JPH11508044A

JPH11508044A - センサー膜の自己組立て

Info

Publication number: JPH11508044A
Application number: JP9503456A
Authority: JP
Inventors: ラグス，バークハード; ジョンペース，ロナルド; ジョージキング，ライオネル; コーンネル，ブルース; ルシヤブラーク−マクスヴィティス，ヴィヨレッタ
Original assignee: Australian Membrane and Biotechnology Research Institute Ltd; University of Sydney
Current assignee: Australian Membrane and Biotechnology Research Institute Ltd; University of Sydney
Priority date: 1995-06-20
Filing date: 1996-06-20
Publication date: 1999-07-13
Also published as: WO1997001092A1; AUPN366995A0; US20030054431A1; EP0838028A4; US6342346B1; US6291155B1; US6432629B1; EP0838028A1; CA2226273A1

Abstract

(57)【要約】バイオセンサーに使用され、標本内の検体を検知する電極および膜の組合わせに関するものであり、また電極および膜の組合わせを製造および貯蔵する方法に関するものである。一つの態様として、第一層の電極膜を下記の方法で製造する。（１）リンカー脂質Ａ、二硫化物メルカト酢酸（ＭＡＡＤ）、または類似分子、例えば”リンカーグラミシジンＢ、脂質ｅまで広がる膜（ＭＳＬ−Ｃ）、および脂質Ｄまで広がる膜（ＭＳＬ−Ｄ）、または他の結合分子およびイオンチャンネルの組合わせを含む溶液を形成する、（２）清潔な金属面を有する電極を溶液と接触させる、これにより溶液内の成分を含む二硫化物は電極の金属面に吸着される、（３）電極を適当な有機溶媒ですすぐ、および、（４）すすぎ洗いに使用された過剰の有機溶液を取り除く。

Description

【発明の詳細な説明】センサー膜の自己組立て本発明はバイオセンサーに使用され，標本内の検体を検知する電極および膜の組み合わせに関するものであり、また、電極および膜の組み合わせを製造する方法に関するものである。本発明は、また、電極および膜の組み合わせを貯蔵する方法に関するものである。金属電極上に積層された脂質膜の中にイオンチャンネル即ちイオン透過担体を有し、イオンチャンネルが検体分子の存在下に切り替わるバイオセンサーは国際特許明細書、Nos．WO 92/17788，WO 93/21528，WO 94/07593，及び、U.S．5,204 ,239(これら明細書の開示は、参考のために、本書に記述してある)に記述されている。これらの出願で開示されているように、グラミシジンイオンチャンネルの様なイオン透過担体は両親媒性分子とともに分散して、イオン透過性に関する変性特性を有する脂質膜を形成する。また、既に付着した結合相手期待する検体の結合に応じて、膜の導電性が変化するようなこれらのイオンチャンネルを開閉する各種の方法(例えば、国際特許出願、WO 90/08783で開示されている横偏折機構)も開示されている。出願は、また、表面増幅効果を使用して改善された感度、改善された安定性、および、電極表面に付着した両親媒性分子の化学吸着した配列を使用したイオン束を有する膜を製造する方法も開示している。出願は、さらに、上記の化学吸着した両親媒性分子上のイオン透過担体を有する脂質膜を製造する手段をも開示している。本発明は、電極および膜の組み合わせを製造するための改善された手段を規定している。電極および膜の組み合わせにより、センサー膜は再現性、検体にたいするゲーティング応答、横偏折応答、表面増幅効果、血清、血漿、および、血液の安定性に関して改善された特性を有する。また、簡素化された製法、乾燥した形(水性浴液の不在下)で膜を貯蔵する能力も含まれる。第一の態様として、本発明は第一層の電極膜を下記の方法で製造する。（１）リンカー脂質 A(図1)、二硫化物メルカプト酢酸(MAAD)，または、類似分子、例えば、EDSリンカーグラミシジン B(図2)，膜貫通脂質C(MSL-C)，(図3)，および、膜貫通脂質D(MSL-D)，(図3)，または、他の結合分子、及び、前記のイオンチャンネル、すなわち、イオン透過担体の組み合わせを含む溶液を形成する、（２）清潔な金表面を有する電極を溶液と接触させる、これにより、溶液内の成分を含む二硫化物は、電極の金表面に吸着される、（３）電極を適当な有機溶媒ですすぐ、および、（４）すすぎ洗いに使用された、過剰の有機溶媒を取り除く。膜成分の性質を下記に示す。ベンジル二硫化物が付着した領域、下記の順序から成る親水性領域(テトラエチレングリコール、コハク酸、テトラエチレングリコールおよびコハク酸の部分群)、および脂肪族鎖から成るリンカー脂質A。脂肪族鎖二硫化物メルカプト酢酸(MAAD)，または、二硫化物2-メルカプトエタノール(EDS)のような類似分子。リンカーグラミシジン B はベンジル二硫化物が付着した領域、下記の順序から成る親水性領域(テトラエチレングリコール、コハク酸、テトラエチレングリコール、コハク酸)およびグラミシジンの疎水性の領域から成る結合分子である。ベンジル二硫化物が付着した領域、下記の順序から成る親水性領域(テトラエチレングリコール、コハク酸、テトラエチレングリコール、コハク酸)および、中間体ビフェニル領域、ホスフアチジルコリン、ヒドロキシル、コハク酸、または、PEG-400 COOHの頭部を有する1,1'ドトリアコンタメチレンビス(2-3RS,7R，1 1-フィタニル)の疎水性領域から成る膜貫通脂質(MSL)D。膜貫通脂質Dと同じ付着領域、および、親水性領域から成るが、頭部は異なり、１−８個の1,6-アミノカプロン酸，および、ビオチンから成る群から構成されている膜貫通脂質C。本発明の好ましい実施態様において、二硫化物メルカプト酢酸(MAAD)，または、リンカー脂質 Aと2-メルカプトエトエタノール(EDS)の比は5:1から1:2であり、さらに、好ましくは、2:1である。膜の安定性を改善するために、さらに、好ましくは、第一層内のMSL-Dの量はできるだけ多く、正当なグラニシジンの伝導を維持する量である。リンカー脂質A +MAAD または、EDS):MSL-Dの比は、それゆえ、好ましくは、10:1と100:1の間である。さらに好ましい実施態様として、MSL-Cの量は、最終センサー膜において、検体を加えると効果的な表面増幅を発生し、ストレプタビジン、アビジン、または、他の類似ビオチン結合蛋白質を加えるとゲーテイングを誘導する横偏折を抑制できる量である。もし、最終センサー膜内のMSL-Cの量が多く、過度の蛋白質、つまり、ストレプタビジン、アビジン、または、類似ビオチン結合蛋白質を加えたMSL-Cに結合された蛋白質はグラミシジン/受容体対の移動を抑制し、ゲーテイング応答を減少することを留意すべきである。検体分子が多重同一エピトープを有する場合は、MSL-Cはグラミシジン/受容体対に優先して検体分子を捕獲しバイオセンサーの応答を減少する。それゆえ、(リンカー脂質 A+MAAD または、EDS)：膜貫通脂質Cの比は、20,000 :1と100:1の間である。さらに好ましい(リンカー脂質 A+MAAD または、EDS)：MSL-Cの比は、20,000:1 である。本分野で知られているように、グラミシジンは二分子層膜内の単量体/二量体平衡内に存在する。グラミシジン横偏折切り替えを効果的に機能させるために、二量体と単量体の比は制御されねばならない。グラミシジンイオンチャンネルの割合は膜外層内の単量体を自由に拡散する割合が好ましい。他の方法でも、膜の前半、および、後半内のグラミシジンの濃度を変えることにより、二量体と単量体の比を制御することができる。それゆえ、(リンカー脂質 A+MAAD または、EDS):リンカーグラミシジンBの比は好ましくは、10,000:1である。