JPH0632604B2 - 氷核活性を有する微生物の回収方法 - Google Patents

氷核活性を有する微生物の回収方法

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JPH0632604B2
JPH0632604B2 JP62236412A JP23641287A JPH0632604B2 JP H0632604 B2 JPH0632604 B2 JP H0632604B2 JP 62236412 A JP62236412 A JP 62236412A JP 23641287 A JP23641287 A JP 23641287A JP H0632604 B2 JPH0632604 B2 JP H0632604B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は氷核活性(ice nucleating activity)を有する
微生物を当該微生物を含む培地から乾燥形態で回収する
方法に関する。
〔従来の技術〕
米国特許第4200228号には雪を製造する方法が開示され
ており、この方法によれば微生物が空気中に噴霧される
小滴中に含まれている。使用されている微生物は氷核生
成を促進することが知られている種類のものである。そ
の結果、通常の温度より可成り高い温度で雪を製造する
ことができる。このプロセスに有用な代表的な微生物は
シュードモナス、更に詳しくはシュードモナス シリン
ゲ(Pseudomonads syringae)である。
このプロセスをいかなる規模でも使用しようとすると、
多量の微生物を必要とすることは明白である。更に、微
生物は、その貯蔵、取扱及び運搬輸送を容易にするため
に、乾燥形態で得るのが好ましい。
微生物の回収に関しては、前記米国特許はホルマリンで
処理した濃縮培養物を凍結乾燥した旨開示されているだ
けでその詳細は不明である。
〔発明が解決すべき問題点〕
前記微生物の大量生産に公知の凍結乾燥方法を用いた場
合には、所望の氷核活性のものは得られないという問題
がある。醗酵プロセスによって醗酵懸濁液中に高活性の
ものが得られたとしても、当該活性の相当部分が多量の
物質を乾燥する間に消失する。その結果として、かかる
プロセスは微生物を商業的な量で妥当なコストで製造す
ることのできるものではない。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明によれば、氷核活性(ice nucleating activity)
を有する微生物を醗酵培地から回収する方法が提供され
る。即ち、この方法は、醗酵培地から氷核活性を有する
微生物を回収するにあたり、 a)前記培地の温度を約15℃以下とする工程、 b)温度を約15℃以下に保持しつつ、前記微生物の濃縮
物、好ましくは水分含量約15〜27重量％の濃縮物を形成
せしめる工程、 c)前記濃縮物を微細流状で極低温液体中に通して前記濃
縮物の凍結ペレット、好ましくは径約２〜１０mmのペレ
ットを生成せしめる工程、そして ｄ）得られたペレットを25℃より低い温度で凍結乾燥す
る工程、 の各工程を含んで構成される。
〔発明の実施態様〕
本発明プロセスは、氷核活性（ＩＮＡ）を有する微生物
を含む、任意の懸濁液の乾燥後も氷核活性を保持させる
ことができる。前述の如く、かかる微生物の醗酵プロセ
ス自体は当業界において知られている。
本発明によれば、氷核活性を有する、任意の微生物を回
収することができる。適当な微生物としては、Ｐ．シリ
ンゲ(syringae)及びＰ．フルオールセンズ(fluorscen
s)、Ｐ．コロナファシエンズ(coronafaciens)及びＰ．
ピシ(pisi)などのシュードモナス(Pseudomonads)属の微
生物を例示することができる。本発明において使用する
のに有用な他の微生物としては、例えばエルウィナ(Erw
ina)、ヘルビコーラ(herbicola)をあげることができ
る。特に好ましい微生物はＰ．シリンゲ(syringae)ATCC
53,543〔ブタペスト条約に従って米国メリーランド州
のロックビルのATCC(American Type Culture Collectio
n)に1986年９月23日に寄託〕である。
本発明者は本発明に従って前記したような微生物を回収
することによって従来法に比較してＩＮＡの低下を抑え
ることができることを見出した。本発明方法において
は、その方法の実施の過程において微生物の温度を実用
上可能な出来るだけ低い温度に保持することが重要であ
る。特に好ましい方法は、醗酵培地の温度を先ず１５℃
より低い温度に低下させ、次に１５℃より低い温度を保
持し乍ら培地を濃縮して乾固物濃度が好ましくは15〜27
重量％、更に好ましくは２２重量％とする。次にこの濃
縮培地を、液体窒素のような極低温液体中で急速に凍結
させる。
培地の濃縮は任意の慣用方法、例えば過又は遠心分離
などによって実施することができる。ソリッドボウル(s
olid bowl)遠心分離又はディスクボウル(disc bowl)連
続遠心分離を用いることができる。
濃縮された培地は連続流(stream)の状態で前記極低温液
体中に入れる。培地の連続流は極低温液体と会うと、小
さな滴状となり、急速に凍結してペレット、好ましくは
