DE3783414T2

DE3783414T2 - Zurueckgewinnung von mikroorganismen mit eiskristallbildungsaktivitaet.

Info

Publication number: DE3783414T2
Application number: DE8787113771T
Authority: DE
Inventors: C O Eastman Kodak Comp Lindsey
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1986-09-23
Filing date: 1987-09-21
Publication date: 1993-07-15
Anticipated expiration: 2007-09-22
Also published as: EP0261623A3; JPH0632604B2; EP0261623A2; JPS63102673A; CA1277273C; ATE84311T1; EP0261623B1; US4706463A; AU589273B2; AU7893187A; DE3783414D1; KR960010904B1; KR880004081A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Rückgewinnung von Mikroorganismen, die eine Eiskristallbildungsaktivität aufweisen, aus einem Medium, das die Mikroorganismen enthält, in getrockneter Form.
Aus der US-PS 4 200 228 ist ein Verfahren zur Herstellung von Schnee bekannt, bei dem Mikroorganismen in Tröpfchen eingeschlossen sind, die in die Luft gesprüht werden. Die Mikroorganismen, die verwendet werden, sind von dem Typ, der dafür bekannt ist, daß er eine Eiskristallbildung zu fördern vermag. Als Folge hiervon kann Schnee bei Temperaturen erzeugt werden, die beträchtlich höher sind, als es normalerweise möglich ist. Ein typischer Mikroorganismus, der für dieses Verfahren geeignet ist, ist ein Pseudomonad und insbesondere ein Pseudomonas syringae.
Es ist offensichtlich, daß, wenn dieses Verfahren in einem beliebigen Maßstab verwendet werden soll, große Mengen an Mikroorganismen benötigt werden. Weiterhin ist es wünschenswert, daß der Mikroorganismus in trockener Form erhalten wird, um dessen Aufbewahrung und Transport zu erleichtern.
Die Wachstumsbedingungen für Mikroorganismen, die eine Eiskristallbildungsaktivität aufweisen, sind bekannt. Beispielsweise ist es aus einer Arbeit von Maki und Willoughby, Bacteria as Biogenic Sources of Freezing Nuclei, J. Applied Meteorology 17 1049-1053 bekannt, daß Mikroorganismen, wie Pseudomonas syringae in einer Koser-Citratbrühe bei einer Temperatur unterhalb 20ºC, d. h. 5ºC, gezüchtet werden können. Dieses Medium ist gut bekannt und weist einen pH-Wert von etwa 6,7 auf. In der Literaturstelle wird keine Steuerung des pH-Wertes beschrieben. Es ist ferner angegeben, daß, falls die Kulturen bei einer Temperatur oberhalb 20ºC gezüchtet werden, sehr wenige Gefrierkeime erzeugt werden.
Soweit es das Wiedergewinnungsverfahren anbelangt, wird in dieser Literaturstelle angegeben, daß konzentrierte Kulturen, die mit Formalin behandelt worden sind, gefriergetrocknet wurden. Es werden jedoch keine Details angegeben.
Gemäß einer weiteren Literaturstelle werden Mikroorganismen in einem Trypton-Hefeextrakt-Glycerin-Medium mit einem pH- Wert von etwa 7,0 gezüchtet (Koxloff, Schofield und Lute, Ice Nucleating Activity of Pseudomonas syringae und Erwinia herbicola, J. Bacter. 153 Seiten 222-231 (1983)). Gemäß dieser Literaturstelle werden die Mikroorganismen nicht in trockener Form wiedergewonnen und die Suspensionen werden direkt auf ihre Aktivität getestet. Zu bemerken ist, daß die Eiskristallbildungsaktivität in den Suspensionen nicht stabil ist und über Nacht abnimmt.
Werden die bekannten Verfahren zur Erzeugung von großen Volumina der Mikroorganismen angewandt, so wird eine geringere als die gewünschte Eiskristallbildungsaktivität erzielt. Sogar dann, wenn die Fermentation eine hohe Aktivität in der Fermentationssuspension erzeugt, geht viel der Aktivität während der Trocknung großer Volumina des Materials verloren. Das Endergebnis ist ein Verfahren, das es nicht ermöglicht, kommerzielle Menge an Mikroorganismus zu vertretbaren Kosten herzustellen. Die vorliegende Erfindung ist auf die Lösung dieses Problems gerichtet.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Wiedergewinnung eines Mikroorganismus bereit, der Eiskristallbildungsaktivität aufweist, aus einem Fermentationsmedium. Das Verfahren umfaßt die folgenden Stufen:
a) Einstellen der Temperatur des Mediums auf etwa 15ºC oder weniger,
b) Bildung eines Konzentrats des Mikroorganismus, vorzugsweise mit einem Wassergehalt von etwa 15 bis 27%, unter Aufrechterhaltung der Temperatur bei etwa 15ºC oder weniger,
c) Einlaufenlassen des Konzentrates in eine cryogene Flüssigkeit in Form eines feinen Stromes unter Erzeugung von gefrorenen Pellets des Konzentrates, vorzugsweise mit einem Durchmesser von etwa 2 bis 10 mm,