さらに好ましくは、(リンカー脂質 A+MAAD または、EDS):リンカーグラミシジンBの比は好ましくは、20,000:1と100,000:1の間である。これらの場合、吸着されたリンカーグラミシジン Bによる背景漏洩の量を最小にすることが必要である。金の電極は新たに蒸着または、吹きつけられた金電極が好ましい。プラズマエッチング法、または、イオンビームミリング法により新たに洗浄された金電極表面がさらに好ましい。吸着用の溶液用の溶媒（工程1 及び、すすぎ洗い工程4）はエタノールが好ましい。第二の態様として、本発明は単一層電極膜を下記の方法で製造する。（１）二硫化物メルカプト酢酸(MAAD)，または、類似分子、（例えば、２−メルカプトエタノール(EDS)）膜貫通脂質C(MSL-C)，および/または、膜貫通脂質D( MSL-D)，および、任意に、リンカー脂質 A，リンカーグラミシジン B 他のリンカー分子、イオンチャンネル、または、イオン透過担体組み合わせを含む溶液を形成する、（２）清潔な金表面を有する電極を溶液と接触させる、これにより、溶液内の成分を含む二硫化物は、電極の金表面に吸着される、（３）電極を適当な有機溶媒ですすぐ、および、（４）すすぎ洗いに使用された、過剰の有機溶媒を取り除く。ここで、工程(1)の溶液は1モル%以上、または、50モル%の膜貫通脂質を含む。さらに好ましくは、工程(1)の溶液は1モル%以上または、70モル%の膜貫通脂質， 29% MAAD または、EDS，および、1%の他の膜貫通脂質を含む。本発明の第一態様の方法に関する上記で記述された好ましい性質および、実施態様は、同様に、本発明の第二様態の方法にも適用できる。本発明の第二態様の方法により製造さえた膜は、二分子層を形成せず、センサーに加えられた血清、血漿、または、全血にたいしての非特異的効果に対して特に抵抗を有する。さらに、特徴として、これらの膜は、性能上の劣化の兆候無しに、血清、血漿、または、全血内で何ヶ月も再度使用することができる。単一層脂質膜は、製造目的に対してより実用的であり、より少ない製造工程で製造され、より安定性を有する。このような膜を有する製造されたセンサーは寿命が長い。スペーサー分子にとってさらに、好ましいものは、共有結合的に、膜貫通脂質 Cまたは、D に結合されたMAADまたは、EDS，および、共有結合的に、PEPG，GDPE ，または、トリフィタニル PCに結合されたMAAD，または、EDSであり、最終的な膜の安定性を増加する。本発明の第二態様における方法で、さらに好ましい実施態様は、適切な長さのリンカーを介して、共有結合的に、膜貫通脂質Cまたは、D に結合されたバリノマイシンを使用することであり、バリノマイシンは、膜の一方の側から他方の側に拡散することができる。その結果、バイオセンサーは再使用することとなる。このことは、イオン透過担体の補充を必要とせず、移植装置に使用できることになる。本発明はバイオセンサーの製造を規定しており、ストレプタビジン、アビジン、または、関連するビオチン結合蛋白質の一つを、ビオチン化されたグラミシジンイオンチャンネル、または、MSL上にビオチン化された受容体に結合する手段として使用することにより、製造方法が簡素化され、改善される。第三の態様として、本発明はビオチン化されたグラミシジンEを利用した第二層電極、および膜の組み合わせを製造する方法に関する。ここで、１個から８個のアミノカプロイル基から成るリンカー腕を使用して、ビオチンはアミドを介してグラミシジンに、リシン残基に(化学的安定性から好ましい)、あるいは、エステルリンクを介してエタノールアミンに結合されている。リンカーの長さ、種類、原子価、リンカーの数は、完成されたセンサーの安定性に影響する。最適のリンカーは、測定される検体による。方法は下記のようになっている。（１）適当な溶媒に分散している脂質および、ビオチン化されたグアニシジンE( 図4)の溶液を、本発明の第一態様で記述されたように製造された第一層を含む電極の表面に加える；（２）電極表面を水溶液ですすぐ、（３）ストレプタビジン、アビジン、中性ビジン、アビジンまたはストレプタビジン誘導体溶液を加える、（４）過剰のストレプタビジン、アビジン、中性ビジン、または、他のアビジンまたは、ストレプタビジン誘導体を取り除くために、電極を水溶液ですすぐ、（５）ビオチン化された結合共同体分子の溶液を加える、（６）被覆された電極を水溶液ですすぐ。本発明の好ましい実施態様において、第三態様の方法の工程(1)で使用された脂質はジフタニルホスファチジルコリンとグリセリルジフタニルエテールの混合物である。発明者はこれらの脂質の組み合わせが、血清、血漿、および、全血に対して、二分子膜層の安定性を改善し、一方、良好なイオン封止、流動性を維持することが分かった。その結果、温度の伝導に対する影響を減少し、真の二分子層膜構成を維持する。さらに好ましいことは、ジフタニルホスファチジルコリン（DPEPC）および、グリセリルジフタニルエテール (GDPE)の比は、7:3である。さらに好ましいことは、脂質は図(6)に示されたように、トリフィタニルホスホリルコリンである。また、好ましいことは、膜は、0から50%の、より好ましくは、0から20%のコレステロールを第二層に含み、血清、血漿、または、全血標本内の安定性および、検体応答を向上することである。好ましくは、ビオチン化されたグラミシジンEと脂質の比は10,000:1と1,000,0 00:1の間であることである。さらに好ましいことは、ビオチン化されたグラミシジンEと脂質の比は100,000 :1であることである。好ましいことは、長さが10-80オングストロームのリンカー腕を使用して、ビオチンは、エタノールアミン端を介してグラミシジンに結合されていることである。好ましいリンカー腕は親水性であることである。好ましいことは、1個から8個のアミノカプロイル基で構成されたリンカー腕を使用して、ビオチンは、エタノールアミン端を介してグラミシジンに結合されていることである。さらに好ましいことは、二つのビオチンはエタノールアミン端を介してグラミシジンに結合されていることである。これにより、ビオチンは、一つのストレプタビジン、アビジン、または、類似のビオチン結合の蛋白質分子の隣接結合部位、または、二つの別のストレプタビジン、アビジン、または、類似のビオチン結合蛋白質分子に同時に結合することができる。あるいはまた、三つ以上のビオチン分子は、グラミシジンに結合することができ、結合共同体分子のための多重結合部位を作りだす。好ましいことは、二つのビオチンはエタノールアミン端を介してグラミシジンに結合して、各ビオチンは、図(5)に示されているようにリシン基に結合されている二つから四つの直線的に結合しているアミノカプロイル基に結合されている。三つ以上のビオチン分子がグラミシジンに結合されている時は、二十までのアミノカプロイル基を有する長いリンカーが必要である。これらは直線的に組織化されるか、分岐した構造である。さらに好ましいことは、検体応答を最適化するために、リンカーの存在に起因する信号を最小にすることが必要である。このようにして、工程(3)で加えられた、ストレプタビジン、アビジン、または、他の類似のビオチン結合蛋白質の量は、プロゾン効果を起こすのに充分なものであり、膜の中の利用できるビオチン化された種のほんとんどは、一つのストレプタビジン、または、関連した結合された分子を持つことができ、検体を含む標本がセンサーに加えられるまでグラミシジンチャネルとMSL間の架橋を防ぐ。さらに好ましいことは、ストレプタビジン、アビジン、または、類似のビオチン結合蛋白質を加えるに先立って、脂質膜電極アッセンブリーは冷やされることである。これにより、膜の流動性は減少し、膜成分の移動が減少する。それゆえ、ストレプタジン、アビジン、または、他の類似のビオチン結合蛋白質は、検体を含む標本がセンサーに加えられるまでグラミシジンチャンネルとMSL間で架橋を起こすことなしに、より容易にビオチン化されたグラミシジンEと膜貫通脂質Cに結合することである。好ましいことは、脂質膜電極は0-50℃，より好ましくは、0-5℃間で冷やされることである。さらに好ましいことは、ビオチン化された結合共同体分子を続いてすすいだり、加えることは、0-50℃，より好ましくは、0-5℃で実行されることである。