JPH0466567A - グルタチオン誘導体およびこれを有効成分とする医薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、グルタチオンペルオキシダーゼ様活性を有す
る新規グルタチオン誘導体、その塩およびこれを有効成
分とする医薬に関する。

（従来の技術） グルタチオンペルオキシダーゼ（以下ＧＰＯと略称する
）は、噴孔動物で唯−知られているセレン含有酵素で、
生体内で活性酸素種の代謝失活に関与する物質の一つと
じて知られている。

生体にとって、酸素はエネルギー産生１伐謝等生命の維
持に必要不可欠であるが、エネルギー産生系での反応、
酵素反応、紫外線や放射線等による反応により酸素アニ
オンラジカル、過酸化イオン、ヒドロキシラジカル等の
いわゆる活性酸素種となる。活性酸素種は、酸素添加酵
素。

白血球の殺菌作用等の発現に有用である反面。

生体膜のリン脂質、アラキドン酸等の過酸化を促進し、
過酸化脂質を形成する。この過酸化脂質は、活性酸素種
と同様に、アルコキシラジカルやとドロキシラジカルを
発生させ、生体膜（細胞膜）を攻撃して膜障害を惹起し
、また９種々の有用酵素類の失活を招く［代謝、第１５
巻、１０号、　１９７８年、特集活性酸素］。

ＧＰＯは、グルタチオンによって上述の過酸化物が分解
され、失活化する生体反応に関与する生体物質であるが
、何らかの理由によりこの酵素の減少をきたしたり、あ
るいは先天的にこの酵素を欠損している患者が認められ
る。活性酸素の防御機構に欠損を生じた場合、過酸化が
連鎖反応的に進行し９種々重大な生体障害が惹起する。

これらの障害の代表的なものとして血小板凝集による各
種疾病、炎症、肝障害、動脈硬化、溶血、老化乃至老人
性痴呆症、網膜症、或種薬物による心及び肺障害、虚血
性血管疾患等が挙げられている。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者等は、ＧＰＯと同様、セレンを構成４分とする
グルタチオン誘導体を合成し、夫々の立体異性体につい
て生理活性作用を調べたところ、いずれの異性体につい
てもＧＰＯに認められるのと同様の作用を認め９本発明
を完成した。

すなわち２本発明は５式 ％式％ で示されるグルタチオン誘導体のＤＤ−型、　ＤＬ型、
ＬＤ−型およびＬＬ−型立体異性体またはこれらの立体
異性体の二量体（以下、これらをグルタチオンと総称ス
る） もしくはそれらの塩である。

本発明のグルタチオン誘導体（Ｔ）（以下５ｅＧＳＨと
略記することがある。）の立体異性体またはこれらの二
量体（■）（以下５ｅＧＳＳＧと略記することがある。

）もしくはこれらの塩（′！、ペグチド合成法の一つで
ある各種保護基、カノグリング試薬などを駆使して行う
カンプリング法、Ｃ端活性化法、Ｎ端活性化法などの液
相法を用いて合成することは勿論可能であるが、簡便に
生産及び精製ができる固相法［Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　
（Ｊ、　Ａｍ＋　Ｃｈｅｍ＋Ｓｏｃ、、　８５．２１８
５．　（１９６３）によって初めて紹介され。

その後改良が加えられている方法コを適用して合成する
のが有利である。同相法によってペプチドを合成するに
当っては、すぐれたペプチド自動合成機、たとえばアプ
ライド・バイオシステムズ社のペプチド合成機４３０Ａ
が市販されており、この装置の標準的運転でプログラム
に従って行えばよい。なお５本発明化合物の製造法とし
て現在市販の装置の適用のみに限定されるべきでないこ
とはいうまでもない。これらのペプチド合成機による合
成は、ラセミ化を伴うことが少なく、原料アミノ酸の立
体配置が維持された目的化合物を得ることができる。

合成されたペプチドは、さらに精製度を高めるため９分
取用逆相高性能液体クロマトグラフィーなどによって精
製するのが有利である。なお、ペプチド自動合成機の最
終生成物としては。

−船釣にトリフルオロ酢酸塩として単離されるが、イオ
ンクロマトグラフィーなどにより種々の塩として単離す
ることができる。合成ペプチドの純度、安定性を維持す
るためには、凍結乾燥するのが好適である。なお、こう
して得られたグルタチオン誘導体（Ｄの各立体異性体は
。

