JPH0690736A - バイオセンサー - Google Patents
バイオセンサーInfo
- Publication number
- JPH0690736A JPH0690736A JP3188434A JP18843491A JPH0690736A JP H0690736 A JPH0690736 A JP H0690736A JP 3188434 A JP3188434 A JP 3188434A JP 18843491 A JP18843491 A JP 18843491A JP H0690736 A JPH0690736 A JP H0690736A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- electrode
- bilayer
- hapten
- biosensor
- channel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
- G01N33/5438—Electrodes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
- B01J2219/0072—Organic compounds
- B01J2219/00734—Lipids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/817—Enzyme or microbe electrode
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
ンサーに関する。 【構成】 本発明は、架橋係留分子を介して記録電極に
付着させた脂質二重層からなる両親媒性液体結晶膜によ
って構成されるバイオセンサーである。脂質二重層は生
物または合成イオンチャネルを模したもので、その両表
面でバルク水性媒体と連続的に接触している。架橋係留
分子は、チオールまたはチオエーテル残基を末端に有す
るポリオキシアルキレン鎖に連結したリン脂質残基を含
有することもできる。
Description
極表面に付着しているバイオセンサーに関する。脂質二
重層は生物または合成イオンチャネルを模したものであ
る。このバイオセンサーは、定性および定量的分析に有
用である。
シグナルを、連結したカスケード様増幅反応の開始によ
って認識する。これらの多くでは、カスケードの開始ま
たは中間工程に、膜関連イオンチャネルの開口が関与し
ている。リガンド活性化チャネルにおいては、その過程
は、チャネル蛋白質に構造的にまたは機械的に連結した
特異的受容体に対する小さなエフェクター分子(神経伝
達物質、オードラントまたはフレーバー)の結合によっ
て開始される。これは脂質二重層を横切る孔部の開口を
招き、膜の電気のコングクタンスの段階的増大を生じる
チャンネル蛋白質のコンホーメーションの変化を誘導す
る。生物チャネルは人工脂質二重層に機能的に再生する
ことが可能で、これは生体膜に生じるのと実質的に同一
のエフェクター誘導電流を招来する。現在利用できる電
子増幅手段によればシグナルチャネルの開口現象を検知
することができる。
チドが人工二重層でイオンチャネルを形成することが明
らかにされている。二重層を横切る伝導路は、水の小孔
の壁部を形成する数個のペプチドの整合的集合によって
形成される。さらに、それらの一次配列を修飾すること
により、特定のチャネルの性質を変更できる。膜の面内
におけるペプチドの側方および回転可動性を制限するこ
とによって、独立に、チャネル形成を制御することがで
きる。
層の核によって形成された誘導体を通過するイオンの流
れを制御する装置である。二重層を、検知電極に、1)
高度に安定で、2)蛋白質やペプチドがその内部にチャ
ネルを作る媒体として働く能力を保持するように付着で
きれば、独特の種類のバイオセンサーが得られるはずで
ある。
から知られている。ラングミュアとプロジェットによっ
て導入された方法が、電極へのリン脂質の吸着が関与す
る装置の開発にいまだに利用されている。この方法によ
り、両親媒性分子の単分子膜が水−空気界面から固体表
面に、それを順序正しく水コンパーメント内に押し込み
ついで引き上げると、移される。分子の両親媒性と水−
空気界面から固体表面の通過の順序によって、層は固体
表面に対する疎水性−親水性の方向性を変え、したがっ
て累積二重層が形成される。これらの層が加湿条件下に
作成されると、限られた可動性を有するわずかな水分子
が二重層内に捕捉される。しかしながら、これらの系は
二重層の間に、バルク型の溶媒水分子を保持することは
できない。液体様の界面であれば、現実には、内部の累
積マトリックスから外部層が脱着してしまうからであ
る。したがって、第一層と電極表面の間のバルク水性媒
体が絶対に容認できないことは明白である。
おけるバルク溶媒水の欠如は、生物学的様系の模倣、と
くに機能性イオンチャネル形成ポリペプチドの導入にそ
れらを不適当にする。
て作成された先行技術のデバイスの2つの例が、豪州特
許出願AU40123/85および、WO89/011
59号として公開されたPCT国際出願に見出される。
ばれた物質が膜表面に存在すると、イオンを通過するよ
うに適合されたフィルムまたは膜を利用する固体状態の
電気化学センサーが開示されている。とくに、この電気
化学センサーは、ベース基層と、ベース基層に付着した
物質の層を包含し、層へのイオン輸送に応答して電流を
生じる。この層は実際、イオン流を電流に転換または変
換する。また、イオンを検出すべき物質または化学種を
含有する液体から層に輸送するため、層に付着させる膜
を包含する。膜は、化学種と相互作用してイオンを液体
から膜へ浸透させるゲート分子を包含する。
親媒性分子がぎっしりつまって配列した膜で、複数個の
イオンチャネルおよび/または支持体と接合して受容体
分子を構成する自己集合性分子の少なくとも一部からな
ることを特徴とする膜が記載されている。イオンチャネ
ルは、ヘリックスおよびその集合体、コロナンド、クリ
プタンド、ポタンドならびにそれらの配合体を形成でき
るペプチドからなる群より選ばれる。支持体と接合した
受容体分子からなる両親媒性分子においては、受容体分
子は受容部位を有し、免疫グロブリン、抗体、抗体フラ
グメント、染料、酵素およびレクチンからなる群より選
ばれる。支持体部は、脂質ヘッド基、炭化水素鎖、架橋
可能分子および膜蛋白質からなる群より選ばれる。支持
体部は受容体分子と受容部位から離れた末端において付
着する。固体表面に付着したこのような膜二重層からな
るバイオセンサーも開示されている。
電極付着溶媒和脂質二重層からなるバイオセンサーに関
する。チャネルの開口は、検出される分子との相互作用
によって誘導される。これは二重層伝導度の段階的増大
を生じ、それが電極によって検知される。
して記録電極に付着した両親媒性液体結晶膜であり、そ
の両表面においてバルク水性電解質媒体に連続的に接触
している。
は、電極物質に強固に結合可能な残基たとえば−SHま
たはチオエーテル残基を末端に有するポリオキシエチレ
ン鎖をもつホスファチジルエタノールアミンに連結した
親水性スペーサーアームからなる。
図である。図2は溶媒和脂質二重層を係留している提案
された電極を例示する図である。図3はハチ毒、メリチ
ンの構造を示す図である。図4は本発明のペプチドCH
−1の構造を示す図である。図5は、脂質二重層内に浸
漬したヘリックス状の棒状集合体としてCH−1を模式
的に示している。(A)は集合体の中心に向いた極性側
鎖基(白丸、正確な縮尺で描かれたものではない)を示
す。集合体のシッファー・エドマンドソンらせん投影
(B)は、極性中心水性小孔領域を示している。ハプテ
ン付着部位は矩形で描かれている。図6はCH−1への
ハプテンの付着部位を示す。図7はチャネル形成免疫検
定法の原理を模式的に示す図である。図8はCH−1の
イオンチャネル活性を示す。(A)はアソレクチンリポ
ソーム中、バリノマイシン誘導K+拡散電位の脱分極を
示す。(B)はガラス毛細管の先端における平面脂質二
重層内の単一チャネル活性を示す。
り、これに架橋係留分子を介して両親媒性液体結晶脂質
二重層膜が付着し、この膜はその両面でバルク水性電解
質媒体に連続的に接触し、その二重層境界は脂質鎖の疎
水性成分と非極性壁部の間の非極性接触によってシール
される。この二重層は、合成または生物イオンチャネル
を模したもので、その開口は適当な外的影響との相互作
用により、たとえば検出すべきリガンドによって誘導さ
れ、その結果、膜の電気的性質に変化を生じ、それが電
極によって感知され、測定される。
たとえば大豆アソレクチンであり、好ましいイオンチャ
ネルはヘリックスおよび集合体を形成できる蛋白質また
は合成ペプチドから構成される。
およびペプチドがその生物学的特異的活動をその中で発
揮できる適当な媒体を構成しなければならないので、液
体結晶状態に保持される。すなわち、チャネル蛋白質お
よびペプチドは、イオンチャネルの自発的形成が可能な
ように、十分な側方可動性を保持していなければならな
い。同時に、膜はその内部に取り付けられるバイオセン
サーデバイスが長い寿命を示すように機械的に安定でな
ければならない。適切に機能するためには、リン脂質二
重層はバルク水媒体中に浸漬していなければならない。
したがって、膜の両側には常にバルク水が存在しなけれ
ばならない。
成分の側方可動性により誘発される可能性がある干渉を
最小にするように、二重層の機械的強化を目的に設計さ
れている。この要求に合致するためには、細胞骨格また
は細胞マトリックスに対する細胞膜の相互作用に基づく
アプローチが採用された。細胞骨格は、すべての生物細
胞に共通な、膜の内側表面における別個の点に結合する
ポリペプチド肋材によって主として作られている機械的
支持系である。類似の連結部により、赤血球や上皮細胞
のような細胞の膜が長期間にわたり著しい機械的ストレ
スに対して耐えることを可能にしている。
電極に付着させる新規な方法が案出された。すなわち、
2つの主要成分、一般的なリン脂質たとえばホスファチ
ジルエタノールアミン(PE)、および末端が金属に対
して高い親和性を有する残基で置換された高親水性スペ
ーサーアームから構成される錨分子の合成を包含する。
たとえば、様々な鎖長のオキシエチレンとその末端にチ
オールまたはチオエーテル残基を含有するホスファチジ
ルエタノールアミン誘導体を特定の錨分子として、チャ
ネル機能に必要な動的性質を維持した安定な溶媒和二重
層が、本発明により、金電極表面に付着された。
図2に例示する。この新規な構造は主として、二重層と
電極の両表面にほぼ垂直に配置された複数個の細長い錨
分子または極性スペーサー架橋によって、電極(好まし
くは、貴金属たとえば銀、金、白金、または金属メッ
キ)に付着された脂質二重層からなる。電極に付着し
た、ある厚さの層をなす全構造が水性媒体中に浸漬さ
れ、脂質二重層が膜を決定する。
を図1に示す。テフロンブロック(11)は円形のウエ
ル(12)を包含し、その底部に電極(13)が配置さ
れる。この電極(13)に、リン脂質二重層(14)
(挿入図および図2も参照)が、二重層(14)と電極
(13)の間のバルク水層(15)が存在するようにし
て付着される。二重層の境界は側方で、リン脂質の疎水
性成分とテフロンの間の非極性接触によってシールされ
る。二重層はさらに、イオンチャネル形成ペプチド(図
には示していない)を含有する。第二の参照電極(1
6)は二重層の上方に配置される。テフロンの代わり
に、炭化水素と強力に相互作用するプラスチック材料、
たとえばポリスチレンを使用することもできる。
強固に接触保持された両親媒性リン脂質二重層が形成さ
れる。この構造により、約50Åから約75Åのオーダ
ーの厚さをもち、したがって包埋された機能性ペプチド
および蛋白質を支持できる液体結晶膜が生成する。リン
脂質膜は電極に接近して、それと平行に配置されるが、
それとの間に空間をおいて、約15Å〜50Åの長さの
架橋錨分子によってそれと付着され、全構造が水性媒体
中に置かれる。径約2mmのバイオセンサーを試験し、
著しく安定であることが見出された。
ペーサーアームを介して電極に付着した溶媒和リン脂質
二重層からなる。使用が好ましいアームは、ポリ(オキ
シエチレン)n(nは約8〜約25であることが好まし
い)から構成されるが、鎖には他の極性残基が含まれて
いてもよく、たとえばポリアミノ酸鎖でもよい。鎖はす
べて、その末端が、チオールもしくはチオエーテル残
基、またはその他の電極に高い親和性をもつ適当な付着
分子によって終結する。これらの分子の親水性部分は、
親水性部分が水と強い相互作用を示す複数個のオキシエ
チレン鎖で作られている天然のある種の界面活性剤分
子、たとえばTritonと化学的に類似している。
合脂質を使用することが可能になる。たとえば、その小
成分は付着に用いられるスペーサー分子をもつリン脂質
で、大部分のリン脂質が二重層構造を決定するように選
択できる。
ペーサー分子によって行う本発明のアプローチには、以
下の新しい特徴がある。すなわち、a)バルク水が電極
表面および二重層の両側に存在する,b)非係留脂質お
よび二重層内に導入されたポリペプチドの移動が可能で
ある,c)二重層は適度の安定性と、電極表面に関して
固定された幾何的配置を有し、これはその表面への錨分
子の反復付着によるものである,d)上記の固定された
幾何的配置により、脂質二重層は電極の輪郭に従うの
で、原子分解時における電極表面の絶対的な平滑化は重
要ではない。
通すイオンの通過が可能になるイオンチャネルを模倣し
たものである。
の方法がある。そのデバイス中に存在する成分蛋白質ま
たはペプチドによって、チャネルの開口は2種の別個の
機構によって誘発できる。第一は、予め存在する固定ま
たは組立てチャネルのリガンド誘発開口である。第二の
機構は、両親媒性ペプチドが自発的に集合してチャネル
集合体を形成するのを妨げている動揺の特異的な除去に
基づくものである。
のチャネル、たとえばアセチルコリンまたはGABA受
