JPH06237767A - トリプトファナーゼの分画法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】大腸菌の生産したトリプトファナーゼを分画す
る。 【構成】大腸菌を培養した後、トリプトファナーゼを含
有する菌体抽出液を調製し、これに硫酸アンモニウムを
添加し、且つ加熱処理を行う。 【効果】トリプトファナーゼを、簡便に且つ高い純度お
よび回収率で分画することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、トリプトファナーゼの
分画法に関するものであり、さらに詳しくは、トリプト
ファナーゼを、簡便に且つ高い純度および回収率で分画
する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】トリプトファナーゼ［tryptophanase
（Ｅ.Ｃ.４.１.９９.１）］は、ワイ・モリノ（Y. Mori
no）およびエズモンド・イー・スネル（Esmond E. Snel
l）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in
Enzymology）、第１７巻、439〜446頁（1970年）、ある
いはアイ・ベフバハニ−ネジャッド（I. Behbahani−Ne
jad）ら、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods
in Enzymology）、第１４２巻、414〜422頁（1987年）
等の文献に記載されているように、α，β−エリミネー
ション反応により、Ｌ-トリプトファンをインドール、
ピルビン酸、アンモニアに分解する酵素である。また、
エイチ・ナカザワ（H.Nakazawa）ら、アグリカルチュラ
ル・アンド・バイオロジカルケミストリー（Agricultur
al and Biological Chemistry）、第３６巻、2523〜252
8頁（1972年）に示されるように、逆反応によりインド
ール、ピルビン酸、アンモニアまたはインドール、Ｌ-
セリンから、Ｌ-トリプトファンを合成する際に使用さ
れる産業上有用な酵素でもある。大腸菌の菌体抽出液か
らトリプトファナーゼを分画する方法としては、以下に
述べる方法が知られている。 菌体抽出液をプロタミン硫酸で除核酸した後、硫酸
アンモニウム存在下、加熱処理し、硫酸アンモニウム塩
析後、結晶化を行う方法。（ワイ・モリノ（Y.Morino）
およびイー・イー・スネル（E.E. Snell）、メソッズ・
イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、
第１７巻、439〜446頁（1970年））、 菌体抽出液をプロタミン硫酸で除核酸後、硫酸アン
モニウム塩析、硫酸アンモニウム存在下、加熱処理、ア
フィニティークロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈
殿を行う方法、（アイ・ベフバハニ−ネジャッド（I. B
ehbahani−Nejad）ら、メソッズ・イン・エンザイモロ
ジー（Methods in Enzymology）、第１４２巻、414〜42
2頁（1987年））。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、微生物
菌体内からトリプトファナーゼを抽出・分画し、酵素反
応させてＬ-トリプトファンを工業的に生産する際に
は、安価に且つ簡便に、さらに効率的にトリプトファナ
ーゼを抽出、分画する必要がある。大腸菌の菌体抽出液
をカラムクロマトグラフィーで処理し、トリプトファナ
ーゼを精製することは、活性を向上させるためには十分
であるが、充填剤、カラム等の高価な資材を必要とする
ため、この方法を工業的に行うことはできない。本発明
は上記のような従来の課題を解決し、トリプトファナー
ゼを、簡便に且つ高い純度および回収率で分画する方法
を提供することを目的とするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意検討
の結果、上記のような従来の課題を解決することができ
た。すなわち本発明は、大腸菌の生産したトリプトファ
ナーゼを分画する方法において、該菌の菌体抽出液を少
なくとも硫酸アンモニウムの存在下、加熱処理すること
を特徴とする、トリプトファナーゼの分画法を提供する
ものである。

