JPH06508663A - 効率の高まったラッカーゼを用いた、リグノセルロースを含む材料の脱リグニン、漂白及び白水処理のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 効率の高まったラッカーゼを用いた、リグノセルロースを含む材料の脱リグニン 、漂白及び白水処理のための方法本発明は、リグノセルロースを含む材料の脱リ グニン及び／又は古紙を酵素的にインキ抜きするためのリグノセルロースを含む 材料の漂白及び白水特にパルプ製紙工場廃棄物の処理のための新しい方法に関す る。

■、パルプ製造のための化学的方法、リグニン分解酵素の使用すなわちバイオパ ルピング、その他の利用分野に関する先行技術Ａ　パルプ製造及び木材パルプ製 造のための化学的方法今日、パルプ製造のためには、硫酸塩及び亜硫酸塩方法が 主として用いられている。硫酸塩方法では、活性化学物質ＮａＯＨ及びＮａｔＳ が使用され、亜硫酸塩方法ではＣａ（Ｈ３Ｏｓ）ｚ　＋ＳＯｔが用いられる。

さらに、をＩ！溶媒を用いる少数の低汚染性蒸煮方法も存在する。

全ての方法が主として１つの目的をもつ。すなわち、使用済みの植物性材料、木 材又は−竿体植物からのリグニンの除去である。植物性材料（茎又は幹）の主な 構成成分であるリグニンは、これがあると高度に填料が加えられる可能性のある 非接色紙を製造することができないことから、除去しなくてはならない。

木材パルプ製造方法では、相応する砕木又は精砕を通しての相応する前処理（化 学的、熱的又は熱化学的）の後に木材をフィブリル化する石材グラインダー（砕 木パルプ）又は精砕機（ＴＭＰ）が利用される。

これらの木材パルプはなおも大部分のリグニンを有し、何よりもまず、ここでは 一般にコーテッドペーパーとして新聞印刷及び雑誌又は広告の印刷のために用い られる。

Ｂ　バイオパルピング リグニン分解系の活動メカニズムは、数年にわたって調査されてきたにすぎず、 この間、適切な培養条件及び誘導物質の付加を通して白腐れ真菌Ｐｈａｎｅｒｏ ｃｈａｅｔｅ　Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍから充分な酵素量を得ることができ るまでに至った。この真菌の中には、それまで知られていなかったリグニンペル オキシダーゼ及びマンガンペルオキシダーゼといった酵素量が発見された。イン ビボのこの真菌はきわめて効果的なリグニン減成力をもつため、当初、真菌無し で酵素を用いた場合にリグニンも又減成されるであろうという結論が下された。

しかし、酵素はなかんづくリグニンの再重合を導くもののその減成を導かないこ とから、この考えは誤ったものであることがわかった。

同じことは同様にしてその他のリグニン分解ペルオキシダーゼ及びＦｌ、Ｏ，で はなく０□の助けを借りて酸化的にリグニンを減成するラフカーゼといったその 他のリグニン分解酵素量についてもあてはまる。あらゆる場合において、減成中 類似のプロセスすなわち、これらの基がいかなる形であれ捕獲されない場合再び 互いに反応し合いかくして再度重合する基（ラジカル）形成にまで行きつくこと になる。

従って、バイオパルピングに関しては、否が応でもインビボ系に戻らざるを得な くなった。

少なくとも漂白可能性を増大させ機械的な後処理（フィブリル化）のために必要 なエネルギーを減少させる部分的脱リグニンを達成するために、真菌を例えば木 材チップと接触させた。バイオパルピングは一般に、生物学的に酵素的な方法又 は予備段階を用いて行なわれるパルプ又はパルプ様の材料の製造であるものとし て理解されている。バイオパルピングでは、まず何よりも、リグニン分解酵素の みが望まれることからいわゆる無セルラーゼ突然変異体であるいがなるセルラー ゼも形成しない培養菌株に対してこれが試みられるが、それでも白腐れ真菌は同 様にリグノセルロースの存在下でセルラーゼを形成する。セルラーゼは、パルプ の場合セルロースの減成を通して望ましくない収量損失を導く。

もう１つの問題点は、白腐れ真菌が炭素供給源としてリグニンを使用できず、従 って炭素供給源としてそれぞれセルロース及びヘミセルロースに依存していると いうことである。現在これらの問題点は、無セルローズ突然変異体にいやしくも 成長を可能にするべく、中でもグルコースといった付加的な炭素供給源を基質に 含浸させるということで巧みに回避されている。

これに関連して、主な問題点は、リグニンの減成速度ががなり緩慢であり（数日 〜数週間）そのためインビボプロセスすなわち木材せん断チッピング＋無セルラ ーゼ突然変異体（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　Ｃｈｒｙ−ｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ）の場合、中でも新しくより優れた野生菌株のスクリーニングに忙がしくなると いうことである。最終目標は、上述のようにバッチを改善するため（すなわち精 砕又は砕木エネルギーの低減及び漂白可能性の改善）より迅速でより有効なリグ ニン減成を達成することにある。

セルロース及びヘミセルロースの損失を低く保つことが可能であったならば、こ れまで精砕又は砕木を用いて製造された木材料パルプとは対照的に、なかでも基 本的に低いエネルギーで製造でき漂白がより容易でしかもより優れた機械的特性 を示すような高収量材料が達成されることになるだろう。

上述のとおり、主要な欠点としては以下のものが残っている＝１、　非常に緩慢 なリグニン減成 ２、　非常に制限されたものにすぎないリグニンの減成（数％）３、　付加的炭 素供給源の恐らくは不可避的な配分４、　特殊曝気、ｐＨ維持及び無汚染を用い た、緩慢な成長及び減成時間による大きなハツチ体積といったプロセス制御のた めにひき起こされる問題点 Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍに関して細胞を含ま ない酵素系を伴うパッチも存在する。

しかしながらここでは、利用分野は１）「クラフトパルプ」　（すなわち、約５ 〜８％の残留リグニン含有量で硫酸塩蒸煮の後結果として得られる部分的に脱リ グニンされたパルプ）の漂白、２）機械パルプすなわちＴｌＩＰ　（熱−機械パ ルプ）　、ＣＭＰ（化学−機械パルプ）及びＣＴＭＰ　（化学−熱−機械パルプ ）といった木材パルプの機械−熱又は化学−機械又は化学−熱一機械処理の結果 得られるパルプの機械的特性の改善、及び３）（クラフトパルプの第１の漂白段 階の後に得られるもののような）白水−Ｅｌの脱色から成る。

ここでは利用分野は、１２〜４８時間以内での最高数パーセント（砕木パルプ） に至るリグニン百分率分画（クラフトパルプの場合）の減成に制限される。

最近になって、成る意味でリグニンペルオキシダーゼ内で活性ヘム成分を産生ず るヘモグロビンといったようなヘム化合物の助けを借りてより優れた漂白結果を 達成するため、いくつかの実験が行なわれた。ここでこれらの化合物は一般に工 業的に使用するにはあまりにも高＋ＩＩ過ぎ又、部分的にはセルロースの減成と いった望ましくない付随女つ果をもつ。

ここではヘミセルロース（キシラン）とリグニンの間の結合に対する影響が仮定 されることから、漂白酵素として同様に、その他の酵素グループの種すなわちヘ ミセルラーゼ二こでは中鱗でもキシラナーゼが用いられる。

同様にここでも、酵素は作用に長くかがりしがも比較的漂白効果が低くリグニン 除去に欠け、これは著しい欠点である。

リグニン分解酵素のさらなる利用分野は、パルプ廃棄物の脱色及び無毒化及び塩 素化芳香剤及びその他の化合物の酸化とそれに続く無毒化である。この分野にお いては現在のところ、脱色及び無毒化の実験においてこれまでインビボ真菌系内 で遊離又は不動化真菌のいずれも利用されたことがないことがら、問題の満足の いく解決法は存在しない。より長い期間（日数）にわたって初めて満足のいく減 成及び酸化の値がそれぞれ達成されたにすぎない。