好ましいことは、結合共同体分子はビオチン化された抗体、または、ビオチン化された抗体断片である。さらに好ましいことは、結合共同体分子は、Fab’断片、すなわち、Fab’チオール基を介したビオチン化されたものである。さらに好ましいことは、Fab'とビオチン間のリンカーの長さは、10-80オングストロームである。さらに好ましいことは、Fab'とビオチン間のリンカーは一つから八個のアミノカプロイル基からなることである。さらに好ましいことは、二つのビオチンを含む基は抗体、または、抗体断片に結合されており、二つのビオチンが、一つのストレプタビジン、アビジン、または、他の類似のビオチン結合蛋白質、または、二つの隣接したストレプタビジン、アビジン、または、他の類似ビオチン結合蛋白質分子を同時に複合することができることである。あるいはまた、三つ以上のビオチンは、抗体、または、抗体断片に結合することができる。さらに、本発明は結合共同体分子とストレプタビジン、アビジン、または、他の類似ビオチン結合蛋白質の間に共有結合的、または、受動的に結合されている共役を作り出すことによってバイオセンサー膜の製造をより簡素化することを規定している。それゆえに、第三態様の方法の工程3から工程5は、下記のように代えることが出来る。 (3) ストレプタビジン、アビジン、中性アビジン、または、他のアビジンまたはストレプタビジン誘導体と結合対の部材である分子の間に供役を含む溶液を加える。好ましくは、結合共同体分子はFab、Fab'，または、Fv断片のような抗体、または、抗体断片である。この発明で使用できる他の結合対も含まれる。当然、結合蛋白質および細胞性受容体/検体、酵素または酵素類似体/基質、レクチン/炭水化物、相補型核酸配列、および、抗-FC，Protein AまたはProtein G/抗体が発生する。効率的かつ再現性よくセンサー膜を製造するために、イオン透過担体単体を組み立てられた膜に組み入れることが有利である。また、イオン透過担体を組み立てた膜に組み入れる前に、一つの結合共同体をイオン透過担体に結合するのが有利である。このことは、膜伝導性の再現性を制御し、向上し、二つの部位免疫- または、類似アッセイ系内で必要な第二結合共同体の再現性結合を可能にする。その結果、第一結合共同体のみがイオン透過担体に結合し、第二結合共同体のみが第二イオン透過担体、または、MSLに結合する。本発明者は、下記のような幾つかの手段により疎水性イオン透過担体を水溶液に供拡散することができることが判明した。 1.界面活性剤の存在下、好ましくは、界面活性剤の臨界ミセル濃度以下のレベルで、イオン透過担体、および、界面活性剤が集合体を形成し、イオン透過担体を溶液中に留める、 2．グラミシジン、または、他のイオン透過担体を高分子量水溶性種に共役する、 3．イオン透過担体をビーズに結合する。さらに、イオン透過担体/界面活性剤集合体の水溶液を予備成形された脂質バイオセンサー膜を浴する溶液に加えることにより、機能性イオン透過担体をバイオセンサー脂質膜に組み入れることができることが判明した。イオン透過担体を加える方法は、イオン透過担体を脂質膜に組み入れる方法をより制御性および再現性がよいものにする。それゆえに、第四の態様において、本発明は下記の方法で第二層電極および膜の組み合わせを製造する。 1.適切な溶媒に分散している脂質水溶液を本発明の第一様態の方法で述べられているようにして製造された第一層を含む電極表面上に加える、 2．電極表面を水溶液ですすぐ、 3．界面活性剤で共分散しているか、または、結合により溶解しているイオン透過担体を含む水溶液を高分子量水溶性種に加える、 4.電極を水溶液ですすぐ、 5.ストレプタビジン、アビジン、または、他の類似ビオチン結合蛋白質のいずれかを使用して受容体を加え、ビオチン化された抗体、または、抗体断片を加える、または、本発明の第三態様に詳細に述べられているように、抗体、または、抗体断片に共役されているストレプタビジン、アビジン、または、類似ビオチン結合蛋白質を加える。本発明の好ましい実施態様において、工程(1)で使用された脂質はジフタニルホスファチジルコリンとグリセリルジフタニルエーテルの混合物である。これら脂質の組み合わせは、血清、血漿、および、全血に対しての二分子層膜の安定性を改善し、良好なイオン封止性、流動性を維持することが判明した。その結果、伝導に対する温度の影響を減少し、真の二分子層膜構成を維持する。さらに好ましいことは、ジフタニルホスファチジルコリンとグリセリルジフタニルエーテルの比率は7:3である。さらに好ましいことは、脂質は図(6)で示されているように、トリフィタニルホスホリルコリンである。さらに好ましいことは、膜は第二層に0-50%，より好ましくは、20%以下のコレステロールを含む、これにより、血清、血漿、または、全血標本内の安定性と検体応答を向上する。好ましいことは、本発明の第四態様の工程(3)で使用されている水溶液は界面活性剤の水溶液に加えられているグラミシジン、または、グラミシジン誘導体を含むことである。この場合、界面活性剤はグラミシジンに対して過度に存在するが、界面活性剤の全濃度は臨界ミセル濃度(CMC)以下である。界面活性剤による膜の破壊を最小限にするか、打ち消すために、全界面活性剤濃度は好ましくはCM C以下に保たれる。グラミシジン/界面活性剤溶液は、好ましくは、超音波浴またはホーンを使用して,5-20分間、超音波処理される。好ましい界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム、オクチルグルコシド、トウイーン、または、他のイオン性、または、非イオン性の界面活性剤である。さらに好ましいことは、アルキル鎖は少なくとも、７個以上のメチレン基を含むことである。界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウムが好ましい。さらに好ましいことは、ドデシル硫酸ナトリウムの濃度は0.00001M末満であり、グラミシジンの濃度はドデシル硫酸ナトリウムの濃度の10倍未満である。電極表面上に吸着された第一層の膜をすでに有する電極を貯蔵することが必要ならば、電極を溶媒で覆って貯蔵することが有利であることが判明した。空気中で電極を貯蔵する方法に比較して、第一層の膜を有する電極を溶液内で貯蔵するこの方法は、改善された均質性、および、イオン透過担体ゲーテイング能力を有する次のセンサー膜を製造することが判明した。それゆえに、この発明の第五態様は、第一層の膜と電極の組み合わせに関するものであり、第一層の膜と電極の組み合わせは、電極と両親媒性分子と複数のイオン透過担体の密接に包み込まれた配列から成る第一層膜から成る。第一層膜は、前述されたようなリンカー基により電極に接続されている。上記第一層膜は溶媒の存在下貯蔵される。電極は気体性、または、液状環境下に貯蔵される。好ましい実施態様として、電極が貯蔵される溶媒は有機溶媒か水性溶媒である。溶媒が有機溶媒である場合は、さらに好ましいことは、溶媒は、エタノール、グリセロール、エチレングリコールのようなアルコール、3から12の炭素原子を含むアルコール、または、ジオールである。さらに好ましくは、溶媒は8から20の炭素原子を有する炭化水素である。さらに好ましくは、溶媒は界面活性剤を含む水溶液である。さらに好ましくは、溶媒は、電極を被覆できる化合物であり、電極表面の酸化は最小化される。そのような溶媒は薄膜として使用できることが好ましい。さらに、非水溶液の形態で、完成されたセンサー膜と電極の組み合わせは貯蔵することができることが判明した。このことは、バイオセンサー製品の製造、出荷、および、貯蔵の容易さからみても、おおいに有利なことである。それゆえ、本発明の第六態様は、イオン透過担体を組み入れた脂質膜から成る脂質膜系のバイオセンサーに関するものである。膜の伝導性は検体の存在、または、不存在により左右される。バイオセンサーが正常に存する水浴液は、上記脂質膜バイオセンサーを乾燥すると、脂質膜、および、受容体分子が再水和された時、機能、構成、および、活性が保たれるような方法で取り除かれる。好ましくは、乾燥工程においては、バイオセンサー膜は、空気−水界面と接触しないことである。