JPH0636740B2 - 新規な耐熱性中性プロテア−ゼの製造方法 - Google Patents
新規な耐熱性中性プロテア−ゼの製造方法Info
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- JPH0636740B2 JPH0636740B2 JP62184323A JP18432387A JPH0636740B2 JP H0636740 B2 JPH0636740 B2 JP H0636740B2 JP 62184323 A JP62184323 A JP 62184323A JP 18432387 A JP18432387 A JP 18432387A JP H0636740 B2 JPH0636740 B2 JP H0636740B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は新規な耐熱性中性プロテアーゼをコードする遺
伝子、その遺伝子を含む組換え体プラスミド、およびそ
れにより形質転換された微生物並びに新規な耐熱性中性
プロテアーゼの製造方法に関する。
伝子、その遺伝子を含む組換え体プラスミド、およびそ
れにより形質転換された微生物並びに新規な耐熱性中性
プロテアーゼの製造方法に関する。
（産業上の利用分野） 近年、耐熱性プロテアーゼは工業用途に広く使用されて
おり、例えば食品製造、洗浄剤製造、皮革工業、ペプチ
ド合成等に用いられている。従って有用なプロテアーゼ
及びその製造法の開発は極めて意義の大きいものであ
る。
おり、例えば食品製造、洗浄剤製造、皮革工業、ペプチ
ド合成等に用いられている。従って有用なプロテアーゼ
及びその製造法の開発は極めて意義の大きいものであ
る。
（従来の技術） 従来、耐熱性中性プロテアーゼ及びその製造方法として
は、醗酵工学会誌第40巻第346頁（1962年）、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー(Journal of Bacteriolog
y)第154巻第831頁（1983年）および特開昭58-162291号
公報等に報告されているが、醗酵工学会誌第40巻第346
頁（1962年）ではプロテアーゼの耐熱性において十分用
途を満足するものではなく、ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー(Journal of Bacteriology)第154巻第831頁
（1983年）及び特開昭58-162291号公報においてはプロ
テアーゼの生産性が十分でないことから、工業的に使用
し得る耐熱性中性プロテアーゼを効果的に製造するには
必ずしも有利な方法とはなっていない。そこで本発明者
等は工業的に使用し得る耐熱性中性プロテアーゼを効果
的に製造する目的で鋭意研究を行なった結果、新規な耐
熱性中性プロテアーゼを生産するバチルス・ステアロサ
ーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)TELNE FER
M-P NO.9439を見出し先に明らかにした。
は、醗酵工学会誌第40巻第346頁（1962年）、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー(Journal of Bacteriolog
y)第154巻第831頁（1983年）および特開昭58-162291号
公報等に報告されているが、醗酵工学会誌第40巻第346
頁（1962年）ではプロテアーゼの耐熱性において十分用
途を満足するものではなく、ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー(Journal of Bacteriology)第154巻第831頁
（1983年）及び特開昭58-162291号公報においてはプロ
テアーゼの生産性が十分でないことから、工業的に使用
し得る耐熱性中性プロテアーゼを効果的に製造するには
必ずしも有利な方法とはなっていない。そこで本発明者
等は工業的に使用し得る耐熱性中性プロテアーゼを効果
的に製造する目的で鋭意研究を行なった結果、新規な耐
熱性中性プロテアーゼを生産するバチルス・ステアロサ
ーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)TELNE FER
M-P NO.9439を見出し先に明らかにした。
（発明が解決しようとする問題点） バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearoth
ermophilus)TELNE FERM-P NO.9439の生産する耐熱性中
性プロテアーゼはその耐熱性および生産性において、工
業的に使用し得るものではあるが、より効果的に製造す
る方法が望まれていた。
ermophilus)TELNE FERM-P NO.9439の生産する耐熱性中
性プロテアーゼはその耐熱性および生産性において、工
業的に使用し得るものではあるが、より効果的に製造す
る方法が望まれていた。
（問題点を解決するための技術的手段） 本発明は上記問題点を解決するために鋭意研究を重ねた
結果完成されたものであって、下記式(1)のアミノ酸配
列で示される新規な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子を含
有する、制限酵素Sau3AIにより切断された約18kbpであ
るバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stear
othemophilus)TELNE(FERM-P NO.9439)由来の染色体ＤＮ
Ａをバチルス属に属する細菌内で複製するベクタープラ
スミドに連結し、得られた組換え体プラスミトでバチル
ス・ズブチルスを形質転換し、形質転換されたバチルス
・ズブチルスを培養し、該培養物から耐熱性中性プロテ
アーゼを採取することを特徴とする新規な耐熱性中性プ