容体である。これらのチャネルは、適当な細胞から高度
に精製するか、または遺伝子操作によって得られる。つ
いで、これらを電極支持人工二重層内に導入できる。次
に、二重層を、非占拠時に受容体−チャネルが閉じた状
態で支持されるように調整する。リガンドがその特異的
受容体部位に結合すると、神経系の場合のように、チャ
ネルの開口の引き金となるコンホーメーション変化が誘
発される。このアプローチは、in vivoにおける
受容体によるアゴニストまたはリガンド感知をそのまま
模倣したデバイスの形成を可能にする。アセチルコリン
受容体の場合には、さらに、センサー集合体にアセチル
コリンエステラーゼを添加すれば、アゴニストおよびア
ンタゴニスト両者に対する神経系の感受性のシミュレー
ションが可能になる。この可能性によりまた、第二の蛋
白質のリガンドまたはチャネル形成部と相互作用する反
復部位を含有するハイブリッド受容体分子が本発明によ
り考慮できる。これらのハイブリッド分子は慣用の遺伝
子操作法で製造できる。
様ペプチド、たとえば本明細書においてはCH−1と呼
ぶ新規な合成ペプチド(下記参照)に関するものであ
る。これらは、適当な接近と軸方向をもって適度の集合
状態に到着したとき、イオンチャネルとして機能する集
合体を形成できる(図5参照)。この分類では、バイオ
センサーは、要素の反復部分としてハプテン、阻害性リ
ガンド成分として抗体の使用に基づいて構築される。
に挿入されると参照電極のコンパートメントに向けられ
るCH−1の一端にハプテンを付着させると、上部溶媒
コンパートメントに添加されたハプテンに対するモノク
ローナル抗体との相互作用が可能になる。ハプテン−C
H−1に抗体が結合している限り、それらは、立体障害
により、イオンチャネルの形成に必要な合成ハプテン−
CH−1の適切な集合を防止する(図7,上部参照)。
検知すべき遊離のハプテンまたはハプテン様分子(被験
物質)の添加は、抗体結合部位に対する競合および抗体
との相互作用からのハプテン−CH−1の放出により、
イオンチャネルの自発的形成(図7,下部参照)とイオ
ン伝導度の増大によるその検知を可能にする。この方法
により、それに対する特異的モノクローナル抗体を生成
する分子を検出できるバイオセンサーの設計が可能にな
る。
SとnSの間)ことから、数個の分子の結合によって誘
発されるただ1個のチャネルの開口も容易に検知でき
る。これらの系で記録された感度はナノモルの範囲であ
る。
ンチャネル部位の化学体との相互作用で、このようなチ
ャネルの開口を生じる。同様にして、このようなチャネ
ルは、適当な電磁線たとえばUVからIRまでおよびも
っと高波長の種類の光のような電磁線と相互作用して、
開口および伝導性の変化を生じさせることができる。光
と相互作用してその構造を変え、その結果、センサーの
伝導性を変化させる発色体またはその他の光感受体から
なるイオンチャネルを構築することもできる。この目的
に適当な分子は、適当な感作分子たとえばカルボシアニ
ンまたはメロシアニンによってより長い波長に感作でき
るスチルベン誘導体を含有するペプチドである。
ためには、ある種の弛緩機構が付与される。受容体結合
アゴニストまたはリガンドは、チャネル−受容部位か
ら、結合した化学体を除去するのに適当な酵素を二重層
内に導入するかまたは二重層の上方の水性コンパート内
のセルの壁部に付着させることによって除去される。酵
素活性は、デバイスを検知すべき物質に暴露したとき、
その濃度が一過性に上昇してチャネルを開くように調整
される。本発明の新規なデバイスではジメンションが縮
小されているので、拡散による応答時間が短縮される。
次に、酵素分解により、検出すべき物質は低レベルに減
少し、検出サイクルの再開が可能になる。チャネルと酵
素の適当な組合せは実験によって容易に確立することが
できる。
程洗浄操作によって回復する。第一の洗浄で検出分子−
抗体複合体が除去され、第二の操作は主として、遊離抗
体分子の補充の働きがある。
媒体の復原は逆イオン流入によって行われる。検出およ
び参照電極の間に電場を発生させる。十分なシグナルが
感知されたならば、同じ機構がイオンの流入を阻止する
ようにして、センサーの寿命を長くする。外部から負荷
される電場に対するイオンチャネルの開口/閉鎖の感受
性は、ペプチドの双極子能率、その空間的方向性、およ
びヘリックス骨格への機械的結合に依存する。
用できる電子工学システムの集積部とすることができ
る。広スペクトルの化学的シグナルの検出に適してい
る。脂質二重層の脂質成分の制御により、この系は4℃
〜40℃の温度で機能するようにできる。デバイスを熱
調節ペルチェ体と適宜連結することにより操作温度を0
℃以下または40℃以上に拡大できる。
に付着されたならば、バイオセンサーは、抗体が作成で
きるかまたはリガンド活性化天然チャネルが存在する任
意、所望の分子を検出するために使用できる。必然に応
じて、様々な成分が各種シグナルの検出のために使用で
きる。
るが、これは本発明を限定するものではない。
ネルの生成の基盤となる原理は完全にはわかっていな
い。アラメチシンおよびメリチン(ミツバチ毒の乾燥重
量の50%)のようなペプチドはそれらが両親媒性ヘリ
ックスのペプチド(AHP)として挙動することから、
イオンチャネルを形成することが示唆されている。すな
わち、極性アミノ酸は、3.4周期性でポリペプチド鎖
中に存在する。α−ヘリックスの1ターンあたり3.6
残基の生成では、極性側鎖はらせんロッドの同じ側を向
くようになる。これはメリチンの配列ならびにそれが形
成するα−らせんロッドの側方および上方投射によって
例示できる(図3参照)。
発点として選択された。これは水溶性で、通常テトラマ
ーとして存在するものと思われる。しかしながら、それ
は多分、ポリペプチドのNH2末端における非極性の6
個のアミノ酸セグメント(下線)の存在により、脂質二
重層内に自発的に移動する。二重層内に取り込まれる
と、それはα−ヘリックス二次構造をよそおい、陰イオ
ン選択性チャネルを形成する。このチャネルは、膜の面
内における数個のヘリックスの集合体からなり、その疎
水性側鎖が周囲の脂質と接触してできている。それらの
親水性側鎖は脂質とは逆の方向を向いて、水性イオン伝
導孔を形成する。しかしながら、経時的におよび/また
は二重層内にさらにメリチンが導入されるに及び、比較
的に大きな孔部が生成し、セルの分解が優勢になってく
る。メリチンの配列(図3)の調査に際して、それはカ
ルボキシ末端の6個の塩基性アミノ酸のクラスター(ボ
ールドおよび下線)をもつことが認められ、この塩基性
アミノ酸のクラスターが、ポリL−リジンの場合のよう
に、メリチンの分解性に関与するものと考えられた。
置にプロリンを含有する。興味あることに、プロリンは
大部分の天然チャネルのイオン伝導セグメントの配列内
に豊富である。プロリンは、その存在により規則的なα
−ヘリックス骨格−水素結合の破壊を生じるアミノ酸で
ある。アミド残基の1個または2個のカルボニル基は水
素結合せず、その非結合電子はα−ヘリックスの全体的
極性および両親媒性コンフィギュレーションに寄与して
いない。
合成した。これは本明細書ではメリチンと呼び、以下の
配列を有する。NH2−Gly−Trp−Gly−Al
a−Val−Leu−Lys−Val−Leu−Thr
−Thr−Gly−Leu−Pro−Ala−Leu−
Ile−Ser−Cys−Ile−Lys−Gln−ア
ミド
飾が行われた。第一に、メリチンのカルボキシ末端の3
個の塩基性アミノ酸および1個のグルタミンは除去さ
れ、CH−1からは分解性が消失している。第二に、メ
リチンの残基2および19は、イソロイシンがトリプト
ファンに、トリプトファンがシステインにそれぞれ置換
されている。CH−1分子の他の部分はメリチンと同じ
である。位置19のシステインは反応中心として導入さ
れた。これは、直接付着またはジスルフィド生成によ
り、ヘリックス構造に変化を与えないで蛍光プローブ、
ハプテンまたは所望のエピトープを含むペプチドの置換
を可能にする。それは、合成後に、メチルジスルフィド
誘導体として(システイン−S−S−CH3)保護され
た。還元すると、ペプチドCH−1のパッキングを変え
ないで容易に蛍光体を付着できる反応基が生成する。シ
ステイン−19はハプテンまたは所望のエピトープを含
有するペプチドとの混合ジスルフィド接合体を形成させ
る(図5参照)反応中心として使用するのが最も重要で
ある。
合体はイオンチャネルを形成する。19の位置のシステ
インは、ハプテンの容易な付着を可能にする。たとえ
ば、ハプテンを含有するトリニトロベンゼン(TNB)
とのCH−1誘導体が製造された。このハプテンへの抗
体、たとえば抗−TNB抗体の結合は、ポリペプチドの
集合を阻害する。遊離のハプテンまたはハプテン様誘導
体(被験物質)、たとえばTNBまたは他のニトロ化芳
香族化合物誘導体の存在は、抗体から競合によってCH
−1ハプテン残基(たとえばCH−1−TNB)を放出
させて、イオンチャネルを形成させる。これによって、
CH−1に付着したハプテン誘導体(たとえばTNBま
たは他のニトロ化芳香族化合物誘導体)と同一または類
似の被験物質の存在をモニタリングできるバイオセンサ
ーの構築が可能になる。CH−1にジスルフィド結合で
付着させたシステイン含有ペプチドエピトープの使用も
適当である。
の角が立ったセクターは、テトラマー集合体の安定なイ
オンチャネルが構築されていることを示すものと思われ
る。図5は、脂質二重層内に浸漬されたヘリックスロッ
ド集合体としてCH−1を模式的に示した図である。
(A)に 極性の側鎖基(白い丸、正しい縮尺で描かれ
てはいない)が集合体の中心に向かっている。集合体の
シッフェル−エドムンドセンによるヘリックス投射
(B)は、極性の中心水性孔部領域を示している。ハプ
テン付着部位は距形で示されている。
形成の確率を低下させるものと思われる。チャネルの開
口は、二重層面内における自発的な側方拡散による一過
性の集合体形成がその原因になるという事実はまた、拡
散に対する任意の妨害もイオンチャネル形成の確率を低
下させることを示唆する。
イザーに基づく独特のペプチドシンセサイザーを用い、
改良されたカップリングおよび除去方法を用いて製造さ
れた。22工程のCH−1合成の総収率は80%であっ
た。ついでペプチドを99%以上に精製すると、HPL
C分析により単一の対称的なピークを生じた。
的および顕微鏡レベルで検査した。肉眼のレベルでは、
リポソーム中のバリノマイシン電位を消失させるのに必
要なCH−1の量を、ナトリウム媒体中に置いたK+含
有リポソームへのバリノマイシンの添加によるLoew
らの方法によって測定した。これは、膜内への陽イオン
性染料の移動の誘発、蛍光の消失が認められる膜内外電
位差を生じる。CH−1またはメリチンを添加すると、
リポソーム膜内へのそれらの導入がバリノマイシン電位
差を消失させ、染料の蛍光を回復させるイオンチャネル
を誘発する。CH−1は、バリノマイシン電位差を消失
させる能力に関しては、メリチンよりも有効であること
が観察された(図8A)。
チャネルの活性を顕微鏡で調べた結果を示している。こ
れらの活性は、毛管二重層測定法を用いた標準イオンチ
ャネル測定装置によって記録した。CH−1およびメリ
チンの等農度(0.1mMNaCl中ペプチド0.1μ
g)は、明白な単一チャネル形成を生じ、それは有意な
期間、開かれたままであることが観察できた。
で誘導体化した一連の同類のホスファチジルエタノール
アミン(PE)を製造して試験した。合成は次の一般的
操作に従って行った。
(オキシエチレン)11−CH2−CH2−SHの合成
は次のようにして実施した。すなわち、ポリエチレング
リコール製品(平均分子量600)を使用した。これは
平均12個のオキシエチレン基を含有する。それをホス
ファチジルエタノールアミンと反応させるためには、そ
れをまず三塩化リンと反応させてジブロモ誘導体に変換
した。水抽出液をベンゼンで抽出して低分子量画分を除
去し、ついでα,w−ジブロモポリ(オキシエチレン)
12をクロロホルムで抽出した。これは、プロトンNM
R、臭素の分析および2−ブタノン/H2O(1:1)
による薄層クロマトグラフィー(Rf=0.01)で特
徴づけられた。ジブロモポリオキシエチレン誘導体(過
剰)をテトラヒドロフラン−トリエチルアミン中、ホス
ファチジルアミンと封管内で加熱して結合させた。チオ
尿素を添加して、テトラヒドロフランをイソプロパノー
ルで置換させた。2時間還流するとブロモ誘導体がイソ
チオウロニウム塩に変換され、これを次に穏和なアルカ
リ加水分解によってメルカプタンに変換した。ホスファ
チジルエタノールアミン−N−ポリ(オキシエチレン)
−SHをシリカゲル中、落出液としてクロロホルム−メ
タノール−酢酸−水を用いたクロマトグラフィーによっ
て精製した。この誘導体は、リン酸塩とメルカプト基の
1:1の存在によって特徴づけられた(5,5′−ジチ
オ−ビス−2−ニトロ安息香酸からチオニトロ安息香酸
の遊離によって測定)。さらに、これは、リン酸基1個
あたり2個のアシル脂肪酸鎖を含有した。このアームは
30Åのオーダーの水相スペーシングを支持する。
の形成方法 3.1.テフロン壁部のコーティング 金線の導入前に、テフロンブロック内のウエルをヘキサ
ン中ヘキセデカン1滴で満たした。これをテフロンと2
0分間相互作用させる。ついでこれを除去し、ウエルを
0.1mM NaCl,0.05M HEPES 緩衝
液、pH7.4の液で洗浄した。
でシールされるように挿入して調製した。挿入前に、金
線を酸でエッチングして洗浄した。
ることにより精製し、乾燥し、ついでクロロホルム−メ
タノール(2:1)に溶解した。この溶液に、クロロホ
ルム溶液中コレステロールを、リン脂質とコレステロー
ルのモル比が5:1になるように添加した。さらに、テ
トラヒドロフランに溶解したホスファチジルエタノール
アミン−N−エチレン−(オキシエチレン)10エチレ
ン−メルカプタン(例2の架橋分子)を、リン脂質と架
橋分子のモル比が50:1になるように添加した。さら
