CN1820079A - 焦磷酸的测定方法和引物延伸反应的检测方法以及实施此方法的装置 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种必需酶的种类少、且无须进行严密温度控制的焦磷酸(PPi)定量测定方法和引物延伸反应的检测方法，以及实施这些方法的套件和装置。本发明的PPi测定方法，通过使未知浓度的PPi试样作用于存在于膜内的放线菌H⁺－焦磷酸酶(H⁺－PPase)，对其结果生成的H⁺的输送进行解析来测定试样中的PPi浓度。本发明的引物延伸反应检测方法使未知的核酸试样作用于在膜内存在的放线菌H⁺－PPase，研究是否引起引物延伸反应，对其结果生成的H+的输送进行解析，判断未知核酸试样是否进行了引物延伸反应。

Description

焦磷酸的测定方法和引物延伸反应的检测方法 以及实施此方法的装置

技术领域

本发明涉及焦磷酸(pyrophosphoric acid)的测定方法以及特定核酸的碱基序列或者特定碱基种类的检测方法，以及用来实施该方法的焦磷酸测定装置和引物延伸反应(primer extension reaction)装置。

背景技术

已知焦磷酸(下面称为PPi)与细胞内的酶反应有密切关系。例如，在蛋白质合成过程中，在氨基酸经由氨酰基腺苷酸(aminoacyl adenylacid)形成氨酰基tRNA的反应中会生成PPi。此外，例如，在植物等中发现的淀粉合成过程中，当通过葡萄糖-1-磷酸和ATP的反应生成ADP-葡萄糖时，也生成PPi。除此之外，已知在各种酶反应中均涉及PPi。从而，定量检测PPi的技术，在解析细胞状态或者上述酶反应等方面是一项重要技术。

作为现有技术的PPi测定方法，已知有Grindley等化学方法(非专利文献1)。但是，在该方法中，因为需要使用浓硫酸，所以在安全方面并不是优选的。

这里，在专利文献1中公开有三种不使用浓硫酸等危险药品、而利用酶的PPi测定方法。

第一种方法是在磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate)和腺苷(adenosine)一磷酸的存在下，使丙酮酸正磷酸二激酶(pyruvateortho phosphate dikinase：PPDK)作用于PPi的方法。由于通过该反应会生成丙酮酸(pyruvic acid)，因此，通过测定丙酮酸的量就可以计算出PPi的量。其中，在测定丙酮酸的量的方法中，提出了两种方法。一种是利用乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase)的催化作用、通过NADH还原丙酮酸时，对NADH的减少进行比色定量的方法，另一种方法是使丙酮酸氧化酶作用于生成的丙酮酸，通过生成的过氧化氢导入色素进行比色定量的方法。

第二种方法是在胞苷二磷酸甘油(シチジン(cytidine)ニリングリセロ一ル(glycerol))存在下，用甘油-3-磷酸胞苷转移酶(glycerol-3-phosphate cytidylic transferase)作用于PPi的方法。通过此反应生成甘油三磷酸。从而，只要测定出甘油三磷酸的生成量就能够计算出PPi的量。有关测定甘油三磷酸的定量方法提出有两种方法。首先是利用3-磷酸甘油脱氢酶的催化作用，在用NAD(P)氧化甘油三磷酸时，对NAD(P)H的增加进行比色定量的方法。其次是对用甘油-3-磷酸氧化酶作用于生成的甘油三磷酸而生成的过氧化氢导入色素进行比色定量的方法。

第三种方法是在胞苷二磷酸核糖醇存在下，使核糖醇-5-磷酸胞苷转移酶作用于PPi的方法。由于通过该反应生成D-核糖醇-5-磷酸，测定其生成量就能够测定出PPi的量。测定D-核糖醇-5-磷酸的方法，提出过在NAD(或NADP)存在下使核糖醇-5-磷酸脱氢酶作用，对NADH(或NADPH)的增加进行比色定量的方法。

此外，除了上述方法以外，还公知有将PPi变换成ATP，然后再利用荧光素酶反应的方法。

而且，上述PPi的测定技术，不仅是只测定PPi，例如，也能够应用于利用以PCR法为代表的核酸扩增法的特定核酸碱基序列的检测中。在此，根据作为目的的核酸序列特异性结合的引物是否进行了延伸反应，而能够判断出在试样中是否存在作为目的的特定核酸碱基序列，在引物的延伸反应中，已知作为副产物会生成PPi。

从而，对于伴随着引物延伸反应(核酸扩增反应)而检测出的PPi来说，由于其与原来目的、即检测核酸碱基序列有关，所以，通过将引物延伸反应和上述PPi测定技术中的任何一种组合起来，就能够在测量PPi时，检测作为目的的核酸碱基序列。这样的技术可以用于例如检查食品中由细菌和病毒造成的污染，或者应用于检查细菌和病毒对人体的感染。

此外，PPi的测定技术，也能够应用于判别核酸碱基序列内的特定的碱基种类。也就是说，例如已知某个遗传基因内的特定一个碱基的变异会引起严重的疾病，或者被称为SNP的由于一个碱基变化造成的遗传基因多型会对各个人的体质产生影响。因此，判别这样的特定一个碱基的碱基种类的技术近年来得到特别的重视，作为代表性的这种技术，已知有可以利用引物延伸反应。

该方法是通过分析有无依存于目的碱基的碱基种类的引物延伸反应或者效率是否不同，来特定该碱基的种类，但是，对于该方法来说，与上述核酸碱基序列检测方法的情况相同，通过测定伴随着反应而生成的PPi生成量就能够实现分析的目的。

另一方面，对于H⁺-焦磷酸酶(H⁺-pyrophosphatase，下面称为“H⁺-PPase”)来说，是将在PPi的高能磷酸键水解的过程中释放出的能量，经过膜而转换为能动地输送H⁺的能量转换酶。在一种光合细菌(深红红螺菌，Rhodospilium rubrum)中，该酶的功能是被检测的H⁺-PPase，但是，近年来随着染色体组计划的进行等，已经明确其在生物界的分布范围远比预想的更广。

也就是说，可以看出，H⁺-PPase存在于包括高等植物或者绿藻等整个植物界，以及光合细菌、古细菌等的某些细菌类的细胞膜、枯氏锥虫(Trypanosoma cruzi)或者疟原虫等寄生原生物所具有的细胞内酸性颗粒的膜等中。其中，研究得比较好的是在植物中发现的H⁺-PPase，据推测，还未解明的许多残留部分对于植物来说是必需的酶，对于其重要性也是毫无疑问的。进一步如下所述。

在植物的液胞膜内存在的H⁺-PPase，能够促进由于水解而除去细胞质PPi的生物体内高分子合成反应。此外，利用通过上述水解得到的能量向细胞内输送细胞质的H⁺，有助于维持细胞质的pH值和液胞酸性化以及液胞膜的能量化。在液胞膜内外形成pH值梯度时产生的能量，作为在液胞膜上存在的其它二次输送体的驱动力是必要的。

这样一来，植物的H⁺-PPase在植物中起着非常重要的作用，而预想放线菌(蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor))的H⁺-PPase的作用也是非常大的。但是，放线菌的H⁺-PPase与植物的H⁺-PPase不同，其生理功能和生化功能等大部分内容都还没有解明。

作为近期涉及放线菌H⁺-PPase研究的例子，有非专利文献2。在该文献中，对在液胞膜H⁺-PPase中高度保存的六个组胺酸残基的重要性进行了解析。其方法是用其它氨基酸残基取代在绿豆的液胞膜H⁺-PPase中的组胺酸残基，对这种变异型液胞膜H⁺-PPase进行解析。结果，上述六个组胺酸残基显示出在液胞膜H⁺-PPase的酶活性和结构的形成过程中起着重要的作用。

其中，作为用来对被分析物质进行定量分析的生物传感器，在专利文献2中公开了由含有离子通道的脂质双层构成的生物传感器。这种生物传感器，是一种含有交联固化高分子的生物传感器，其特征在于，是一种液晶膜，包括：由从内部室中露出的极性物质构成的具有至少一个壁的用于区分室的容器，包含在室内的大量水性电解质介质，位于室的上部且浸渍在电解质介质中的参照电极，位于室的下部的记录电极，和含有离子通道的脂质双层，其中，该液晶膜浸泡在参照电极和记录电极之间的电解质介质中，交联固化分子一侧与记录电极、另一侧与脂质双层相结合，通过在空间上连接脂质双层和记录电极，使得与至少一个壁的极性物质接触的而产生的极性，使在密闭的脂质双层的上面和假面连续地连接着大量的水性电解质。

专利文献1：日本专利特开昭61-12300号公报

专利文献2：美国专利第5204239号说明书

非专利文献1：G.B.Grindley and C.A.Nichel，Anal.Biochem.，vol33.p114(1970).

