金属塩の使
用量は表１に示された通りであり、金属塩の水溶液を加
える場合には、表１に示された量の金属塩を水１mlに溶
解した水溶液を加えた。ＣｕＣｌの粉末は、ＰＰＣ水溶
液に添加した後直ちに溶解した。ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを
用いたときには混合後瞬時に混合液の色が赤紫色とな
り、ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏを用いたときには、混合後約１
０分後から次第に混合液の色が赤紫色に変わり、２時間
の放置後、着色は一定となった。ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ及
びＣｕＣｌを用いたときには、混合液の色が薄青色に呈
色した。２時間の放置後、各混合液の紫外吸収スペクト
ルを測定し、その結果を図２〜９に示す。

【００４２】図２は、ＰＰＣとＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏとか
ら形成された金属錯体の紫外吸収スペクトルを示す。図
３は、ＰＰＣとＣｕＣｌとから形成された金属錯体の紫
外吸収スペクトルを示す。図４は、ＰＰＣとＭｎＳＯ₄
・５Ｈ₂Ｏとから形成された金属錯体の紫外吸収スペク
トルを示す。

【００４３】図５は、ＰＰＣとＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏとか
ら形成された金属錯体の紫外吸収スペクトルを示す。図
６は、ＰＰＣとＮｉＳＯ₄・６Ｈ₂Ｏとから形成された金
属錯体の紫外吸収スペクトルを示す。図７は、ＰＰＣと
ＺｎＣｌ₂とから形成された金属錯体の紫外吸収スペク
トルを示す。

【００４４】図８は、ＰＰＣとＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏとか
ら形成された金属錯体の紫外吸収スペクトルを示す。図
９は、ＰＰＣとＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏとから形成された金
属錯体の紫外吸収スペクトルを示す（過剰のＦｅＣｌ₃
・６Ｈ₂Ｏ）。また、対照として、ＰＰＣ水溶液の紫外
吸収スペクトルを測定し、図１にその結果を示す。な
お、使用した金属塩は、紫外領域にほとんど吸収を持た
ない。

【００４５】

【表１】

【００４６】図１〜９から、ＰＰＣ塩酸塩と各金属塩と
を混合した後の混合液の紫外吸収スペクトルは、ＰＰＣ
水溶液の紫外吸収スペクトルと異なる吸収パターンを示
すことが明らかである。従って、そのスペクトルの形状
の変化によって、金属錯体が形成されたことが確認され
た。また、鉄イオン又は銅イオンのように、錯体を形成
することによって着色するものに関しては、その着色に
よっても錯体の形成が確認された。

【００４７】また、ＰＰＣ塩酸塩とＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
とを混合した混合液を高速液体クロマトグラフィー〔カ
ラム：Asahipak HIKARISIL-C18、移動相：２％メタノー
ル、波長：278nm、流速：0.5ml/min〕で分析し、その結
果を図１１に示す。対照として、ＰＰＣ水溶液を同様に
高速液体クロマトグラフィーで分析し、図１０にその結
果を示す。

【００４８】図１０及び１１から、ＰＰＣよりも保持時
間の短いＰＰＣ−鉄（II）錯体の形成が確認された。次
に、各混合液を凍結乾燥し、500μｌの水に溶解して高
速液体クロマトグラフィー〔カラム：YMC-Pack ODS SH-
343、移動相：メタノール／水(0.5/99.5)〕に負荷して
主成分を分取し、これを凍結乾燥した。得られた粉末状
の金属錯体の収量は、表１に示された通りである。得ら
れたＰＰＣ−鉄（II）及びＰＰＣ−鉄（III)の粉末は赤
紫色で、ＰＰＣ−銅（Ｉ）及びＰＰＣ−銅（II）の粉末
は微青色であった。

【００４９】各粉末状の金属錯体の一定量を水に溶解し
て陽イオン交換樹脂〔バイオラド、AG 50W-X4 (3×280m
m)〕のＨ型に負荷し、１Ｍの塩酸及び３Ｍの塩酸で溶出
することによって、遷移金属イオンとＰＰＣを分離し
た。分離したＰＰＣをニンヒドリン比色法で、また分離
した遷移金属イオンを以下に示す方法でそれぞれ定量
し、ＰＰＣと金属イオンのモル比を算出した。その結果
は、表１に示された通りである。