容易に酸化されて二量体（ｎ）を与える。

本発明のグルタチオン誘導体を製造する別の方法として
、このペプチドをコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学
的手法により行うことも可能である。

（発明の効果） 本発明医薬の有効成分は、生体内で活性酸素の産生を抑
制するので、活性酸素の産生に起因する種々の疾患の予
防および治療剤として有用である。

活性酸素は、主として脂質を過酸化脂質に変えることに
より細胞（膜）を変性、破壊するとともに細胞中で行わ
れている生命活動を阻害する。上述の疾患は、細胞の生
命活動の阻害に起因して発生するものである。本発明の
医薬は、これらの疾患の治療や予防に有用である。

また、活性酸素は９発癌過程のプロモーションによるガ
ン細胞の増殖、イニシェーションにおける発癌物質のフ
リーラジカル化に関与していると言われており、活性酸
素の産生を抑制することにより、癌の発生、増殖が抑え
られると考えられる。

本発明化合物は、活性酸素産生抑制作用を有するため、
癌の発生、増殖を抑制しうる。本発明の化合物は、経口
的あるは非経口的に投与される。

投与量は年令２体重、症状、投与方法により異るが、た
とえばグルタチオンのＬＤ異性体の場合通常成人１日当
り、経口投与で１０ｍｇ〜２０００ｒｒＩｇ。

好ましくは１１００ｒｎ〜１０００ｍｇの範囲で、１回
判から数回に分けて投与される。また、非経口投与では
１日１ｍｇ〜１０００１１１ｇの範囲で１回から数回に
分けて静脈内投与される。

経口投与のための製剤としては２錠剤、散剤。

顆粒剤等の固形製剤および乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シ
ロップ剤、エリキシル剤等の液体製剤が利用できる。こ
れらの経口投与製剤は９通常の製剤化の手法により調製
することができる。すなわち。

固形製剤の場合は、佐薬としてコーンスターチ。

マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロー
ス、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリド
ン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等の賦形剤、た
とえばマグネシウムステアレートのような潤滑剤、その
他崩壊剤、安定剤、溶解補助剤等が適宜配合される。ま
た、液体製剤の場合は、たとえば精製水、エタノール等
の希釈剤に適宜湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤
。

風味剤、芳香剤、防腐剤を配合したものが用いられる。

つぎに、非経口投与のための注射剤としては。

無菌の水性または非水性の溶解剤、懸濁剤、乳濁剤が用
いられる。これらは２例えば注射用蒸留水またはプロピ
レングリコール等の非水溶液を用℃・て調製される。非
経口投与製剤は、凍結乾燥製剤の如き投与時溶解形の製
剤とすることもできる。

（実験例および実施例） つぎに、実験例および実施例を挙げて９本発明をさらに
説明する。

実験例　１　（活性酸素の消去作用） ＧＳＨ ５−８Ｇ グルタチオン（ＧＳＨ）は９本発明の化合物の存在下で
活性酸素種である過酸化水素を還元して。

酸化型グルタチオン（ＧＳ−８Ｇ）になる。Ｇ５−８Ｇ
レダクターゼにより還元される過程で、酸化還元補酵素
ＮＡＤＰＨは、　ＮＡＤＰに変換するので、この実験系
でＮＡＤＰＨの減少量及び減少速度を測定することによ
り９本発明化合物の活性酸素の消去作用の指標とする。

測定法 （試　薬） 凍結乾燥した５ｅＧＳＳＧを超純水（比抵抗１メガオー
ム・ｍ以上）に溶解し、　　５ｍｇ／ｌａｔの溶液を調
製する。同様に下記の溶液を超純水にて調製する。

１還元型グルタチオン（１０ｍＭ）（輿入製）２リン酸
カリウム緩衝液（０，１Ｍ　）　ＰＨ７，０３ＮＡＤＰ
Ｈ（１，６ｍＭ）（輿入製）４アジ化ナトリウム（１０
ｍＭ） ５過酸化水素水（４ｍＭ） グルタチオンレダクターゼはベーリンガーマンハイム社
製の酵母由来の製品（約２４単位／ｍｌ）をそのまま使
用した。

各溶液は２５℃の恒温室に置き、温度平衡まで待つ。

（操　作） ミクロキュベツト（５０μを以上で測定可能、最大２０
０μを収容、島津製作所製）に還元型グルタチオン溶液
１０μｔ、ついでリン酸カリウム緩衝液５０μｔ。