非专利文献2：Hsiao YY、Van RC，Hung SH、Lin HH、Pan RL.，《Roles of histidine residues in plant vacuolar H(+)-pyrophosphatase》(《在植物液胞H(⁺)焦磷酸酶中组胺酸残基的作用》)，Biochim Biophys Acta.2004Feb 15；1608(2-3)：190-9.

发明内容

(发明要解决的问题)

如上所述，作为PPi的测定技术，现阶段已知有几种方法，但是，在任何一种方法中，都存在必需有多种酶、试剂等而导致成本升高，而且工序复杂的缺点。特别是所用的酶对热都是不稳定的，所以在使用时必须适当地保存在冰中。

在此，当测定PPi时使用的酶具有如下的耐热性时，上述现有技术的缺点就能够在很大程度上得以消除。也就是说，即使在至少40℃的条件下曝露30分钟，也能够维持与在冰中保存30分钟时同样的活性。但是，在测定PPi时使用的酶当中，还不知具有这种耐热性的酶。

此外，在现有技术的检测核酸碱基序列或者碱基种类的方法中，从敏感度的方面出发，将PPi变换为ATP，然后再利用荧光素酶反应检测PPi的方法已经很好地得到了应用。但是，在该情况下，由于在引物延伸反应中通常使用的dATP成为荧光素酶反应的基质，所以不能使用。从而，代替dATP作为DNA聚合酶的基质，而且作为荧光素酶反应的基质，必须使用没有作用的特殊dATP类似物，这就成为缺点。

此外，当植物的H⁺-PPase接触Tris缓冲液时会失活。因此，当成为测定对象的溶液含有Tris缓冲液时，不能使用植物的H⁺-PPase来测定PPi，这也成为一个问题。

(解决问题的手段)

本发明人针对上述课题进行了深刻研究的结果发现，在H⁺-PPase当中，放线菌的H⁺-PPase具有耐热性，即使接触Tris缓冲液也不会失活，至此完成了本发明。

也就是说，基于上述的认识，本发明的目的在于提供一种PPi的测定方法以及引物延伸反应的检测方法，并且提供实施该方法用的装置。

具体说来，本发明是一种焦磷酸的测定方法，其特征在于，该方法包括：

在由保持有放线菌H⁺-焦磷酸酶、且H⁺难以通过的膜所分隔的第一区域和第二区域中，以与上述膜相接触的方式向上述第一区域添加含有焦磷酸的溶液的工序(a)；和

在上述工序(a)之后，对上述第一区域或者上述第二区域中的任何一方的H⁺浓度进行测定的工序(b)，其中，

上述放线菌的H⁺-焦磷酸酶的使焦磷酸水解的活性部位从上述第一区域露出。

上述溶液可以含有Tris缓冲液。

在上述工序(b)中，可以光学测定上述第一区域或者上述第二区域中的H⁺浓度。

在上述工序(b)中，也可以在上述第一区域或者上述第二区域中的至少一方添加pH感受性色素或者膜电位感受性色素，通过对上述pH感受性色素或者膜电位感受性色素的光学特性进行解析来测定H⁺浓度。

优选上述pH感受性色素或者膜电位感受性色素选自荧光黄、荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖、吖啶橙、喹吖因和氧杂菁V中的至少一种。

在上述工序(b)中，可以对上述第一区域或者上述第二区域中的任何一方的H⁺浓度进行电气测定。

上述放线菌优选是蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)。

本发明还是一种焦磷酸的测定装置，其特征在于，该装置包括：容器；

将上述容器内分隔为内部区域和外部区域、且H⁺难以通过的膜；

以与存留在上述外部区域或者内部区域中的溶液相接触的方式而设置的参照电极；和

以与存留在上述内部区域中的溶液相接触的方式而设置的H⁺感受性电极，其中，

在上述膜中，放线菌H⁺-焦磷酸酶的使焦磷酸水解的活性部位被保持露出上述外部区域。

上述溶液可以含有Tris缓冲液。

上述放线菌优选是蓝色链霉菌。

本发明还是一种使用上述焦磷酸测定方法来检测引物延伸反应的方法，

在上述工序(a)之前，还包括配制反应溶液的工序(c)，该反应溶液含有被检测核酸和具有与该被检测核酸互补结合的碱基序列的引物，在发生上述引物延伸反应时会生成焦磷酸，

在上述工序(a)中，以与上述膜相接触的方式向上述第一区域中添加含有在上述工序(c)中发生引物延伸反应情况下生成的焦磷酸的上述反应溶液，通过测定上述反应溶液中的焦磷酸，来判别上述被检测核酸中存在特定的碱基序列或者碱基种类。

在上述工序(b)中，也可以光学测定H⁺浓度。

在上述工序(b)中，向上述第一区域或者上述第二区域中的至少一方添加pH感受性色素或者膜电位感受性色素，通过对上述pH感受性色素或者膜电位感受性色素的光学特性进行解析来测定H⁺浓度。

优选上述pH感受性色素或者膜电位感受性色素选自荧光黄、荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖、吖啶橙、喹吖因和氧杂菁V中的至少一种。

在上述工序(b)中，也可以电气测定上述第一区域或者上述第二区域中的至少一方的H⁺浓度。

本发明还是一种检测引物延伸反应装置，该装置包括上述焦磷酸测定装置，

上述容器是包括如下部分的反应容器：

用来注入试样的试样注入口；

进行引物延伸反应处理的引物延伸反应槽；

用来进行测定焦磷酸的反应的焦磷酸反应槽；和

连接上述引物延伸反应槽和焦磷酸反应槽的流道，其中，

上述引物延伸反应槽存留反应溶液，该反应溶液是含有具有核酸、和含有包括与该核酸互补结合区域的碱基序列的引物的溶液，在发生上述引物延伸反应的情况下会生成焦磷酸，

上述焦磷酸反应槽包括通过参照电极和H⁺感受性电极对在槽内产生的信号进行检测的检测装置，

在由保持有放线菌H⁺焦磷酸酶、且难以通过H⁺的膜所分隔的第一区域和第二区域当中，向上述第一区域添加含有由引物延伸反应生成的焦磷酸的溶液，使其与上述第一区域相接触，然后对上述第一区域或者上述第二区域中的任何一方的H⁺浓度进行测定。