【００５０】鉄イオン：ヒドロキシルアミン−ｏ−フェ
ナンスロリン法銅イオン：ヒドロキシルアミン−ネオクプロイン法マンガンイオン：ジフェニルチオカルバゾン法コバルトイオン：ジフェニルチオカルバゾン法ニッケルイオン：ジメチルグリオキシム法亜鉛イオン：ジフェニルチオカルバゾン法得られた赤紫色のＰＰＣ−鉄(III)粉末に関しては、紫
外及び可視の吸収スペクトルを測定し、その結果を図１
２に示す。図１２から、ＰＰＣ−鉄(III)が可視領域に
強い吸収を示すことがわかる。

【００５１】実施例２ＰＰＣ−メチルエステルの合成ＰＰＣのメチルエステルを、以下の方法を用いて合成し
た。メタノール（10ml）をマイナス10℃に冷却し、撹拌
しながら塩化チオニル（2.6ml）を徐々に加えた。10分
後、実施例１で合成したＰＰＣの塩酸塩（2.26g）を加
え、室温で15分間撹拌した。これを減圧濃縮し、残渣に
エーテルを加えて油状物質を得た。この油状物質を少量
のメタノールに溶解し、高速液体クロマトグラフィー
〔カラム：YMC-Pack ODS SH-343、移動相：メタノール
／水（90／10）〕に負荷して主成分を分取し、室温で減
圧下に濃縮、更に真空ポンプで３時間乾燥することによ
って、飴状のＰＰＣ−メチルエステル塩酸塩（1.90g）
を得た。

【００５２】本品をＴＬＣ〔プレート：メルクシリカ
ゲル60F₂₅₄、溶媒：ｎ−ブタノール／酢酸／水（４／１
／３）の上層に５％ピリジン添加〕で展開し、プレート
をＦｅＳＯ₄で呈色した。ＰＰＣ−メチルエステルのＲ
ｆ値は0.31（ＰＰＣのＲｆ値は0.09である）であった。

【００５３】金属錯体混合物の合成得られたＰＰＣ−メチルエステル塩酸塩（360mg）をメ
タノール（１ml）に溶解し、これにＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
（139mg）を溶解した水（２ml）を加え、さらに水（７m
l）を加えて撹拌した。すると混合液は瞬間的に赤紫色
を呈した。

【００５４】実施例１と同様に、高速液体クロマトグラ
フィー〔カラム：YMC-Pack ODS SH-343、移動相：メタ
ノール／水（60／40）〕に負荷して主成分を分取し、凍
結乾燥することによって、赤紫色の固体（280mg）を得
た。本品を実施例１と同様に処理してＰＰＣと鉄イオン
を分離し、ＰＰＣ及び鉄イオンを定量した結果、そのモ
ル比は３：１であった。本品の紫外吸収スペクトルを測
定し、その結果を図１３に示す。

【００５５】図１３から、本品の紫外吸収スペクトルが
ＰＰＣ単独のものと異なる吸収パターンを示したことに
よって、ＰＰＣ−メチルエステルと鉄（II）との錯体の
形成が確認された。

【００５６】試験例１実施例１及び２で形成された金属錯体のＳＯＤ様活性
を、以下の方法（ＮＢＴ法又はチトクロームＣ法）によ
って測定した。ＰＰＣ−鉄（II）及びＰＰＣ−鉄（III)
についてはＮＢＴ法で、その他の金属錯体についてはチ
トクロームＣ法で測定し、その結果を表２に示す。

【００５７】

【表２】

【００５８】ＳＯＤ活性の測定法としては、ＮＢＴ法又
はチトクロームＣ法を用いた。これらの測定原理は、キ
サンチン／キサンチンオキシダーゼで発生するスーパー
オキシドアニオンが、チトクロームＣ又はニトロブルー
テトラゾリウム（ＮＢＴ）の存在で酸化されてＯ₂に変
換される反応において、その系にＳＯＤ活性が存在する
と、発生したスーパーオキシドアニオンがその活性によ
って消去され、スーパーオキシドアニオンが変換されて
生じるＯ₂の発生が阻害されることに基づいている。Ｏ₂
の発生が50％阻害された際の活性物質の濃度（μＭ）を
ＩＣ₅₀値とした。