に、α−トコフェロールを、リン脂質200あたりα−
トコフェロール1のモル比で添加した。混合後、溶媒を
除去し、脂質を0.1mMNaCl,0.05M HE
PES緩衝液、pH7.4中オクチルグルコシドの溶液
を添加して分散させ、ミセルを形成させた。オクチルグ
ルコシドは、各リン脂質あたり2分子の界面活性剤が存
在するように添加した。この比により、リン脂質、コレ
ステロールおよび架橋アームを含有するオクチルグルコ
シドの混合ミセルが形成される。
加え、ミセルを架橋アームによって金に付着させる(2
時間〜一夜、室温)。混合ミセルが金電極に付着したの
ち、金電極の反対の末端でウエルに透析膜を付着させ、
ウエル内に空気が捕捉されなかったことを確認した。全
集合体をついで、0.1mM NaCl,0.05M
HEPES緩衝液、pH7.4を充填した大容器中に導
入し、オクチルグルコシドを透析によって除去した。こ
れには24時間を要した。透析膜を除去し、電極上の溶
液を注意深く除去し、数回、0.1mM NaCl,
0.05M HEPES緩衝液、pH7.4によって置
換した。
の透析を行う。これにより、電極に付着した連続二重層
の生成と、その側部のヘキサデカン被覆テフロンとの相
互作用によるシールが行われた。さらに、過剰の脂質が
リポソームを形成するが、これは3.4に詳述した洗浄
操作で除去される。電極をウエルの上部に置くことによ
り、この対照電極と金電極の間のインピーダンスの測定
が可能になる。金属極に付着する二重層の形成とその側
部のヘキサデカン被覆テフロンとの相互作用によるシー
ルは、電極間の電流に対するきわめて高いインピーダン
スの存在によって確認される。得られた値は、基礎伝達
度が5〜10pSのオーダーであることを示している。
測定はMontal平面脂質二重層による単一チャネル
形成の測定に使用したのと同じ装置を用いて実施した。
度測定のための使用 本発明のデバイスは、サンプル中の被験物質の分析方法
に有用である。この場合、サンプルは、ハプテンとして
被験物質または被験物質様残基を含有するメリチン様ペ
プチドを模した脂質二重層からなり、全分子はハプテン
に対する抗体に結合しているバイオセンサーと接触させ
る。ここに詳述する例では、ペプチドCH−1に接着さ
せるハプテンとしてトリニトロベンゼン(TNB)を使
用し、被験物質としての遊離TNB−誘導体の濃度を測
定した。同様にして、CH−1に付着させたサイロキシ
ンを使用して、サンプル中の遊離サイロキシンを測定で
きる。
ニル−システインを製造した。これをホウ酸緩衝液、p
H8.0中で当量のジチオ−ビス−ニトロ安息香酸と反
応させた。反応終了後(チオニトロ安息香酸の遊離を4
12nmで測定した)、これを精製することなく0.6
mM DTTによりpH9.0で予め処理し、ついでH
PLCでCH−1のシステイン−19のチオール基を保
護するために用いられたチオメチール基を除去したCH
−1の溶液に加えた。反応はチオニトロ安息香酸の遊離
によって追跡した。反応完了後、生成したN−TNB−
β−アラニル−システイン−CH−1ジスルフィドを、
アセトニトリル勾配を用いたHPLCによって精製し
た。
ステイン−CH−1ジスルフィドとTNP−抗体および
金電極に付着した二重層の相互作用 N−TNB−β−アラニル−システイン−CH−1ジス
ルフィド(ハプテン−CH−1)を、TNB残基に対す
る高い特異性と高い親和性定数を有するモノクローナル
抗体と処理した。ハプテン−CH−1のチャネル活性を
中和するのに必要な量を、ハプテン−CH−1の抗−ハ
プテン抗体による、Montalセットアップでの平面
脂質二重層の存在下における滴定で測定した。この化学
量論がわかると、ハプテン−CH−1と抗−ハプテン抗
体が、チャネルを中和する比率で、金電極に付着した二
重層に添加される。測定された基礎チャネル活性は無視
できるものである。遊離N−TNB−アラニルシステイ
ンを被験物質として添加すると、遊離TNB−誘導対と
ハプテン−CH−1−抗−ハプテン抗体複合体の競合に
よりハプテン−CH−1の放出が起こり、これが二重層
中にイオンチャネルを形成させる。チャネル活性は、遊
離されたハプテン−CH−1の濃度に相関し、一方これ
は被験物質の濃度に相関する。測定されるハプテン−C
H−1の濃度は抗体親和性に依存して変動する。一般
に、チャネル形成はきわめて高い感度で検出できるの
で、ハプテンに対する抗−ハプテン抗体の親和性曲線の
最初の3分の1に比例性が観察される。3×108mo
l−1,1−1の親和性をもつ抗体では、平均濃度10
−8Mの被験物質が検出できる。与えられた範囲内での
応答の直線性は与えられた抗体について適当である。し
かしながら、各抗体の検量は必要である。
有する二重層の生成方法 生物イオンチャネルを模倣した脂質二重層からなる本発
明のバイオセンサーはサンプル中のリガンドの検出に有
用である。この場合、サンプルは、受容体またはそのリ
ガンドの受容体の受容部からなるハイブリッド分子によ
って構成されるイオンチャネルを包含するバイオセンサ
ーと接触させる。
混合ミセルの製造 アセチルコリン受容体は、Naja najaトキシン
との親和性クロマトグラフィーを用いる標準方法で精製
した。ついでこれを、3.3に記載したと同一の成分を
含む混合ミセル中に導入した。リン脂質とアセチルコリ
ン受容体の比は200:1であった。
ほぼ同様にして実施した。
性は、ドパントを添加しない場合の値よりもわずかに高
かった。伝導度は10〜15pSの間で変動した。電極
に付着した二重層の外側表面が浸漬されている媒体にア
セチルコリンを添加すると、ノイズのレベルの上昇が出
現し、異なる活性レベルを有する別個のチャネル現象が
観察される。この活性の上昇は30分ほど続いた。総ノ
イズレベルの上昇および伝達性の上昇は、アセチルコリ
ンの存在の検知を可能にする。アセチルコリンがなけれ
ば、また受容体と結合しない他のアミンの存在下には活
性は低く維持される。アセチルコリンの添加により、シ
グナルは明らかに増大する。
図である。図2は溶媒和脂質二重層を係留している提案
された電極を例示する図である。図3はハチ毒、メリチ
ンの構造を示す図である。図4は本発明のペプチドCH
−1の構造を示す図である。図5は脂質二重層内に浸漬
したヘリックス状の棒状集合体としてCH−1を模式的
に示している。(A)は集合体の中心に向いた極性側鎖
基(白丸、正確な縮尺で描かれたものではない)を示
す。集合体のシッファー・エドマンドソンらせん投影
(B)は、極性中心水性小孔領域を示している。ハプテ
ン付着部位は矩形で描かれている。図6はCH−1への
ハプテンの付着部位を示す。図7はチャネル形成免疫検
定法の原理を模式的に示す図である。図8はCH−1の
イオンチャネル活性を示す。(A)はアソレクチンリポ
ソーム中、バリノマイシン誘導K+拡散電位の脱分極を
示す。(B)はガラス毛細管の先端における平面脂質二
重層内の単一チャネル活性を示す。
極表面に付着しているバイオセンサーに関する。脂質二
重層は生物または合成イオンチャネルを模したものであ
る。このバイオセンサーは、定性および定量的分析に有
用である。
シグナルを、連結したカスケード様増幅反応の開始によ
って認識する。これらの多くでは、カスケードの開始ま
たは中間工程に、膜関連イオンチャネルの開口が関与し
ている。リガンド活性化チャネルにおいては、その過程
は、チャネル蛋白質に構造的にまたは機械的に連結した
特異的受容体に対する小さなエフェクター分子(神経伝
達物質、オードラントまたはフレーバー)の結合によっ
て開始される。これは、脂質二重層を横切る孔部の開口
を招き、膜の電気コンダクタンスの段階的増大を生じる
チャネル蛋白質のコンホーメーションの変化を誘導す
る。生物チャネルは人工脂質二重層に機械的に再生する
ことが可能で、これは生体膜に生じるのと実質的に同一
のエフェクター誘導電流を招来する。現在利用できる電
子増幅手段によればシグナルチャネルの開口現象を検知
することができる。
チドが人工二重層でイオンチャネルを形成することが明
らかにされている。二重層を横切る伝導路は、水の小孔
の壁部を形成する数個のペプチドの整合的集合によって
形成される。さらに、それらの一次配列を修飾すること
により、特定のチャネルの性質を変更できる。膜の面内
におけるペプチドの側方および回転可動性を制限するこ
とによって、独立に、チャネル形成を制御することかで
きる。
層の核によって形成された誘導体を通過するイオンの流
れを制御する装置である。二重層を、検知電極に、1)
高度に安定で、2)蛋白質やペプチドがその内部にチャ
ネルを作る媒体として働く能力を保持するように付着で
きれば、独特の種類のバイオセンサーが得られるはずで
ある。
から知られている。ラングミュアとプロジェットによっ
て導入された方法が、電極へのリン脂質の吸着が関与す
る装置の開発にいまだに利用されている。この方法によ
り、両親媒性分子の単分子膜が水―空気界面から固体表
面に、それを順序正しく水コンパートメント内に押し込
みついで引き上げると、移される。分子の両親媒性と水
−空気界面から固体表面の通過の順序によって、層は固
体表面に対する疏水性−親水性の方向性を変え、したが
って累積二重層が形成される。これらの層が加湿条件下
に作成されると、限られた可動性を有するわずかな水分
子が二重層内に捕捉される。しかしながら、これらの系
は二重層の間に、バルク型の溶媒水分子を保持すること
はできない。液体様の界面であれば、現実には、内部の
累積マトリックスから外部層が脱着してしまうからであ
る。したがって、第一層と電極表面の間のバルク水性媒
体か絶対に容認できないことは明白である。
おけるバルク溶媒水の欠如は、生物学的様系の模倣、と
くに機能性イオンチャネル形成ポリペプチドの導入にそ
れらを不適当にする。
て作成された先行技術のデバイスの2つの例が、豪州特
許出願AU40123/85および、WO89/011
59号として公開されたPCT国際出願に見出される。
ばれた物質が膜表面に存在すると、イオンを通過するよ
うに適合されたフィルムまたは膜を利用する固体状態の
電気化学センサーが開示されている。とくに、この電気
化学センサーは、ベース基層と、ベース基層に付着した
物質の層を包含し、層ヘのイオンの輸送に応答して電流
を生じる。この層は実際、イオン流を電流に転換または
変換する。また、イオンを検出すべき物質または化学種
を含有する液体から層に輸送するため、層に付着させる
膜を包含する。膜は、化学種と相互作用してイオンを液
体から膜へ浸透させるゲート分子を包含する。
親媒性分子がぎっしりつまって配列した膜で、複数個の
イオンチャネルおよび/または支持体と接合して受容体
分子を構成する自己集合性分子の少なくとも一部からな
ることを特徴とする膜が記載されている。イオンチャネ
ルは、ヘリックスおよびその集合体、コロナンド、クリ
プタンド、ポタンドならびにそれらの配合体を形成でき
るペプチドからなる群より選ばれる。支持体と接合した
受容体分子からなる両親媒性分子においては、受容体分
子は受容部位を有し、免疫グロブリン、抗体、抗体フラ
グメント、染料、酵素およびレクチンからなる群より選
ばれる。支持体部は、脂質ヘッド基、炭化水素鎖、架橋
可能分子および膜蛋白質からなる群より選ばれる。支持
体部は受容体分子と受容部位から離れた末端において付
着する。固体表面に付着したこのような膜二重層からな
るバイオセンサーも開示されている。
電極付着溶媒和脂質二重層からなるバイオセンサーに関
する。チャネルの開口は、検出される分子との相互作用
によって誘導される。これは二重層伝導度の段階的増大
を生じ、それが電極によって検知される。
して記録電極に付着した両親媒性液体結晶膜であり、そ
の両表面においてバルク水性電解質媒体に連続的に接触
している。
は、電極物質に強固に結合可能な残基たとえば−SHま
たはチオエーテル残基を末端に有するポリオキシエチレ
ン鎖をもつホスファチジルエタノールアミンに連結した
親水性スペーサーアームからなる。
図である。図2は溶媒和脂質二重層を係留している提案
された電極を例示する図である。図3はハチ毒、メリチ
ンの構造を示す図である。図4は本発明のペプチドCH
−1の構造を示す図である。図5は、脂質二重層内に浸
漬したへリツクス状の棒状集合体としてCH−1を模式
的に示している。(A)は集合体の中心に向いた極性側
鎖基(白丸、正確な縮尺で描かれたものではない)を示
す。集合体のシッファー−エドマンドソンらせん投影
(B)は、極性中心水性小孔領域を示している。ハプテ
ン付着部位は矩形で描かれている。図6はCH−1への
ハプテンの付着部位を示す。図7はチャネル形成免疫検
定法の原理を模式的に示す図である。図8はCH−1の
イオンチャネル活性を示す。(A)アソレクチンリポソ
ーム中、バリノマイシン誘導K+拡散電位の脱分極を示
す。(B)はガラス毛細管の先端における平面脂質二重
層内の単一チャネル活性を示す。
り、これに架橋係留分子を介して両親媒性液体結晶脂質
二重層膜が付着し、この膜はその両面でバルク水性電解
質媒体に連続的に接触し、その二重層境界は脂質鎖の疏
水性成分と非極性壁部の間の非極性接触によってシール
される。この二重層は、合成または生物イオンチャネル
を模したもので、その開口は適当な外的影響との相互作
用により、たとえば検出すべきリガンドによって誘導さ
れ、その結果、膜の電気的姓質に変化を生じ、それが電
極によって感知され、測定される。
たとえば大豆アソレクチンであり、好ましいイオンチャ
ネルはヘリックスおよび集合体を形成できる蛋白質また
は合成ペプチドから構成される。
およびペプチドかその生物学的特異的活動をその中で発
揮できる適当な媒体を構成しなければならないので、液
体結晶状態に保持される。すなわち、チャネル蛋白質お
よびペプチドは、イオンチャネルの自発的形成が可能な
ように、十分な側方可動性を保持していなければならな
い。同時に、膜はその内部に取り付けられるバイオセン
サーデバイスが長い寿命を示すように機械的に安定でな
ければならない。適切に機能するためには、リン脂質二
重層はバルク水媒体中に浸漬していなければならない。