上述检测引物延伸反应装置，优选还包括控制上述引物延伸反应槽温度的温度控制部件。

上述检测引物延伸反应装置，优选还包括对上述检测装置内的测定结果进行解析的解析部件。

如图1所示，在自然界当中，H⁺-PPase存在于液胞膜等的脂质双重膜中，具有使PPi水解的活性部位，具有相对于被该膜隔开的两个区域中的任何一个露出的形状。在露出该PPi水解活性部位一侧的区域中存在有PPi的情况下，H⁺-PPase在使该PPi水解的同时，还具有使露出上述PPi水解活性部位一侧的区域内的H⁺向被膜隔开的另一侧区域内输送的性质。因此，通过H⁺-PPase的酶反应，能够使被膜隔开的两个区域中，在露出H⁺-PPase的PPi水解活性部位一侧区域中的H⁺浓度减少，在另一侧区域中的H⁺浓度增大。

按照本发明的PPi测定方法，通过保持具有耐热性的放线菌H⁺-PPase，且由H⁺难以通过的膜所隔开的第一区域和第二区域中，在上述第一区域中以与上述膜接触的方式而储存含有PPi的溶液，使得从第一区域向第二区域输送H⁺，致使第一溶液和第二溶液的H⁺浓度发生变化。通过测定第一溶液或者第二溶液中的任何一方的H⁺浓度的变化，而能够测定第一溶液中的PPi量。从而，在本发明的PPi测定方法中，无需多种酶和试剂等，工序也很简单，在测定时降低了一定的成本。

具有耐热性的放线菌H⁺-PPase与植物的H⁺-PPase不同，在50℃以上还具有酶的活性，所以与现有技术的PPi测定技术不同，没有必要进行严密的温度控制。

由于来源于放线菌或者嗜热菌的H⁺-PPase在60℃以上还维持酶的活性，所以非常容易处置。而在放线菌的H⁺-PPase中，由于本发明人确立了大量的生产手段，所以是优选的。

在本发明的PPi测定装置中，当向容器内注入试样溶液时，在试样溶液中存在有PPi的情况下，会发生H⁺-PPase的酶反应，被膜隔开的内部区域中的H⁺的浓度增大，而在外部区域中的H⁺浓度减小。由此，通过由参照电极和H⁺感受性电极用电气方法测定的H⁺浓度变化，就能够定量测定出PPi的量。

作为判别在核酸中存在特定碱基的碱基种类的方法，例如，在使用具有与想要判别的碱基与3’相邻的碱基序列完全互补序列的引物和与想要判别的碱基的预想碱基种类互补的dNTP进行引物延伸反应的情况下，通过引物延伸反应进行的程度，而能够判别想要判别的碱基的碱基种类。而在具有与含有想要判别的碱基的碱基序列互补的碱基序列，而且同时使用四种dNTP进行引物延伸反应的情况下，依存于待判别碱基的碱基种类不同，在进行引物延伸反应的程度上产生差异，就是使用所谓等位特异性引物的方法。

无论任何一种方法，在根据引物延伸反应进行的程度判断特定的碱基序列或者碱基种类这一点上都是共同的。引物与具有互补碱基序列的核酸杂交，通过引物延伸反应而延伸。当引起引物延伸反应时，生成PPi。本发明的特定碱基序列的检测方法和检测装置，通过测定由该引物延伸反应生成的PPi，而能够解析引物延伸反应进行的程度。从而，能够判别特定碱基的碱基种类。

此外，在判别试样溶液中有无具有特定碱基序列的核酸的情况下，如果进行引物延伸反应，则可以得知存在具有与引物互补的碱基序列的核酸。反之，如果不进行引物延伸反应，则可以得知不存在具有与引物互补的碱基序列的核酸。

如此，本发明的特定碱基序列的检测方法和检测装置，能够判别在试样溶液中有无具有特定碱基序列的核酸，同时检测特定的核酸。

发明效果

在本发明中，提供一种对PPi进行定量测定的方法，该方法使用放线菌H⁺-PPase，与现有技术的PPi定量测定方法不同，无须严密的温度控制，只用一种酶就能够进行测定。

此外，在本发明中，还提供一种检测引物延伸反应的方法，该方法使用放线菌H⁺-PPase，比现有技术的引物延伸反应检测方法使用的酶的种类更少，而且与现有技术的检测引物延伸反应的方法不同，可以使用通常的dATP，且没有必要进行严密的温度控制。

而且，在本发明中，能够使用放线菌H⁺-PPase，即使在构成测定对象的溶液含有Tris缓冲液的情况下，也能够对PPi进行定量测定。

附图说明

图1是表示H⁺-PPase的概念图。

图2是说明在第一实施方式中的PPi测定方法原理的图。

图3是表示第二实施方式的PPi测定套件的图。

图4是表示第三实施方式的用光学方法测定PPi装置的一个例子的图。

图5是表示第四实施方式的用电气方法测定PPi装置的一个例子的图。

图6是表示第四实施方式的用电气方法测定PPi装置的另一个例子的图。

图7是表示第四实施方式的用电气方法测定PPi装置的又一个例子的图。

图8是表示第四实施方式中用电气方法测定PPi装置的又一个例子的图。

图9是说明涉及第五实施方式的检测引物延伸反应方法的原理图。

图10是表示涉及第五实施方式的检测引物延伸反应装置的一个例子的图，图10(a)表示反应容器是卧式的，而图10(b)表示反应容器是立式的。

图11是说明放线菌H⁺-PPase热稳定性解析试验方法的图；在此，步骤S3的测定用基本缓冲液是20mM的N-二羟乙基甘氨酸-NaOH(Bicine-NaOH)，pH值8.0，100mM KCl，1mM MgCl₂，0.15M蔗糖，0.4mM Na₄PPi。但是，在实施例3的试验中，使用各种pH值适当的20mM缓冲液代替20mM的N-二羟乙基甘氨酸-NaOH(Bicine-NaOH)，pH值8.0；而作为步骤S5的发色液，使用了和光纯药公司制造的ホスフアCテストワコ一(商品名)。

图12表示放线菌H⁺-PPase热稳定性解析实验结果的图；在此，A是内存放线菌H⁺-PPase的大肠杆菌膜试样的图，B是精制放线菌H⁺-PPase试样的图。

图13是表示由Tris系缓冲液阻碍放线菌H⁺-PPase酶活性的实验方法的图。在此，在步骤S12中的测定用基本缓冲液是0～100mMTris-HCl，pH值7.3，50mM或0mM KCl，1mM MgCl₂，0.15M蔗糖，0.4mM Na₄PPi。但是，在实施例3的实验中，使用各种适当的pH值20mM缓冲液代替0～100mM Tris-HCl，pH值7.3的缓冲液；而作为步骤S14中的发色液，使用了和光纯药公司制造的ホスフアCテストワコ一(商品名)。

图14是表示由Tris系缓冲液阻碍放线菌H⁺-PPase酶活性实验结果的图；在此，A是内存放线菌H⁺-PPase的大肠杆菌膜试样的图，B是绿豆液胞膜试样的图。

符号的说明

1焦磷酸(PPi)水解活性部位

2脂质双重膜

3含有放线菌H⁺-PPase的膜

4盖体

5容器

6pH感受性色素

7膜电位感受性色素

8放线菌H⁺-PPase

9含有放线菌H⁺-PPase的膜小胞

10PPi反应容器

11检测装置

12参照电极

13H⁺感受性电极

14高分子化合物

15能够充分通过H⁺而且充分保持水分的膜

16高分子膜

17极化电极

18有机薄膜

19介体

20反应容器

21引物延伸反应槽

22试样注入口

23流道

24使用放线菌H⁺-PPase的反应槽

具体实施方式

下面，参照附图对本发明的优选实施方式进行说明。

在本发明中，将“在至少40℃的条件下曝露30分钟还能维持与在冰中保存30分钟的情况下同样的活性”的酶定义为“耐热性”酶。

首先，说明作为本发明人发现的知识的、放线菌H⁺-PPase的热稳定性和化学稳定性。

<放线菌H⁺-PPase热稳定性解析实验>

开始时，对放线菌H⁺-PPase热稳定性进行解析。首先，制成在膜内显现有放线菌H⁺-PPase的大肠杆菌菌株，配制该大肠杆菌的膜分隔部分。下面，将该膜的分隔部分称为内存放线菌H⁺-PPase的大肠杆菌膜。然后，在该内存放线菌H⁺-PPase的大肠杆菌膜上配制可被CHAPS溶化以及由蔗糖密度梯度离心法进行精制的放线菌H⁺-PPase，对该内存放线菌H⁺-PPase的大肠杆菌膜试样和精制放线菌H⁺-PPase试样，按照在图11中所示的方法进行实验。其结果显示在图12中。