ＮＡＤＰＨ溶液１０μ乙、グルタチオンレダクターゼ１
０μｌ。

アジ化ナトリウム溶液１０μ２を加え、最後に過酸化水
素水を５μを加えた後、ノ（ラフイルムで封をして混合
する。約３秒間混合後、直ちに、島津製作所製の分光光
度計ＵＶ−２６０にて３４０　ｎｍの吸光度変化を測定
する。

すべての操作は２５°Ｃの恒温室にて行う。

約１分間自記記録計に３４０ｎｍの吸光度の時間変化を
記録させた後、　　５ｅＧＳＳＧを５μを加えて、上述
のようによく混合する。

ただちに分光光度計にて３４０１ｍ、の吸光度の時間変
化を記録する。

（結　果） ＬＬ−８ｅＧＳＳＧについては５ｎ′］ｇ／ｍｌの濃度
の溶液を５μｔ、　３μｔおよび１μｌ加えて測定した
。

ＬＤ−８ｅＧＳＳＧの同濃度溶液を５μＬ加えたときに
反応速度が高すぎて適正な測定が出来なかったので０．
５　ｍｇ／ｒｎ　ｌに超純水で希釈し、それを５μｌ、
３μｌ、及び１μＬ加えて反応速度を測定した。

ＤＬ−８ｅＧＳＳＧについても０−５ｍｇ／ｍｌの溶液
を５μｌ、　３μｌ及び１μを加えて測定した。

ＤＤ−８ｅＧＳＳＧは１　ｍｇ／ｒｎｌの溶液を５μｌ
、　３μｌ及び１μｌ加えて測定した。

３μｔの５ｅＧＳＳＧをくわえる時は２μｔの、また、
１μｔの５ｅＧＳＳＧを加える時は４μｌの超純水を加
えて合計容量を１００μｔになるようにした。

測定はすべて、上述のように、まず、　　５ｅＧＳＳＧ
以外のすべての試薬を含む反応液につし・て３４０ｎｍ
の吸光度時間変化を測定しておき、そこに５ｅＧＳＳＧ
を加えて再び３４０ｎｍの吸光度時間変化を測定し。

両者の差をもって真の反応速度とした。

典型的な例としてＬＬ−８ｅＧＳＳＧ　（ｓｍｇ／ｍｌ
）を３μを用いて行った実験結果を添付する。（第１図
）ＳｅＧＳＳＧの各ジアステレオマーの触媒するグルタ
チオンペルオキシダーゼ反応速度は５ｅＧＳＳＧの量に
比例する。（第２図） それぞれの反応速度をまとめると表１のようになる。

表　　１ ２５℃における反応速度を示す 製剤調製例（処方例） 実施例　１　錠剤 ＬＬ−８ｅＧＳＳＧ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　３０　ｍｇ乳　　剤　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１５０ｍｇ結晶状セルロース　　　　
　　　　　５０ｍｇカルシウムカルボキシメチルセルロ
ース　　　７ｍｇステアリン酸マグネシウム　　　　　
３ｍｇ上記の成分を混合しそして通常の装置を用いて通
常の方法で錠剤に圧縮する。所望ならば９錠剤を通常の
コーティングで被覆してよ（・０実施例　２　錠剤 ＬＬ−８ｅＧＳＳＧ　　　　　　　　　　　　５０　ｍ
ｇ微結晶状セルロース　　　　　　　１５０■クチナ（
Ｃｕｔｉｎａ　）　ＨＲ１５ｍｇヒドロキシプロピルメ
チルセルロースフタレート　　２０１ｒ１ｇ実施例　３
カプセル ＬＬ−８ｅＧＳＳＧ　　　　　　　　　　　　３０　ｎ
’１ｇ乳　　剤　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１０２　［１１ｇ結晶状セルロース　　　　　　　
　　５６ｍｇコロイド状シリカ　　　　　　　　　　２
■上記成分を混合しそして通常通りに顆粒化しそて硬質
ゼラチンカプセル中に充填スる。

実施例　４　カプセル ＬＬ−８ｅＧＳＳＧ　　　　　　　　　　　　５０　ｍ
ｇ。

メ　　　ル　　り　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　５ｍｇエアロシン２００　　　　　　
　　　　１Ｏｒｌ１ｇを混合し、顆粒化しそして硬質ゼ
ラチンカプセル中に充填する。