ここで、凍結乾燥、蒸発、または、制御された湿度での蒸発のような乾燥方法が推薦できる。さらに好ましいことは、水置換剤の濃度は、膜内のすべての成分，すなわち、脂質、イオン透過担体、および、蛋白質を、乾燥中、貯蔵中に保護できるような充分な濃度であり、適切なマトリックス内に検体または、標本を最初に加えると容易に取り除かれることである。このようにして、バイオセンサー膜の充分な活性が直ちに回復される。水置換物質は蛋白質、低分子量ジオールまたはトリオール、ポリエチレングリコール、低分子量糖、重合性ペプチド、高分子電解質、あるいは、これら物質の組み合わせのいずれかである。これら物質のすべては本分野においてよく知られている。水置換物質の主たる特質は、高度な極性であること、低蒸気圧を有していること、膜が膜の構造を維持すること、蛋白質に対して相容性があること、および、再水和された時、バイオセンサーの機能を妨げないことである。これらの物質はまた、特定の膜成分、好ましくは、脂質まで広がる膜に共有結合的に結合する。好ましくは、水置換物質は牛血清、アルブミン、血清、魚のゼラチン、脱脂粉乳、カゼイン、グリセロール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、ポリエチレングリコール、トレハロース、キシロース、グルコース、スクロース、デキストロース、フィコールであり、さらに、好ましくは、水置換分子はグリセロール、スクロース、デキストランまたはトレハロースである。そのような分子種はまたバイオセンサーにとって追加的利点をもたらし、下記のような役を果たす。 1.血清、血液、流体を加えるための延展層、 2.特定の細胞、バクテリア、ウイルス粒子、または、分子種に対してのフィルター、あるいは、 3.血清、または、血液内で結合している蛋白質と小さな検体が競合しないために必要な特定の置換試薬を含むリザーバーさらに、水置換剤の利点は、検体溶液また標本が追加されているので、脂質二分子層が大気/水の界面と接触せず脂質膜の再水和を制御することである。図13に後者の一例を示す。水置換分子は膜領域に加えられるか共有結合的に結合され、例えば、ANS(8-アニリノ-1-ナフタレン-スルホン酸)を含んでいる。 ANSはアルブミンとチロキシン結合グロブリン(TBG)内の結合部位のためのチロキシンと競合し、バイオセンサー膜によりチロキシンを解放し、続いて行われる検出をする。下記の本発明に限定されない例と添付図面を参照して、本発明をさらに述べる。図面の簡単な説明図１はリンカー脂質 Aを示す。リンカー脂質 Aは二硫化物結合領域、下記の順序から成る親水性領域、(テトラエチレングリコール、コハク酸、テトラエチレングリコール、コハク酸部分群),および、脂肪族鎖から成る。図２はリンカー分子を示す。リンカー分子は、二硫化ベンジル結合領域、下記の順序から成る親水性領域、(テトラエチレングリコール、コハク酸、テトラエチレングリコール、コハク酸),および、グラミシジンの疎水性領域から成る。図３は膜貫通脂質Cおよび、Dを示す。膜貫通脂質Cは一個から八個の間の1,6- アミノカプロン基とビオチンから成るグループで終結する。膜貫通脂質Dはホスファチジルコリン(PC)，OH，コハク酸またはポリエチレングリコール（PEG）400から成るグループである頭部から成る。図４はビオチン化されたグラミシジンEを示す。ビオチンは、一個から八個の間のアミノカプロイル基から成るリンカー腕を使用して、エタノールアミン端を介してグラミシジンに結合されている。図５はエタノールアミン端を介してグラミシジンに結合されている二つのビオチンを示す。各ビオチンは、リシン基に結合されている直線的に結ばれた二つから四つのアミノカプロイル基に結合されている。図６はトリフタニルホスホリルコリンから成る脂質を示す。図７は人血液内のK+によるバイオセンサーのインピーダンスの変化を示す。図８は単一層のバイオセンサー膜内の繰り返し全血K+検出を示す図９は全血内のバイオセンサー応答がK+濃度の機能であったことを示す。図１０は全血および、血清内のフェリチンの検出を示す。図１１はフェリチンの血清濃度に対するバイオセンサーの応答を示す。図１２はリンカータイプと長さによるストレプタビジンの応答の依存性を示す。図１３はバイオセンサー膜に結合した水置換剤、例えば、保護物資のネットワークを示す。水置換剤は、ANSのようなチロキシン置換試薬を含む。ANS分子は蛋白質結合部位と競合するので、チロキシンは解放され、膜に拡散する。これは競合アッセイ(脂質まで広がる膜に結合している抗チロキシンAb/Fabに結合しているチロキシン-グラミシジンは解放されたチロキシンと競合せず、グラミシジンチャンネルの解放となり、バイオセンサー内でイオン性伝導を戻す)により検出される。図１４はリンカーグラミシジンE"/SDS(1)の追加前；リンカーグラミシジンE"/ SDSの追加後、および、ストレプタビジンおよびビオチン化された抗フェリチンF ab’(2)の追加後の膜のインピーダンススペクトル、フェリチン(3)の追加後のインピーダンススペクトルを示す。図１５はリンカーグラミシジンF"/ストレプタビジンの追加前(1)；リンカーグラミシジンF"/ストレプタビジンの追加後、および、ビオチン化された抗-TSH Fa b’(2)の追加後の膜のインピーダンススペクトル;および、TSH(3)の追加後のインピーダンススペクトルを示す。実施例１単分子層バイオセンサー膜中の全血Ｋ＋の検出グラミシジン以外のイオン担体を、この発明に記載の膜に使用してもよい。脂質成分にかかる膜から主として形成される単純な膜が、極度に強くて生適合的なバイオセンサーを形成することができる。少数の膜成分もまた一層容易な製造性をもっている。単分子層膜：１００ｕＭＭＳＬＰＣ（ＭＳＬ−Ｄ）２０ｕＭＭＡＡＤクロム接着層（ガラス顕微鏡スライド上２００Ａ）上へ新しく蒸着させた金（１０００Ａ）をもつ電極を、上記の成分のエタノール溶液中へ浸し、エタノールですすぎ、そしてインピーダンス測定に用いるまでエタノールと４℃で保存した（何日間から何週間にわたり）。スライドを、作用電極の面積を約１６ｍｍ²と定義したテフロン被覆のウェルを含むブロックの中へ締め付けた。ＰＢＳ緩衝液を加え、次いでＫ＋検出にイオノホア特異的であるエタノール中１ｍＭのバリノマイシン溶液５ｕｌを加えた。インピーダンス測定を行った。図７は、ヒト全血（健康なボランティアから得たもの）中のＫ＋に対するバイオセンサー応答を示すインピーダンス変化は、バイオセンサー膜の中へ取り込まれたバリノマイシンの存在に対して特異的であったことを示している。電極ウェル中のＰＢＳ緩衝液の容量を、血中Ｋ＋イオンがバリノマイシンによりバイオセンサー膜を越えて輸送されるに伴ってインピーダンスの減少をもたらす全血１００ｕｌと完全に交換した。全血の添加は、脂質膜に有害な効果を示さなかった。膜のもっと便宜な集合体でさえも、共に共有結合され単一分子として合成される膜成分をもつであろう。すなわち脂質まで広がる膜は、ＭＡＡＤまたはその類似体（必須のイオンチャンネル又はイオノホア拡散を可能とする最初の層の正しいパッキングを提供する）のようなスペーサー分子と、そしてフィタニルのような余分の炭化水素鎖と結合することができ、脂質まで広がる膜へ、高い流動性を提供する。実施例２：同じ単分子層バイオセンサー膜中の、全血Ｋ＋の反復検出単分子層バイオセンサーの強力な生適合的特性は、全血への反復露出を保持しそしてなおもバイオセンサーとして機能する能力により説明することができる。単分子層膜：１００ｕＭＭＳＬ−コハク酸（ＭＳＬ−Ｄ）２０ｕＭＭＡＡＤ実施例１に記載のようにして電極を作成し測定した。バリノマイシンの添加後、８０ｕｌのＰＢＳ緩衝液を電極ウェル（初期容量は１６０ｕｌ）から除去し、８０ｕｌの全血で置換した。Ｋ＋応答によるインピーダンス変化の記録後、ウェルをＰＢＳ緩衝液で４回洗浄し、そして次の全血への露出前にバリノマイシンを再びウェルに加えた。このサイクルを図８（全血へ反復露出後も完全さを保ち機能しているバイオセンサーを示す）に示すように４回反復した。実施例３：バイオセンサー膜中での全血Ｋ＋滴定この実施例はバイオセンサーの検出能が、臨床的に適切な３〜６ｍＭの範囲または、もし必要ならばそれ以上であることを示すものである。