在图12中，将在0℃下进行培育时的酶活性作为100％的情况下的比活性作为纵坐标，以培育(incubation)温度作为横坐标。从在图12中所示的曲线A和曲线B可以看出，在50℃之前进行培育时，两个试样都能够维持100％的活性，而即使达到60℃的培育中，也表示出维持超过60％活性的很强的热稳定性。

<由Tris系缓冲液阻碍放线菌H⁺-PPase酶活性的实验>

然后，作为对放线菌H⁺-PPase化学稳定性的解析，比较由Tris系缓冲液对现有技术的H⁺-PPase和对放线菌H⁺-PPase的影响。更具体地说，按照图13中所示的方法，在有50mM的K+存在下(K⁺(+))和不存在下(K⁺(-))，比较0～100mM的Tris-HCl(pH值为7.3)对绿豆(Vigna radiata)H⁺-PPase和放线菌H⁺-PPase水解活性的影响。其结果显示在图14中。

图14的纵轴分别表示绿豆的H⁺-PPase和放线菌H⁺-PPase在50mM的K⁺存在下和Tris不存在下的活性为100％的情况下的比活性。由此图可以看出，特别在K+不存在下，绿豆的H⁺-PPase受到Tris-HCl很强的活性阻碍，但放线菌H⁺-PPase无论在K+存在下还是不存在下，完全不受Tris-HCl的阻碍作用。

如上所述，通过上述的实验能够得出，放线菌H⁺-PPase具有耐热性，即使与Tris缓冲液接触也不会失活。

下面，参照适当的附图依次对本发明的实施方式进行说明。但是本发明并不局限于这些实施方式。

(第一实施方式)

第一实施方式举例表示使用放线菌H⁺-PPase定量测定PPi的方法。下面使用图2进行说明。

首先，制成由内存放线菌H⁺-PPase的膜和由该膜隔开的两种区域(在图2中是区域A(第一区域)和区域B(第二区域))组成的状态。此时，所使用的膜只要是保持不会显著地抑制放线菌H⁺-PPase的酶活性，而且几乎不会使H⁺通过即可。例如，可以是天然的或者人工的脂质双重膜，也可以是除此以外的膜。其形状可以是小胞体状，也可以是平面状，只要是能够隔开上述两种区域的结构即可。

从测定PPi的敏感度的观点出发，希望存在于该膜内的放线菌H⁺-PPase的取向性是一样的，当然不同取向性混合存在也是无所谓的。上述两种区域，可以预先被缓冲液等某种液体充满，也可以处于使得完全不失去上述膜的结构和放线菌H⁺-PPase活性程度下的湿润状态。

然后，向上述两个区域中的一个(在图2中的A区域)添加未知浓度的PPi试样。此时，在上述一个区域内，有必要露出放线菌H⁺-PPase的全部或者一部分PPi水解活性部位。通过该操作，使PPi试样中的PPi水解，将H⁺从上述一个区域向另一个区域输送。由于该H⁺的输送依存于上述PPi试样中的PPi浓度，当对其进行解析时就能够测定出上述PPi试样中的PPi浓度。

作为对H⁺的输送解析的方法，可以举出光学方法和电学方法。在使用光学方法的情况下，例如用pH值试纸研究在H⁺输送后在上述两个区域中的任何一个的pH值的方法，或者也可以在上述两个区域中的任何一个中添加依存于H⁺的浓度变化而改变光学性能的物质。

作为依存于H⁺浓度变化而改变光学特性的物质，具体可以举出pH感受性色素或者膜电位感受性色素，而其中从容易操作的方面考虑，优选荧光黄(ピラニン：pyranine)、荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran)、吖啶橙(acridine orange)、喹吖因(quinacrine)、或者氧杂菁V(オクソノ一ルV：oxonol V)。

此外，如果是电学方法，可以列举出金属电极法(氢电极法、氢醌电极法、钼电极法等)、玻璃电极法、ISFET电极法、膜片钳(patchclamp)法、LAPS法、以及同时使用脂溶性离子(具体地为四苯基膦、三苯基甲基膦、ClO^4-、四苯基硼等)和脂溶性离子选择性电极的脂溶性离子选择性电极法等。但是，作为对H⁺的输送解析的方法并不局限于这些，只要是能够将H⁺的输送变换为光学或者电气信号，并检测出这样的信号的方法就可以。

(第二实施方式)

第二实施方式举例显示出在PPi的测定方法中使用的套件(PPi测定套件)。下面参照图3来进行说明。

在图3中，表示本实施方式的PPi测定套件所含有的溶液处于被保存在容器中的状态。本实施方式的PPi测定套件，由至少一种内部存在放线菌H⁺-PPase的膜小胞9和pH感受性色素6或者膜电位感受性色素7构成。从而，使用者将未知浓度的PPi试样与本实施例的PPi测定套件混合，检测混合后的pH感受性色素6或者膜电位感受性色素7的光学信号，并对其进行解析，就能够测定出在上述未知试样中PPi的浓度。

在此，图3的含有放线菌H⁺-PPase的膜小胞9，只要保持放线菌H⁺-PPase8的酶活性不会被显著地抑制，而且几乎不能通过H⁺即可，可以是天然的或者人工的脂质双重膜，也可以是除此以外的膜。

此外，对于放线菌H⁺-PPase8来说，其全部或者部分PPi水解活性部位必须处于露出膜小胞9外侧的状态。

对于pH感受性色素6来说，只要依存于膜小胞9内侧或者外侧溶液中H⁺浓度的变化来改变其光学特性即可，对其种类没有特别的限制，但从容易操作的方面考虑，优选是荧光黄、荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖、吖啶橙或者喹吖因。

对于膜电位感受性色素7来说，只要能够依存于膜小胞9的膜电位的变化来改变其光学特性即可，对其种类没有特别的限制，但从容易操作的方面考虑优选为氧杂菁V。

如在图3中所示，膜小胞9和pH感受性色素6或者膜电位感受性色素7，能够以溶解于缓冲液等溶剂中的状态而提供给使用者，也可以在使用前由使用者将其溶解于所需溶剂中。在进行PPi的定量测定时，只要提供给使用者时能够形成健全的膜小胞，而且在膜小胞9内能够维持H⁺-PPase的活性状态下就可以。

此外，如图3所示，当膜小胞9、pH感受性色素6或者膜电位感受性色素7被预先混合时，能够以保存在密闭容器中的状态而提供给使用者，或者以分别保存在不同的密闭容器中的状态而提供给使用者，在使用前由使用者将其混合。

(第三实施方式)

第三实施方式举例表示使用放线菌H⁺-PPase的光学方法测定PPi的装置的一个例子。下面参照图4进行说明。

本实施方式的PPi测定装置是使用放线菌H⁺-PPase的光学方法测定PPi的装置，包括进行用来测定未知浓度PPi试样中的PPi测定反应容器10和检测该PPi反应容器中的光学信号的检测装置11。