ロテアーゼの製造方法である。
結果完成されたものであって、下記式(1)のアミノ酸配
列で示される新規な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子を含
有する、制限酵素Sau3AIにより切断された約18kbpであ
るバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stear
othemophilus)TELNE(FERM-P NO.9439)由来の染色体ＤＮ
Ａをバチルス属に属する細菌内で複製するベクタープラ
スミドに連結し、得られた組換え体プラスミトでバチル
ス・ズブチルスを形質転換し、形質転換されたバチルス
・ズブチルスを培養し、該培養物から耐熱性中性プロテ
アーゼを採取することを特徴とする新規な耐熱性中性プ
ロテアーゼの製造方法である。
式(1)： 前記耐熱性中性プロテアーゼをコードする遺伝子DNAと
は、式(1)のアミノ酸配列に対応するDNAの組合せならど
れでも良く、例えば第１図に示されるDNA配列が挙げら
れる。
は、式(1)のアミノ酸配列に対応するDNAの組合せならど
れでも良く、例えば第１図に示されるDNA配列が挙げら
れる。
前記新規な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子とは、新規な
耐熱性中性プロテアーゼをコードする遺伝子または／お
よび必要によりプロモーター、SD配列、シグナル配列お
よびターミネーター等の他の遺伝子配列からなるもので
ある。
耐熱性中性プロテアーゼをコードする遺伝子または／お
よび必要によりプロモーター、SD配列、シグナル配列お
よびターミネーター等の他の遺伝子配列からなるもので
ある。
本発明者らはバチルス・ステアロサーモフィラス（Baci
llus stearothemophilus)TELNE FERM-P NO.9439の新規
な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子を宿主に形質転換する
ことにより、新規な耐熱性中性プロテアーゼを高生産さ
せ、工業的に効果的な製造方法を確立するに至った。
llus stearothemophilus)TELNE FERM-P NO.9439の新規
な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子を宿主に形質転換する
ことにより、新規な耐熱性中性プロテアーゼを高生産さ
せ、工業的に効果的な製造方法を確立するに至った。
以下本発明を実施のための各ステップにわけて詳細に説
明する。
明する。
(a)新規な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子DNAを含む形質
転換体の選択 本発明に用いられる新規な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝
子DNAを含む形質転換体は、宿主細胞内で複製するベク
タープラスミドに、耐熱性中性プロテアーゼ生産能を有
する微生物から調整された耐熱性中性プロテアーゼ遺伝
子DNAを組み込み、該組換え体プラスミドを宿主細胞に
形質転換してなる形質転換体である。
転換体の選択 本発明に用いられる新規な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝
子DNAを含む形質転換体は、宿主細胞内で複製するベク
タープラスミドに、耐熱性中性プロテアーゼ生産能を有
する微生物から調整された耐熱性中性プロテアーゼ遺伝
子DNAを組み込み、該組換え体プラスミドを宿主細胞に
形質転換してなる形質転換体である。
前記ベクタープラスミドとしては、バチルス属細菌中で
複製するベクタープラスミドを使用する。このようなベ
クタープラスミドとしては、例えばJournal of Bacteri
ology.June 1981,P1091〜1097記載のpTB53、pUB110、pC1
94等が挙げられるが、バチルス属に属する細菌内で複製
するベクタープラスミドであれば良い。
複製するベクタープラスミドを使用する。このようなベ
クタープラスミドとしては、例えばJournal of Bacteri
ology.June 1981,P1091〜1097記載のpTB53、pUB110、pC1
94等が挙げられるが、バチルス属に属する細菌内で複製
するベクタープラスミドであれば良い。
新規な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子DNAとしては、耐
熱性中性プロテアーゼを生産する微生物から調整するこ
とが出来るが、バチルス属菌から調製したものとして、
例えば、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus
stearothemophilus)TELNE FERM-P NO.9439より調整し
たDNAが挙げられる。
熱性中性プロテアーゼを生産する微生物から調整するこ
とが出来るが、バチルス属菌から調製したものとして、
例えば、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus
stearothemophilus)TELNE FERM-P NO.9439より調整し
たDNAが挙げられる。
また、前記ベクターDNAに前記DNA断片を組み込む方法
は、既知のいずれの方法も適用できる。
は、既知のいずれの方法も適用できる。
このようにして得た組換え体プラスミドを既知の形質転
換法により宿主細胞に導入する。
換法により宿主細胞に導入する。
前記宿主細胞としては、前記ベクタープラスミドが複製
することが可能なものであれば良いが、本発明ではバチ
ルス・ブチルスを使用する。例えばJournal of Bacteri
ology.May 1983,P831〜837記載のバチルス・ズブチリス
（Bacillns subtilis)MT-2、MI113、ISW1214等が挙げら
れる。