したがって、膜の両側には常にバルク水が存在しなけれ
しばならない。
成分の側方可動性により誘発される可能性がある干渉を
最小にするように、二重層の機械的強化を目的に設計さ
れている。この要求に合致するためには、細胞骨格また
は細胞マトリックスに対する細胞膜の相互作用に基づく
アプローチが採用された。細胞骨格は、すべての生物細
胞に共通な、膜の内側表而における別個の点に結合する
ポリペプチド肋材によって主として作られている機械的
支持系である。類似の連結部により、赤血球や上皮細胞
のような細胞の膜が長期間にわたり著しい機械的ストレ
スに対して耐えることを可能にしている。
電極に付着させる新規な方法が案出された。すなわち、
2つの主要成分、一般的なリン脂質たとえばホスファチ
ジルエタノールアミン(PE)、および末端が金属に対
して高い親和性を有する残基で置換された高親水性スペ
ーサーアームから構成される錨分子の合成を包含する。
たとえば、様々な鎖長のオキシエチレンとその末端にチ
オールまたはチオエーテル残基を含有するホスファチジ
ルエタノールアミン誘導体を特定の錨分子として、チャ
ネル機能に必要な動的性質を維持した安定な溶媒和二重
層が、本発明により、金電極表面に付着された。
図2に例示する。この新規な構造は主として、二重層と
電極の両表面にほぼ垂直に配置された複数個の細長い錨
分子または極性スペーサー架橋によって、電極(好まし
くは、貴金属たとえば銀、金、白金、または金属メツ
キ)に付着された脂質二重層からなる。電極に付着し
た、ある厚さの層をなす全構造が水性媒体中に浸漬さ
れ、脂質二重層が膜を決定する。
を図1に示す。テフロンブロック11は円形のウエル1
2を包含し、その底部に電極13が配置される。この電
極13に、リン脂質二重層14(挿入図および図2も参
照)が、二重層14と電極13の間のバルク水槽15が
存在するようにして付着される。二重層の境界は側方
で、リン脂質の疎水性成分とテフロンの間の非極性接触
によってシールされる。二重層はさらに、イオンチャネ
ル形成ペプチド(図には示していない)を含有する。第
二の参照電極16は二重層の上方に配置される。テフロ
ンの代わりに、炭化水素と強力に相互作用するプラスチ
ック材料、たとえばポリスチレンを使用することもでき
る。
強固に接触保持された両親媒性リン脂質二重層か形成さ
れる。この構造により、約50Åから約75Åのオーダ
ーの厚さをもち、したがって包埋された機能性ペプチド
およひ蛋白質を支持できる液体結晶膜が生成する。リン
脂質膜は電極に接近して、それと平行に配置されるが、
それとの間に空間をおいて、約15Å〜50Åの長さの
架橋錨分子によってそれと付着され、全構造が水性媒体
中に置かれる。径約2mmのバイオセンサーを試験し、
著しく安定であることが見出された。
ペーサーアームを介して電極に付着した溶媒和リン脂質
二重層からなる。使用が好ましいアームは、ポリ(オキ
シエチレン)n(nは約8〜約25であることが好まし
い)から構成されるが、鎖には他の極性残基が含まれて
いてもよく、たとえばポリアミノ酸鎖でもよい。鎖はす
べて、その末端が、チオールもしくはチオエーテル残
基、またはその他の電極に高い親和性をもつ適当な付着
分子によって終結する。これらの分子の親水性部分は、
親水性部分が水と強い相互作用を示す複数個のオキシエ
チレン鎖で作られている天然のある種の界面活性剤分
子、たとえばTritonと化学的に類似している。
合脂質を使用することが可能になる。たとえば、その小
成分は付着に用いられるスペーサー分子をもつリン脂質
で、大部分のリン脂質が二重層構造を決定するように選
択できる。
ペーサー分子によって行う本発明のアプローチには、以
下の新しい特徴がある。すなわち、a)バルク水が電極
表面および二重層の両側に存在する、b)非係留脂質お
よひ二重層内に導入されたポリペプチドの移動が可能で
ある、C)二重層は適度の安定性と、電極表面に関して
固定された幾何的配置を有し、これはその表面への錨分
子の反復付着によるものである、d)上記の固定された
幾何的配置により、脂質二重層は電極の輪郭に従うの
で、原子分解時における電極表面の絶対的な平滑化は重
要ではない。
通すイオンの通過が可能になるイオンチャネルを模倣し
たものである。
の方法がある。そのデバイス中に存在する成分蛋白質ま
たはペプチドによって、チャネルの開口は2種の別個の
機構によって誘発できる。第一は、予め存在する固定ま
たは組立てチャネルのリガンド誘発開口である。第二の
機構は、両親媒性ペプチドが自発的に集合してチャネル
集合体を形成するのを妨げている動揺の特異的な除去に
基づくものである。
のチャネル、たとえばアセチルコリンまたはGABA受
容体である。これらのチャネルは、適当な細胞から高度
に精製するか、または遺伝子操作によって得られる。つ
いで、これらを電極支持人工二重層内に導入できる。次
に、二重層を、非占拠時に受容体−チャネルが閉じた状
態で支持されるように調整する。リガンドがその特異的
受容体部位に結合すると、神経系の場合のように、チャ
ネルの開口の引き金となるコンホーメーション変化が誘
発される。このアプローチは、in vivoにおける
受容体によるアゴニストまたはリガンド感知をそのまま
模倣したデバイスの形成を可能にする。アセチルコリン
受容体の場合には、さらに、センサー集合体にアセチル
コリンエステラーゼを添加すれば、アゴニストおよびア
ンタゴニスト両者に対する神経系の感受性のシミュレー
ションが可能になる。この可能性によりまた、第二の蛋
白質のリガンドまたはチャネル形成部と相互作用する反
復部位を含有するハイブリッド受容体分子が本発明によ
り考慮できる。これらのハイブリッド分子は慣用の遺伝
子操作法で製造できる。
様ペプチド、たとえば本明細書においてはCH−1と呼
ぶ新規な合成ペプチド(下記参照)に関するものであ
る。これらは、適当な接近と軸方向をもって適度の集合
状態に到着したとき、イオンチャネルとして機能する集
合体を形成できる(図5参照)。この分類では、バイオ
センサーは、要素の反復部分としてハプテン、阻害性リ
ガンド成分として抗体の使用に基づいて構築される。
に挿入されると参照電極のコンパートメントに向けられ
るCH−1の一端にハプテンを付着させると、上部溶媒
コンパートメントに添加されたハプテンに対するモノク
ローナル抗体との相互作用が可能になる。ハプテン−C
H−1に抗体が結合している限り、それらは、立体障害
により、イオンチャネルの形成に必要な合成ハプテン−
CH−1の適切な集合を防止する(図7、上部参照)。
検知すべき遊離のハプテンまたはハプテン様分子(被験
物質)の添加は、抗体結合部位に対する競合およひ抗体
との相互作用からのハプテン−CH−1の放出により、
イオンチャネルの自発的形成(図7、下部参照)とイオ
ン伝導度の増大によるその検知を可能にする。この方法
により、それに対する特異的モノクローナル抗体を生成
する分子を検出できるバイオセンサーの設計が可能にな
る。
SとnSの間)ことから、数個の分子の結合によって誘
発されるただ1個のチャネルの開口も容易に検知でき
る。これらの系で記録された感度はナノモルの範囲であ
る。
ンチャネル部位の化学体との相互作用で、このようなチ
ャネルの開口を生じる。同様にして、このようなチャネ
ルは、適当な電磁線たとえばUVからIRまでおよびも
っと高波長の種類の光のような電磁線と相互作用して、
開口および伝導性の変化を生じさせることができる。光
と相互作用してその構造を変え、その結果、センサーの
伝導性を変化させる発色体または他の光感受体からなる
イオンチャネルを構築することもできる。この目的に適
当な分子は、適当な感作分子たとえばカルボシアニンま
たはメロシアニンによってより長い波長に感作できるス
チルベン誘導体を含有するペプチドである。
ためには、ある種の弛緩機構が付与される。受容体結合
アゴニストまたはリガンドは、チャネル−受容部位か
ら、結合した化学体を除去するのに適当な酵素を二重層
内に導入するかまたは二重層の上方の水性コンパート内
のセルの壁部に付着させることによって除去される。酵
素活性は、デバイスを検知すべき物質に暴露したとき、
その濃度が一過性に上昇してチャネルを開くように調整
される。本発明の新規なデバイスではジメンションか縮
小されているので、拡散による応答時間が短縮される。
次に、酵素分解により、検出すべき物質は低レベルに減
少し、検出サイクルの再開が可能になる。チャネルの反
応はきわめて早いので、チャネルと酵素の適当な組合せ
は実験によって容易に確立することができる。
程洗浄操作によって回復する。第一の洗浄で検出分子−
抗体複合体が除去され、第二の操作は主として、遊離抗
体分子の補充の働きがある。
媒体の復原は逆イオン流入によって行われる。検出およ
び参照電極の間に電場を発生させる。十分なシグナルが
感知されたならば、同じ機構がイオンの流入を阻止する
ようにして、センサーの寿命を長くする。外部から負荷
される電場に対するイオンチャネルの開口/閉鎖の感受
性は、ペプチドの双極子能率、その空間的方向性、およ
びヘリックス骨格への機械的結合に依存する。
用できる電子工学システムの集積部とすることができ
る。広スペクトルの化学的シグナルの検出に適してい
る。脂質二重層の脂質成分の制御により、この系は4℃
〜40℃の温度で機能するようにできる。デバイスを熱
調節ペルチェ体と適宜連結することにより操作温度を0
℃以下または40℃以上に拡大できる。
に付着されたならば、バイオセンサーは、抗体が作成で
きるかまたはリガンド活性化天然チャネルが存在する任
意、所望の分子を検出するために使用できる。必然に応
じて、様々な成分が各種シグナルの検出のために使用で
きる。
るが、これは本発明を限定するものではない。
ネルの生成の基盤となる原理は完全にはわかっていな
い。アラメチシンおよびメリチン(ミツバチ毒の乾燥重
量の50%)のようなペプチドはそれらが両親媒性ヘリ
ックスのペプチド(AHP)として挙動することから、
イオンチャネルを形成することが示唆されている。すな
わち、極性アミノ酸は、3.4周期性でポリペプチド鎖
中に存在する。α−ヘリックスの1ターンあたり3.6
残基の生成では、極性側鎖はらせんロッドの同じ側を向
くようになる。これはメリチンの配列ならびにそれが形
成するα−らせんロッドの側方および上方投射によって
例示できる(図3参照)。
発点として選択された。これは水溶性で、通常テトラマ
ーとして存在するものと思われる。しかしながら、それ
は多分、ポリペプチドのNH2末端における非極性の6
個のアミノ酸セグメント(下線)の存在により、脂質二
重層内に自発的に移動する。二重層内に取り込まれる
と、それはα−ヘリックス二次構造をよそおい、陰イオ
ン選択性チャネルを形成する。このチャネルは、膜の面
内における数個のヘリックスの集合体からなり、その疏
水性側鎖が周囲の脂質と接触してできている。それらの
親水性側鎖は脂質とは逆の方向を向いて、水性イオン伝
導孔を形成する。しかしながら、経時的におよび/また
は二重層内にさらにメリチンが導入されるに及び、比較
的に大きな孔部が生成し、セルの分解が優勢になってく
る。メリチンの配列(図3)の調査に際して、それはカ
ルボキシ末端の6個の塩基性アミノ酸のクラスター(ボ
ールドおよび下線)をもつことが認められ、この塩基性
アミノ酸のクラスターが、ポリL−リジンの場合のよう
に、メリチンの分解性に関与するものと考えられた。
置にプロリンを含有する。興味あることに、プロリンは
大部分の天然チャネルのイオン伝導セグメントの配列内
に豊富である。プロリンは、その存在により規則的なα
−ヘリックス骨格−水素結合の破壊を生じるアミノ酸で
ある。アミド残基の1個または2個のカルボニル基は、
水素結合せず、その非結合電極はα−ヘリックスの全体
的極性および両親媒性コンフィギュレーションに寄与し
ていない。
合成した。これは本明細書ではメリチンと呼び、以下の
配列を有する。NH2−Gly−Trp−Gly−Al
a−Val−Leu−Lys−Val−Leu−Thr
−Thr−Gly−Leu−Pro−Ala−Leu−
Ile−Ser−Cys−Ile−Lys−Gln−ア
ミド
飾が行われた。第一に、メリチンのカルボキシ末端の3
個の塩基性アミノ酸および1個のグルタミンは除去さ
れ、CH−1からは分解性が消失している。第二に、メ
リチンの残基2および19は、イソロイシンがトリプト
ファンに、トリプトファンがシステインにそれぞれ置換
されている。CH−1分子の他の部分はメリチンと同じ
である。位置19のシステインは反応中心として導入さ
れた。これは、直接付着またはジスルフィド生成によ
り、ヘリックス構造に変化を与えないで蛍光プローブ、
ハプテンまたは所望のエピトープを含むペプチドの置換
を可能にする。それは、合成後に、メチルジスルフィド
誘導体として(システイン−S−S−CH3)保護され
た。還元すると、ペプチドCH−1のパッキングを変え
ないで容易に蛍光体を付着できる反応基が生成する。シ
ステイン−19はハプテンまたは所望のエピトープを含
有するペプチドとの混合ジスルフィド接合体を形成させ
る(図5参照)反応中心として使用するのが最も重要で
ある。
合体はイオンチャネルを形成する。19の位置のシステ
インは、ハプテンの容易な付着を可能にする。たとえ
ば、ハプテンを含有するトリニトロベンゼン(TNB)
とのCH−1誘導体が製造された。このハプテンへの抗
体、たとえば抗−TNB抗体の結合は、ポリペプチドの
集合を阻害する。遊離のハプテンまたはハプテン様誘導
体(被験物質)、たとえばTNBまたは他のニトロ化芳
香族化合物誘導体の存在は、抗体から競合によってCH
−1ハプテン残基(たとえばCH−1−TNB)を放出
させて、イオンチャネルを形成させる。これによって、
CH−1に付着したハプテン誘導体(たとえばTNBま
たは他のニトロ化芳香族化合物誘導体)と同一または類
似の被験物質の存在をモニタリングできるバイオセンサ
ーの構築が可能になる。CH−1にジスルフィド結合で
付着させたシステイン含有ペプチドエピトープの使用も