更具体地说，在PPi反应容器11中，包含至少一种内部存在放线菌H⁺-PPase的小胞体状膜(含有放线菌H⁺-PPase的膜小胞9)和pH感受性色素6或者膜电位感受性色素7的混合物。此时的放线菌H⁺-PPase，其全部或者部分PPi水解活性部位必须处于露出到膜小胞的外侧的状态。然后，检测装置11构成为能够装卸该PPi反应容器，而且在安装时能够检测pH感受性色素6或者膜电位感受性色素7的光学信号。

在此，当使用者将未知浓度的PPi试样添加到PPi反应容器10中时，PPi试样中的PPi被放线菌H⁺-PPase8水解，与此同时，将H⁺从膜小胞9的外侧向内侧输送。结果，pH感受性色素6或者膜电位感受性色素7呈现出依存于H⁺输送的光学信号，所以，通过检测装置11对其进行解析，就能够测定出PPi试样中的PPi浓度。

其中，膜小胞9只要能够保持放线菌H⁺-PPase8而不显著抑制其酶活性，并且不能通过H⁺即可，例如可以是天然的或者人工的脂质双重膜，也可以是除此以外的膜。

膜小胞9、pH感受性色素6或者膜电位感受性色素7的混合物，可以处于被缓冲液等任何一种溶剂所溶解的状态，也可以处于完全不丧失膜小胞9和放线菌H⁺-PPase8活性程度下的润湿状态。

对于pH感受性色素6来说，只要依存于膜小胞9内侧或者外侧溶液中的H⁺浓度的变化来改变其光学特性即可，对其种类没有特别的限制，但从容易操作的方面考虑，优选是荧光黄、荧光素异酸氰酸酯-葡聚糖、吖啶橙或者喹吖因。

对于膜电位感受性色素7来说，只要依存于膜小胞9的膜电位的变化来改变其光学特性即可，对其种类没有特别的限制，但从容易操作的方面考虑优选氧杂菁V。

PPi反应容器10优选用盖体等进行密闭。即，优选让使用者在使用前打开盖体，将PPi试样添加到PPi反应容器中。

(第四实施方式)

第四实施方式表示使用放线菌H⁺-PPase的电学方法测定PPi的装置的一个例子。下面参照图5～图8进行说明。

如图5所示，本实施方式的PPi测定装置，包括进行用于未知浓度PPi试样中的PPi浓度测定的反应的PPi反应容器10和检测该PPi反应容器中电气信号的检测装置11。下面，进行详细的说明。

首先，在图5和图6(a)、(b)中，在PPi反应容器10中张开含有放线菌H⁺-PPase的膜3，构成两种区域A和B。在此，如图5所示，膜13除了固定在PPi反应容器10的侧面上之外，也可以如图6(a)所示那样直接固定在PPi反应容器10的底面上，此外，也可以如图6(b)所示那样，通过直链的碳化物等高分子化合物14而被固定在PPi反应容器10的底面上。

此时，对于放线菌H⁺-PPase8来说，其全部或者部分PPi的水解活性部位必须处于露出区域A的状态。在图5或者图6(a)、(b)中的任何一种情况下，其结构为在该PPi反应容器10的底部，配置H⁺感受性电极13，使其与区域B接触，而在区域A，配置参照电极12，使其与该H⁺感受性电极13相对，这两个电极之间的电位差可以被检测装置所解析。其中，在图5和图6(a)、(b)中，也可以在区域A配置参照电极12，而在区域B以不接触的形式配置H⁺感受性电极13。

在这样的PPi反应容器10中，当向区域A添加未知浓度的PPi试样时，放线菌H⁺-PPase8的PPi水解活性部位中露出到A区域的部分，使试样中的PPi水解，伴随着水解的发生，H⁺被从区域A输送到区域B。此时，区域B的H⁺浓度发生的变化，可以通过对H⁺感受性电极13的电位变化解析来进行测定，而且，在添加PPi试样之后的区域B的H⁺浓度，依存于该PPi试样中的PPi浓度。从而，通过用检测装置解析添加PPi试样后H⁺感受性电极13的电位，就能够测定PPi试样中的PPi浓度。

在此，区域A和区域B，在测定时可以处于被缓冲液等溶液充满的状态。也可以预先向使用者提供充满区域A和区域B的溶液，在测定前由使用者将溶液充满区域A和区域B。

作为PPi反应容器10的另一种方式的例子，可以举出如图7(a)所示的形式。即，在PPi反应容器10的底面上配置H⁺感受性电极13，在其上面形成能够充分通过H⁺、而且能够充分保持水分的膜15，再在其表面上固定含有放线菌H⁺-PPase的膜3。

作为能够充分通过H⁺，而且能够充分保持水分的膜15，可以使用含有琼脂糖凝胶等高分子凝胶或者富勒烯(fullereneフラ一レン)样化合物的膜等。此时，对于放线菌H⁺-PPase8来说，其全部或者部分PPi水解活性部位，必须处于从能够充分通过H⁺，而且能够充分保持水分的膜15不接触的区域C露出的状态，PPi试样就添加在该区域中。结果，向区域C露出的PPi水解活性部位的放线菌H⁺-PPase8，在使PPi试样中的PPi水解的同时，使H⁺从区域C输送到能够充分通过H⁺而且能够充分保持水分的膜15处。被输送的H⁺的量，依存于PPi试样中的PPi浓度，而由于该被输送的H⁺能够到达H⁺感受性电极13上，所以能够由H⁺感受性电极13测定PPi试样中的PPi浓度。

作为PPi反应容器10的另一种方式的例子，可以列举出图7(b)所示的样子。即，在图7(b)中使用了膜小胞9作为含有放线菌H⁺-PPase的膜。在此，膜小胞9能够以例如高分子膜16的形式固定在H⁺感受性电极13的表面上。在此情况下，在对放线菌H⁺-PPase8的固定化时使用的膜，优选是能够迅速通过H⁺的膜。

在这样制造的反应容器10(传感器)中，在其PPi试样溶液中存在有PPi的情况下，由于H⁺-PPase的活性，使PPi被水解为磷酸，伴随着此过程，在膜小胞9内部液体的H⁺浓度上升，而在膜小胞9周边的H⁺浓度减少。由于此H⁺浓度减少的程度依存于PPi试样中的PPi浓度，所以当膜小胞9非常靠近H⁺感受性电极13之处时，就能够通过使用H⁺感受性电极13来测定H⁺浓度的降低，从而测定出试样溶液中的PPi浓度。

而作为PPi反应容器10的另一种方式，可以列举出如图8所示的例子。在图8中，在绝缘基板上形成极化电极17，由此能够进行电流滴定测试。作为极化电极17，使用了金、铂、碳等通常在电化学中可以使用的电极。在该极化电极17的表面，形成有含有介体19的有机薄膜18。作为有机薄膜18，可以利用例如在一端具有巯基(thiol)的直链状碳的SAM膜(self-assembled monolayer：自组装单层)等。作为介体19，可以使用H⁺感受性物质的氧化物。在这样形成的有机薄膜18上固定含有H⁺-PPase的膜3。

在含有H⁺-PPase的膜3是脂质膜的情况下，有机薄膜和脂质膜的疏水性部分是相对的，脂质膜的亲水部分形成膜的表面。H⁺-PPase8被固定在有机薄膜和脂质膜的疏水性部分形成的膜的内部，而此时H⁺-PPase8使PPi水解的活性部位，露出在膜13的外部。在这样制造的反应容器10(传感器)的试样溶液中存在PPi的情况下，由于H⁺-PPase8的活性使PPi水解为磷酸，伴随着此过程，有机薄膜内的H⁺浓度上升。

在存在着H⁺感受性介体19的氧化体的情况下，通过氧化还原反应生成介体19的还原体。通过在极化电极17中介体19的氧化还原电位上增加了足够高的电位，能够测定对应介体19的还原物质的浓度的电流。从而能够测量出试样溶液中的PPi的浓度。