することが可能なものであれば良いが、本発明ではバチ
ルス・ブチルスを使用する。例えばJournal of Bacteri
ology.May 1983,P831〜837記載のバチルス・ズブチリス
（Bacillns subtilis)MT-2、MI113、ISW1214等が挙げら
れる。
こうして得た形質転換体の中から耐熱性中性プロテアー
ゼを生産するものを選択する。例えば、カゼインを含む
寒天培地上に形質転換のコロニーを形成させ、耐熱性中
性プロテアーゼの分泌によりコロニーの周囲に形成され
るハローによって、耐熱性中性プロテアーゼ生産菌、す
なわち新規な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子DNAを含む
形質転換体を選択することができる。
ゼを生産するものを選択する。例えば、カゼインを含む
寒天培地上に形質転換のコロニーを形成させ、耐熱性中
性プロテアーゼの分泌によりコロニーの周囲に形成され
るハローによって、耐熱性中性プロテアーゼ生産菌、す
なわち新規な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子DNAを含む
形質転換体を選択することができる。
こうして得た新規な耐熱性プロテアーゼ遺伝子DNAを含
む組換え体プラスミドの例として、pSP53がある。また
新規な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子DNA含むプラスミ
ドで形質転換体としてバチルス・ズブチリス(Bacillns
subtilis)MT-2(pSP53)がある。pSP53の制限酵素地図を
第２図に示す。
む組換え体プラスミドの例として、pSP53がある。また
新規な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子DNA含むプラスミ
ドで形質転換体としてバチルス・ズブチリス(Bacillns
subtilis)MT-2(pSP53)がある。pSP53の制限酵素地図を
第２図に示す。
(b)新規な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子DNAの確認 (a)で得た組換え体プラスミド、例えばpSP53の中の耐熱
性中性プロテアーゼをコードするDNAについて、Proc.Na
tl.Acad.Sci.,USA74巻5463頁（1977年）記載のサンガー
らのダイデオキシチェインターミネーション法による塩
基配列の決定を行なう。
性中性プロテアーゼをコードするDNAについて、Proc.Na
tl.Acad.Sci.,USA74巻5463頁（1977年）記載のサンガー
らのダイデオキシチェインターミネーション法による塩
基配列の決定を行なう。
すなわちpSP53について、適当な制限酵素で切断後、M13
mp系ファージベクターに、ショットガンクローニングす
る。次いでDNAが挿入されたファージDNAを精製し、プラ
イマーを付加した後、DNAポリメラーゼ(Klenow Fragmen
t)を用いてダイデオキシ反応を行わせることにより、そ
の塩基配列を決定した。
mp系ファージベクターに、ショットガンクローニングす
る。次いでDNAが挿入されたファージDNAを精製し、プラ
イマーを付加した後、DNAポリメラーゼ(Klenow Fragmen
t)を用いてダイデオキシ反応を行わせることにより、そ
の塩基配列を決定した。
SP53では、Nature New Biology.Vol.238,July12 1972,P
35〜37にて報告された耐熱性中性プロテアーゼであるTh
ermolysinのアミノ酸配列と極めてよく一致するオープ
ンリーディングフレームが存在し、得られたpSP53が新
規な耐熱性中性プロテアーゼの遺伝子DNAを含むプラス
ミドであることが確認された。
35〜37にて報告された耐熱性中性プロテアーゼであるTh
ermolysinのアミノ酸配列と極めてよく一致するオープ
ンリーディングフレームが存在し、得られたpSP53が新
規な耐熱性中性プロテアーゼの遺伝子DNAを含むプラス
ミドであることが確認された。
(c)新規な耐熱性中性プロテアーゼのアミノ酸配列の決
定 (b)で得られたオープンリーディングフレームおよび既
知の方法より求めた新規な耐熱性中性プロテアーゼのア
ミノ末端およびカルボキシル末端のアミノ酸より、新規
な耐熱性中性プロテアーゼのアミノ酸配列を決定し、式
(1)に示した。これはNature New Biology.Vol.238,July
12 1972,P35〜37にて報告されたThermolysinのアミノ酸
配列と比較すると、３７番目のアスパラギン酸が本発明
ではアスパラギンであり、また１１９番目のグルタミン
酸が本発明ではグルタミンであることから、新規な耐熱
性中性プロテアーゼであることが確証された。この違い
が本発明の耐熱性中性プロテアーゼの優れた耐熱性に関
与していると推察される。
定 (b)で得られたオープンリーディングフレームおよび既
知の方法より求めた新規な耐熱性中性プロテアーゼのア
ミノ末端およびカルボキシル末端のアミノ酸より、新規
な耐熱性中性プロテアーゼのアミノ酸配列を決定し、式
(1)に示した。これはNature New Biology.Vol.238,July
12 1972,P35〜37にて報告されたThermolysinのアミノ酸
配列と比較すると、３７番目のアスパラギン酸が本発明
ではアスパラギンであり、また１１９番目のグルタミン
酸が本発明ではグルタミンであることから、新規な耐熱
性中性プロテアーゼであることが確証された。この違い
が本発明の耐熱性中性プロテアーゼの優れた耐熱性に関
与していると推察される。
(d)新規な耐熱性中性プロテアーゼの生産 (a)で得られた新規な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子DNA
を含む形質転換体を培養するには、宿主微生物の生育に
適した栄養培地であって、且つ耐熱性中性プロテアーゼ