約２〜１０mmサイズのペレットとなる。前記濃縮培養培
地に類似の液体を極低温液体中に導入する装置及び方法
は当業者の知るところであり、例えば米国特許第322883
8号、同第3928566号、同第4077227号及び同第4479363号
などに記載されている通りである。
前記ペレットは次いで極低温液体から回収して、慣用方
法で好ましくは水分含量約２〜８重量％に、凍結乾燥す
る。出来るだけＩＮＡを保持するために、凍結乾燥プロ
セスの間、生成物の温度を２５℃又はそれ以下に、好ま
しくは１５℃又はそれ以下に保持するのが好ましい。本
発明者らは、生成物の温度を高くすると、ＩＮＡが一部
失なわれることを見出した。例えば生成物温度を30〜50
℃にすると、ＩＮＡ損失が30〜70％となる。
以下の例においてはＩＮＡは慣用技術を用いて計算し
た。ＩＮＡは複数個の微生物を含む水滴（１０μｌ）を
パラフィン被覆アルミ箔上に置き、これを−５℃の恒温
浴中に入れることによって求めた。この方法の詳細は、
例えば文献Vali,Quantitative Evaluation of Experime
ntal Results on the Heterogenous Freezing of Super
cooled Liquids,J.Atoms Sci,28,402〜409頁（1971年）
に記載されている。以下の例において記載したＩＮＡ
は、乾燥微生物１ｇ当りの氷核形成サイトの数である。
本発明の目的に対して、乾燥することなく醗酵器から直
接サンプリングしたサンプルを用いて測定したＩＮＡを
「醗酵器ＩＮＡ」と称し、回収した乾燥製品を用いて測
定したＩＮＡを「回収ＩＮＡ」と称す。
〔実施例〕
例１ マンニトール、酵母エキス及び硫酸マグネシウムを含む
栄養培地を含んだアガープレート上に、シュードモナス
シリンゲ ATCC No.53,543をしま状又は線状にうえ
た。温度２６℃で４８時間経過後、プレートの半分を同
様な培地を含む500mlフラスコ中に接種するのに用い
た。
温度２６℃で１２時間経過後、前記液状接種物を100リ
ットルの醗酵培地に接種するのに用いた。この培地の組
成は、約８０ｇ／のマンニトール、約２０ｇ／の酵
母エキス、約１ｇ／の硫酸マグネシウム及び0.1g／
の植物ベースの発泡抑制剤ストラクトール(Struktol)
（米国Struktol Corp.より市販）を含むものであった。
醗酵温度は２１℃にコントロールした。醗酵の間、系の
pHを４Ｎ硫酸及び２Ｎ水酸化ナトリウムでコントロール
した。即ち、pHが6.6に近づいたら硫酸を添加し、pHが
5.6に近づいたら水酸化ナトリウムを添加した。溶解酸
素は３０％飽和より上に維持し、前記発泡抑制剤は発泡
をコントロールするのに必要な場合に添加した。
２４時間経過後、細胞塊は１リットル当り１８ｇ（乾燥
細胞）に到達し、醗酵器ＩＮＡは3.70×1011であった。
醗酵液体培地(broth)を５℃に冷却し、温度を５℃に保
持し乍ら遠心分離した。固形物を回収し、固形分含量２
２％のスラリーとした。このスラリーを液体窒素を含む
容器中に流した。液体窒素中に入る流れ（ストリーム）
の直径は約１〜４mmであった。このようにして得られた
ペレットを集めて凍結乾燥した。凍結乾燥プロセスの
間、生成物の温度が２１℃を超えないようにした。乾燥
品の回収ＩＮＡは1.26×1011であった。
例２ 本例は比較例である。
即ち、凍結乾燥工程の間、生成物の温度が約３５℃であ
った以外は例１と同様にして凍結乾燥品を得た。このも
のの回収ＩＮＡは0.25×1011であった。
例３ 本例は比較例である。
醗酵後、醗酵培地を温度２１℃に保ち、濃縮及びペレッ
ト化工程の前に室温（２５℃）で４時間保持した以外は
例１と同様にして凍結乾燥品を得た。回収ＩＮＡは0.36
×1011であった。
例４ 本例は比較例である。
例１の醗酵培地を浅いパン中に深さ約2.54cmに注いだ。
次に、これらのパンを培地が完全に凍結して凍結培地の
スラブが形成されるまでフリーザー（−６℃）中に置い
た。次にこれらのパンを凍結乾燥器中に入れて生成物温
度２１℃より低く保持した。得られた乾燥品の回収ＩＮ
Ａは0.40×1011であった。
得られた結果を以下の表に纏める。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】醗酵培地から氷核活性を有する微生物を回
    収するにあたり、 ａ）前記培地の温度を約15℃以下とする工程、 ｂ）温度を約15℃以下に保持しつつ、前記微生物の濃縮
    物を形成せしめる工程、 ｃ）前記濃縮物を微細流状で極低温液体中に通して前記
    濃縮物の凍結ペレットを生成せしめる工程、そして ｄ）得られたペレットを25℃より低い温度で凍結乾燥す
    る工程、 の各工程を含む氷核活性を有する微生物の回収方法。
JP62236412A 1986-09-23 1987-09-22 氷核活性を有する微生物の回収方法 Expired - Lifetime JPH0632604B2 (ja)

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US910552 1986-09-23

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