也可以利用聚苯胺、聚邻苯二胺、聚N-甲基苯胺、聚吡咯、聚N-甲基吡咯、聚噻吩等电化学活性的电解聚合膜代替含有介体19的有机薄膜18。此外，在极化电极17上的含有介体19的有机薄膜18或电解聚合膜中固定含有H⁺-PPase的膜小胞，能够用极化电极测定伴随着膜小胞外部的H⁺减少的介体或电解聚合膜的氧化还原电流。

在此，在图5～图8中的含有放线菌H⁺-PPase的膜3，只要能够保持不会显著抑制放线菌H⁺-PPase8的活性，而且几乎不能通过H⁺即可，可以是天然的或者人工的脂质双重膜，也可以是这种膜以外的膜。对于膜小胞9也是同样的。

其中，在图5～图8的含有放线菌H⁺-PPase的膜3中，也可以含有放线菌H⁺-PPase以外的蛋白质，但该蛋白质优选是不与PPi发生反应，或者是活性比较低的蛋白质。在PPi试样中的PPi与膜中的H⁺-PPase以外的蛋白质发生反应的情况下，使得与H⁺-PPase反应的PPi的量减少，伴随着该过程，使H⁺的输送量减少。

此外，在膜中含有不与PPi反应，而且通过与PPi以外的物质反应而输送H⁺的蛋白质的情况下，优选在试样溶液中几乎不含与该蛋白质反应的物质。例如，在膜中含有ATPase的情况下，在试样溶液中优选几乎不含ATP。

作为图5～图7的H⁺感受性电极13，只要是具有作为通常的pH值传感器功能的即可，可以利用玻璃电极、ISFET电极、LAPS(Light-Addressable Potentiometric Sensor：可光寻址的电位滴定传感器)等。另外，作为参照电极12，可以使用氢电极、饱和甘汞电极、汞-氧化银电极等。考虑到容易操作等，优选使用银-氯化银电极。

在第三实施方式和第四实施方式中，说明了本发明的PPi测定装置。但是，这里所显示的只不过是其中一个例子。也就是说，本发明的PPi测定装置，其特征在于通过放线菌H⁺-PPase使PPi水解，对与此同时进行的H⁺输送进行光学或者电学方法的检测，只要是其结构能够测量PPi的浓度即可。

(第五实施方式)

第五实施方式，举例显示使用放线菌H⁺-PPase的检测引物延伸反应的方法(核酸的碱基序列检测方法和碱基种类的判别方法)，以及实施这些方法的套件和装置。如上所述，在检测核酸的碱基序列和判别碱基种类时，由于其结果在研究是否引起引物延伸反应这一点上是共同的，所以下面预先说明“检测引物延伸反应的方法、套件和装置”。

[使用放线菌H⁺-PPase检测引物延伸反应的方法]

使用图9说明涉及本实施方式的用放线菌H⁺-PPase检测引物延伸反应的方法。在本检测方法中，利用了在第一实施方式中所述的、使用放线菌H⁺-PPase对PPi进行定量的测定方法。

开始时，进行用来检测核酸序列或者判别碱基种类的引物延伸反应。然后，使用该已经开始引物延伸反应处理的试样溶液(即引物延伸反应处理完全结束的试样溶液或者正在进行引物延伸反应的试样溶液)，代替未知浓度的PPi试样进行第一实施方式的操作，只要由此可以解析光学或者电学信号即可。假如在上述引物延伸反应处理中进行了引物延伸反应，在引物延伸反应处理过的试样溶液中就会含有PPi，反之，如果在上述引物延伸反应处理中几乎或者完全没有进行引物延伸反应，则在引物延伸反应处理过的试样溶液中就几乎或完全不含PPi。所谓第一实施方式的测定方法能够对PPi的浓度进行定量，就是按照如上所述来进行的。从而，当对光学或者电气信号进行解析时，就能够解析出是否进行了上述引物延伸反应。

[使用放线菌H⁺-PPase检测引物延伸反应的套件]

下面，说明涉及本实施方式的、使用放线菌H⁺-PPase检测引物延伸反应的套件。本引物延伸反应的检测套件的结构与第二实施方式相同。首先，与上述引物延伸反应检测方法的情况相同，进行用来检测核酸序列或者判别碱基种类的引物延伸反应处理。然后，将该已经进行引物延伸反应的试样溶液与本实施方式的套件混合，只要对本套件中所含的pH感受性色素6或者膜电位感受性色素7的光学信号进行解析即可。由此就可以解析出是否进行了上述引物延伸反应。

[使用放线菌H⁺-PPase的引物延伸反应检测装置]

下面，使用图10来说明涉及本实施方式用的放线菌H⁺-PPase的引物延伸反应检测装置。如在图10中所示，本引物延伸反应的检测装置包括用来注入未知核酸试样以研究是否引起引物延伸反应的试样注入口22、进行引物延伸反应处理的引物延伸反应槽21、具有PPi反应槽24以进行用来测定PPi反应的反应容器20、和检测装置11。

首先，说明检测装置11是光学检测装置的引物延伸反应检测装置。引物延伸反应槽21是一个用来进行引物延伸反应的反应槽，具有与在第三实施方式中说明的PPi反应容器本质上相同的功能。而检测装置11也具有与在第三实施方式中的检测装置同样的功能。也就是说，其结构能够检测在PPi反应槽中的光学信号。

更具体地说，在PPi反应槽24中包含至少一种内部存有放线菌H⁺-PPase的小胞体状膜(膜小胞)和pH感受性色素6或者膜电位感受性色素7的混合物，此时的放线菌H⁺-PPase，其全部或者部分PPi水解活性部位必须处于露出膜小胞外面的状态。而检测装置11的结构能够在反应容器20上装卸，而且在安装上时，能够检测pH感受性色素6或者膜电位感受性色素7的光学信号。

此外，对于试样注入口22、引物延伸反应槽21和PPi反应槽24的结构来说，构成为从试样注入口22注入未知的核酸试样之后，通过例如流道23等，先送到引物延伸反应槽21，最后送到PPi反应槽24。

在PPi反应槽24中，已经进行引物延伸反应处理的试样中的PPi被放线菌H⁺-PPase水解，与此同时，H⁺被从膜小胞的外侧向其内侧输送。结果，pH感受性色素6或者膜电位感受性色素7根据H⁺的输送而呈现出光学信号。由检测装置11对该信号进行解析，能够判断出未知核酸试样实际上是否进行了引物延伸反应。

在此，在引物延伸反应槽21中，在进行引物延伸反应处理时被认为是必需的聚合酶、dNTP、引物等材料中，其全部或者一部分可以在预先被保持在反应槽中的状态下提供给使用者，或者由使用者自己从试样注入口22注入。

对于膜小胞来说，只要被保持住不会显著地抑制放线菌H⁺-PPase的酶活性，而且几乎不通过H⁺即可，可以是天然的或者人工的脂质双重膜，也可以是除此以外的膜。

膜小胞、pH感受性色素6或者膜电位感受性色素7的混合物，可以处于被缓冲液等任何一种溶剂溶解的状态，也可以处于完全不丧失上述膜结构和放线菌H⁺-PPase活性程度下的润湿状态。

对于PH感受性色素6来说，只要依存于膜小胞内侧或者外侧溶液中H⁺浓度的变化来改变其光学特性即可，对其种类没有特别的限制，但从容易操作的方面考虑，优选是荧光黄、荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖、吖啶橙或者喹吖因。

对于膜电位感受性色素7来说，只要依存于膜小胞的膜电位的变化来改变其光学特性即可，对其种类没有特别的限制，但从容易操作的方面考虑优选氧杂菁V。

试样注入口22优选用盖体等密闭。也就是说，优选让使用者在使用前打开盖体，注入未知的核酸试样。

在为了进行引物延伸反应处理而必须控制引物延伸反应槽21的温度的情况下，其结构可以赋予反应容器20本身控制温度的功能，也可以赋予检测装置11等控制温度的功能，使之能够控制引物延伸反应槽21内的温度。

下面，说明检测装置11是电气检测装置的引物延伸反应检测装置。本电气引物延伸反应检测装置的反应容器20，其基本结构和使用方法基本上都与上述光学引物延伸反应检测装置相同。

PPi反应槽24，具有与在第四实施例中说明的PPi反应容器本质上同样的功能，具有例如图5～图8中所示的结构。对于检测装置11，除了与第四实施例中的检测装置同样的功能以外，还具有能够进行引物延伸反应的功能。即，在能够检测PPi反应槽中的电气信号的同时，其结构还能够进行温度控制。该结构就能够在引物延伸反应结束时，将试样从引物延伸反应槽送到PPi反应槽中。

使用者首先从研究是否引起了引物延伸反应的试样注入口注入未知的核酸试样，在引物延伸反应槽21中进行引物延伸反应处理。然后，将该进行过引物延伸反应处理的试样送入PPi反应槽24的区域A(相当于图5和图6中的区域A)。结果，由于PPi反应槽24的区域B(相当于图5和图6中的区域B)的H⁺浓度反映了引物延伸反应过的试样中的PPi浓度，通过电气检测装置11对此进行解析，能够判断出未知的核酸试样实际上是否进行了引物延伸反应。

在引物延伸反应槽21中，在进行引物延伸反应处理时是必要的聚合酶、dNTP、引物等材料中，其全部或者一部分可以处于预先就被保持的状态，或者由使用者本人从试样注入口22中注入。

此外，PPi反应槽24的区域A和区域B，可以预先充满某种缓冲液等溶液，也可以不充满。在任一种情况下，只要预先把握住所添加的PPi试样中的PPi浓度与伴随着得到的电气信号之间的相关关系，就能够通过电气方法测定出未知试样中PPi的浓度。

对于将试样注入口22用盖体等密闭，以及控制温度的优选结构，都与上述光学引物延伸反应检测装置是同样的。

在第一～五实施方式中显示的PPi定量测定方法和引物延伸反应检测方法以及实施这些方法的套件和装置，它们的特征都是使用放线菌H⁺-PPase。当使用放线菌H⁺-PPase时，与现有技术的PPi定量测定的情况不同。没有必要使用多种酶。如在图12中所示，由于放线菌H⁺-PPase具有很强的耐热性，在第一及五实施方式的PPi定量测定方法和引物延伸反应检测方法中，对适宜的H⁺-PPase，置于冰中或者置于4℃条件下的严密的温度控制就变得没有必要。

在现在已知的H⁺-PPase中，有其酶活性会受到Tris系缓冲液的阻碍，但是，如图14所示，放线菌H⁺-PPase的酶活性几乎不受阻碍。从而，对于第一实施方式和第五实施方式的PPi测定方法和引物延伸反应检测方法，可以用Tris缓冲液进行试样配制。这样的优点对于第五实施例是特别重要的。这是因为以PCR法为代表的引物延伸反应，在很多情况下都是使用Tris缓冲液的。

在第二实施方式和第五实施方式中所示的PPi测定套件和引物延伸反应检测套件中，也可以列举出与如上所述同样的优点。也就是说，在使用放线菌H⁺-PPase时，使用的酶的种类比现有技术的要少，而且放线菌H⁺-PPase对热是稳定的，在使用或者保存时，没有必要对套件进行严格的温度控制。特别是，由于放线菌H⁺-PPase的酶活性几乎不受Tris系缓冲液的阻碍，即使是由Tris系缓冲液配制的试样也可以操作。关于这一点，特别在引物延伸反应检测时是特别重要的已在上面进行了说明。

此外，在第三、四和五实施方式中所示的光学和电气PPi测定装置，以及光学和电气引物延伸反应检测装置中，可以列举出与如上所述同样的优点。也就是说，PPi测定装置或者引物延伸反应检测装置中的任何一种，都包括包含放线菌H⁺-PPase的反应容器和对该反应容器中的光学或者电气信号进行检测的检测装置，但由于放线菌H⁺-PPase对热是稳定的，在反应容器的使用或者保存时，不必进行严密的温度控制，从而使操作变得容易。

特别是在引物延伸反应检测装置的情况下，引物延伸反应槽和PPi反应槽这两种反应槽存在于同一反应容器内。在进行引物延伸反应处理时，通常如在上面所述那样，对温度进行控制是必要的。也就是说，例如，如果使用PCR法，有必要在大约50～90℃附近的温度带上升下降，而如果使用LAMP(环状介导等温扩增：Loop-Mediated IsothermalAmplification)法，就有必要在65℃附近保持温度一定。这样的温度控制功能，可以安装在反应容器本身上，也可以安装在检测装置上，但是无论安装在哪一个上面，这样的温度控制功能都会将引物延伸反应槽内的溶液一时置于高温的条件下。在该情况下，假如使用了对热不稳定的H⁺-PPase，在引物延伸反应槽被置于如上所述的高温条件下时，就有必要努力进行严密的温度控制，以使这样的高温条件不会对PPi反应槽产生影响。

但是，由于放线菌H⁺-PPase对如上所述的热是非常稳定的，没有必要进行这样的温度控制。特别是，在60℃的条件下经过30分钟之后，放线菌H⁺-PPase还维持60％以上的酶活性。这样的耐热性，特别在使用LAMP法的情况下就成为很大的优点。也就是说，在如上所述保持在65℃附近的温度条件下进行LAMP法，此时的PPi反应槽即使在65℃的条件下，只要是在放线菌H⁺-PPase的情况下，就完全没有失活的危险。

放线菌H⁺-PPase的酶活性几乎不受Tris系缓冲液的阻碍这个优点已经如上所述。

在此，关于H⁺-PPase的热稳定性，除了放线菌H⁺-PPase以外，作为嗜热菌Thermotoga maritime或者Pyrobaculum aerophilum的H⁺-PPase耐热性是已知的(参照FEBS Letters 496(2001)6-11、FEBS Letters 460(1999)505-512)。更具体说，Thermotoga maritime的H⁺-PPase，其最适宜温度是70℃，而Pyrobaculum aerophilum的H⁺-PPase，其最适宜温度是90℃。从而，如果只是考虑热稳定性方面，在上述第一～五实施方式中，如果使用来源于这些嗜热菌的H⁺-PPase，能够得到比使用放线菌H⁺-PPase的情况更明显的效果。

但是，针对由于放线菌的繁殖速度很慢，难以大量生产的放线菌H⁺-PPase，本发明的发明人确立了效率非常高的使用大肠杆菌的显现系，能够很容易地大量配制放线菌H⁺-PPase。另外，对于上述两种嗜热菌，不确立大肠杆菌显现系而迅速地大量配制来源于这些嗜热菌的H⁺-PPase，在目前还是不可能的。所以，从产业应用的方面考虑，使用放线菌H⁺-PPase的优点是非常大的。

产业上利用的可能性

本发明的PPi定量测定方法和引物延伸反应的检测方法，以及实施这些方法的套件和装置，由于使用了放线菌H⁺-PPase，与现有技术的有关PPi定量测定方法和引物延伸反应检测方法的技术相比，在减少了必须使用的酶的种类的同时，还能够克服对热不稳定的问题。而特别应该提出的特性是酶的活性几乎不受Tris系缓冲液的阻碍。由此，本发明的PPi测定和引物延伸反应的检测方法，以及实施这些方法的套件和装置，与现有技术中使用H⁺-PPase的情况相比，在保存性能或者易于操作方面具有非常优异的特性。