【０００５】以下に本発明をさらに詳細に説明する。ト
リプトファナーゼを生産する大腸菌の培養方法は、一般
的な方法でよく、特に制限するものではない。つまり、
培地としては通常の微生物の培養に用いられるものと同
様の炭素源、無機塩等を含む天然または合成培地を使用
することができる。例えば、炭素源としては、グルコー
ス、グリセロール、フラクトース、スクロース、糖蜜等
の種々の炭水化物が使用でき、また、窒素源としては、
トリプトン、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー、
カゼイン加水分解物等の天然有機窒素源を使用すること
ができる。天然有機窒素源の多くは窒素源とともに炭素
源にもなりうる。無機塩としては、例えばリン酸一水素
カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、塩化マ
ンガン等を使用することができる。また、培地には微生
物の生育に有用な他の栄養素（例えばビタミン類、アミ
ノ酸塩等）を添加してもよい。本発明で使用する大腸菌
は野生型であってもよいが、とくにトリプトファナーゼ
を産生するための構造遺伝子を含むプラスミドで形質転
換されたエシエリヒア・コリがさらに好ましい。そのよ
うな菌としては、エシエリヒア・コリ（Escherichia co
li）K-12 YK3004（FERM BP-1735）、同K-12 YK3005（FE
RM BP-1736）、同K-12 YK3006（FERM BP-1737）、同YK3
007（FERM BP-2803）、同YK3008（FERM P-11616）を挙
げることができる。

【０００６】さらに、トリプトファナーゼ生産菌のもつ
トリプトファナーゼを産生するための構造遺伝子が、少
なくともtrpＡ、trpＢ両遺伝子を発現させるプロモータ
ー機能を有するＤＮＡ断片、並びにこのプロモーター機
能をトリプトファンリプレッサーにより発現調節しうる
オペレーター機能をもつＤＮＡ断片を有するような酵素
生産菌である場合には、培地にはトリプトファンリプレ
ッサーによる抑制を解除するために、インドールアクリ
ル酸またはその塩を添加することができる。また、トリ
プトファナーゼを産生するための構造遺伝子が、トリプ
トファナーゼオペロン中のプロモーターおよびこのプロ
モーターを制御しうる調節遺伝子を含むＤＮＡ断片で発
現制御を受けるような酵素生産菌である場合には、培地
には、トリプトファナーゼプロモーターからの転写を誘
導させるために、Ｌ-またはＤＬ-トリプトファンを添加
することができる。

【０００７】インドールアクリル酸またはその塩、ある
いはＬ-またはＤＬ-トリプトファンは、培養の当初に添
加してもよく、または培養の途中で添加してもよい。途
中で添加する場合には、遅くとも微生物の対数増殖期の
末期までに添加することが好ましい。添加は一回に行っ
てもよく、あるいは複数回に分けて断続的あるいは連続
的に行うこともできる。インドールアクリル酸の塩とし
ては、例えばインドールアクリル酸ナトリウムのような
インドールアクリル酸のアルカリ金属塩等が挙げられ
る。インドールアクリル酸またはその塩の添加量は、厳
密には制限されるものではないが、一般には培地に対し
少なくとも２５μg／mlの最終濃度になるように添加す
ることができ、好ましくは８０〜４００μg／mlの範
囲、さらに好ましくは１００〜２００μg／mlの範囲の
最終濃度となるように添加するのがよい。ここで「最終
濃度」とは、培養終了時までに培地に添加したインドー
ルアクリル酸またはその塩の添加量の合計の全液量に対
する割合である。培地中に添加するＬ-またはＤＬ-トリ
プトファンの濃度は厳密に制限されるものではないが、
好ましくは０.０５〜２％（W/V）さらに好ましくは０.
１〜０.５％（W/V）の濃度がよい。