の生産に適した培地を用いる。すなわち使用する培地組
成としては使用菌株が資化し得る炭素源、窒素源、無機
物、その他必要な栄養素およびプラスミドを安定的に保
持させるための薬剤、培地の発泡を防ぐための界面活性
剤等の培養に必要な添加剤を適量含有するものであれ
ば、合成培地、天然培地いずれも使用できる。例えば炭
素源としてはグルコース、グリセロール、デンプン等が
使用される。窒素源としては例えば塩化アンモニウム、
カザミノ酸、カゼイン、ポリペプトンなどが使用され
る。
を含む形質転換体を培養するには、宿主微生物の生育に
適した栄養培地であって、且つ耐熱性中性プロテアーゼ
の生産に適した培地を用いる。すなわち使用する培地組
成としては使用菌株が資化し得る炭素源、窒素源、無機
物、その他必要な栄養素およびプラスミドを安定的に保
持させるための薬剤、培地の発泡を防ぐための界面活性
剤等の培養に必要な添加剤を適量含有するものであれ
ば、合成培地、天然培地いずれも使用できる。例えば炭
素源としてはグルコース、グリセロール、デンプン等が
使用される。窒素源としては例えば塩化アンモニウム、
カザミノ酸、カゼイン、ポリペプトンなどが使用され
る。
培養温度は20〜70℃の範囲、好ましくは37〜42℃付近、
培養pHは4.5〜11.0の範囲、好ましくはpH6.0〜8.0に制
御するのが良い。また、これら以外の条件下でも使用す
る菌株が生育すれば実施できる。
培養pHは4.5〜11.0の範囲、好ましくはpH6.0〜8.0に制
御するのが良い。また、これら以外の条件下でも使用す
る菌株が生育すれば実施できる。
培養期間は、通常10〜80時間で生育し、培養物中に耐熱
性中性プロテアーゼが生成蓄積されるが、培養条件、培
養温度、pHおよびその他の培養条件によって、それ以上
の時間を要することがある。
性中性プロテアーゼが生成蓄積されるが、培養条件、培
養温度、pHおよびその他の培養条件によって、それ以上
の時間を要することがある。
培養終了後、培養液より、遠心分離あるいは過などの
固液分離手段により、菌体および不溶物を除いて粗酵素
液を得る。このようにして得られた粗酵素液をそのま
ま、あるいは硫安分画法、有機溶媒分画法、透析、等電
点沈殿法あるいはカラムクロマトグラフィー等の通常の
酵素精製法を単独あるいは組合わせて用いることによ
り、精製された新規な耐熱性中性プロテアーゼを得るこ
とができる。
固液分離手段により、菌体および不溶物を除いて粗酵素
液を得る。このようにして得られた粗酵素液をそのま
ま、あるいは硫安分画法、有機溶媒分画法、透析、等電
点沈殿法あるいはカラムクロマトグラフィー等の通常の
酵素精製法を単独あるいは組合わせて用いることによ
り、精製された新規な耐熱性中性プロテアーゼを得るこ
とができる。
この精製された新規な耐熱性中性プロテアーゼをそのま
まあるいは安定化剤、増量剤などを添加して液状、スラ
リー状、あるいは粉末状として得ることができる。
まあるいは安定化剤、増量剤などを添加して液状、スラ
リー状、あるいは粉末状として得ることができる。
本発明では食品製造、洗浄剤製造、皮革工業、ペプチド
合成等、工業的に極めて有用な耐熱性中性プロテアーゼ
を安価に効率良く製造することができる。尚、耐熱性中
性プロテアーゼ活性測定法は次の通りである。
合成等、工業的に極めて有用な耐熱性中性プロテアーゼ
を安価に効率良く製造することができる。尚、耐熱性中
性プロテアーゼ活性測定法は次の通りである。
基質溶液：カゼイン２％ H3BO4 Na2B4O4 10mM CaSO4 2mM pH7.2 反応停止液：20％トリクロロ酢酸溶液 上記の2%カゼイン溶液の１ｍを試験管に分取し、35℃
で５分間予備加温する。酵素液を１ｍ添加混和後35℃
で10分間反応する。上記の20％トリクロロ酢酸溶液を２
ｍ加え、反応を停止させた後、35℃で30分間放置後、
遠心分離、過等により、不溶物を除去したのち、275m
mの吸光度を記録する。盲検は上記操作において、酵素
溶液を添加する前に20％トリクロロ酢酸溶液を添加し、
その後、酵素溶液を加えたものを用いる。
で５分間予備加温する。酵素液を１ｍ添加混和後35℃
で10分間反応する。上記の20％トリクロロ酢酸溶液を２
ｍ加え、反応を停止させた後、35℃で30分間放置後、
遠心分離、過等により、不溶物を除去したのち、275m
mの吸光度を記録する。盲検は上記操作において、酵素
溶液を添加する前に20％トリクロロ酢酸溶液を添加し、
その後、酵素溶液を加えたものを用いる。
本発明の耐熱性中性プロテアーゼ活性の表示は、上記条
件下で１分間当たり１μｇのチロシンを生ずる活性を１
単位とした。
件下で１分間当たり１μｇのチロシンを生ずる活性を１
単位とした。
以下、本発明を実施例により、更に詳しく説明するが、
本発明は何らこれらに限定されるものではない。
本発明は何らこれらに限定されるものではない。
（実施例） (1)ベクタープラスミドpTB53の調製 ベクタープラスミドpTB53のDNAを保有するバチルス・ズ
ブチルス(Bacillus subtilis)MT-2を以下の通り調製し
てベクタープラスミドpTB53を得た。
ブチルス(Bacillus subtilis)MT-2を以下の通り調製し
てベクタープラスミドpTB53を得た。
LB培地〔純水１あたりバクト・トリプトン(Difco)10
g、バクト・イーストエキス(Difco)5g、NaCl10gをpH7.0
に調製したもの〕100mを500m容坂口フラスコに分注
し、120℃で20分間オートクレーブ滅菌した。この培地
にカナマイシン0.0004％、テトラサイクリン0.0025％を
添加し、pTB53のDNAをプラスミドとして保有するバチル
ス・ズブチルス(Bacillus subtilis)MT-2を１白金耳接
種し、30℃で16分間振盪培養した後、800rpm、５分間、
４℃にて遠心分離し、菌体を集めた。次に集めた菌体に
５mg／ｍのリゾチーム（太陽化学（株）製）、50mMグ
ルコース、10mM EDTAを含む25mMトリス塩酸緩衝液(pH8.