バイオセンサーはまた、単分子層よりもむしろ二分子層の配置においてさえも、全血添加にたいして安定である。第１層：１００ｕＭＭＳＬ−ＰＥＧ４００−ＣＯＯＨ（ＭＳＬ−Ｄ）０．８ｍＭＭＡＡＤ１ｍＭＤＬＰ第２層：１４ｍＭ（Ｃ₁₈ＤＰＥＰＣ：Ｃ₁₈ＧＭＰＥ＝７：３）：バリノマイシン＝１００：１（注：Ｃ₁₈ＤＰＥＰＣ＝２つの付加的なＣＨ₂基をもつＤＰＥＰＣ；Ｃ₁₈ＧＭＰＥ＝２つの付加的なＣＨ₂基とジフィタニル鎖の代わりにモノフィタニル基をもつＧＤＰＥ）実施例１に記載のようにして電極を作成した。第２層をエタノール溶液から加え、次いでＰＢＳ緩衝液を添加し、電極ウェルを４回洗浄した。全血を異なる電極に加え、Ｋ＋濃度によるインピーダンス変化を記録した。図９は、ヒト全血中のＫ＋に対するバイオセンサーの応答は、血中のＫ＋濃度の関数であることを示すものである。全血の添加は、脂質膜に対して悪影響を示さなかった。実施例４：全血と血清中の内因性フェリチンの検出２分子層バイオセンサーは全血の添加に安定であり、無処理の血液中の１工程の内因性フェリチン検出に十分に機能的である。（血液は、クエン酸、クエン酸ソーダ、酸性燐酸ソーダ及びデキストローズ含有の抗凝固剤としてＣＰ２Ｄを使用したボランティアから得た）第１層：９．３ｎＭＧａｙｙ（リンカーＢ）５．５ｎＭＭＳＬＸＸＢ（ＭＳＬ−Ｃ）１．１ｕＭＭＳＬＯＨ（ＭＳＬ−Ｄ）３７ｕＭＭＡＡＤ７５ｕＭＤＬＰ（リンカーＡ）第２層：１４ｍＭ（ＤＰＥＰＣ：ＧＤＰＥ＝７：３）：Ｇａ５ＸＢ（リンカーＥ）＝１００，０００：１電極を作成し、第２層を実施例３に記載のようにして添加した。ＰＢＳ、血清または全血の中のフェリチンを異なる電極［図１０ａ）、ｂ）及びｃ）］に加え、フェリチン濃度によるインピーダンス変化を記録した。図４はまた被検体の添加前の工程、すなわＳＡの添加（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌの５ｕｌ）と過剰のＳＡの洗い流しを示し、次いで図１０ａ）、ｂ）及びｃ）のみにおいて、チオール基でビオチン化した抗フェリチンＦａｂ’の添加（ＰＢＳ中０．０５ｍｇ／ｍｌの５ｕｌ）と次のすすぎ工程をも示す。図１０ｄ）、ｅ）及びｆ）は、フェリチンに特異的なレセプターが存在しないときは、ＰＢＳや血清や全血が添加されることとは無関係に、応答がないことを示している。被検体を含有するサンプルの添加後は、他の試薬や洗浄工程を必要としないことに注意。特異的なレセプターが添加される段階に応じてバイオセンサーが製造され、次いでそれはサンプルの１工程添加のために用いる。実施例５：ヒト血清中の内因性フェリチンからの滴定曲線凝固後に、４人の異なるボランティアから得た血液を遠心分離し、血清を分離してこの例のために用いた。第１層：９．３ｎＭＧａｙｙ（リンカーＢ）５．５ｎＭＭＳＬＸＸＸＸＢ（ＭＳＬ−Ｃ）１．１ｕＭＭＳＬＯＨ（ＭＳＬ−Ｄ）３７ｕＭＭＡＡＤ７５ｕＭＤＬＰ（リンカーＡ）第２層：１４ｍＭ（ＤＰＥＰＣ：ＧＤＰＥ＝７：３）：Ｇａ５ＸＢ（リンカーＥ）＝６６，６６７：１電極を作成し、実施例４に記載のようにして第２層を加えた。当初の１５０ｕｌのウェル容量から１００ｕｌの緩衝液を除去し、１５０ｕｌの血清と置き換えた。異なる電極に異なる血清を加え、フィリチン応答のタウ（秒）を最小のフェーズでのアドミタンスから計算した。図１１は、フェリチンの次の濃度（すなわち１８．８、３８、２８０又は４７６ｐＭ、２回）（インミュライトImmuliteの自動分析器で測定）の一つを含む血清に対するバイオセンサーの応答を示している。図１０ｄ）、ｅ）及びｆ）は、フェリチンに対する特定のレセプターが存在しないときは、ＰＢＳや血清や全血の添加とは無関係に、応答がないことを示している。被検体を含有するサンプルの添加後は、他の試薬や洗浄工程を要しないことに注意。バイオセンサーは、特定のレセプターが添加される時点までに製造され、次いでサンプルの１工程添加に用いられる。実施例６：グラミシジン−ビオチンリンカーの長さと種類に対する被検体応答の変動グラミシジンとビオチンの間のリンカーの長さは、種々の数のカプロイル基または「多くの腕をもった」リンカーをグラミシジンに添加することで変えることができ、ここで各々のリンカーはビオチン分子で終わっており従って単一のグラミシジンは、リンカーの長さと存在する「腕」の数に応じて同一ＳＡ分子内の２つのビオチン部位または２つ若しくはそれ以上のＳＡ分子を補足できるようになる。第１層：０．１ｕＭＧａｙｙ（リンカーＢ）１０ｕＭＭＳＬＸＸＢ（ＭＳＬ−Ｃ）０．８ｍＭＭＡＡＤ１ｍＭＤＬＰ（リンカーＡ）１０ｍＭＧＭＰＥ第２層：Ｇａ...Ｂ＝１００，０００：１、次の何れかを使用：ＧａＸＢ、ＧａＸＸＢ、ＧａＸＸＸＢ、又はＧａ（ＸＸＸ）₂（リンカーＥ）２８ｍＭＧＭＰＥ（注：ＧＭＰＥ＝ジフィタニル鎖の代わりにモノフィタニル鎖をもつＧＤＰＥ）電極を作成し、第２層を実施例４に記載のようにして添加した。ＳＡを、いろいろな種類のグラミシジンを含有する膜の中へ滴定した。図１２はＳＡ応答が、リンカーの種類や長さに依存することを示している。この応答は、最小フェーズにおける周波数を規格化して測定される。すなわち次のように計算する。（ＰｈａＳｅ_final − Ｐｈａｓｅ_initial）／Ｐｈａｓｅ_final 実施例７：２分子層膜の作成「リンカー脂質Ａ」の構造は図１に示され；「リンカーグラミシジンＢ」の構造は図２に示され、「膜貫通脂質D」の構造は図３に示され；「膜貫通脂質C」（ただしｎ＝２）の構造は図３に示され；使用される「ビオチン化されたグラミシジンＦ」の構造は図５に示され；使用される「ビオチン化されたグラミシジンＥ」（ただしｎ＝５）の構造は図４に示されている。ガラスのスライド又はプラスティックの支持体を５０オングストロームのクロム接着層で被覆し、次いで２０００オングストロームの金の層で被覆する。金で被覆した基質を、「リンカー脂質Ａ」（エタノール中１０ｍＭ溶液の３００ｕｌ）、メルカプト酢酸のジスルフィド（エタノール中１０ｍＭ溶液の１５０ｕｌ）、「リンカーグラミシジンＢ」（エタノール中０．０１ｍｇ／ｍｌ溶液の１００ｕｌ）、「膜貫通脂質D」（エタノール中１ｍＭ溶液の２２５ｕｌ）、「膜貫通脂質C」（エタノール中０．０１ｍＭ溶液の２２．３ｕｌ）及びエタノール（５０ｍｌ）を含むエタノール溶液の中へ入れる。金被覆基質は、好ましくは作成後５分以内にこの溶液の中へ入れるべきである。金被覆基質をこの溶液中に６０分放置し、次いでエタノールですすぐ。次に、必要があるまで、エタノール、水とナトリウムアジド（０．０１％，ｗ／ｖ）、エチレングリコール、グリセロール、デカン、デカノール又はヘキサデカン中で貯蔵してもよい。必要とあれば、金被覆スライドをエタノール中ですすぎ、電極が定義され、電流例が約１６ｍ²の面積をもつような電極ホルダーへ組み立てる。次いで７：３の比率の１，２−ジ（３ＲＳ，７Ｒ，１１Ｒ−フィタニル）−グリセロ−３−ホスホコリンと１，２−ジ（３ＲＳ，７Ｒ，１１Ｒ−フィタニル）グリセロールの溶液（エタノール中の総脂質濃度は１４ｍＭ）の５ｕｌを加え、次に燐酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）５００ｕｌで２回すすぎを行い、１００ｕｌのＰＢＳを電極表面に残す。典型的には銀である対電極をＰＢＳ溶液に浸漬し、対電極とセンサー電極をインピーダンス橋につなぐ。−３００ｍＶのＤＣオフセットを、ＡＣ測定の間センサー電極に流す。実施例８：可溶化されたグラミシジンの作成実施例（８Ａ）ＰＢＳ中の「リンカーグラミシジンＥ」（１ｕＭ）とドデシル硫酸ナトリウム（１０ｕＭ）溶液を、浴音波処理器の中で音波処理を２０分間行う。この溶液は、４℃で少なくとも１２カ月貯蔵することができる。ドデシル硫酸ナトリウムとグラミシジンは水溶液では安定であるが、グラミシジンは容易にセンサー膜の中へ取り込まれて、伝導イオンチャンネルを生じる。この伝導変化は、インピーダンス分光法でモニター可能である。実施例（８Ｂ）または「リンカーグラミシジンＦ」溶液（エタノール中１０ｕＭの２０ｕｌ）をストレプタビジン溶液（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌの２００ｕｌとＰＢＳ７００ｕｌ；全量は１ｍｌ）へ加え、撹拌して１分間混合した。この溶液は４℃で数カ月安定である。