【０００８】さらに本発明方法において、トリプトファ
ナーゼを抽出する場合においては、炭素源の少なくとも
一部としてグルコースを使用することが好ましく、その
使用量は一般に、インドールアクリル酸またはその塩を
添加する場合には、それらに対して１０〜６００倍モ
ル、好ましくは５０〜４００倍モル、さらに好ましくは
１００〜３００倍モルの範囲が適当である。Ｌ-または
ＤＬ−トリプトファンを添加する場合には、グルコース
をその濃度が０.０１〜０.３％（W/V）、好ましくは０.
０１〜０.２５％（W/V）、さらに好ましくは０.０３〜
０.２％（W/V）の範囲内に維持されるように、連続的ま
たは間欠的に該培地に添加しつつ行うのが適当である。
培養時間はトリプトファナーゼ生産菌の種類、培養条件
等により異なるが、インドールアクリル酸またはその塩
あるいはＬ-またはＤＬ-トリプトファンを培養の当初に
添加して培養を行う場合にも、あるいはＬ-またはＤＬ-
トリプトファンを培養の途中で添加して培養する場合に
も、通常約１〜１２０時間程度の培養時間でよい。ま
た、培養温度は、通常約２０〜５０℃の範囲がよく、培
地のpＨは一般に５〜９の範囲、好ましくは約６〜８の
範囲に調節するのが好適である。さらに、培養は振盪ま
たは通気撹拌等の好気的条件下に行うのが好ましい。こ
のように培養した菌体から、トリプトファナーゼを含有
する菌体抽出液を調製する方法としては、機械的破壊、
超音波破壊等の公知の方法が挙げられるが、先に我々の
提案したグラム陰性菌の培養途中および／または培養終
了後に、該菌をグリシンと接触させることにより、酵素
を菌体外に溶出させることを特徴とする、酵素の分離方
法（特願平2-246164号）が工業的に大量処理にむく方法
として好適に用いることができる。

【０００９】このようにして得られた菌体抽出液に添加
する硫酸アンモニウムの量としては、菌体抽出液１lあ
たり、通常１０〜２００g、好ましくは、５０〜１８０g
がよい。加熱処理温度は、３０〜６０℃、好ましくは４
０〜５５℃で行うのがよい。pＨは、４〜９、好ましく
は６〜８.５がよい。処理時間は、菌体抽出液の蛋白質
濃度、硫酸アンモニウム濃度、液量、処理温度等により
異なるが、通常５分〜１０時間、好ましくは５分〜８時
間、さらに好ましくは５分〜７時間がよい。加熱処理
は、静置または撹拌条件下のいずれで行ってもよく、両
条件にあまり大きな差はないが、撹拌しながら行うのが
加熱の均一性を保つうえで好適である。硫酸アンモニウ
ム存在下、加熱処理を行う際、トリプトファナーゼが要
求する補酵素であるピリドキサール-5′-リン酸、緩衝
液成分であるリン酸塩、トリス等を必要あらば添加する
こともできる。このようにして加熱処理した菌体抽出液
は、遠心分離、濾別等の手段で、変性蛋白質を除去する
ことにより、清澄且つ比活性の向上したトリプトファナ
ーゼ含有液を得ることができる。さらに、トリプトファ
ナーゼをイオン交換、ゲル濾過、ヒドロキシアパタイ
ト、疎水性樹脂等の各種クロマトグラフィー等の公知の
方法によりさらに精製することができる。

【００１０】

【実施例】以下、実施例により本発明を説明する。参考例１ 下記表１に示す組成の培地１００mlを、５００ml容三角
フラスコに分注し、１２０℃で１５分間加熱滅菌したも
のに、アンピシリンおよびグルコースをそれぞれ終濃度
５０μg／mlおよび０.５％（W/V）となるように添加
し、これにエシエリヒア・コリ（Escherichia coli）K-
12 YK3004（FERM BP-1735）を１白金耳植菌し、３７℃
で１３時間振盪培養した。