【００５９】ＮＢＴ法及びチトクロームＣ法の詳細は以
下のようである。ＮＢＴ法：0.05Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.0又
は7.8)(52ml）、１％ゼラチン水溶液（20ml）、４単位
のキサンチンオキシダーゼを含むリン酸緩衝液（８ml）
及び316単位のカタラーゼを含む溶液（１μｌ）を混合
する。この溶液（２ml）に、0.4ｍＭＮＢＴ（ニトロブ
ルーテトラゾリウム)(0.2ml）、各種濃度の金属錯体
（0.2ml）及び0.66ｍＭキサンチン（0.5ml）を加える。
キサンチンの添加によって反応が開始されるが、25℃に
おいて540ｎｍの吸光度の変化を３分間測定する。

【００６０】チトクロームＣ法：0.05Ｍリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ7.0又は7.8)（22ml）、0.75ｍＭキサンチ
ン（２ml）、0.15ｍＭチトクロームＣ（酸化型）及び15
8単位のカタラーゼを含む溶液（１μｌ）を混合する。
この溶液（2.6ml）に、各種濃度の金属錯体（0.2ml）及
び0.008単位のキサンチンオキシダーゼを含むリン酸緩
衝液（0.2ml）を加える。このキサンチンオキシダーゼ
の添加で反応が開始されるが、25℃で550ｎｍの吸光度
の変化を３分間測定する。

【００６１】上記の２種の方法で測定した結果からＩＣ
₅₀値（50％阻害濃度）を算出するには、阻害率を縦軸、
金属錯体濃度（μＭ）の対数値を横軸として少なくとも
３種以上の濃度の異なる金属錯体溶液について阻害率
（％）を求め、グラフによってＩＣ₅₀値を求めた。対照
として、ＰＰＣ単独及び関連化合物のＩＣ₅₀値を同様に
して求め、あわせて結果を表２に示す。

【００６２】表２中、ｏ−フェナンスロリン−銅（II）
は低分子ＳＯＤ活性物質として報告されたものである
〔ヴァレンチン（Valentine)ら、J. Am. Chem. Sec., 9
7, 224-225, 1975〕。表２から、本発明の金属錯体が優
れたＳＯＤ様活性を有することがわかる。また、表中、
ＰＰＣ−銅（II）のＩＣ₅₀値は0.11μＭ（ｐＨ7.0)で、
長野らのＴＰＥＮ−鉄（II）のＩＣ₅₀値0.7μＭ（J. Bi
ol. Chem., 224, 6049-6055, 1989）に比べても非常に
優れている。各種ＰＰＣ−金属錯体の抗菌・抗カビ活性
を調べたところ、100μｇ／ｍｌ程度でも全く認められ
なかった。

【００６３】試験例２サルモネラエンテリチディス（Salmonella enteritid
is）を用いて、農薬パラコートの毒性解除実験を行っ
た。培地として、１リットル中に0.2gのＭｇＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ、3.28gのクエン酸ナトリウム、10gのＫ₂ＨＰ
Ｏ₄、2.2gの（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄及び5gのグルコースを含
む合成培地を用いた。その培地に、５μＭのパラコート
を加えて上記サルモネラ菌の発育を抑制させ、それに6.
2μＭ、12.5μＭ又は25μＭのＰＰＣ−鉄（II）を添加
した。

【００６４】6.2μＭ及び12.5μＭのＰＰＣ−鉄（II）
の添加によって発育は次第に回復し、25μＭのＰＰＣ−
鉄（II）の添加で完全に発育の回復が見られた。次に、
ＰＰＣ−鉄（II）錯体の雄性マウスに対する急性毒性試
験を行った。その結果は、７日間判定で、経口投与の場
合のＬＤ₅₀値は５ｇ／ｋｇ以上、静脈内投与の場合のＬ
Ｄ₅₀値は３ｍｇ／ｋｇであった。

【００６５】更に、ＰＰＣ−鉄（II）水溶液を、瀉血し
て一時的に貧血を起こさせた雄性家兎群に１日１回１μ
ｇ／ｋｇの割合で投与した結果、ＰＰＣ−鉄（II）水溶
液を投与しない対照群に比べて明瞭な体重増加が認めら
れた。パラコートの毒性は、活性酸素によっておこるこ
とが知られており、パラコートの添加によって阻害され
たサルモネラ菌の発育が本発明の金属錯体の添加によっ
て回復されたことから、活性酸素が関与する各種疾患の
治療に対する本発明の金属錯体の有用性が示唆された。