ＳＤＳやストレプタビジンの存在しないときは、２分子層膜中へのグラミシジン挿入能は１〜２日で急速に劣化する。科学的理論により拘束されることは望まないが、グラミシジンは水溶液外へ沈澱するように思われる。実施例９：可溶化されたグラミシジンを用いてのバイオセンサー膜の作成実施例（９Ａ）実施例７で作成した２分子層膜へ、実施例８Ａで作成した可溶性グラミシジン溶液（１０ｕｌ）を加える。膜のコンダクタンスを、インピーダンス分光法でモニターする。このコンダクタンスは、グラミシジン分子が２分子層膜の中へ挿入されるに伴って増大する。グラミシジンがない場合のＳＤＳまたはストレプタビジンの当量添加は、膜のコンダクタンスを著しく増加させない。可溶性グラミシジン添加前は、１０Ｈｚでのインピーダンスは１７０ｋｏｈｍ／１６ｍｍ²であった。可溶性グラミシジン添加後、所望のレベルのコンダクタンスが得られるまでインピーダンスをモニターし（この場合は、１０Ｈｚで４１ｋｏｈｍｓ／１６ｍｍ²のインピーダンス）、電極をＰＢＳ（３ｘ５００ｕｌ）でよくすすいだ。ストレプタビジン（ＰＢＳ中０．１ｍｇ／ｍｌの５ｕｌ）を電極ウエルに加え、３〜５分間放置し、ＰＢＳ（３ｘ５０ｕｌ）ですすいだ。フェリチン応答センサーの場合は、ビオチン化した抗フェリチンＦａｂ’（ＰＢＳ中０．０６ｍｇ／ｍｌの５ｕｌ）を加え、そして３〜５分後に電極をＰＢＳでよくすすいだ。甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）センサーの場合は、２つの相補的ビオチン化された抗ＴＳＨＦａｂ’（０．０１ｍｇ／ｍｌの１０ｕｌ）の１：１混合物を加えた。ビオチン化されたＦａｂは、新しく分解した（Ｆａｂ）₂二量体の遊離チオール基によりビオチン化されたものである。こうしてセンサーは非検体溶液を添加される状態になった。最終ウェル濃度が２００ｐＭのフェリチンであるようなフェリチンのＰＢＳ溶液の添加により、インピーダンスは４１ｋｏｈｍｓ／１６ｍｍ²から７４ｋｏｈｍｓ／１６ｍｍ²へと増大した。実施例（９Ｂ）実施例７で作成された２分子層膜へ、ストレプタビジン溶液（ＰＢＳ中０．１ｍｇ／ｍｌの５ｕｌ）を加えた。３〜５分後に電極をＰＢＳでよくすすぎ、ビオチン化された抗ＴＳＨＦａｂ’（ＰＢＳ中０．０１ｍｇ／ｍｌの１０ｕｌ）の相補的ペアの１つを加えた。３〜５分後に電極をＰＢＳですすぎ、例（８Ｂ）で作成した可溶性グラミシジン溶液（１０ｕｌ）を加えた。所望の伝導が得られるまで膜のインピーダンスをモニターし（この場合は、１０Ｈｚで４９ｋｏｈｍ／１６ｍｍ²のインピーダンス）、そして電極をＰＢＳですすいだ。次にビオチン化抗体ＴＳＨＦａｂ’の相補的ペアのもう１つ（ＰＢＳ中０．０１ｍｇ／ｍｌの１０ｕｌ）を加え、３〜５分後に電極をすすいだ。このようにして電極は、「膜貫通脂質C」に付着した第一の相補的抗ＴＳＨＦａｂ’と「リンカーグラミシジンＦ」に付着した第二の相補的抗ＴＳＨＦａｂ’をもっている。ウエル中の最終被検体濃度が５００ｐＭであるようなＰＢＳ中のＴＳＨ試験溶液の添加により、インピーダンスは４９ｋｏｈｍ／１６ｍｍ²から６０ｋｏｈｍ／１６ｍｍ²へと増大した。インピーダンスのスペクトルは図１５に示してある。実施例１０：センサー膜の乾燥貯蔵実施例（１０Ａ）センサー膜を実施例７のようにして作成した。次いでこのセンサー膜を、０．５％（ｗ／ｖ）グリセロールの水溶液（０．１％のナトリウムアジド添加）ですすいだ。過剰のグリセロール溶液を除去し、電極アセンブリーに２０ｕｌのグリセロール溶液が残るようにした。次ぎに、乾燥剤をいれた室内へ移し（室内の相対湿度は約１５％）乾燥させた。乾燥したセンサー膜は、室温において１５％〜７０％の相対湿度で１週間まで貯蔵することができる。膜を０．１％ｗ／ｖより低いグリセロール濃度の溶液から乾燥するとその膜はＰＢＳで再水和したときに過剰な漏洩を生じることがわかった。すなわち乾燥してない新しく作成しシールした膜の１０Ｈｚにおけるインピーダンスは１２９〜１４９ｋｏｈｍ／１６ｍｍ²であるが、５〜０．１％ｗ／ｖグリセロール溶液で乾燥した膜の１０Ｈｚにおけるインピーダンスは１００〜１１０ｋｏｈｍ／１６ｍ²の間であった。０．１％ｗ／ｖより低いグリセロール溶液で乾燥した膜は、１０Ｈｚのインピーダンスが４５ｋｏｈｍより少ないというように非常に漏洩的であった。１０Ｈｚでのインピーダンス（１６コの電極の平均）作成直後１５％ＲＨで５日間保存後５％グリセロール（ｗ／ｖ）１４８ｋｏｈｍ１１８ｋｏｈｍ０．５％グリセロール（ｗ／ｖ）１３９ｋｏｈｍ９８ｋｏｈｍ０．１％グリセロール（ｗ／ｖ）１４８ｋｏｈｍ１０３ｋｏｈｍ０．０５％グリセロール（ｗ／ｖ）１３６ｋｏｈｍ３５ｋｏｈｍ過剰の乾燥剤の有利な性質の１つは、空気／水の界面通過から２分子層脂質膜を保護することである。空気／水の界面は、ある種の脂質２分子層構造を不安定化させ分裂させることがある。グリセロールの溶解速度は被検体溶液の添加速度より遅いので、グリセロール被覆は、被検体溶液が添加されるとき空気／水界面と直ちに接触する脂質２分子層なしに脂質膜の制御された再水和を許す。もしセンサー膜を＜５０％ＲＨで貯蔵し次いで被検体溶液を添加すれば、３０〜９０秒継続する平衡／再水和期間が生じることが見いだされた。この平衡は、それは第二の非感知性の示差電極により減少するので被検体濃度を決定するときの必要的な問題とはならない。しかしながら、約７０％の相対湿度雰囲気で一定時間乾燥センサー膜を前平衡化して、この平衡／再水和効果を除去することも可能である。典型的には、この前平衡化は被検体溶液を加える以前の５〜９０分間であってよい。実施例（１０Ｂ）「リンカーグラミシジンＥ」を４，００００：１の脂質：グラミシジン比で２分子層の中へ取り込む以外は、実施例７に記載のようにしてセンサー膜を作成した。この膜は実施例１０Ａに記載のように０．５％ｗ／ｖグリセロール溶液から乾燥され、次いで約１５％の相対湿度で室温において５日間保存した。次にセンサー膜をＰＢＳ溶液で再水和し、ストレプタビジンを加えた（０．１ｍｇ／ｍｌの５ｕｌ）。インピーダンスの増加速度を測定した。便宜な測定は、フェーズと時間の標準的なボード（Ｂｏｄｅ）プロットから得られる最小フェーズにおける周波数であった。指数関数的曲線（ｙ＝−ｋｅ^1/tau）を応答速度曲線へ適合させ、ストレプタビジンへのゲートによる制御速度の測定としてタウ値を用いた。このタウ値は被検体濃度と関連している。ゲート制御ストレプタビジンと応答するこのタウ値は５日間にわたって実験誤差の範囲内で変化しないことがわかった。すなわち次ぎのようである。多くの変更及び／または修飾が、広範に記載された本発明の精神や範囲から逸脱することなく特定の実施態様に示したような発明について当業者によって成されることは理解されるであろう。従って上記の実施態様はすべて説明のためのものであり、限定のためのものではないと考えられるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ラグス，バークハードオーストラリア国 2075 ニューサウスウェールズセイントアイヴズマディーズロード２ (72)発明者ペース，ロナルドジョンオーストラリア国 2607 オーストラリアンキャピタルテリトリーファラーホークスベリークレッセント 138 (72)発明者キング，ライオネルジョージオーストラリア国 2113 ニューサウスウェールズノースライドベアトリスストリート 27 (72)発明者コーンネル，ブルースオーストラリア国 2089 ニューサウスウェールズニュートラルベイウィコムロード 58 (72)発明者ブラーク−マクスヴィティス，ヴィヨレッタルシヤオーストラリア国 2203 ニューサウスウェールズダルウィッチヒルダーリーストリート９

Claims