d) Gefriertrocknung der Pellets bei einer Temperatur unterhalb 25ºC.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist geeignet, um die Eiskristallbildungsaktivität (INA) nach dem Trocknen einer beliebigen Suspension, die den Mikroorganismus enthält, beizubehalten. Wie oben angegeben, sind die Fermentationsverfahren für diese Mikroorganismen bekannt.
Nach der vorliegenden Erfindung läßt sich jeder Mikroorganismus, der eine Eiskristallbildungsaktivität aufweist, gewinnen bzw. zurückgewinnen. Zu geeigneten Mikroorganismen gehören Pseudomonads, wie z. B. P. syringae und P. fluorscens, P. coronafaciens und P. pisi. Zu anderen Mikroorganismen, die für das Verfahren der Erfindung geeignet sind, gehören Erwina herbicola. Der zum gegenwärtigen Zeitpunkt bevorzugte Mikroorganismus ist P. syringae ATCC Nr. 53 543, niedergelegt am 23. September 1986, in Übereinstimmung mit dem Budapester Übereinkommen bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, USA.
Es wurde gefunden, daß das vorliegende Verfahren zur Rückgewinnung des Mikroorganismus zu einem geringeren Verlust der INA führt als bekannte Verfahren. Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung ist wichtig, daß die Temperatur der Mikroorganismen so niedrig, wie es während des Verfahrens praktisch ist, gehalten wird. Das gegenwärtig bevorzugte Verfahren besteht darin, zunächst die Temperatur des Fermentationsmediums auf eine Temperatur unterhalb 15ºC zu reduzieren. Das Medium wird dann auf eine Konzentration auf Feststoff-Trockengewichtsbasis von vorzugsweise zwischen 15 und 27% und in besonders vorteilhafter Weise 22% gebracht, wobei die Temperatur unterhalb 15ºC gehalten wird. Das konzentrierte Medium wird dann rasch in einer cryogenen Flüssigkeit, beispielsweise flüssigem Stickstoff, gefroren.
Die Konzentrierung des Mediums kann nach irgendeiner üblichen Methode erfolgen, z. B. Filtrieren oder Zentrifugieren. Eine Festtank-Zentrifuge oder eine kontinuierlich arbeitende Scheiben-Tankzentrifuge können angewandt werden.
Das konzentrierte Medium wird in die cryogene Flüssigkeit in Form eines kontinuierlichen Stromes des Mediums überführt. Wenn der Strom auf die Flüssigkeit auftrifft, werden kleine Tröpfchen gebildet, die rasch zu Pellets frieren, vorzugsweise mit einer Größe von etwa 2 bis 10 mm.
Vorrichtungen und Verfahren zur Einführung von Flüssigkeiten, ähnlich denen des konzentrierten Fermentationsmediums in die cryogene Flüssigkeit sind bekannt. Verwiesen wird auf die US-PS 3 228 838; 3 928 566; 4 077 227 und 4 479 363.
Die Pellets werden dann aus der cryogenen Flüssigkeit zurückgewonnen und nach üblichen Methoden gefriergetrocknet, vorzugsweise bis zu, einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 2 bis 8 Gew.-%. Während des Gefrier-Trocknungsverfahrens wird die Produkttemperatur vorzugsweise bei einer Temperatur von 25ºC oder darunter gehalten, vorzugsweise von 15ºC oder darunter, um soviel wie möglich der INA beizubehalten. Es wurde gefunden, daß eine höhere Produkttemperatur zu einem gewissen INA-Verlust führt. Produkttemperaturen von 30 bis 50ºC, beispielsweise, können zu einem 30 bis 70%igen Verlust an INA führen.
In den im folgenden angegebenen Beispielen ist die INA nach üblichen Methoden berechnet worden. Die INA wurde bestimmt durch Einbringen einer Vielzahl von Mikroorganismen enthaltenden Wassertröpfchen (10 ul) auf eine mit Paraffin beschichtete Aluminiumfolie. Die Folie wurde bei einer Temperatur von -5ºC gehalten, indem sie auf ein Temperaturbad konstanter Temperatur gebracht wurde. Details dieses Verfahrens finden sich in der Literatur, beispielsweise in der Arbeit von Vali, Quantitative Evaluation of Experimental Results on the Heterogenous Freezing of Sypercooled Liquids, J. Atoms Sci., 28, 402-409 (1971). Die INA, die in den Beispielen angegeben wird, ist die Anzahl von Eiskristallbildungszentren pro Trockengramm Mikroorganismus. Für die vorliegenden Zwecke wird die INA, die gemessen wurde, unter Verwendung einer Probe direkt aus dem Fermentor ohne Trocknung, bezeichnet als "Fermentor INA" und die INA des wiedergewonnen getrockneten Produktes wird bezeichnet als die "wiedergewonnene INA".
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen.