0)5mに懸濁し、37℃で30分間静止した。次に氷中で５
分間静置した後、1%SDSを含む0.2N NaOH溶液10mを加
え、氷中で10分間静置した。更に3Mの酢酸ナトリウム溶
液（pH4.8）を7.5m加え氷中で15分間静置した。16,00
0rpm、20分間、４℃にて遠心分離を行った。
g、バクト・イーストエキス(Difco)5g、NaCl10gをpH7.0
に調製したもの〕100mを500m容坂口フラスコに分注
し、120℃で20分間オートクレーブ滅菌した。この培地
にカナマイシン0.0004％、テトラサイクリン0.0025％を
添加し、pTB53のDNAをプラスミドとして保有するバチル
ス・ズブチルス(Bacillus subtilis)MT-2を１白金耳接
種し、30℃で16分間振盪培養した後、800rpm、５分間、
４℃にて遠心分離し、菌体を集めた。次に集めた菌体に
５mg／ｍのリゾチーム（太陽化学（株）製）、50mMグ
ルコース、10mM EDTAを含む25mMトリス塩酸緩衝液(pH8.
0)5mに懸濁し、37℃で30分間静止した。次に氷中で５
分間静置した後、1%SDSを含む0.2N NaOH溶液10mを加
え、氷中で10分間静置した。更に3Mの酢酸ナトリウム溶
液（pH4.8）を7.5m加え氷中で15分間静置した。16,00
0rpm、20分間、４℃にて遠心分離を行った。
この上清に12mのイソプロパノールを加え、10,000rp
m、30分間、18℃にて遠心分離を行い、得られた沈殿物
について、70％エタノール洗浄後、６ｍの50mM EDTA
含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解させた。次
に5.9gの塩化セシウム、0.3mのエチジウムブロマイド
溶液（5%ジメチルスルホキシドを含む1%エチジウムブロ
マイド溶液）と混合し、38,000rpm、40時間、18℃にて
遠心分離を行った。プラスミドDNA層を注射器で抜き取
り、ｎ−ブタノール抽出によってエチジウムブロマイド
を除去し、1mM EDTAを含む10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
5）に透析することにより、約30μｇのpTB53DNAを取得
した。
m、30分間、18℃にて遠心分離を行い、得られた沈殿物
について、70％エタノール洗浄後、６ｍの50mM EDTA
含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解させた。次
に5.9gの塩化セシウム、0.3mのエチジウムブロマイド
溶液（5%ジメチルスルホキシドを含む1%エチジウムブロ
マイド溶液）と混合し、38,000rpm、40時間、18℃にて
遠心分離を行った。プラスミドDNA層を注射器で抜き取
り、ｎ−ブタノール抽出によってエチジウムブロマイド
を除去し、1mM EDTAを含む10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
5）に透析することにより、約30μｇのpTB53DNAを取得
した。
(2)新規な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子DNAの調製 新規な耐熱性中性プロテアーゼを産生するバチルス・ス
テアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus)
TELNE FERM-P NO.9439を500m容坂口フラスコに分注し
た100mの滅菌したLB培地に１白金耳接種し、55℃にて
10〜12時間培養した後、88,000rpm５分間、４℃にて遠
心分離し、菌体を集めた。５ｍの15mMクエン酸ミナト
リウムを含む0.15M NaClで菌体を洗浄後、8,000rpm、５
分間、４℃にて再び菌体を集めた。この菌体に５ｍの
１mM EDTA、20％シュクロース(Sucrose）を含む50mMト
リス塩酸緩衝液（pH7.6）を加え、更に10％リゾチーム
溶液を0.5m添加し、37℃にて10分間静置した。
テアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus)
TELNE FERM-P NO.9439を500m容坂口フラスコに分注し
た100mの滅菌したLB培地に１白金耳接種し、55℃にて
10〜12時間培養した後、88,000rpm５分間、４℃にて遠
心分離し、菌体を集めた。５ｍの15mMクエン酸ミナト
リウムを含む0.15M NaClで菌体を洗浄後、8,000rpm、５
分間、４℃にて再び菌体を集めた。この菌体に５ｍの
１mM EDTA、20％シュクロース(Sucrose）を含む50mMト
リス塩酸緩衝液（pH7.6）を加え、更に10％リゾチーム
溶液を0.5m添加し、37℃にて10分間静置した。
次に1%N-ラウロイルサルコシン酸ナトリウムを含む0.1M