グルタセレノン製造例 実施例　１ つぎに９本発明の化合物の固相法による合成例を詳述す
る。なお９本合成法で使用した原料の調製法を後述する
。

グルタセレノンとそのジアステレオマーは、アプライド
バイオシステムス４３０Ａペプチド合成機を用℃・９表
２に示した条件で合成した。合成は。

Ｎ−ｔｅｒｔ−Ｂｏｃ　Ｇｌｙ　ＯＨ２Ｐａｍ樹脂１ｇ
（樹脂１ｇ当り０．５　ｍｍｏｌ　）を用いて始められ
た。ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基は、Ｎ末端保護に
用いられ、側鎖の保護は、　Ｇｌｕ　（ＯＢｚｌ）、　
Ｓｅ　Ｃｙｓ　（Ｂｚｌ）　（但し、Ｂｚｌ＆まベンジ
ル基を意味する）であった。カンプリング反応は、保護
されたアミノ酸２．０　ｍｍｏｌを用〜・て行われた。

生成したペプチド樹脂（約０７ｇ）は、０．１％トリフ
ルオロメタンスルホン酸のトリフルオロ酢酸溶液（この
溶液中には、００８％チオアニンールおよび０．０４％
１．２−エタンジチオールを含む）を用いて、２５°Ｃ
３０分間処理した。反応混合物から樹脂を分離したのち
、水１５ｍｔを加え、エチルエーテル２０ｍ＋ｔで洗浄
した。

水層は０℃に冷却し、０℃に冷却した１０規定苛性ソー
ダ水溶液を用いてｐ　Ｈ２，０に調節した。得られた溶
液は、　　Ｄａｗｅｘ　５０　（Ｎａ”　）を充填した
２×１１ｃｍカラムに流した。カラムを水で洗浄し、１
規定アンモニア水で溶出した。最初に流出する２又は３
両分（薄層クロマトグラフィーにより、グルタセレノン
を含むことを確認）を集め、凍結乾燥した。

得られたペプチドを１５０°Ｇ、１時間で６Ｎ塩酸（１
％フェノールを含む）によって加水分解した後、アミノ
酸分析によって同定した。分析によって得られた残基の
値を第３表に示す。

第３表 （値はｍｏｌｅ　／ｍｏｌｅ　） こうして得られた５ｅＧＳＳＧの各立体異性体は。

ＣＤスペクトルにより確認した（第３図参照）。

表　　２ ＤＭＦ　ニジメチルホルムアミド ＤＩＥＡ　：　Ｎ、Ｎ−ンイソプｐビルエチルアミン原
料の調製法 り一β−クロロアラニンは、　Ｗａｌｓｈ等の方法（Ｊ
。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２４６．６８５５−６８６
６、１９７１　）によりＬ−セリンから合成した。

ジンジウム　ジセレニドは、　Ｋａｌａｙｍａｎおよび
Ｇｒｉ−ｆｆｉｎの方法（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　
Ｓｏｃ、、　１９５．１９７−１９９．１９７３）によ
り合成した。

Ｌ−セレノシスチンは、ジンジウム　ジセレニドとＬ−
β−クロロアラニンとからＣｈｏｃａｔ等の方法（Ａｎ
ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１４８．４８５−４８９
．１９８５）に憔じて。

以下の通り合成した。Ｌ−β−クロロアラニン（４，２
ｇ、　３４ｍｍｏｌ）を水５５ｍ７に溶かした溶液を１
０規定苛性ソーダ水でｐＨ９に調節し、この溶液に窒素
気流中で１．ＯＭジソジウム　ジセレニド溶液７８ｍ１
を２時間かけて滴下した。反応は、共栓性の１０１００
Ｏ三頚フラスコを用（・、３７°Ｃでかきまぜながら行
った。反応終了後（３６時間）、６規定塩酸を徐々に加
えてｐＨ２に調節し、　　０．３９　ｇ　（５，６ｍｍ
ｏｌ）のヒドロキシルアミンを加えてセレン原素を還元
してセレン化水素とした。溶液に窒素ガスを１時間はげ
しく通し、排出ガスは酢酸鉛の飽和溶液に２回通してセ
レン化水素を捕獲した。得られた黒色けん懸液を濾過し
、黄色のし一セレノシスチン溶液を得た。次いで、１０
規定苛性ソーダでｐＨ６，０〜６．５に調節した。４℃
で１夜放置し、黄色結晶状のセレノシスチンを得た。（
収率６８％）。