【特許請求の範囲】１．（１）リンカー脂質 Aメルカプト酢酸の二硫化物、（ＭＡＡＤ）、または類似分子、リンカーグラミシジン B，膜貫通脂質C(MSL-C)および、膜貫通脂質D( MSL-D),または他の適当な結合分子、及び、前記のイオンチャンネル、または、イオン透過担体の組み合わせを含む溶液を形成すること、（２）清潔な金表面を有する電極を溶液と接触させ、これにより、溶液内の成分を含む二硫化物を、電極の金表面に吸着させること、（３）電極を適当な有機溶媒ですすぐこと、および、（４）すすぎ洗いに使用された、過剰の有機溶媒を取り除くことを特徴とする第１層、の電極膜の製造方法。２．溶液がメルカプト酢酸の二硫化物（ＭＡＡＤ）または２−メルカプトエタノールの二硫化物（ＥＤＳ）を含む請求の範囲第１項記載の方法。３．メルカプト酢酸の二硫化物（ＭＡＡＤ）または２−メルカプトエタノールの二硫化物（ＥＤＳ）に対するリンカー脂質 Aの比が２：１である請求の範囲第２項記載の方法。４．ＭＳＬ−Ｄに対する(リンカー脂質 A + MAADまたはEDS)に対する比が１０：１と１００：１の範囲である請求の範囲第２または３項記載の方法。５．ＭＳＬ−Ｃに対する(リンカー脂質 A + MAADまたはEDS)に対する比が２０，０００：１と１００：１の範囲である請求の範囲第２〜第４項記載の方法。６．ＭＳＬ−Ｃに対する(リンカー脂質 A + MAADまたはEDS)に対する比が２０，０００：１である請求の範囲第２〜５項記載の方法。７．溶液が、他の適当な結合分子／イオンチャンネルまたは他の組み合わせよりむしろリンカーグラミシジン Bを含む請求の範囲第２〜６項の何れか一つに記載の方法。８．リンカーグラミシジン Bに対する(リンカー脂質 A + MAADまたはEDS)に対する比が１０，０００：１である請求の範囲第７項記載の方法。９．リンカーグラミシジン Bに対する(リンカー脂質 A + MAADまたはEDS)に対する比が２０，０００：１と１００，０００：１の範囲である請求の範囲第７または８項記載の方法。１０．金電極が新たに蒸着または吹き付けられた金電極よりなる請求の範囲第１〜９項の何れか一つに記載の方法。１１．金電極が、プラズマエッチング法またはイオンビームミリング法により新たに洗浄されている請求の範囲第１０記載の方法。１２．溶液吸着（工程（１））用並びにすすぎ洗い工程（４）用の溶媒がエタノールである請求の範囲第１〜１１項の何れか一つに記載の方法。１３．（１）メルカプト酢酸の二硫化物（ＭＡＡＤ）、または、類似分子、膜貫通脂質C(MSL-C)、および／または、膜貫通脂質D(MSL-D)、および、任意に、リンカー脂質 A，リンカーグラミシジン B、または他の適当なリンカー分子、および他のイオンチャンネルの組み合わせを含む溶液を形成すること、（２）清潔な金表面を有する電極を溶液と接触させ、これにより、溶液内の成分を含む二硫化物を、電極の金表面に吸着させること、（３）電極を適当な有機溶媒ですすぐこと、および、（４）すすぎ洗いに使用された、過剰の有機溶媒を取り除くことよりなる単一層電極膜の製造方法において、工程（１）の溶液が、５０モル％を超える脂質まで広がる膜を含むことを特徴とする方法。１４．工程（１）の溶液が、７０モル％の脂質まで広がる膜と、２９モル％のＭＡＡＤまたは２−メルカプトエタノール（ＥＤＳ）と、１％の他の脂質まで広がる膜を含む請求の範囲第１３項に記載の方法。１５．金電極が、新たに蒸着または吹き付けられた金電極よりなる請求の範囲第１３または１４項記載の方法。１６．金電極表面が、プラズマエッチング法またはイオンビーミング法により新たに洗浄されている請求の範囲第１５項に記載の方法。１７．溶液吸着（工程（１））用並びにすすぎ洗い工程（４）用の溶媒がエタノールである請求の範囲第１３〜１６項の何れか一つに記載の方法。１８．ＭＡＡＤ、または、ＥＤＳのような類似のスペーサー分子が、膜貫通脂質CまたはDと共有結合している請求の範囲第１３〜１７項の何れか一つに記載の方法。１９．ＭＳＬ−ＣまたはＤが、ＤＰＥＰＣ、ＧＤＰＥ、トリフィタニルまたは類似分子と共有結合している請求の範囲第１３〜１８項の何れか一つに記載の方法。２０．溶液が、メルカプト酢酸の二硫化物（ＭＡＡＤ）または２−メルカプトエタノールの二硫化物（ＥＤＳ）を含む請求の範囲第１３〜１９項の何れか一つに記載の方法。２１．ＭＳＬ−ＣまたはＤが、ＭＡＡＤまたＥＤＳ並びにＤＰＥＰＣ、ＧＤＰＥ、トリフィタニルまたは類似分子と共有結合している請求の範囲第２４項記載の方法。２２．１）適当な溶媒に分散している脂質および、ビオチン化されたグラミシジンＥの溶液を、請求項第１〜１２項の何れか一つに記載された方法により製造された第一層を含む電極の表面に加えること、２）電極表面を水溶液ですすぐこと、３）ストレプタビジン、アビジン、中性ビジン、アビジンまたはストレプタビジン誘導体溶液を加えること、４）過剰のストレプタビジン、アビジン、中性ビジン、または、他のアビジンまたは、ストレプタビジン誘導体を取り除くために、電極を水溶液ですすぐこと、５）ビオチン化された結合共同体分子の溶液を加えること、６）被覆された電極を水溶液ですすぐことを特徴とする第二層の電極膜の組み合わせの製造方法。２３．工程（１）で使用する脂質が、ジフタニルホスファチジルコリン（DPEP C）とグリセリルジフィタニルエーテル(GDPE)との混合物である請求項第２２項記載の方法。２４． DPEPCとGDPEの比が７：３である請求項第２２または２３項記載の方法。２５．工程（１）で使用する脂質が、図（６）に示したトリフタニルフォスフォリルコリンである請求項第２２項記載の方法。２６．工程（１）で使用する脂質に、０〜５０％のコレステロールを含有させた請求項第２２項記載の方法。２７．工程（１）で使用する脂質に、０〜２０％のコレステロールを含有させた請求項第２２項記載の方法。２８．ビオチン化されたグラミシジン Eに対する脂質の比が１０，０００：１と１，０００，０００：１の間である請求項第２２〜２７項の何れか一つに記載の方法。２９．ビオチン化されたグラミシジンEに対する脂質の比が１００，０００：１である請求項第２８項記載の方法。３０．１個から８個のアミノカプロイル基で構成されたリンカー腕を使用して、ビオチンをエタノールアミン端を介してグラミシジンに結合した請求項第２２〜２９項の何れか一つに記載の方法。３１．二つのビオチンが、エタノールアミン端を介してGramicidinに結合されており、これにより、ビオチンが、一つのストレプタビジン、アビジン、または、類似のビオチン結合の蛋白質の隣接結合部位に同時に結合することができる請求項第２２〜３０項の何れか一つに記載の方法。３２．二つのビオチンがエタノールアミン端を介してグラミシジンに結合されており、これにより、ビオチンが二つの別のストレプタビジン、アビジン、または、類似のビオチン結合蛋白質分子に同時に結合することができる請求項第２２〜３０項の何れか一つに記載の方法。３３．二つのビオチンがエタノールアミン端を介してグラミシジンに結合しており、これにより各ビオチンが図（５）に示されているようにリジン基に結合されている二つから四つの直線的に結合しているアミノカプロイル基に結合している請求項第３１項記載の方法。３４．ビオチンがエタノールアミン端を介してグラミシジンに結合しており、これにより各ビオチンがリシン基に結合されている２〜２０個の直線的に結合しているアミンカプロイル基に結合している請求項第３１項記載の方法。３５．ビオチンが、エタノールアミン端を介してグラミシジンに結合しており、これにより、各ビオチンが、分岐した構造として２〜２０個のアミノカプロイル基に結合している請求項第３０項記載の方法。３６．工程（３）で加えられた、ストレプタビジン、アビジン、または、他の類似のビオチン結合蛋白質の量は、プロゾン効果を起こすのに充分なものであり、膜の中の利用できるビオチン化された種のほとんどは、一つのストレプタビジン、または、関連した結合された分子を持つことができ、検体を含む標本がセンサーに加えられるまでグラミシジンチャンネルとＭＳＬ間の架橋を防ぐ請求項第２２〜３３項記載の方法。３７．ストレプタビジン、アビジン、または、類似のビオチン結合蛋白質を加えるに先立って、脂質膜電極アッセンブリを冷却する請求項第２２〜３６項の何れか一つに記載の方法。３８．脂質膜電極組立を、０〜５０℃の範囲に冷却する請求項第３７項記載の方法。３９．脂質膜電極組立を、０〜５℃の範囲に冷却する請求項第３８項記載の方法。４０．引き続いてのすすぎ洗いとビオチン化した結合相手分子の添加を０℃から５０℃で行う請求項第３７項から第３９項の何れか一つに記載の方法。４１．引き続いてのすすぎ洗いとビオチン化した結合相手分子の添加を０℃から５℃で行う請求項第４０項記載の方法。