EDTA(pH9.6)を11.0m添加した。次に0.5%のプロナー
ゼ溶液を0.5m添加し、50℃にて１時間静置した後、17
ｇの塩化セシウム、0.8mのエチジウムブロマイド溶液
と混合し、38,000rpm、40時間、18℃にて遠心分離を行
った。染色体DNA層を注射器で抜き取り、ｎ−ブタノー
ル抽出によってエチジウムブロマイドを除去し、1mM ED
TAを含む10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）に透析するこ
とにより、約700μｇの新規な耐熱性中性プロテアーゼ
遺伝子DNAを含む染色体DNAを取得した。
EDTA(pH9.6)を11.0m添加した。次に0.5%のプロナー
ゼ溶液を0.5m添加し、50℃にて１時間静置した後、17
ｇの塩化セシウム、0.8mのエチジウムブロマイド溶液
と混合し、38,000rpm、40時間、18℃にて遠心分離を行
った。染色体DNA層を注射器で抜き取り、ｎ−ブタノー
ル抽出によってエチジウムブロマイドを除去し、1mM ED
TAを含む10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）に透析するこ
とにより、約700μｇの新規な耐熱性中性プロテアーゼ
遺伝子DNAを含む染色体DNAを取得した。
(3)新規な耐熱性中性プロテアーゼのベクタープラスミ
ドpTB53を用いたクローニング (A)上記(1)で得られたベクタープラスミドpTB53 10μｇ
について50ＵのエンドヌクアーゼBamHI（東洋紡製）お
よび10％のHigh Buffer〔東洋紡製，1M NaCl,0.1M塩化
マグネシウムおよび10mMジチオスレイトールを含む0.5M
トリス塩酸緩衝液（pH7.5）〕を加え、37℃、１時間の
反応を行うことによりこれを完全に切断した。
ドpTB53を用いたクローニング (A)上記(1)で得られたベクタープラスミドpTB53 10μｇ
について50ＵのエンドヌクアーゼBamHI（東洋紡製）お
よび10％のHigh Buffer〔東洋紡製，1M NaCl,0.1M塩化
マグネシウムおよび10mMジチオスレイトールを含む0.5M
トリス塩酸緩衝液（pH7.5）〕を加え、37℃、１時間の
反応を行うことによりこれを完全に切断した。
(B)次に上記(2)で得られた染色体DNA 30μｇについて0.
3ＵのエンドヌクレアーゼSau3AI（東洋紡製）および10
％のMedium Buffer〔東洋紡製，0.5M NaCl,0.1M塩化マ
グネシウムおよび10mMジチオスレイトールを含む0.1Mト
リス塩酸緩衝液（pH7.5）〕を加え、37℃、１時間の反
応を行うことにより、これを部分的に切断した。
3ＵのエンドヌクレアーゼSau3AI（東洋紡製）および10
％のMedium Buffer〔東洋紡製，0.5M NaCl,0.1M塩化マ
グネシウムおよび10mMジチオスレイトールを含む0.1Mト
リス塩酸緩衝液（pH7.5）〕を加え、37℃、１時間の反
応を行うことにより、これを部分的に切断した。
(C)BamHIにて完全に切断したpTB53 10μｇとSau3AIにて
部分的に切断した染色体DNA 30mgを混合し、1mM ATPお
よび5mMジチオスレイトールの存在下に、10ＵのT4ファ
ージ由来のDNAリカーゼを用いて15℃、16時間のDNA鎖の
連結反応を行った。
部分的に切断した染色体DNA 30mgを混合し、1mM ATPお
よび5mMジチオスレイトールの存在下に、10ＵのT4ファ
ージ由来のDNAリカーゼを用いて15℃、16時間のDNA鎖の
連結反応を行った。
(D)(C)で得られた組換え体プラスミドをJournal of Bac
terology 81,41〜746、(1961)に示されたコンピテント
・セル法にてバチルス・ズブチルス(Bacillus subtili
s)MT-2に形質転換し、1%カゼイン、0.0004％カナマイシ
ン、0.0025％テトラサイクリン、および 1.5%寒天を含むLB培地上に広げた。
terology 81,41〜746、(1961)に示されたコンピテント
・セル法にてバチルス・ズブチルス(Bacillus subtili
s)MT-2に形質転換し、1%カゼイン、0.0004％カナマイシ
ン、0.0025％テトラサイクリン、および 1.5%寒天を含むLB培地上に広げた。
30℃、１日間でコロニーを形成させ、耐熱性中性プロテ
アーゼの分泌によりコロニーの周囲に形成されるハロー
によって耐熱性中性プロテアーゼ生産菌、すなわち新規
な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子DNAを含む形質転換体
を選択することができた。こうして得た新規な耐熱性中
性プロテアーゼ遺伝子DNAを含む組換え体プラスミドpSP
53はpTB53のBamHIサイトに約18KbpのDNAが挿入されたも
のであった。
アーゼの分泌によりコロニーの周囲に形成されるハロー