適当である。
の角が立ったセクターは、テトラマー集合体の安定なイ
オンチャネルが構築されていることを示すものと思われ
る。図5は、脂質二重層内に浸漬されたヘリックスロッ
ド集合体としてCH−1を模式的に示した図である。
(A)にお極性の側鎖基(白い丸、正しい縮尺で描かれ
てはいない)が集合体の中心に向かっている。集合体の
シッフェル−エドムンドセンによるヘリックス投射
(B)は、極性の中心水性孔部領域を示している。ハプ
テン付着部位は距形で示されている。
形成の確率を低下させるものと思われる。チャネルの開
口は、二重層面内における自発的な側方拡散による一過
性の集合体形成がその原因になるという事実はまた、拡
散に対する任意の妨害もイオンチャネル形成の確率を低
下させることを示唆する。
イザーに基づく独特のペプチドシンセサイザーを用い、
改良されたカッブリングおよひ除去方法を用いて製造さ
れた。22工程のCH−1合成の総収率は80%であっ
た。ついでペプチドを99%以上に精製すると、HPL
C分析により単一の対称的なピークを生じた。
的および顕微鏡レベルで検査した。肉眼のレベルでは、
リポソーム中のバリノマイシン電位を消失させるのに必
要なCH−1の量を、ナトリウム媒体中に置いたK+含
有リポソームへのバリノマイシンの添加によるLoew
らの方法によって測定した。これは、膜内への陽イオン
性染料の移動の誘発、蛍光の消失が認められる膜内外電
位差を生じる。CH−1またはメリチンを添加すると、
リポソーム膜内へのそれらの導入がバリノマイシン電位
差を消失させ、染料の蛍光を回復させるイオンチャネル
を誘発する。CH−1は、バリノマイシン電位差を消失
させる能力に関しては、メリチンよりも有効であること
が観察された(図8A)。
チャネルの活性を顕微鏡で調べた結果を示している。こ
れらの活性は、毛管二重層測定法を用いた標準イオンチ
ャネル測定装置によって記録した。CH−1およびメリ
チンの等濃度(0.1mMNaCl中ペプチド0.1μ
g)は、明白な単一チャネル形成を生じ、それは有意な
期間、開かれたままであることが観察できた。
で誘導体化した一連の同類のホスファチジルエタノール
アミン(PE)を製造して試験した。合成は次の一般的
操作に従って行った。
(オキシエチレン)11−CH2−CH2−SHの合成
は次のようにして実施した。すなわち、ポリエチレング
リコール製品(平均分子量600)を使用した。これは
平均12個のオキシエチレン基を含有する。それをホス
ファチジルエタノールアミンと反応させるためには、そ
れをまず三塩化リンと反応させてジブロモ誘導体に変換
した。水抽出液をベンゼンで抽出して低分子量画分を除
去し、ついでα,ωジブロモポリ(オキシエチレン)
12をクロロホルムで抽出した。これは、プロトンNM
R,臭素の分析および2−ブタノン/H2O(1:1)
による薄層クロマトグラフィー(Rf=0.01)で特
徴づけられた。ジブロモポリオキシエチレン誘導体(過
剰)をテトラヒドロフラン−トリエチルアミン中、ホス
ファチジルアミンと封管内で加熱して結合させた。チオ
尿素を添加して、テトラヒドロフランをイソプロパノー
ルで置換させた。2時間還流するとブロモ誘導体がイソ
チオウロニウム塩に変換され、これを次に穏和なアルカ
リ加水分解によってメルカプタンに変換した。ホスファ
チジルエタノールアミン−N−ポリ(オキシエチレン)
−SH―をシリカゲル中、溶出液としてクロロホルム−
メタノール−酢酸−水を用いたクロマトグラフィーによ
って精製した。この誘導体は、リン酸塩とメルカプト基
の1:1の存在によって特徴づけられた(5,5′−ジ
チオ−ビス−2−ニトロ安息香酸からチオニトロ安息香
酸の遊離によって測定)。さらに、これは、リン酸基1
個あたり2個のアシル脂肪酸鎖を含有した。このアーム
は30Åのオーダーの水相スペーシングを支持する。
の形成方法 3.1. テフロン壁部のコーテイング 金線の導入前に、テフロンブロック内のウエルをヘキサ
ン中ヘキサデカン1滴で満たした。これをテフロンと2
0分間相互作用させる。ついでこれを除去し、ウエルを
0.1mM NaCl,0.05M HEPES緩衝
液、pH7.4の溶液で洗浄した。
シールされるように挿入して調製した。挿入前に、金線
を酸でエッチングして洗浄した。
ることにより精製し、乾燥し、ついでクロロホルム−メ
タノール(2:1)に溶解した。この溶液に、クロロホ
ルム溶液中コレステロールを、リン脂質とコレステール
のモル比が5:1になるように添加した。さらに、テト
ラヒドロフランに溶解したホスファチジルエタノールア
ミン−N−エチレン−(オキシエチレン)10エチレン
−メルカプタン(例2の架橋分子)を、リン脂質と架橋
分子のモル比が50:1になるように添加した。さら
に、α−トコフェロールを、リン脂質200あたりα−
トコフェロール1のモル比で添加した。混合後、溶媒を
除去し、脂質を0.1mMNACl,0.05M HE
PES緩衝液、pH7.4中オクチルグルコシドの溶液
を添加して分散させ、ミセルを形成させた。オクチルグ
ルコシドは、各リン脂質あたり2分子の界面活性剤が存
在するように添加した。この比により、リン脂質、コレ
ステロールおよび架橋アームを含有するオクチルグルコ
シドの混合ミセルが形成される。
加え、ミセルを架橋アームによって金に付着させる(2
時間〜一夜、室温)。混合ミセルが金電極に付着したの
ち、金電極の反対の末端でウエルに透析膜を付着させ、
ウエル内に空気が捕捉されなかったことを確認した。全
集合体をついで、0.1mM NAC1,0.05M
HEPES緩衝液、pH7.4を充填した大容器中に導
入し、オクチルグルコシドを透析によって除去した。こ
れには24時間を要した。透析膜を除去し、電極上の溶
液を注意深く除去し、数回、0.1mM NACl,
0.05M HEPES緩衝液、pH7.4によって置
換した。
の透析を行う。これにより、電極に付着した連続二重層
の生成と、その側部のヘキサデカン被覆テフロンとの相
互作用によるシールが行われた。さらに、過剰の脂質が
リポソームを形成するが、これは3.4に詳述した洗浄
操作で除去される。電極をウエルの上部に置くことによ
り、この対称電極と金電極の間のインピーダンスの測定
が可能になる。金属極に付着する二重層の形成とその側
部のヘキサデカン被覆テフロンとの相互作用によるシー
ルは、電極間の電流に対するきわめて高いインピーダン
スの存在によって確認される。得られた値は、基礎伝達
度が5〜10pSのオーダーであることを示している。
測定はMontal平面脂質二重層による単一チャネル
形成の測定に使用したのと同じ装置を用いて実施した。
度測定のための使用 本発明のデバイスは、サンプル中の被験物質の分析方法
に有用である。この場合、サンプルは、ハプテンとして
被験物質または被験物質様残基を含有するメリチン様ペ
プチドを模した脂質二重層からなり、全分子はハプテン
に対する抗体に結合しているバイオセンサーと接触させ
る。ここに詳述する例では、ペプチドCH−1に接着さ
せるハプテンとしてトリニトロベンゼン(TNB)を使
用し、被験物質としての遊離TNB−誘導体の濃度を測
定した。同様にして、CH−1に付着させたサイロキシ
ンを使用して、サンプル中の遊離サイロキシンを測定で
きる。
ニル−システインを製造した。これをホウ酸緩衝液、p
H8.0中で当量のジチオ−ビス−ニトロ安息香酸と反
応させた。反応終了後(チオニトロ安息香酸の遊離を4
12nmで測定した)、これを精製することなく0.6
mM DTTによりpH9.0で予め処理し、ついでH
PLCでCH−1のシステイン−19のチオール基を保
護するために用いられたチオメチール基を除去したCH
−1の溶液に加えた。反応はチオニトロ安息香酸の遊離
によって追跡した。反応完了後、生成したN−TNB−
β−アラニル−システイン−CH−1ジスルフィドを、
アセトニトリル勾配を用いたHPLCによって精製し
た。
ステイン−CH−1ジスルフィドとTNP−抗体および
金電極に付着した二重層の相互作用 N−TNB−β−アラニル−システイン−CH−1ジス
ルフィド(ハプテン−CH−1)を、TNB残基に対す
る高い特異性と高い親和性定数を有するモノクローナル
抗体と処理した。ハプテン−CH−1のチャネル活性を
中和するのに必要な量を、ハプテン−CH−1の抗−ハ
プテン抗体による、Montalセットアップでの平面
脂質二重層の存在下における滴定で測定した。この化学
量論がわかると、ハプテン−CH−1と抗−ハプテン抗
体が、チャネルを中和する比率で、金電極に付着した二
重層に添加される。測定された基礎チャネル活性は無視
できるものである。遊離N−TNB−アラニルシステイ
ンを被験物質として添加すると、遊離TNB誘導体とハ
プテン−CH−1−抗−ハプテン抗体複合体の競合によ
りハプテン−CH−1の放出が起こり、これが二重層中
にイオンチャネルを形成させる。チャネル活性は、遊離
されたハプテン−CH−1の濃度に相関し、一方これは
被験物質の濃度に相関する。測定されるハプテン−CH
−1の濃度は抗体親和性に依存して変動する。一般に、
チャネル形成はきわめて高い感度で検出できるので、ハ
プテンに対する抗−ハプテン抗体の親和性曲線の最初の
3分の1に比例性が観察される。3×108mol−1
1−1の親和性をもつ抗体では、平均濃度10−8Mの
被験物質が検出できる。与えられた範囲内での応答の直
線性は与えられた抗体について適当である。しかしなが
ら、各抗体の検量は必要である。
有する二重層の生成方法 生物イオンチャネルを模倣した脂質二重層からなる本発
明のバイオセンサーはサンプル中のリガンドの検出に有
用である。この場合、サンプルは、受容体またはそのリ
ガンドの受容体の受容部からなるハイブリッド分子によ
って構成されるイオンチャネルを包含するバイオセンサ
ーと接触させる。
る混合ミセルの製造 アセチルコリン受容体は、Naja najaメキシン
との親和性クロマトグラフィーを用いる標準方法で精製
した。ついでこれを、3.3に記載したと同一の成分を
含む混合ミセル中に導入した。リン脂質とアセチルコリ
ン受容体の比は200:1であった。
ほぼ同様にして実施した。
性は、ドパントを添加しない場合の値よりもわずかに高
かった。伝導度は10〜15pSの間で変動した。電極
に付着した二重層の外側表面が浸漬されている媒体にア
セチルコリンを添加すると、ノイズのレベルの上昇が出
現し、異なる活性レベルを有する別個のチャネル現象が
観察される。この活性の上昇は30分ほど続いた。総ノ
イズレベルの上昇および伝達性の上昇は、アセチルコリ
ンの存在の検知を可能にする。アセチルコリンがなけれ
ば、また受容体と結合しない他のアミンの存在下には活
性は低く維持される。アセチルコリンの添加により、シ
グナルは明らかに増大する。
図である。図2は溶媒和脂質二重層を係留している提案
された電極を例示する図である。図3はハチ毒、メリチ
ンの構造を示す図である。図4は本発明のペプチドCH
−1の構造を示す図である。図5は、脂質二重層内に浸
漬したヘリックス状の棒状集合体としてCH−1を模式
的に示している。(A)は集合体の中心に向いた極性側
鎖基(白丸、正確な縮尺で描かれたものではない)を示
す。集合体のシッファー−エドマンドソンらせん投影
(B)は、極性中心水性小孔領域を示している。ハプテ
ン付着部位は矩形で描かれている。図6はCH−1への
ハプテンの付着部位を示す。図7はチャネル形成免疫検
定法の原理を模式的示す図である。図8はCH−1のイ
オンチャネル活性を示す。(A)はアソレクチンリポソ
ーム中、バリノマイシン誘導K+拡散電位の脱分極を示
す。(B)はガラス毛細管の先端における平面脂質二重
層内の単一チャネル活性を示す。
Claims (10)
- 【請求項1】 (1)その頂部における参照電極,
(2)その底部における記録電極,および(3)合成ま
たは生物イオンチャネルを模した脂質二重層からなる両
親媒性液体結晶膜から構成され、その脂質二重層は架橋
係留分子を介して記録電極に付着しまたその両面でバル
ク水性電解質媒体に連続的に接触し、その境界は壁部の
非極性物質との非極性的接触によってシールされている
定性および定量分析用バイオセンサー。 - 【請求項2】 リン脂質残基に接合する親水性スペー
サーアームからなる架橋係留分子を介して溶媒和リン脂
質二重層が記録電極表面に付着している「請求項1」記
載のバイオセンサー。 - 【請求項3】 架橋係留分子は、金属電極の表面に付
着するため末端にチオールまたはチオエーテル残基を有
するポリオキシアルキレン鎖に結合するホスファチジル
エタノールアミンからなる「請求項1または2」記載の
バイオセンサー。 - 【請求項4】 架橋係留分子は式、PE−NH−(C
H2−CH2−O)n−CH2−CH2−SH(式中、
PE−NHはホスファチジルエタノールアミンの残基で
あり、nは約7〜約24の整数、好ましくは11であ
る)を有する「請求項1〜3」記載のバイオセンサー。 - 【請求項5】 イオンチャネルは、天然の受容体、な
らびにリガンドおよび第二の蛋白質のチャネル形成部と
相互作用する受容部を有するハイブリッド受容体から選
ばれる蛋白質である「請求項1〜4」記載のバイオセン
サー。 - 【請求項6】 イオンチャネルは、受容部としてハプ
テンと阻害リガンド成分としてハプテンに対する抗体を
有する合成メリチン様ペプチドであり、ハプテンは被験
物質または被験物質様残基である「請求項1〜4」記載
のバイオセンサー。 - 【請求項7】 イオンチャネルは式、 NH2−Gly−Trp−Gly−Ala−Val−L
eu−Lys−Val−Leu−Thr−Thr−Gl
y−Leu−Pro−Ala−Leu−Ile−Ser
−Cys−Ile−Lys−Gln−アミドで示される
ペプチドCH−1である「請求項6」記載のバイオセン
サー。 - 【請求項8】 リガンドを含有するサンプルを、イオ
ンチャネルがそのリガンドに対する受容体からなるかま
たは少なくともその受容部がハイブリッド蛋白質のチャ
ネル形成部からなり、そのリガンドの結合が脂質二重層
内のイオンチャネルの開口を誘導して記録電極で測定さ