４２．結合相手分子がビオチン化した抗体またはビオチン化した抗体フラグメントである請求項第４０項または第４１項に記載の方法。４３．結合相手分子が、有利Ｆａｂ’チオール基によりビオチン化されたＦａｂ’フラグメントである請求項第３７項から第３９項の何れか一つに記載の方法。４４．Ｆａｂ’とビオチンの間のリンカーが１０〜８０オングストロームの長さの間にある請求項第４０項に記載の方法。４５．Ｆａｂ’とビオチンの間のリンカーが１〜８個のアミノカプロイル基から成る請求項第４２項または第４３項に記載の方法。４６．２つのビオチンを含む基が、該２つのビオチンが１つのストレプタビジン、アビジン又は他の類似のビオチン結合蛋白と同時に複合形成可能なように抗体または抗体フラグメントに付着している請求項第４２項から第４５項の何れか一つに記載の方法。４７．２つのビオチンを含む基が、該２つのビオチンが２つのストレプタビジン、アビジン又は他の類似のビオチン結合蛋白と同時に複合体形成可能なように抗体または抗体フラグメントに付着している請求項第４２項から第４５項の何れか一つに記載の方法。４８．工程３）〜５）が次に示す３）、すなわち「３）ストレプタビジン、アビジン、ニュートラビジン又は他のアビジン若しくはストレプタビジン誘導体と結合対の１つである分子との接合体を含む溶液を加えること、」で置き換えられた請求項第２２項から第４１項の何れか一つに記載の方法。４９．結合相手分子が抗体または抗体フラグメント例えばＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦａｂｖフラグメントである請求項第４８項に記載の方法。５０．結合対が天然の結合蛋白および細胞レセプター／被検体、酸素または酵素類似体／置換体、レクチン／炭水化物、相補的核酸配列、抗ＦＣ、プロテインＡまたはプロテインＧ／抗体から選ばれたものである請求項第４８項または第４９項に記載の方法。５１．１）適当な溶媒に分散している脂質の溶液を、請求項第１項から第１２項の何れかに記載された方法により製造された第１層を含む電極の表面に加えること；２）電極表面を水溶液ですすぐこと；３）界面活性剤で共分散されるか又は高分子種とカップリングして可溶化されたイオンホアを含有する水溶液を加えること；４）電極を水溶液ですすぐこと；そして５）ストレプタビジン、アビジンもしくは他の類似のビオチン結合蛋白を用いてレセプターを加え次いでビオチン化した抗体もしくは抗体フラグメントを加えるか、又はストレプタビジン、アビジンもしくは抗体もしくは抗体フラグメントと接合した他の類似のビオチン結合蛋白を加えること、から成る、第二層の電極膜の組み合わせの製造方法。５２．工程１）で使用する脂質がジフィタニルホスファチジルコリン（ＤＰＥＰＣ）及びグリセリルジフィタニルエーテル（ＧＤＰＥ）の混合物である請求項第５１項に記載の方法。５３．ＤＰＥＰＣ及びＧＤＰＥが７：３比率である請求項第５２項に記載の方法。５４．工程１）で使用する脂質が、図（６）に示すトリフィタニルホスホリルコリンである請求項第５１項に記載の方法。５５．製造された膜がさらに０〜５０％のコレステロールを含有する詰求項第５１項から第５４項の何れか１つに記載の方法。５６．製造された膜がさらに０〜２０％のコレステロールを含有する請求項第５１項から第５４項の何れか１つに記載の方法。５７．工程３）で用いた水溶液が、界面活性剤の水溶液に添加されたグラミシジン又はグラミシジン誘導体を含んでおり、その界面活性剤はグラミシジンに関して過剰に存在するが界面活性剤の総濃度は臨海的ミセル濃度（ＣＭＣ）より低い請求項第５１項から第５６項の何れか１つに記載の方法。５８．グラミシジン／界面活性剤溶液を超音波浴またはホーンを用いて５〜１０分間音波処理する請求項第５７項に記載の方法。５９．界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム、オクチルグルコシド、ツイーン及びその他のイオン性または非イオン性洗剤から選ばれる請求項第５７項または第５８項に記載の方法。６０．洗剤がドデシル硫酸ナトリウムである請求項第５９項に記載の方法。６１．ドデシル硫酸ソーダの濃度が０．００００１Ｍよりも低くかつグラミシジンの濃度がドデシル硫酸ソーダ濃度より１０倍低い請求項第６０項に記載の方法。６２．第一層膜がリンカー基によって電極と結合し、該第一層膜が溶媒の存在下に貯蔵されているような、両親媒性分子および複数のイオノホアが密接にバックされた配列ならびに電極から成る第一層膜電極の組み合わせ。６３．電極が貯蔵されている溶媒が有機溶媒または水性溶媒である請求項第６２項に記載の電極の組み合わせ。６４．電極が貯蔵されている溶媒がエタノール、グリセロール、エチレングリコール及び３〜１２個の炭素原子を含むアルコール又はジオールから選ばれた溶媒である請求項第６３項にに記載の電極の組み合わせ。６５．電極が貯蔵されている溶媒が８〜２０個の炭素原子の炭化水素である請求項第６３項に記載の電極の組み合わせ。６６．溶媒が洗剤を含む水性溶媒である請求項第６３項に記載の電極の組み合わせ。６７．電極が貯蔵されている溶媒が電極表面の酸化を最小にするように電極を被覆できる化合物である請求項第６２項または第６３項に記載の電極の組み合わせ。６８．溶媒が薄膜として使用され得る請求項第６７項に記載の電極の組み合わせ。６９．膜の伝導度が被検体の存在または不存在に依存的であり、バイオセンサーが通常存在している水性浴溶液が脂質膜バイオセンサーの乾燥時には除去され、そして脂質膜およびレセプター分子は脱水時にそれらの機能、構造および活性を保持するような、イオノホアの組み込まれた脂質膜からなるところの脂質膜由来バイオセンサー。７０．乾燥工程中はバイオセンサー膜は空気と水の界面とは接触しないような請求項第６９項に記載のバイオセンサー。７１．脱水工程中はバイオセンサー膜は空気と水の界面とは接触しないような請求項第６９項に記載のバイオセンサー。７２．水溶性溶液が凍結乾燥、蒸発、および管理された温度下での蒸発から選ばれた乾燥方法によって除去される請求項第６９項から第７１項までの何れか１つに記載のバイオセンサー。７３．水性浴溶液が蛋白、低分子ジオール又はトリオール、ポリエチレングリコール、低分子量糖類、重合ペプチド、重合電解質およびそれらの組み合わせから選ばれた水置換物質で置換される請求項第６９項から第７２項までの何れか１つに記載のバイオセンサー。７４．水置換物質がウシ血清アルブミン、血清、魚ゼラチン、非脂肪乾燥粉ミルク、カゼイン、グリセロール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、ポリエチレングリコール、トレハロース、キシロース、グルコース、スクロース、デキストロース、デキストラン又はフィコールから選ばれたものである請求項第７３項に記載のバイオセンサー。７５．水置換物質がグリセロール、スクロース、デキストラン又はトレハロースから選ばれたものである請求項第７４項に記載のバイオセンサー。７６．分子の種類が、サンプルに拡散層を与えるという付加的な利点をもつものから選ばれた請求項第７３項に記載のバイオセンサー。７７．分子の種類が、特定の細胞、細菌、ウイルス及び分子類たとえば大分子量の蛋白に対するフィルターを提供するという付加的な利点をもつものから選ばれた請求項第７３項に記載のバイオセンサー。７８．分子の種類が、血清や血液中の蛋白と結合している小さな被検体と競合するに必要な特定の置換試薬のための貯器を提供するという付加的な利点をもつものから選ばれた請求項第７３項に記載のバイオセンサー。７９．水置換剤の何れかが特定の膜成分と共有結合的に結合してもよい請求項第７３項に記載のバイオセンサー。８０．水置換剤の何れかが膜まで広がる脂質と共有結合的に結合してもよい請求項第７３項に記載のバイオセンサー。８１．バリノマイシンが適切な長さのリンカーによって共有結合的にＭＳＬ− Ｃ又はＭＳＬ−Ｄと結合して片方の側から他の側へのバリノマイシンの拡散を可能としている請求項第１３項から第２１項の何れか１つに記載の方法。８２．脂質リンカーＡと、２−メルカプトエタノール（ＥＤＳ）又はメルカプト酢酸のジサルファイドとの比率が５：１から１：２までの範囲内である請求項第１項または第２項に記載の方法。