によって耐熱性中性プロテアーゼ生産菌、すなわち新規
な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子DNAを含む形質転換体
を選択することができた。こうして得た新規な耐熱性中
性プロテアーゼ遺伝子DNAを含む組換え体プラスミドpSP
53はpTB53のBamHIサイトに約18KbpのDNAが挿入されたも
のであった。
(4)新規な耐熱性遺伝子DNAの確認およびアミノ酸配列の
決定 (3)で得た組換え体プラスミドpSP53の耐熱性中性プロテ
アーゼをコードするDNAについて、Proc.Natl,Acad.Sc
i.,USA74巻5463頁（1977年）記載のサンガーらのダイデ
オキチェインターミネーション法による塩基配列の決定
を行った。
決定 (3)で得た組換え体プラスミドpSP53の耐熱性中性プロテ
アーゼをコードするDNAについて、Proc.Natl,Acad.Sc
i.,USA74巻5463頁（1977年）記載のサンガーらのダイデ
オキチェインターミネーション法による塩基配列の決定
を行った。
pSP53について、適当な制限酵素で切断後、同じ酵素あ
るいはSmaIで完全に切断したM13mp18あるいはmp19RFDNA
にT4-リガーゼにて連結後、大腸菌JM109に形質転換し
た。IPTGおよびX-galを含む寒天培地に広げ、半透明の
プラークを選択した。単一プラークを1.5mの2XYT培地
（1.6%バクトトリプトン、1%酵母エキス、0.5%食塩）に
て培養した。培養上清よりファージをポリエチレングリ
コールにより沈殿、回収し、フェノール処理でファージ
蛋白質を除去し、エタノール沈殿を行うことにより、pS
p53のDNAが挿入されたファージDNAを精製した。
るいはSmaIで完全に切断したM13mp18あるいはmp19RFDNA
にT4-リガーゼにて連結後、大腸菌JM109に形質転換し
た。IPTGおよびX-galを含む寒天培地に広げ、半透明の
プラークを選択した。単一プラークを1.5mの2XYT培地
（1.6%バクトトリプトン、1%酵母エキス、0.5%食塩）に
て培養した。培養上清よりファージをポリエチレングリ
コールにより沈殿、回収し、フェノール処理でファージ
蛋白質を除去し、エタノール沈殿を行うことにより、pS
p53のDNAが挿入されたファージDNAを精製した。
次に得られたDNAについてM13シーケンシングキット（東
洋紡製）および〔α−３２ｐ〕dcTP（アマーシャム社
製）を用いて、プライマーのアニーリング、ダイデオキ
シ反応、ホルムアミド色素による反応停止を行なった。
３分間沸騰後、ポリアクリルアミドゲルにて1000Ｖにて
電気泳動を行なったものについてオートラジオグラムを
とることにより塩基配列を決定した。
洋紡製）および〔α−３２ｐ〕dcTP（アマーシャム社
製）を用いて、プライマーのアニーリング、ダイデオキ
シ反応、ホルムアミド色素による反応停止を行なった。
３分間沸騰後、ポリアクリルアミドゲルにて1000Ｖにて
電気泳動を行なったものについてオートラジオグラムを
とることにより塩基配列を決定した。
pSP53では、Natura New Biology.Vol.238、July 12 197
2,P35〜37にて報告された耐熱性中性プロテアーゼであ
るThermolysinのアミノ酸配列と極めてよく一致するオ
ープンリーディングフレームが存在し、得られたpSP53
が新規な耐熱性中性プロテアーゼの遺伝子DNAを含むプ
ラスミドであることが確認された。
2,P35〜37にて報告された耐熱性中性プロテアーゼであ
るThermolysinのアミノ酸配列と極めてよく一致するオ
ープンリーディングフレームが存在し、得られたpSP53
が新規な耐熱性中性プロテアーゼの遺伝子DNAを含むプ
ラスミドであることが確認された。
このようにして得られたオープンリーディングフレーム
および既知の方法により求めた新規な耐熱性中性プロテ
アーゼのアミノ末端およびカルボキシル末端のアミノ酸
より、新規な耐熱性中性プロテアーゼのアミノ酸配列を
決定した。
および既知の方法により求めた新規な耐熱性中性プロテ
アーゼのアミノ末端およびカルボキシル末端のアミノ酸
より、新規な耐熱性中性プロテアーゼのアミノ酸配列を
決定した。
(5)新規な耐熱性プロテアーゼの生産 (3)で得られた新規な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子DNA
を含む形質転換体を500m容坂口フラスコに分注した10
0mの0.0005％カナマイシンおよび0.0025％テトラサイ
クリンを含むLB培地に１白金耳接種し、30℃、16時間振
盪培養した後、プロテアーゼ生産培地、（1%カゼイン、
1%グルコース、0.2%酵母エキス、0.02%硫酸マグネシウ
ム、0.02％塩化カルシウム、0.002%硫酸亜鉛、0.0003％
カナマイシンおよび0.0015％テトラサイクリン、pH7.