Beispiel 1

Pseudomonas syringae ATCC Nr. 53 543 wurde auf eine Agarplatte aufgestrichen, die ein Nährmedium enthielt mit Mannitol, Hefeextrakt und Magnesiumsulfat. Nach 48 h bei 26ºC wurden fünf Platten dazu verwendet, um einen 10 l fassenden Fermentor, der ein ähnliches Medium enthielt, zu inokulieren.
Nach 12 h bei 26ºC wurden diese flüssigen Keime dazu verwendet, um 100 l Fermentationsmedium zu inokulieren. Das Medium war ein Medium, wie in Tabelle I oben beschrieben, mit der Ausnahme, daß es ferner 0,1 g/l das Antischaummittel Struktol® auf vegetabilischer Basis enthielt.
Die Fermentationstemperatur wurde auf 21ºC eingestellt. Während der Fermentation wurde der pH-Wert durch 4N Schwefelsäure und 2N Natriumhydroxid gesteuert. Die Säure wurde zugegeben, wenn der pH-Wert sich 6,6 näherte und die Base wurde zugegeben, wenn der pH-Wert sich 5,6 näherte. Der gelöste Sauerstoff wurde auf eine Sättigung von mehr als 30% eingestellt. Das Antischaummittel wurde zugesetzt, je nach Bedarf, um ein Schäumen zu überwachen.
Nach 24 h erreichte die Zellmasse 18 g trockene Zellen/l. Die Fermentor-INA betrug 3,70 · 10¹¹.
Die Fermentationsbrühe wurde auf eine Temperatur von 5ºC abgekühlt und zentrifugiert, wobei die Temperatur bei 5ºC gehalten wurde. Die Feststoffe wurden abgetrennt und aufgeschlämmt auf einen Feststoffgehalt von 22%. Die Aufschlämmung wurde in einen Container einlaufengelassen, der mit flüssigem Stickstoff gefüllt war. Der Durchmesser des Stromes, der in den Stickstoff eingeführt wurde, betrug etwa 1 bis 4 mm. Die Pellets, die auf diese Weise erzeugt wurden, wurden aufgefangen und gefriergetrocknet. Während des Gefriertrocknungsprozesses stieg die Produkttemperatur nicht über 21ºC an. Die wiedergewonnene INA des getrockneten Materials betrug 1,26 · 10¹¹.

Beispiel 2

Dieses Beispiel ist ein Vergleichsbeispiel.
Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme jedoch, daß die Produkttemperatur während der Gefriertrocknungsstufe bei etwa 35ºC lag. Die wiedergewonnene INA betrug 0,25 · 10¹¹.

Beispiel 3

Dieses Beispiel ist ein Vergleichsbeispiel.
Beispiels 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme jedoch, daß das Fermentationsmedium bei einer Temperatur von 21ºC nach der Fermentation gehalten wurde und über einen Zeitraum von 4 h bei Raumtemperatur (25ºC) bevor den Konzentrierungs- und Pelletisierungsstufen. Die wiedergewonnene INA betrug 0,36 · 10¹¹.

Beispiel 4

Dieses Beispiel ist ein Vergleichsbeispiel.
Das Fermentationsmedium von Beispiel 1 wurde in flache Schalen gegossen, die eine Tiefe von etwa 2,54 cm hatten. Die Schalen wurden dann in einen Gefrierschrank gebracht (-6ºC), bis das Medium vollständig gefroren war, unter Erzeugung einer Platte des gefrorenen Mediums. Die Schalen wurden dann in einen Gefriertrockner gebracht, in dem die Produkttemperatur unterhalb 21ºC gehalten wurde. Das erhaltene getrocknete Produkt besaß eine wiedergewonnene INA von 0,40 · 10¹¹. Tabelle II Zusammenfassung der Beispiele Beispiel Form des Mediums Gefriertrocknungs-Temperatur Wiedergewonnene INA · 10&supmin;¹¹

Claims

1. Verfahren zur Zurückgewinnung eines Mikroorganismus mit Eiskristallbildungsaktivität aus einem Fermentationsmedium mit den Stufen:

a) Einstellen der Temperatur des Mediums auf etwa 15ºC oder weniger,

b) Bildung eines Konzentrates des Mikroorganismus unter Aufrechterhaltung der Temperatur bei etwa 15ºC oder weniger,

c) Einlaufenlassen des Konzentrates in eine cryogene Flüssigkeit in Form eines feinen Stromes unter Erzeugung von gefrorenen Pellets des Konzentrats und

d) Gefriertrocknung der Pellets bei einer Temperatur unterhalb 25ºC.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Mikroorganismus ein Pseudomonad ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der Mikroorganismus P. syringae ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Feststoff-Gewichtskonzentration in Stufe b) zwischen etwa 15 und 27% liegt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Produkttemperatur bei der Gefriertrocknung in Stufe d) unterhalb 15ºC gehalten wird.