元素分析値（Ｃ６ＨＩ３　Ｎ２０４　Ｓｅ２として）Ｃ
（％）　　　Ｈ（％）　　Ｎ（％） 実測値　　２１，５０　　３，４８　　８．４８理論値
　　２１．５５　　３．５９　　８．３８Ｓｅ−ベンジ
ル−し−セレノシスティン＆’ｉ、Ｌ−セレノシスチン
を水素化はう素還元して得られたセレノシスティンとベ
ンジルクロライドとからＥｒ１ｃｋｓｏｈおよびＭｅｒ
ｒｉｆｉｅｌｄの方法（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ−Ｓｏ
ｅ。

９５、３７５７−３７６３．１９７３）の変法により得
られた。

トリエチルアミン（５８ｍＺ、　４１０ｍｍｏｌ）を窒
素ガスで置換した１、０００ｍ７の共栓付三頚フラスコ
中のエタノール水溶液（１：　１．　ｖ／ｖ　）　２０
Ｏｎ＋Ｚに加え、溶液を２０分間かきまぜた。次いで、
Ｌ−セレノシスチン（２，８４ｇ　、　８．５　ｍｍｏ
ｌ　）を溶液中にとかし、水素化ホウ素ナトリウム（２
ｇ、　５３ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。１時間後、ベン
ジルクロライド（３，０ｇ、　２４ｍｍｏｌ　）を加え
、混合物を油浴中４０°Ｃで１４時間かきまぜた。沈澱
する白色結晶を集め、水およびエタノールで良く洗った
（収率９４％）。

Ｓｅ−ベンジル−Ｎ　−ｔ　−Ｂｏｃ−Ｌ−セレノシス
ティンは、　　Ｓｅ−ベンジル−し−セレノシスティン
とＳ　−ｔ−Ｂｏｃ　−４，６−シメチルー２−チオピ
リミジン（ベプチドインスチチーート社）とがらＮａｇ
ａ−ｓａｗａ等の方法（Ｂｕｌｌ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏ
ｃ、　Ｊａｐａｎ、　４６　、１２６９１２７２、１９
７３）の変法により合成した。

Ｓｅ−ベンジル−し−セレノシスティン（４，３ｇ　。

１７　ｍｍｏｌ　）およびトリエチルアミン（１５ｍｌ
、　　１０８ｍｍｏｌ　）を水１１．３　ｍｌ中に加え
た。得られた溶液にＳ−ｔ　−Ｂｏｃ　−４，６−シメ
チルー２−チオ−ピリミジン（４，８１ｇ、　２０ｍｍ
ｏｌ）をジオキサン９．３　ｒｎｌに溶かした溶液を加
え１反応液を室温で６５時間かきまぜた。反応終了後９
反応液中に水５０ｍＺを加えた。

５分後に溶液は混濁し、未反応のカーボネートは酢酸エ
チル５０ｍ１で２回抽出した。次いで水層をＯ′Ｃに冷
却し、０°Ｃに冷却した５％硫酸水素カリウム水溶液を
加えてｐＨ２，３に調節すると袖状の沈澱が析出した。

沈澱物を酢酸エチル川Ｏｍ１．で１回および酢酸エチル
５０ｍ１で２回抽出し、酢酸エチル層を４°Ｃで無水硫
酸ナトリウムで乾燥した。

酢酸エチルを減圧除去した。得られた固体を酢酸エチル
３　ｍｌにとかし９石油エーテル１　ｍｌを加えた。

溶媒を再び減圧除去し、残留物を４°Ｃで２４時間冷却
した。得られた固体を栓枠し９石油エーテル４０ｍ１中
で１時間遺留した。クリーム色の微粉末結晶が得られた
（収率９０％）。

元素分析値（Ｃ１０）（２２０４ＮＳｅとして）Ｃ（％
）　　　Ｈ（％）　Ｎ（％） 実測値　　５０，４８　　５，８８　　４．２０理論値
　　５０，２８　　５．９１　　３．９１ルタチオンベ
ルオキシダーゼ活性を比較した結果を示す。

第３図は、グルタセレノンの各異性体のＣＤスペクトル
を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるグルタチオン誘導体のＤＤ−型、ＤＬ−型、
   ＬＬ−型およびＬＤ−型立体異性体またはこれらの立体
   異性体の二量体 ２、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるグルタチオン誘導体のＤＤ−型、ＤＬ−型、
   ＬＬ−型およびＬＤ−型立体異性体またはこれらの立体
   異性体の二量体を有効成分として含有する活性酸素産生
   抑制剤