二こで本発明の目的は、リグノセルロースを含む材料がらのリグニンの減成及び ／又はリグノセルロースを含む材料の漂白のため及び古紙を酵素的にインキ抜き するため及びパルプ製紙工場廃棄物を処理するための、上述の欠点を全くもたな い方法を利用可能にすることにある。

このＩＩＩ！は、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ及びその他のラッカ ーゼ形成体から得られたラッカーゼが、非芳香族還元及び酸化剤ならびに、フェ ノール及び／又は非フエノール芳香剤の作用を通して直接フェノール及び非フエ ノールリグニン構造を酸化するが或いは又さらなるフェノール及び／又は非フエ ノール化合物のこれらの化合物によってもたらされる酸化を通してリグニンを酸 化するようなフェノール化合物及び／又は非フエノール芳香剤を同時に付加する 及び／又は配分することによって使用されることで解決される。

値カニ、ドイツ特許出願明細書ＤＥ３６３６２０８　（Ｗ０８８１０３１９０） 、Ｐ４０８８９３．６、Ｐ４０Ｂ８９４．４は、還元及び酸化剤及びその他の酸 化還元材料（塩など）を同時に配分する一方でリグニン分解酵素を使用すること を記述している、しかしながら、これらの文書に比較した場合の主な差異は、ラ ッカーゼすなわち成る種の物１Ｘ（フェノール芳香剤、非フェノール芳香剤）の 付加によりその活性が著しく拡張されかくして完全なリグニン分子を攻撃しりゲ ニンペルオキシダーゼのように作用することのできるラッカーゼの拡張された使 用にある。

本発明に従うと、なかでもＣｏｒｉｏｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒのランカー ゼが用いられる。このラッカーゼは、ラッカーゼ基質（それぞれフェノール化合 物及び非フエノール化合物）及び／又はフェノール化合物及び／又は非フエノー ル芳香剤と共に用いられ、かくしてこれらの化合物は酸化され、次にそれ自体酸 化還元媒介物質として直接リグニンを酸化するか又は、介在されたさらなる酸化 還元媒介物質（フェノール化合物又は非フエノール芳香剤、例えばベラトリルア ルコール）を用いて酸化を行なう。従って、リグニンのフェノール成分（これは 下部構造の約３分の１を構成するにすぎない）のみを攻撃するラッカーゼは非フ エノール下部構造も攻撃することができ従って理論的には完全に全リグニン分子 を減成することができ、その結果ちょうどリグニンペルオキシダーゼのように作 用する、ということになる。かくして、これらの酸化還元系は、呼吸鎖において と同様に酸化された物質が次の物質のための酸化剤として作用しそれによって還 元されるように、互いに「整合」しなければならない。図１は、補欠分子族（Ｃ ｕ”）Ｃｕ”）のレヘルに対するラッカーゼの作用のメカニズムを示している。

図１゜ ２　（Ｃｕ”）う、カーゼ＋フェノール２　（Ｃｕ”　）　ラッカーゼ十基（ラ ジカル）（Ｉ）＋２Ｈ”２　（Ｃｕ”　）ラッカーゼ＋１／２　０．＋２Ｈ”２ 　（Ｃｕ”）ラッカーゼ＋ＨｔＯ ラッカーゼは、フェノールからの中割球アリルオキシー基の形成を触媒する。

ラッカーゼの使用について上述の特許の中に記述されている方法とは対照的に、 主たる利点は、より大きな発酵容器の中でのとりわけＰｈａｎｅｒｏ　ｃｈａｅ ｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｓ＋といった培養がより困難なリグニンペルオ キシダーゼ形成体とは対照的な基本的に単純化された培養にある。独自の収量は 、約２０００万！ｕ／１で特殊な誘導物質を用むまた場合である。リグニンペル オキシダーゼの擬領特異性に対するラッカーゼの効果の拡張によってのみ、きわ めて有利なことであるこれらの酵素の実際の商業的利用が達成される。初期リグ ニン含有量が約２７％で基質としてとうひ／木材パルプを用いてのラッカーゼ単 独の（すなわちリグニンと酵素の間に配置されたフェノール又は非フエノールタ イプの酸化還元媒介物質及びう・ノカーゼを伴う上述の系無しの）リグニン減成 実験は、最大２２％の残留リグニン含有量までの脱リグニンすなわち１９％を示 し、新しい系での減成実験は目下のところ最高１６％の残留リグニン含有量のリ グニン減成すなわち約４１％すなわち２倍以上を示している。

本発明に従うと、還元剤及び／又は酸化剤、塩及び／又はフェノール化合物を付 加することにより、２００〜６００　ａ＋Ｖの酸化還元電位が調整される。これ は、酸化還元電極を用いて測定でき、本発明に従った方法において酸化及び還元 剤、塩及びフェノール化合物を付加することにより反応時間全体にわたり制御装 置及び制御機構を用いて一定に維持され得る。

好ましくは、酸化剤としては空気、０□又は過酸化水素が用いられる。還元剤と しは、重亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、亜ニチオン酸塩及びチオール化合 物が考慮に入れられる。

塩としては好ましくは金属塩が用いられる。特にＦｅＳＯ４，Ｆａｃｔ、、。

Ｍｎ５Ｏａ、　ＴｉＯ□、　ＣＯ３Ｏ４及びＭｌ−酢酸塩がここでは可能である 。さらに、本発明に従うと錯体形成体の付加が好まれるという事実も記しておき たい。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又はジエチレントリアミン 五酢酸（ＤＴＰ八）がそのようにして用いられる。

Ｌ述の物質Ｃ二加えて、バルブを含む水溶液に対しさらなる物質を付加すること が可能である。このようなものとして考えられるのはＮａ０ＣＩ　、？ｆｉ浄削 及びポリサツカリドである。その他のものとしては、非イオン、イオン、陰イオ ン、陽イオン及び両性表面活性剤ならびにグルカン及びキサンタンがそれに属し ている。さらに、リグニン分解酵素に加えてヘミセルラーゼ及び／又はペクチナ ーゼ及び／又はリパーゼを使用することも可能である。

Ｒ，Ｂｏｕｒｂｏｎｎａｉｓ及びＭ、Ｇ、Ｐａ１ｃｅの研究「非フエノール基質 の酸化」（ＦＥＢＳ　２６７、ｌ９９０．ｐ９９〜１０２）に比べた主な差異は 、中でも、酸化剤を供給することによって反応を同時に維持しながら「トラ、ピ ング基」を通してのリグニンの脱型台及び再重合の抑制を優先させるため同時に 還元剤及び酸化剤を配分することによる全く異なるプロセス制御にある。う、カ ーゼがＨ，０□とも作用し、ラッカーゼの酸化作用は成る種の基質を用いて過酸 化物により同定されるということも知られている（Ｒ，ＢＩａｉｃｂ＋Ａｎａｌ ｙｔｉｓｃｈｅ　Ｅｌｅｋｔｒｏｐｈｏｒｅｓ　ｅｖｅｒ　ｆａｈｒｅｎ（分析 的電気泳動法）　、Ｔｈｉｅｍｅ−Ｖｅｒｌａｇ　１９７８．ｐ５９）。

本発明に従ったシステムは、ラッカーゼ単独で使用されるが或いは又例えばＰｂ ａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕ＊のマンガンペルオキシダ ーゼ及び／又はリグニンペルオキシダーゼと共に、或いは又他の白腐れ真菌と合 わせて用いられる。後者つまりリグニンペルオキシダーゼ（マンガンペルオキシ ダーゼ）＋ラッカーゼの場合、両方の酵素種がなおも活性である約４〜５のｐＨ 値で作用させられる。酵素的インキ抜きの間の実際のリグニン減成、漂白（リグ ニン減成を伴う）又は膨潤プロセスは、還元剤と酸化剤を同時に配分することに よって、すなわちリグニン減成から生じる基のトラッピング（捕捉）を通して行 なわれる。往々にして、それ自体リグニン減成を加速することのできる００１（ −基（Ｆｅ”及び／又はＴｉ″”＋ＨｚＯｔ）　、’０ｗ１（−基（Ｔｉ”及び ０２）又は−重積酸素（ＮａＯＣＩ　＋ＨｔＯｚ＝ＮａＣＩ　＋ＨｚＯ＋Ｏりと いった成る種の基へと導（Ｎａ０Ｃ１のＦｅ”＋　Ｆｅ”、　Ｃｕ”、　Ｔｉ” といった成る種の金属塩が同時に存在することも重要である。同様に、一部分真 菌自体により産生されるか又は混合培養において白腐れ真菌と酵母の間に結果と して生しる酵母細胞壁から来る多Ｆ［の存在及び、脱リグニン及び／又は漂白の 際に繊維間に酵素がよりうまく進入できるようにししかもインキ粒子の発泡及び 収集効果にとって不可欠であるいくつかの洗浄剤の存在も重要な助けである。イ ンキ抜きの場合、化学系の中に存在するＮａＯＨ／８０の漂白作用を補償するた めホルムアミジンスルフィン酸（ＦＡＳ）　／　ＮａＯＨといった付加的な漂白 系も同様に重要であり得、又さらに、石けん単独又は石けんと洗浄剤を組合わせ ての付加も収集剤として重要でありうる。

木材パルプ廃棄物（ＴＭＰ／砕木パルプなど）を酵素的に処理する場合、ラッカ ーゼ＋フェノール又は非フエノール芳香剤が用いられる。

還元剤は付加しないものの連続的に酸化手段（ＨｔＯｚ、Ｏｘ又は大気中酸素） を供給しながら成る種のフェノール又は非フエノール芳香剤を充分照準を合わせ た形で使用することにより、ここでは、ラッカーゼのみを用いた場合達成できる 値（２０〜５０％）をはるかに超える白水中に含まれたリグニンのほぼ完全な重 合が可能である。従って、不可溶化ひいては凝集、沈陣、ろ過、マイクロ浮上分 離などにより白水から７０〜９０％のリグニンを除去し、Ｃ３Ｂを徹底的に６０ 〜７０％まで低下させることが可能である。

Ａ０例１） 例：硫酸塩パルプの酵素的漂白 ５０ｇの炉乾燥パルプ（硫酸塩パルプ）を約５００　ｒｐｍ　、４０°Ｃで１％ の缶液濃度で撹拌容器内で撹拌する。ｉｎのＨＣＩでＧＩＨ値をｐＨ５に調整す る。炉乾燥物質に基づいて０．１〜１．５％のＨ２０□、約０．１％の１！Ｔｌ ）Ａ又はＩ）ＴＰＡ、炉乾燥物質に基づいて０．０１〜０．５％の硫酸銅（Ｉ［ ）を付加する。Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｕｅｒｓｉｃｏｌｏｒのラフカーゼを５００ 〜８０００１Ｕ（１１Ｕ＝酵素１ｄ１分あたり１μｍのシリンガラダジンの変換 ）を付加した後、炉乾燥物質１つあたり約２Ｘ１０−”％〜ｌＸ１０−’％のベ ラトリルアルコールと０．０１〜０．１％のナフトールを付加し、同時にＨ２Ｏ ，と重亜硫酸ナトリウム溶液を秤量する一方で漂白プロセスを開始させる。この ように秤量することによって約４００　ｍＶの酸化還元電位が維持される。この プロセスは、開始後２〜４時間続行される。