0）50mを分注した500m容坂口フラスコに１ｍ植菌
し、30℃、60時間培養した。この時の培養力価は約11,0
00Ｕ／ｍであり、親株バチルス・ステアロサーモフィ
ラス(Bacillus stearothemophilus)TELNEの約５倍の生
産量となった。
を含む形質転換体を500m容坂口フラスコに分注した10
0mの0.0005％カナマイシンおよび0.0025％テトラサイ
クリンを含むLB培地に１白金耳接種し、30℃、16時間振
盪培養した後、プロテアーゼ生産培地、（1%カゼイン、
1%グルコース、0.2%酵母エキス、0.02%硫酸マグネシウ
ム、0.02％塩化カルシウム、0.002%硫酸亜鉛、0.0003％
カナマイシンおよび0.0015％テトラサイクリン、pH7.
0）50mを分注した500m容坂口フラスコに１ｍ植菌
し、30℃、60時間培養した。この時の培養力価は約11,0
00Ｕ／ｍであり、親株バチルス・ステアロサーモフィ
ラス(Bacillus stearothemophilus)TELNEの約５倍の生
産量となった。
これを遠心分離にて菌体および不溶物を除いて粗酵素液
を得た。次にここに得られた粗酵素液を硫安で塩析し、
10〜50％飽和画分（飽和度はOsborne法で表示）を凍結
乾燥して粗粉末80mgを得た。ここに得られた粗粉末１mg
あたりの耐熱性中性プロテアーゼ活性は約5000Ｕであっ
た。
を得た。次にここに得られた粗酵素液を硫安で塩析し、
10〜50％飽和画分（飽和度はOsborne法で表示）を凍結
乾燥して粗粉末80mgを得た。ここに得られた粗粉末１mg
あたりの耐熱性中性プロテアーゼ活性は約5000Ｕであっ
た。
（発明の効果） 本発明によれば、新規な耐熱性中性プロテアーゼ生産能
のある新規な微生物が得られれ、かつ、それの培養によ
り新規な耐熱性中性プロテアーゼの工業的生産が可能と
なる。
のある新規な微生物が得られれ、かつ、それの培養によ
り新規な耐熱性中性プロテアーゼの工業的生産が可能と
なる。
第１図は新規な耐熱性中性プロテアーゼの構造遺伝子を
示す図である。 第２図はpSP53の調整法および制限酵素地図を示す図で
ある。
示す図である。 第２図はpSP53の調整法および制限酵素地図を示す図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/57 Ｃ１２Ｒ 1:07） 審査官 平田 和男 (56)参考文献 特開 昭63−192388（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，134（1988) Ｐ．1883−1892
Claims (1)
- 【請求項１】下記式(1)のアミノ酸配列で示される新規
な耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子を含有する、制限酵素
Sau3AIにより切断された約18kbpであるバチルス・ステ
アロサーモフィルス(Bacillus stearothemophilus)TELN
E(FERM-P NO.9439)由来の染色体ＤＮＡをバチルス属に
属する細菌内で複製するベクタープラスミドに連結し、
得られた組換え体プラスミドでバチルス・ズブチルスを
形質転換し、形質転換されたバチルス・ズブチルスを培
養し、該培養物から耐熱性中性プロテアーゼを採取する
ことを特徴とする新規な耐熱性中性プロテアーゼの製造
方法。 式(1)：
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62184323A JPH0636740B2 (ja) | 1987-07-22 | 1987-07-22 | 新規な耐熱性中性プロテア−ゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62184323A JPH0636740B2 (ja) | 1987-07-22 | 1987-07-22 | 新規な耐熱性中性プロテア−ゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6427475A JPS6427475A (en) | 1989-01-30 |
| JPH0636740B2 true JPH0636740B2 (ja) | 1994-05-18 |
Family
ID=16151317
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62184323A Expired - Fee Related JPH0636740B2 (ja) | 1987-07-22 | 1987-07-22 | 新規な耐熱性中性プロテア−ゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0636740B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2590462B2 (ja) * | 1986-09-30 | 1997-03-12 | 東ソー株式会社 | 耐熱性プロテア−ゼの製造法 |
-
1987
- 1987-07-22 JP JP62184323A patent/JPH0636740B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３４（１９８８）Ｐ．１８８３−１８９２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6427475A (en) | 1989-01-30 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |