CZ278277B6

CZ278277B6 - Pseudomonas syringae bacteria strain for the preparation of ice crystal nuclei

Info

Publication number: CZ278277B6
Application number: CS881875A
Authority: CZ
Inventors: Bohumil Rndr Drsc Sikyta; Helena Rndr Hegerova; Vaclav Ing Csc Kudela
Original assignee: Mikrobiologicky Ustav Avcr
Priority date: 1988-03-23
Filing date: 1988-03-23
Publication date: 1993-11-17
Also published as: CZ187588A3

Abstract

The invention concerns a new bacterial strain of Pseudomonas syringae, demarcated as B 17, registered in the Czechoslovak Library of Micro-organisms of J. E. Purkyne University in Brno under reference number CCM 4073. The new strain of bacterial cells exhibit roughly three times the effect from the point of view of the creation of crystal nuclei in comparison with the original strain. In the form of a suspension of free or disintegrated cells it accelerates the process of transforming water into ice at higher temperatures than for existing known strains. It can be used for freezing foods, production of frozen foods, making artificial snow and ice and for immunoassays, inducing artificial rain and preventing hail.<IMAGE>

Description

Předmětem vynálezu je nový kmen bakterie Pseudomonas syringae, značený jako B 17, vykazující vysokou tvorbu krystálizačních jader ledu, uložený v Československé sbírce mikroorganismů University J. E. Purkyně v Brně pod číslem CCM 4073.The subject of the invention is a new strain of Pseudomonas syringae, designated B17, showing high formation of ice crystallization nuclei deposited in the Czechoslovak Collection of Microorganisms of the University of J. E. Purkyně in Brno under the number CCM 4073.

Je známo, že voda začne mrznout při teplotách nižších než je bod tání ledu (0 °C) teprve poté, až je určitý počet molekul uspořádán do krystalizační mřížky ledu. Chybí-li krystalky ledu (ledová jádra), lze vodu přechladit. Malé objemy čisté vody mohou zůstat v tekutém stavu (mohou být přechlazeny) i při -40 °C, větší objemy při -10 až -20 ’C (Bigg, E. K. , Proč. Phys. Soc. B., 66 : 688, 1953).It is known that water will only freeze at temperatures below the melting point of ice (0 ° C) only after a certain number of molecules have been arranged in the ice crystal lattice. If ice crystals (ice cores) are missing, water can be cooled. Small volumes of pure water can remain in a liquid state (can be supercooled) even at -40 ° C, larger volumes at -10 to -20 ° C (Bigg, EK, Proc. Phys. Soc. B., 66: 688, 1953 ).

Při teplotách blízkých bodu tání zmrzne voda po přidání cizorodých katalyzátorů, tzv. heterogenních ledových jader. V rozmezí teplot okolo -2 až -5 C plní v přírodě funkci ledových jader ubikvistní epifytní bakterie Pseudomonas syringae var. Halí a některé další druhy (Váli G., J. Atmos, Sci., 28: 402, 1071, Schnell, R. C. -Váli, G., Nátuře, 236: 163, 1972 a Váli 1972, Maki, L. R. - Galyon, E. L. - Chang-Chian, M. - Caldwell, D. 'R. et al., 1984, Lindow, L. E. - Arny, D. C. - Upper, C. S., Phytopathology, 68: 523, 1978)At temperatures close to the melting point, water freezes after the addition of foreign catalysts, the so-called heterogeneous ice cores. In the temperature range of about -2 to -5 ° C, the ubiquitous epiphytic bacteria Pseudomonas syringae var. Halí and some other species (Vali G., J. Atmos, Sci., 28: 402, 1071, Schnell, RC-Vali, G., Nature, 236: 163, 1972 and Vali 1972, Maki, LR - Galyon, EL Chang-Chian, M. - Caldwell, D. R., et al., 1984, Lindow, LE - Arny, DC - Upper, CS, Phytopathology, 68: 523, 1978)

Krystalizačně aktivní kmeny bakterií rychle mění přechlazenou vodu při -2 až -5 °C na led, zatímco známá krystalizačně aktivní látka jodid stříbrný je účinná až při teplotách okolo -8 °C.Crystallizing active strains of bacteria rapidly change the supercooled water at -2 to -5 ° C on ice, while the known crystallizing active substance silver iodide is only effective at temperatures around -8 ° C.

Bakterie Pseudomonas syringae jsou účinnějšími· katalyzátory tvorby ledu při teplotách blízkých 0 °C, než bakterie Erwinia herbicola (Lindow et. al., 1983). Mezi kmeny P. syringae jsou značné rozdíly v krystalizační aktivitě v závislosti na teplotě a živném mediu.Pseudomonas syringae are more effective catalysts for ice formation at temperatures close to 0 ° C than Erwinia herbicola (Lindow et. Al., 1983). Among P. syringae strains there are considerable differences in crystallization activity depending on temperature and nutrient medium.

Krystalizační aktivita bakterií P.. syringae a E. herbicola je lokalizována na vnější membráně bakteriálních buněk. Je podmíněna dvěma látkami, z nichž jedna je blíže neurčený protein a druhá fosfatidylinositol (Kozloff, L. M. - Lute, M. - Westaway, D., Science, 226: 845, 1984).The crystallization activity of P. syringae and E. herbicola is located on the outer membrane of bacterial cells. It is conditioned by two substances, one of which is an unspecified protein and the other phosphatidylinositol (Kozloff, L.M. - Lute, M. - Westaway, D., Science, 226: 845, 1984).

Mutant Pseudomonas syringae byl získán působením ultrafialového světla na suspenzi buněk (10⁹ na 1 ml) kmene Pseudomonas syringae B 17 o intenzitě 6 J/m² po dobu 5 min. Ozářená neředěná suspenze byla rozlita na agarovou půdu s peptonem a jednotlivé izoláty byly hodnoceny podle tvorby krystalizačních jader ledu.The Pseudomonas syringae mutant was obtained by ultraviolet light on a cell suspension (10 ⁹ per 1 ml) of Pseudomonas syringae B 17 strain at 6 J / m ² for 5 min. The irradiated undiluted suspension was poured onto peptone agar broth and individual isolates were evaluated for ice crystal formation.

Bakteriální kmen je charakterizován následujícími morfologickými a fyziologickými vlastnostmi: mikroskopický vzhled: gram negativní tyčinky o velikosti 0,75 až 1,5 x 1,5 až 3,0 um s 1 až 2 polárními bičíky. Makroskopický vzhled: na agarovém mediu s masovým extraktem tvoří kulaté, šedobílé kolonie s namodralým odstínem s hladkým povrchem a nečleněnými okraji. Fyziologické vlastnosti: v tekutém mediu s peptonem roste ve formě zákalu a sedimentu dobře roztřepatelného. Optimální teplota pro růst je 28 až 30 °C, optimální pH 7,0 až 7,2. Zkvašuje glukózu, galaktózu, manózu, arabinózu, xylózu, sacharózu, manitol a glycerol, z nichž tvoří kyseliny, nikoliv plyny. Nezkvašuje ramnózu, laktó-1CZ 278277 B6 zu, octovou, mravenčí a vinnou kyselinu. Na solích cittronové, jablečné, jantarové a mléčné kyseliny alkalizuje roztoky. Nehydrolýzuje škrob, neprodukuje indol a sirovodík, není lipolytický a z nitrátů netvoří nitridy.The bacterial strain is characterized by the following morphological and physiological properties: microscopic appearance: gram negative rod of size 0.75 to 1.5 x 1.5 to 3.0 µm with 1 to 2 polar flagella. Macroscopic appearance: on agar medium with meat extract, it forms round, gray-white colonies with a bluish tint with a smooth surface and unitary edges. Physiological properties: In liquid medium with peptone it grows in the form of turbidity and sediment well-frayable. The optimum temperature for growth is 28-30 ° C, the optimum pH is 7.0-7.2. It fermentes glucose, galactose, mannose, arabinose, xylose, sucrose, mannitol and glycerol, which form acids, not gases. It does not ferment rhamnose, lactose, acetic, formic or tartaric acid. It bases the solutions on the salts of citric, malic, succinic and lactic acids. It does not hydrolyze starch, does not produce indole and hydrogen sulfide, is not lipolytic and does not form nitrides from nitrates.

Vynález, se týká kmene bakterie Pseudomonas syringae B 17 pro výrobu krystalizačních jader ledu. Kmen bakterie podle vynálezu vykazuje vysokou tvorbu krystalizačních jader ledu a je možno jej použít pro přípravu umělého sněhu, který se liší od přirozeného sněhu tím, že taje při teplotách o 2 až 3 ’C vyšších než přirozený sníh, pro přípravu ledu ekonomickým způsobem, dále k zabráněni krupobití a navození umělého deště. Postup přípravy spočívá v kultivaci bakterií v živné půdě následujícího složení: pepton 2 g, glycerol 1 g, KH₂PO₄ (bezv.) 0,15 g, MgSO₄ . 7 H₂O 0,15 g, destilovaná voda 1 000 ml, pH 7,2, kultivační teplota 28 °C. Po 24 h kultivace v baňkách na třepacích strojích nebo v bioreaktoru se bakterie oddělí od roztoku odstředěním. Aktivita tvorby krystalizačních jader ledu se stanoví následujícím způsobem:The invention relates to a strain of Pseudomonas syringae B17 for producing ice crystallization cores. The bacterial strain according to the invention exhibits high formation of ice crystallization nuclei and can be used for the preparation of artificial snow which differs from natural snow by melting at temperatures 2 to 3 ° C higher than natural snow, for the preparation of ice economically, further to prevent hail and induced artificial rain. The preparation process consists in cultivation of bacteria in a culture medium of the following composition: peptone 2 g, glycerol 1 g, KH ₂ PO ₄ (fine) 0.15 g, MgSO ₄ . 7 H ₂ O 0.15 g, distilled water 1000 ml, pH 7.2, culture temperature 28 ° C. After 24 h cultivation in flasks on a shaker or bioreactor, the bacteria are separated from the solution by centrifugation. The ice crystallization core formation activity is determined as follows:

Bakterie se zředí destilovanou vodou na koncentraci 5.10³buněk na 1 ml, což odpovídá 100 Klettovým jednotkám. Takto připravená suspenze se pipetuje po kapkách do misek o průměru 2 cm zhotovených z obalové folie, uvnitř pokrytých roztokem 1 % parafinu v xylenu, který se před použitím misek odpaří. Misky jsou 1 h před pipetováním kapek uloženy do ochlazené lázně s teplotou -5 °C. Aktivita tvorby krystalizačních jader ledu se projeví zmrznutím kapek do 60 s. Bakteriálních buněk nového kmene podle vynálezu lze použít zejména k urychlení procesu přeměny vody v led (v mrazírenství, při výrobě ledu a pro přípravu umělého sněhu) tím, že do prostředí se vnesou krystalizačně aktivní látky bakteriálního původu. Ve formě suspenze volných nebo dezintegrovaných buněk urychluje procesy přeměny vody v led a to již při vyšších teplotách než dosavadní známé kmeny.The bacteria are diluted with distilled water to a concentration of ⁵ x 10 ³ cells per ml corresponding to 100 Klett units. The suspension thus prepared is pipetted dropwise into 2 cm diameter dishes made of packaging foil, covered with a solution of 1% paraffin in xylene, which is evaporated before use. The dishes are placed in a cooled bath at -5 ° C for 1 h before pipetting the droplets. The activity of ice crystallization cores is manifested by the freezing of drops within 60 s. The bacterial cells of the new strain according to the invention can be used in particular to accelerate the process of water to ice conversion (freezing, ice making and artificial snow) by introducing into the environment active substances of bacterial origin. In the form of a suspension of free or disintegrated cells, it accelerates the processes of water-to-ice conversion even at higher temperatures than previous known strains.

Využití zejména při mražení potravin, výrobě zmražených potravin pro přípravu umělého sněhu a ledu a pro imuno-esey, vyvolání umělého deště a zabránění krupobití.Particularly used for freezing food, producing frozen food for the preparation of artificial snow and ice and for immuno-esey, inducing artificial rain and preventing hail.

Nový kmen bakteriálních buněk vykazuje zhruba trojnásobný účinek z hlediska tvorby krystalizačních jader ve srovnání s výchozím kmenem.The new bacterial cell strain exhibits about a threefold effect on the formation of crystallization nuclei compared to the initial strain.

Claims

PATENT CLAIMS

Pseudomonas syringae microorganism strain, designated as B 17, for the production of ice crystallization cores, deposited in the Czechoslovak Collection of Microorganisms at the University of J. E. Purkyně in Brno under the number CCM 4073.