プロセスの制御は、酸化還元電極及びポンプ制御を介して行なわれる。

８１例２） 木材パルプ（ＴＭＰ）の脱リグニン １００　ａｄの水中の１ｇの炉乾燥ＴＭＰ（１％）を１ｍの）ＩＣＩ　ｉ′ｐＨ ５に調整する。１ｍのＨＣＩを伴って炉乾燥物質あたり０．０１％〜０．１％の ナフトール、４００　ｔｔｒａｏｌ　のＨｚＯｚ、８　μｍｏｌ　のベラトリル アルコールを付加する。配分につれて（ｌ　ｍ／時）、重亜硫酸ナトリウムとＨ ２０！を同時に溶液として（各９．８０　ｍ＊ｏｌａｒ）付加する。約１０００ ００　Ｉｌｌの酵素（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒのラッーカーゼ ）を付加することにより反応を開始させる。反応時間は、約５００　ｒｐ−の撹 拌下で４０°Ｃで４時間である。

Ｃ１例３） 例：前処理を伴う酵素的インキ抜き １００ｇの炉乾燥古紙（紙５０％／雑誌５０％）をｌＸ３ｃ＋ｗの細片に破砕す る。その後２２の水を付加しく約４５°Ｃ）ｐＨをミョウバンで７〜７．５に調 整する。次に、８０−８０００１０のラッカーゼ（Ｉ　ＩＩ−酵素ｌｄ、１分あ たり１μｍｏ１のシリンガラダジンの変換）、８μｍｏｌのへラトリルアルコー ル及び０．０５〜０．６％の収集剤としての洗浄剤及び０．２−２μＩの亜硫酸 水素ナトリウム溶液（３８〜４０％）を各々炉乾燥古紙材料ｇに基づいて付加す る。次に、１５分間、崩壊剤の中で３００Ｏｒｐｍで精砕する。次に古紙材料を ７５分間約４５゛Ｃ放置するか又は直ちに１０〜２０分間市販の２ｏｌ入り浮上 分離セル内で浮上分離させる。

０６例４） 木材パルプ廃棄物（Ｔ？ＩＰ、砕木パルプその他）の酵素的処理〉〉〉存在する リグニンの重合 未ろ過の２５０蔵のＴＭＰ白水を、１　＋０．０ＩＸ１０−’−０，１％ナフト ールあたり１０−２００００　ＩＩのラッカーゼに対して付加し、１〜４時間２ ０〜５０°Ｃで撹拌し大気中酸素を供給しながらインキュベートする。ラッカー ゼ単独使用については、存在するリグニンの重合の著しい増加が起こり、リグニ ンは不溶性となりポリエチレンイミンなどの適切な凝集剤の付加又はマイクロろ 過、遠心分離又はろ過によってこれを除去することが可能である。

手続補正書（方式） ％式％ ■、事件の表示 ＰＣＴ／ＥＰ　９２１０１０８６ ２、　発明の名称 効率の高まったラッカーゼを用いた、リグノセルロースを含む材料の脱リグニン 、漂白及び白水処理のための方法、 ３、　補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名　カル、ハンスーベーター ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６、　補正の対象 （１）明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文（２）委任状 ７、補正の内容 ｆｉｌ　明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文の浄書（内容に変更なし） （２）別紙の通り ８、　添附書類の目録 （１）　明細書、請求の範囲及び 要約書の翻訳文　各１通 （２）委任状及びその翻訳文　各１通 フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＵ、 　ＢＲ，ＣＡ、　ＦＩ、　ＨＵ、　ＪＰ、　ＮＯ，ＲＵ、　ＵＳ