特别是，本发明的引物延伸反应检测方法、检测套件和检测装置，在诊断SNP或突然变异、检查细菌或病毒等对食品的污染、细菌或病毒对人体的感染等方面是有用的。

权利要求书

(按照条约第19条的修改)

在所述工序(b)中，向所述第一区域或者所述第二区域中的至少一方添加pH感受性色素或者膜电位感受性色素，通过对所述pH感受性色素或者膜电位感受性色素的光学特性进行解析来测定H⁺浓度。

14.如权利要求13所述的引物延伸反应的检测方法，其特征在于：

所述pH感受性色素或者膜电位感受性色素选自荧光黄、荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖、吖啶橙、喹吖因和氧杂菁V中的至少一种。

15.如权利要求11中所述的引物延伸反应的检测方法，其特征在于：

在所述工序(b)中，电气测定所述第一区域或者所述第二区域中的至少一方的H⁺浓度。

16.一种引物延伸反应检测装置，其特征在于，包括：

用来注入试样的试样注入口；

进行引物延伸反应处理的引物延伸反应槽；

用来进行测定焦磷酸的反应的焦磷酸反应槽；和

连接所述引物延伸反应槽和焦磷酸反应槽的流道，其中，

所述引物延伸反应槽存留反应溶液，该反应溶液是包括具有核酸、和含有与该核酸互补结合区域的碱基序列的引物的反应溶液，在发生所述引物延伸反应的情况下会生成焦磷酸，

所述焦磷酸反应槽包括通过参照电极和H⁺感受性电极对在槽内产生的信号进行检测的检测装置，

在由保持有放线菌H⁺-焦磷酸酶、且H⁺难以通过的膜所分隔的第一区域和第二区域当中，向所述第一区域添加含有由引物延伸反应生成的焦磷酸的溶液，使其与所述第一区域相接触，然后对所述第一区域或者所述第二区域中的任何一方的H⁺浓度进行测定。

17.如权利要求16所述的引物延伸反应检测装置，其特征在于：

该装置包括对所述引物延伸反应槽的温度进行控制的温度控制部件。

18.如权利要求16所述的引物延伸反应检测装置，其特征在于：该装置包括对所述检测装置内的测定结果进行解析的解析部件。

Claims (18)

1.一种焦磷酸的测定方法，其特征在于，该方法包括：

在由保持有放线菌H⁺-焦磷酸酶、且H⁺难以通过的膜所分隔的第一区域和第二区域中，以与所述膜相接触的方式向所述第一区域添加含有焦磷酸的溶液的工序(a)；和

在所述工序(a)之后，对所述第一区域或者所述第二区域中的任何一方的H⁺浓度进行测定的工序(b)，其中，

所述放线菌的H⁺-焦磷酸酶的使焦磷酸水解的活性部位从所述第一区域露出。

2.如权利要求1所述的焦磷酸测定方法，其特征在于：

所述溶液含有Tris缓冲液。

3.如权利要求1所述的焦磷酸测定方法，其特征在于：

在所述工序(b)中，光学测定所述第一区域或者所述第二区域中的任何一方的H⁺浓度。

4.如权利要求3所述的焦磷酸测定方法，其特征在于：

在所述工序(b)中，在所述第一区域或者所述第二区域中的至少一方添加pH感受性色素或者膜电位感受性色素，通过对所述pH感受性色素或者膜电位感受性色素的光学特性进行解析来测定H⁺浓度。

5.如权利要求4所述的焦磷酸测定方法，其特征在于：

所述pH感受性色素或者膜电位感受性色素选自荧光黄、荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖、吖啶橙、喹吖因和氧杂菁V中的至少一种。

6.如权利要求1所述的焦磷酸测定方法，其特征在于：

在所述工序(b)中，电气测定所述第一区域或者所述第二区域中的任何一方的H⁺浓度。

7.如权利要求1所述的焦磷酸测定方法，其特征在于：

所述放线菌是蓝色链霉菌。

8.一种焦磷酸的测定装置，其特征在于，该装置包括：

容器；

将所述容器内分隔为内部区域和外部区域、且H⁺难以通过的膜；

以与存留在所述外部区域或者内部区域中的溶液相接触的方式而设置的参照电极；和

以与存留在所述内部区域中的溶液相接触的方式而设置的H⁺感受性电极，其中，

在所述膜中，放线菌H⁺-焦磷酸酶的使焦磷酸水解的活性部位被保持露出所述外部区域。

9.如权利要求8所述的焦磷酸测定装置，其特征在于：

所述溶液含有Tris缓冲液。

10.如权利要求8所述的焦磷酸测定装置，其特征在于：

所述放线菌是蓝色链霉菌。

11.一种引物延伸反应的检测方法，该方法使用如权利要求1所述的焦磷酸测定方法，其特征在于：

在所述工序(a)之前，还包括配制反应溶液的工序(c)，该反应溶液含有被检测核酸和具有与该被检测核酸互补结合的碱基序列的引物，在发生所述引物延伸反应时会生成焦磷酸，

在上述工序(a)中，以与所述膜相接触的方式向所述第一区域中添加含有在所述工序(c)中发生引物延伸反应情况下生成的焦磷酸的所述反应溶液，通过测定所述反应溶液中的焦磷酸，来判别所述被检测核酸中存在特定的碱基序列或者碱基种类。

12.如权利要求11所述的引物延伸反应的检测方法，其特征在于：

在所述工序(b)中，光学测定H⁺浓度。

13.如权利要求11所述的引物延伸反应的检测方法，其特征在于：

在所述工序(b)中，向所述第一区域或者所述第二区域中的至少一方添加pH感受性色素或者膜电位感受性色素，通过对所述pH感受性色素或者膜电位感受性色素的光学特性进行解析来测定H⁺浓度。

14.如权利要求13所述的引物延伸反应的检测方法，其特征在于：

所述pH感受性色素或者膜电位感受性色素选自荧光黄、荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖、吖啶橙、喹吖因和氧杂菁V中的至少一种。

15.如权利要求11中所述的引物延伸反应的检测方法，其特征在于：

在所述工序(b)中，电气测定所述第一区域或者所述第二区域中的至少一方的H⁺浓度。

16.一种引物延伸反应检测装置，该装置包括如权利要求8所述的焦磷酸测定装置，其特征在于：

所述容器是包括如下部分的反应容器：

用来注入试样的试样注入口；

进行引物延伸反应处理的引物延伸反应槽；

用来进行测定焦磷酸的反应的焦磷酸反应槽；和

连接所述引物延伸反应槽和焦磷酸反应槽的流道，其中，

所述引物延伸反应槽存留反应溶液，该反应溶液是包括具有核酸、和含有与该核酸互补结合区域的碱基序列的引物的反应溶液，在发生所述引物延伸反应的情况下会生成焦磷酸，

所述焦磷酸反应槽包括通过参照电极和H⁺感受性电极对在槽内产生的信号进行检测的检测装置，

在由保持有放线菌H⁺-焦磷酸酶、且H⁺难以通过的膜所分隔的第一区域和第二区域当中，向所述第一区域添加含有由引物延伸反应生成的焦磷酸的溶液，使其与所述第一区域相接触，然后对所述第一区域或者所述第二区域中的任何一方的H⁺浓度进行测定。

17.如权利要求16所述的引物延伸反应检测装置，其特征在于：

该装置包括对所述引物延伸反应槽的温度进行控制的温度控制部件。

18.如权利要求16所述的引物延伸反应检测装置，其特征在于：

该装置包括对所述检测装置内的测定结果进行解析的解析部件。

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