れる電極伝導度の変化を招く「請求項5」記載のバイオ
センサーと接触させる、リガンドの分析方法。 - 【請求項9】 被験物質を含有するサンプルを、イオ
ンチャネルがハプテンとして上記被験物質または被験物
質様残基を含み、ハプテンに対する抗体に結合している
メリチン様ペプチドである「請求項6」記載のバイオセ
ンサーと接触させ、この場合、抗体分子が放出されて脂
質二重層内のイオンチャネルの開口を誘導し、記録電極
で測定される電気伝導度の変化を招来させる被験物質の
分析方法。 - 【請求項10】 バイオセンサーは「請求項7」記載
のバイオセンサーである「請求項9」記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IL9302090A IL93020A (en) | 1990-01-09 | 1990-01-09 | Biosensors comprising a lipid bilayer doped with ion channels anchored to a recording electrode by bridging molecules |
IL093020 | 1990-01-09 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0690736A true JPH0690736A (ja) | 1994-04-05 |
JP3213341B2 JP3213341B2 (ja) | 2001-10-02 |
Family
ID=11060783
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP18843491A Expired - Lifetime JP3213341B2 (ja) | 1990-01-09 | 1991-01-09 | バイオセンサー |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5204239A (ja) |
EP (1) | EP0441120B2 (ja) |
JP (1) | JP3213341B2 (ja) |
AT (1) | ATE130938T1 (ja) |
AU (1) | AU625017B2 (ja) |
CA (1) | CA2033776C (ja) |
DE (1) | DE69114870T3 (ja) |
ES (1) | ES2082867T5 (ja) |
IL (1) | IL93020A (ja) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2695044B2 (ja) * | 1991-03-27 | 1997-12-24 | オーストラリアン メンブレイン アンド バイオテクノロジィ リサーチ インスティチュート | 電極表面のイオンリザーバー |
US6540893B1 (en) | 1999-08-23 | 2003-04-01 | Agency Of Industrial Science And Technology | Ion sensor |
JP2008518594A (ja) * | 2004-11-05 | 2008-06-05 | ウニベルジテート・オスナブリユツク | 細胞特性を測定するための装置および方法 |
JP2008525797A (ja) * | 2004-12-23 | 2008-07-17 | ナノキシス アーベー | 装置及びその使用 |
JP2009229344A (ja) * | 2008-03-25 | 2009-10-08 | Tokyo Institute Of Technology | 匂いセンサ用感応膜および匂いセンサ素子 |
JP2010513332A (ja) * | 2006-12-19 | 2010-04-30 | バーシテック、リミテッド | 合成イオンチャネル |
Families Citing this family (86)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5328847A (en) * | 1990-02-20 | 1994-07-12 | Case George D | Thin membrane sensor with biochemical switch |
ATE143730T1 (de) * | 1992-04-22 | 1996-10-15 | Ecole Polytech | Lipidmembranen fur biosensoranwendungen |
DE69331333T2 (de) * | 1992-10-01 | 2002-08-14 | Au Membrane & Biotech Res Inst | Verbesserte sensormembranen |
AU682801B2 (en) * | 1992-10-01 | 1997-10-16 | Ambri Limited | Improved sensor membranes |
WO1995008637A1 (en) * | 1993-09-21 | 1995-03-30 | Washington State University Research Foundation | Immunoassay comprising ligand-conjugated, ion channel receptor immobilized in lipid film |
US20010055581A1 (en) | 1994-03-18 | 2001-12-27 | Lawrence Tamarkin | Composition and method for delivery of biologically-active factors |
AT402935B (de) * | 1994-10-19 | 1997-09-25 | Pittner Fritz | Biorekognitions-gesteuerter, ionenfluss-modulirender biosensor |
WO1996038726A1 (en) * | 1995-05-30 | 1996-12-05 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) | Covalently immobilized phospholipid bilayers on solid surfaces |
US5879878A (en) * | 1995-06-20 | 1999-03-09 | Australian Membrane And Biotechnology Research Institute | Method of producing a first layer electrode membrane for a biosensor |
AUPN366895A0 (en) * | 1995-06-20 | 1995-07-13 | Australian Membrane And Biotechnology Research Institute | Detection of small analytes |
AUPN366995A0 (en) * | 1995-06-20 | 1995-07-13 | Australian Membrane And Biotechnology Research Institute | Self-assembly of bilayer membrane sensors |
WO1997020203A1 (de) * | 1995-11-28 | 1997-06-05 | Thomas Schalkhammer | Neuartige membranen und membran-dna/rna-sensoren |
AU1360297A (en) * | 1996-01-11 | 1997-08-01 | Australian Membrane And Biotechnology Research Institute | Ion channel sensor typing |
JP3775799B2 (ja) * | 1996-02-08 | 2006-05-17 | アンブリ・リミテッド | 酵素検出バイオセンサー |
DE19607279A1 (de) | 1996-02-27 | 1997-08-28 | Bayer Ag | Durch Festkörper unterstützte Membran-Biosensoren |
US5858713A (en) * | 1996-03-01 | 1999-01-12 | Cornell Research Foundation, Inc. | Calcium permeable insect sodium channels and use thereof |
US6165335A (en) * | 1996-04-25 | 2000-12-26 | Pence And Mcgill University | Biosensor device and method |
US5955379A (en) * | 1996-04-25 | 1999-09-21 | Mcgill University | Biosensor device and method |
JP2000510233A (ja) * | 1996-04-25 | 2000-08-08 | ペンス,インコーポレイテッド | バイオセンサ装置および方法 |
AUPN980796A0 (en) * | 1996-05-13 | 1996-06-06 | Australian Membrane And Biotechnology Research Institute | Improved reservoir components |
DE19622628A1 (de) * | 1996-06-05 | 1997-12-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Stabilisierung von Metallkonjugaten |
US6503452B1 (en) | 1996-11-29 | 2003-01-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Biosensor arrays and methods |
WO1998023948A1 (en) * | 1996-11-29 | 1998-06-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Arrays of independently-addressable supported fluid bilayer membranes and methods of use thereof |
US6699719B2 (en) * | 1996-11-29 | 2004-03-02 | Proteomic Systems, Inc. | Biosensor arrays and methods |
US7169272B2 (en) * | 1997-04-30 | 2007-01-30 | Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Microfabricated recessed disk microelectrodes: characterization in static and convective solutions |
AUPO717197A0 (en) | 1997-06-04 | 1997-07-03 | Australian Membrane And Biotechnology Research Institute | Improved biosensor |
AU742532B2 (en) * | 1997-06-04 | 2002-01-03 | Ambri Limited | Improved biosensor |
AU9786798A (en) * | 1997-10-10 | 1999-05-03 | Biosepra Inc. | Aligned multiwell multiplate stack and method for processing biological/chemicalsamples using the same |
WO1999020649A1 (en) * | 1997-10-22 | 1999-04-29 | Merck Patent Gmbh | Spacer peptides and membranes containing same |
US6407218B1 (en) | 1997-11-10 | 2002-06-18 | Cytimmune Sciences, Inc. | Method and compositions for enhancing immune response and for the production of in vitro mabs |
US7229841B2 (en) | 2001-04-30 | 2007-06-12 | Cytimmune Sciences, Inc. | Colloidal metal compositions and methods |
US6221673B1 (en) * | 1997-11-25 | 2001-04-24 | Microsensor Systems Inc. | Materials, method and apparatus for detection and monitoring of chemical species |
CA2316966C (en) * | 1997-12-17 | 2008-04-08 | Horst Vogel | Positioning and electrophysiological characterization of individual cells and reconstituted membrane systems on microstructured carriers |