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．リグノセルロースを含む材料からのリグニンの減成及び／又は古紙を酵素的 にインキ抜きするためのリグノセルロースを含む材料の漂白のため及びパルプ製 紙工場廃棄物の処理のための方法において、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏ ｌｏｒ及びその他のラッカーゼ形成体から得られたラッカーゼが、非芳香族還元 及び酸化剤ならびに、フェノール及び／又は非フェノール芳香剤の作用を通して 直接フェノール及び非フェノールリグニン構造を酸化するか或いは又さらなるフ ェノール及び／又は非フェノール化合物のこれらの化合物によってもたらされる 酸化を通してリグニンを酸化するようなフェノール化合物及び／又は非フェノー ル芳香剤を同時に付加する及び／又は配分することによって使用されることを特 徴とする方法。
2. ２．ラッカーゼに加えてリグニンペルオキシダーゼ及び／又はマンガンペルオキ シダーゼが使用されることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ又はその他の白 腐れ真菌からのリグニンペルオキシダーゼ及び／又はマンガンペルオキシダーゼ が使用されることを特徴とする、請求の範囲第２項に記載の方法。
4. ４．反応溶液に対してヘミセルラーゼ及び／又はペクチナーゼ及び／又はリパー ゼがさらに付加されることを特徴とする、請求の範囲第１項乃至第３項のいずれ かに記載の方法。
5. ５．ｐＨ値が３〜８の間に調整されていることを特徴とする、請求の範囲第１項 乃至第４項のいずれかに記載の方法。
6. ６．温度が２５℃〜６０℃の間に調整されることを特徴とする、請求の範囲第１ 項乃至第５項のいずれかに記載の方法。
7. ７．酸化還元電位が２００ｍＶから６００ｍＶの間に調整されることを特徴とす る、請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記載の方法。
8. ８．金属塩がさらに反応溶液に付加されることを特徴とする、請求の範囲第７項 に記載の方法。
9. ９．金属塩としてＦｅＳＯ４，ＦｅＣｌ３，ＭｎＳＯ４，ＴｉＯ２，ＣｕＳＯ４ 及びＭｎ３−酢酸塩が使用されることを特徴とする、請求の範囲第８項に記載の 方法。
10. １０．ＮａＯＣｌが使用されることを特徴とする、請求の範囲第９項に記載の方 法。
11. １１．還元剤として重亜硫酸ナトリウム、亜ニチオン酸ナトリウム、アスコルビ ン酸、チオール化合物又はグルタチオンが使用されることを特徴とする、請求の 範囲第８項乃至第１０項のいずれかに記載の方法。
12. １２．空気、酸素、Ｈ２Ｏ２又は有機過酸化物が酸化剤として使用されることを 特徴とする、請求の範囲第８項乃至第１１項のいずれかに記載の方法。
13. １３．付加的に洗浄剤が使用されることを特徴とする、請求の範囲第１項乃至第 １２項のいずれかに記載の方法。
14. １４．非イオン、イオン、陰イオン、陽イオン及び両性界面活性剤が洗浄剤とし て使用されることを特徴とする、請求の範囲第１３項に記載の方法。
15. １５．反応溶液に対しさらに多糖類が付加されることを特徴とする、請求の範囲 第１項乃至第１４項のいずれかに記載の方法。
16. １６．真菌自体によって形成されるか又は酵母を用いて混合培地内で産生される 独自の多糖類及び／又はグルカン、マンナン、デキストラン、レバン、又は植物 性コームが多糖類として付加されることを特徴とする、請求の範囲第１５項に記 載の方法。
17. １７．反応溶液に対して錯化剤がさらに付加されることを特徴とする、請求の範 囲第１項乃至第１６項のいずれかに記載の方法。
18. １８．錯化剤としてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又はジエチレントリア ミン五酢酸（ＤＴＰＡ）が使用されることを特徴とする、請求の範囲第１７項に 記載の方法。
19. １９．水ガラスが付加されることを特徴とする、請求の範囲第１項乃至第１８項 に記載の方法。
20. ２０．例えば石けん、ケン化脂肪酸などが付加されることを特徴とする、請求の 範囲第１項乃至第１９項に記載の方法。
21. ２１．ホルムアミジンスルフィン酸（ＦＡＳ）／ＮａＯＨが系に付加されること を特徴とする、請求の範囲第１項乃至第２０項に記載の方法。
22. ２２．基（ラジカル）形成体が系に付加されることを特徴とする、請求の範囲第 １項乃至第２１項に記載の方法。
23. ２３．遊離基スカベンジャが系に付加されることを特徴とする、請求の範囲第１ 項乃至第２２項に記載の方法。
24. ２４．ラッカーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ又は その混合物が酵素として配分されることを特徴とする、請求の範囲第１項乃至第 ２３項に記載の方法。