【００６６】また、本発明の金属錯体のＬＤ₅₀値から、
その安全性が確認された。更には、インビボ（in vivo)
での試験においても、本発明の金属錯体の有用性が示唆
された。

【００６７】

【発明の効果】本発明の金属錯体は、水に溶けやすく、
強力なＳＯＤ様活性を有する。従って、水に溶けやすい
ために取り扱いが容易であり、活性酸素が関与すると考
えられる各種疾患の予防又は治療に有用である。例え
ば、虚血性疾患、虚血−再灌流が関与する疾患、脳血管
障害、リウマチ性関節炎、膵炎、腎炎及び肝炎のような
炎症性疾患、癌、自己免疫疾患、インスリン依存性の真
性糖尿病、汎発性血管内凝固症候群、脂肪閉塞症、成人
及び幼児の呼吸困難症、新生児の脳出血、火傷、電離放
射線による悪影響、腎臓、肺、心臓、膵臓、肝臓又は皮
膚のような器官の移植、心臓手術、酸素ラジカルを産生
する有毒物質もしくは発癌物質で曝露されて生じる疾
患、スーパーオキシドラジカルによって誘発される内皮
由来の脈管弛緩因子の分解が関与する病理学的疾患等の
予防又は治療に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＰＣの紫外吸収スペクトルを示す。

【図２】ＰＰＣとＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏとから形成された
金属錯体の紫外吸収スペクトルを示す。

【図３】ＰＰＣとＣｕＣｌとから形成された金属錯体の
紫外吸収スペクトルを示す。

【図４】ＰＰＣとＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏとから形成された
金属錯体の紫外吸収スペクトルを示す。

【図５】ＰＰＣとＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏとから形成された
金属錯体の紫外吸収スペクトルを示す。

【図６】ＰＰＣとＮｉＳＯ₄・６Ｈ₂Ｏとから形成された
金属錯体の紫外吸収スペクトルを示す。

【図７】ＰＰＣとＺｎＣｌ₂とから形成された金属錯体
の紫外吸収スペクトルを示す。

【図８】ＰＰＣとＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏとから形成された
金属錯体の紫外吸収スペクトルを示す。

【図９】ＰＰＣとＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏとから形成された
金属錯体の紫外吸収スペクトルを示す（過剰のＦｅＣｌ
₃・６Ｈ₂Ｏ）。

【図１０】ＰＰＣを高速液体クロマトグラフィーで分析
することによって得られたクロマトグラムを示す。

【図１１】ＰＰＣ−鉄（II）を高速液体クロマトグラフ
ィーで分析することによって得られたクロマトグラムを
示す。

【図１２】ＰＰＣ−鉄(III)の紫外及び可視の吸収スペ
クトルを示す。

【図１３】ＰＰＣ−メチルエステルと鉄（II）とから形
成された錯体の紫外吸収スペクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】２−（２−ピリジル）−１−ピロリン−
５−カルボン酸又はそのエステルもしくはそれらの塩と
遷移金属塩（但し、２価鉄の塩を除く）との反応生成物
からなるピロリンカルボン酸誘導体の金属錯体。
【請求項２】一般式（Ｉ）【化１】〔式中、Ｒは水素原子、又は酸素原子が介在していても
よい脂肪族炭化水素残基あるいは芳香族炭化水素残基
を、Ｍｅは遷移金属イオン（但し、２価鉄の塩を除く）
を、ｎは１〜４の整数を、ｍは２〜６の整数を示す〕で
表わされる請求項１記載の金属錯体。
【請求項３】遷移金属塩が、１価の銅、２価の銅、２
価のマンガン、４価のマンガン、２価のニッケル、２価
のコバルト、２価の亜鉛又は３価の鉄の塩である請求項
１記載の金属錯体。
【請求項４】一般式（Ｉ）において、Ｒが水素原子で
ある請求項２記載の金属錯体。
【請求項５】一般式（Ｉ）において、Ｒが低級アルキ
ル基である請求項２記載の金属錯体。
【請求項６】一般式（Ｉ）において、Ｒがメチル基で
ある請求項５記載の金属錯体。
【請求項７】２−（２−ピリジル）−１−ピロリン−
５−カルボン酸又はそのエステルもしくはそれらの塩と
遷移金属塩との反応生成物からなるピロリンカルボン酸
誘導体の金属錯体を有効成分として含有してなるスーパ
ーオキシドジスムターゼ様作用組成物。