US20020144905A1 (en) * | 1997-12-17 | 2002-10-10 | Christian Schmidt | Sample positioning and analysis system |
US7244349B2 (en) * | 1997-12-17 | 2007-07-17 | Molecular Devices Corporation | Multiaperture sample positioning and analysis system |
GB2332511A (en) * | 1997-12-19 | 1999-06-23 | Paul Nicholas | Liquid crystal sensors for sensing analyte molecules |
US6652734B1 (en) | 1999-03-16 | 2003-11-25 | Lifescan, Inc. | Sensor with improved shelf life |
GB9812783D0 (en) | 1998-06-12 | 1998-08-12 | Cenes Ltd | High throuoghput screen |
US6322963B1 (en) | 1998-06-15 | 2001-11-27 | Biosensor Systems Design., Inc. | Sensor for analyte detection |
WO1999066322A1 (en) * | 1998-06-15 | 1999-12-23 | Biosensor Systems Design, Inc. (1998) | A sensor for analyte detection |
US6503701B1 (en) | 1999-06-15 | 2003-01-07 | Biosensor Systems Design, Inc. | Analytic sensor apparatus and method |
AU5868700A (en) * | 1999-06-15 | 2001-01-02 | Biosensor Systems Design, Inc. | Analytic sensor apparatus and method |
US6342347B1 (en) | 1999-10-22 | 2002-01-29 | Biosensor Systems Design., Inc. | Electromagnetic sensor |
DE19936302A1 (de) * | 1999-08-02 | 2001-02-15 | Niels Fertig | Vorrichtungen und Verfahren zur Untersuchung von Ionenkanälen in Membranen |
US20040185462A1 (en) * | 1999-08-06 | 2004-09-23 | Tum Gene, Inc. | Method of and detecting apparatus and detecting chip for single base substitution SNP and point mutation of genes |
US6319674B1 (en) | 1999-09-16 | 2001-11-20 | Agilent Technologies, Inc. | Methods for attaching substances to surfaces |
DE19961951C2 (de) * | 1999-12-20 | 2003-09-18 | Univ Dresden Tech | Verfahren zur Herstellung einer biosensorischen Schicht und Vorrichtung zur Messung mit derartigen Schichten |
US6616895B2 (en) * | 2000-03-23 | 2003-09-09 | Advanced Research Corporation | Solid state membrane channel device for the measurement and characterization of atomic and molecular sized samples |
US20060292041A1 (en) * | 2000-03-23 | 2006-12-28 | Dugas Matthew P | Solid state membrane channel device for the measurement and characterization of atomic and molecular sized samples |
EP1279959A4 (en) * | 2000-05-11 | 2006-07-05 | Toudai Tlo Ltd | POLYMER COMPOSITION FOR FORMING THE SURFACE OF A BIOSENSOR |
US7270730B2 (en) | 2000-08-04 | 2007-09-18 | Essen Instruments, Inc. | High-throughput electrophysiological measurement system |
US7067046B2 (en) * | 2000-08-04 | 2006-06-27 | Essen Instruments, Inc. | System for rapid chemical activation in high-throughput electrophysiological measurements |
AU2001294656A1 (en) * | 2000-10-12 | 2002-04-22 | Biosensor Systems Design, Inc. | An analyte detection system |
US6835552B2 (en) * | 2000-12-14 | 2004-12-28 | The Regents Of The University Of California | Impedance measurements for detecting pathogens attached to antibodies |
US6913697B2 (en) * | 2001-02-14 | 2005-07-05 | Science & Technology Corporation @ Unm | Nanostructured separation and analysis devices for biological membranes |
DE10108483A1 (de) * | 2001-02-22 | 2002-09-05 | Bayer Ag | Phosphorhaltige Polymere für optischen Signalwandler |
SE0100875D0 (sv) * | 2001-03-14 | 2001-03-14 | Biacore Ab | Method of preparing supported lipid film membranes and use thereof |
AU2002243129B2 (en) * | 2001-03-14 | 2007-07-19 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Method of preparing supported lipid film membranes and use thereof |
DE10112505C1 (de) * | 2001-03-15 | 2003-01-30 | Iongate Biosciences Gmbh | Sensoranordnung und Vorrichtung zur amperometrischen und/oder potentiometrischen, pharmakologischen Wirkort- und/oder Wirkstofftestung sowie Verfahren zur amperometrischen und/oder potentiometrischen, pharmakologischen Wirkort- und/oder Wirkstofftestung |
DE10120083A1 (de) * | 2001-04-17 | 2003-01-30 | Nmi Univ Tuebingen | Meßelektrodenpaar, Biosensor mit einem solchen Meßelektrodenpaar und Verfahren zur Herstellung |
DE10122659A1 (de) * | 2001-05-10 | 2002-12-05 | Infineon Technologies Ag | Biochip-Anordnung |
JP2004530697A (ja) * | 2001-05-25 | 2004-10-07 | ダンシャー,ゴーム | たとえば金である貴金属などの重金属を移植する方法、および移植に用いるための金属 |
EP3021106B8 (en) * | 2001-07-30 | 2019-03-27 | Meso Scale Technologies, LLC | Methods of using assay electrode having immobilized lipid/protein layers for luminescence test measurements |
FR2828491B1 (fr) * | 2001-08-07 | 2003-10-10 | Warner Lambert Co | Nouvelle membrane supportee, preparation et utilisations |
AU2003205125A1 (en) * | 2002-01-14 | 2003-07-30 | George W. Gokel | Synthetic ion channels |
EP1481268A4 (en) * | 2002-02-07 | 2005-06-29 | Covalent Partners Llc | NANOFILM AND MEMBRANE COMPOSITIONS |
US20040034223A1 (en) * | 2002-02-07 | 2004-02-19 | Covalent Partners, Llc. | Amphiphilic molecular modules and constructs based thereon |
AU2003221336A1 (en) * | 2002-03-11 | 2003-09-22 | Toudai Tlo, Ltd. | Brush-like structured surface of poly(ethylene oxide) having elevated density |
US20030215881A1 (en) * | 2002-05-10 | 2003-11-20 | Hagan Bayley | Stochastic sensing through covalent interactions |
JP2005538377A (ja) * | 2002-09-11 | 2005-12-15 | シナメム コーポレイション | 膜ベースアッセイ |
US20040106741A1 (en) * | 2002-09-17 | 2004-06-03 | Kriesel Joshua W. | Nanofilm compositions with polymeric components |
CN1500887A (zh) * | 2002-10-01 | 2004-06-02 | 松下电器产业株式会社 | 引物伸长反应检测方法、碱基种类判别方法及其装置 |
AU2003301244A1 (en) * | 2002-10-15 | 2004-05-04 | Advanced Research Corporation | Solid state membrane channel device for the measurement and characterization of atomic and molecular sized samples |
US20060269915A1 (en) * | 2003-07-02 | 2006-11-30 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Pyrophosphate acid detection sensor, method of detection of nucleic acid, and method of discrimination of base type |
JP2008504216A (ja) | 2003-12-02 | 2008-02-14 | サイトイミューン サイエンシズ インコーポレイテッド | モノクローナル抗体の生成のための方法および組成物 |
CN1820079A (zh) * | 2004-03-29 | 2006-08-16 | 松下电器产业株式会社 | 焦磷酸的测定方法和引物延伸反应的检测方法以及实施此方法的装置 |
KR100845507B1 (ko) * | 2004-07-02 | 2008-07-10 | 미쓰이 가가쿠 가부시키가이샤 | 변성 산성 이온교환수지 및 비스페놀류의 제조방법 |
WO2007084103A2 (en) * | 2004-12-21 | 2007-07-26 | The Texas A & M University System | High temperature ion channels and pores |
CN104906962B (zh) * | 2005-05-20 | 2017-11-10 | 博通分离膜技术(北京)有限公司 | 用于过滤水的膜 |
US8906609B1 (en) | 2005-09-26 | 2014-12-09 | Arrowhead Center, Inc. | Label-free biomolecule sensor based on surface charge modulated ionic conductance |
US20080103064A1 (en) * | 2006-06-13 | 2008-05-01 | Antara Biosciences Inc. | Microscale fluidic devices for electrochemical detection of biological molecules |
DE102007016699A1 (de) * | 2007-04-04 | 2008-10-09 | Synentec Gmbh | Biochip für die Fluoreszenzanalyse von einzelnen Transportern |
US7960145B2 (en) | 2007-11-08 | 2011-06-14 | Cytimmune Sciences, Inc. | Compositions and methods for generating antibodies |
DE102007059166A1 (de) * | 2007-12-06 | 2009-06-10 | Synentec Gmbh | Vorrichtung zur Messung von Transportsystemen |
CN101614729B (zh) * | 2008-06-27 | 2013-04-24 | 博奥生物有限公司 | 用于细胞操作及电生理信号检测的微电极阵列器件及专用装置 |
CN110045300B (zh) * | 2019-04-08 | 2020-06-02 | 东南大学 | 基于磁感应蛋白探测磁场的传感器 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US193625A (en) † | 1877-07-31 | Improvement in hydraulic railroad-signals | ||
US4434236A (en) * | 1982-10-20 | 1984-02-28 | E. I. Du Pont De Nemours & Co. | Immunoassay wherein labeled antibody is displaced from immobilized analyte-analogue |
US4895809A (en) * | 1984-01-09 | 1990-01-23 | Varian Associates, Inc. | Immobilized antigen-antibody displacement process |
CA1223039A (en) * | 1984-03-26 | 1987-06-16 | Michael Thompson | Chemical selective sensors utilizing admittance modulated membranes |
US4637861A (en) * | 1985-12-16 | 1987-01-20 | Allied Corporation | Stabilized, lipid membrane-based device and method of analysis |
AU617687B2 (en) * | 1987-07-27 | 1991-12-05 | Ambri Limited | Receptor membranes |
EP0382736B1 (en) * | 1987-07-27 | 1994-11-02 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Receptor membranes |
-
1990
- 1990-01-09 IL IL9302090A patent/IL93020A/en not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-01-08 DE DE69114870T patent/DE69114870T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-08 AT AT91100198T patent/ATE130938T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-01-08 ES ES91100198T patent/ES2082867T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-08 EP EP91100198A patent/EP0441120B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-08 CA CA002033776A patent/CA2033776C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-09 US US07/638,488 patent/US5204239A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-09 AU AU69245/91A patent/AU625017B2/en not_active Withdrawn - After Issue
- 1991-01-09 JP JP18843491A patent/JP3213341B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2695044B2 (ja) * | 1991-03-27 | 1997-12-24 | オーストラリアン メンブレイン アンド バイオテクノロジィ リサーチ インスティチュート | 電極表面のイオンリザーバー |
US6540893B1 (en) | 1999-08-23 | 2003-04-01 | Agency Of Industrial Science And Technology | Ion sensor |
JP2008518594A (ja) * | 2004-11-05 | 2008-06-05 | ウニベルジテート・オスナブリユツク | 細胞特性を測定するための装置および方法 |
JP2008525797A (ja) * | 2004-12-23 | 2008-07-17 | ナノキシス アーベー | 装置及びその使用 |
JP2010513332A (ja) * | 2006-12-19 | 2010-04-30 | バーシテック、リミテッド | 合成イオンチャネル |
JP2009229344A (ja) * | 2008-03-25 | 2009-10-08 | Tokyo Institute Of Technology | 匂いセンサ用感応膜および匂いセンサ素子 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU6924591A (en) | 1991-07-11 |
JP3213341B2 (ja) | 2001-10-02 |
DE69114870T3 (de) | 2002-11-14 |
EP0441120B1 (en) | 1995-11-29 |
CA2033776C (en) | 2001-03-13 |
US5204239A (en) | 1993-04-20 |
DE69114870D1 (de) | 1996-01-11 |
ES2082867T5 (es) | 2002-11-16 |
EP0441120A3 (en) | 1992-01-22 |
DE69114870T2 (de) | 1996-08-29 |
IL93020A (en) | 1995-06-29 |
AU625017B2 (en) | 1992-06-25 |
CA2033776A1 (en) | 1991-07-10 |
EP0441120B2 (en) | 2002-04-03 |
ATE130938T1 (de) | 1995-12-15 |
ES2082867T3 (es) | 1996-04-01 |
EP0441120A2 (en) | 1991-08-14 |
IL93020A0 (en) | 1990-11-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3213341B2 (ja) | バイオセンサー | |
US5756355A (en) | Lipid membrane sensors | |
US5368712A (en) | Biologically mimetic synthetic ion channel transducers | |
JP2927942B2 (ja) | 受容体膜およびイオノホアのゲーテイング | |
JP2682859B2 (ja) | レセプター膜 | |
CA2311165C (en) | Improvements in or relating to electrochemical assays | |
JPH11508044A (ja) | センサー膜の自己組立て | |
WO1992017788A1 (en) | Ionic reservoir at electrode surface | |
KR20110108661A (ko) | 미각 수용체 기능화된 탄소 나노튜브 전계효과 트랜지스터 기반 미각센서 및 이를 포함한 고선택성 바이오 전자혀 | |
Peggion et al. | A peptide-tethered lipid bilayer on mercury as a biomimetic system | |
PT1352245E (pt) | Biossensor com proteínas transmembranares ligadas covalentemente | |
TWI475228B (zh) | 聯結電導定錨分子之抗體探針晶片 | |
KR100965244B1 (ko) | 리포솜을 이용한 바이오센서 또는 가스센서의 제조방법 | |
JP5230300B2 (ja) | 生体分子機能解析用基板、生体分子機能解析用試料体および生体分子機能解析方法 | |
Wang et al. | Double‐Layer Nanogold and Poly (amidoamine) Dendrimer‐Functionalized PVC Membrane Electrode for Enhanced Electrochemical Immunoassay of Total Prostate Specific Antigen | |
WO1994023287A1 (en) | Immunoassay and immunoassay cell used therefor | |
JP5344450B2 (ja) | 電解発光物質を内封するリポソームを用いた迅速高感度アッセイ法 | |
Schalkhammer et al. | Ion channels in artificial bolaamphiphile membranes deposited on sensor chips: optical detection in an ion-channel-based biosensor | |
Connell et al. | Electroimmunoassay of PGE2: An antibody-sensitive electrode based competitive protein-binding assay | |
JP2005249725A (ja) | 甲状腺ホルモン受容体固定化電極、その製造方法、及びその用途 | |
Gitler et al. | Biosensors Based on Solvated Bilayers Attached to Electrodes | |
Kim et al. | Monolayer molecular recognition sites as a basis for biosensor development | |
BR112020007150A2 (pt) | detecção de dimetilarginina simétrica | |
MXPA98003985A (en) | Diagnostics for and mediators of inflammatory disorders | |
JP2001083157A (ja) | 毒性評価装置及び方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070719 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080719 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080719 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090719 Year of fee payment: 8 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090719 Year of fee payment: 8 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100719 Year of fee payment: 9 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110719 Year of fee payment: 10 |