【００１１】

【表１】

【００１２】続いて、下記表２の培地１.５lを、３l容
ジャーファーメンター容器に入れ、さらにグルコースお
よびＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏがそれぞれ終濃度１％（W/V）お
よび５０mg／lとなるように添加し、これに上記の培養
によって得られた培養物３０mlを接種し、通気撹拌培養
により、３７℃、通気量１vvm、回転１０００rpm、pＨ
７.２（２８％アンモニア水で調整）に調節しながら培
養を行った。培養液の濁度（ＯＤ_660nm）が１５前後に
達したところで、ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂ＯおよびＦeＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏをそれぞれ終濃度４００mg／lおよび１００mg／l
となるように添加した。また、培養液中の溶存酸素濃度
を溶存酸素電極にて測定し、グルコース濃度がゼロにな
り、培養液の溶存酸素値が上昇を始めた時点で、グルコ
ースを１％となるように添加した。

【００１３】

【表２】

【００１４】培養を継続し、培養液の濁度（Ｏ
Ｄ_660nm）の増加が観察されなくなった時点で、培養を
終了させ、菌体を遠心分離により回収した。得られた菌
体６０g（湿重量）を脱イオン水に懸濁し、pＨを８とし
（２８％アンモニア水で調整）、全量を脱イオン水で１
lとした。この懸濁液を３l容ジャーファーメンターに移
し、グリシンおよびリゾチームを、それぞれ１０g／lお
よび０.５g／lとなるように添加、溶解し、３００rpmの
撹拌下、３７℃、１０時間、無通気でトリプトファナー
ゼを抽出した。抽出終了後、遠心分離し、抽出残渣を除
去した上清液（菌体抽出液）について、トリプトファナ
ーゼ活性を測定した。すなわち、あらかじめ３７℃に保
温しておいた反応液（４０μＭの濃度でＬ-トリプトフ
ァンを含有する１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、pＨ
７.８）０.９mlに、希釈液（２００μＭの濃度でピリド
キサール-5′-リン酸を含有する１００ｍＭ リン酸カリ
ウム緩衝液、pＨ７.８）で適当に希釈した菌体抽出液
０.１mlを投入し、３７℃で１５分間反応を行わせた
後、５Ｎ ＮaＯＨ０.１mlを添加し反応を停止した。こ
の液に、トルエン４mlを加え、Ｌ-トリプトファンから
生じたインドールを抽出した。続いて、トルエン抽出物
１mlに、改変エーリッヒ試薬（p−ジメチルアミノベン
ズアルデヒド１.８gおよび濃塩酸１８mlをエタノールに
溶解し１００mlにしたもの）３mlを加え、混合し、室温
で放置し、エタノールをブランクとして５４０ｎｍの吸
光度を測定し、生成したインドールを定量した。なお、
トリプトファナーゼの活性は、３７℃で、１時間あた
り、１μモルのインドールがＬ-トリプトファンから生
成し得る酵素量を１ユニット（Ｕ）と定義する。また、
菌体抽出液中に含まれる蛋白質１mgあたりのトリプトフ
ァナーゼ活性（Ｕ）を比活性（Ｕ／mg）と定義する。該
菌体抽出液の比活性は、２３５Ｕ／mgであった。

【００１５】参考例２ 参考例１の表１に示す培地１００mlに、Ｌ−トリプトフ
ァンを終濃度０.０５％（W/V）添加したものを、５００
ml容三角フラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌処
理したものに５０％（W/V）グルコース溶液（１２０
℃、１５分間殺菌）を無菌的に１ml添加後、エシエリヒ
ア・コリ（Escherichia coli）YK3007（FERM BP-2803）
を植菌し、３７℃、２４時間振盪培養した。続いて、参
考例１の表２の培地１.５lに、Ｌ−トリプトファンの濃
度が１g／lとなるように添加し、これを３l容ジャーフ
ァーメンター容器に入れ、さらにグルコースおよびＦe
ＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏがそれぞれ終濃度０.１％（W/V）および
５０mg／lとなるように添加し、これに上記の培養によ
って得られた培養物３０mlを接種し、通気撹拌培養によ
り、３７℃、通気量１vvm、回転１０００rpm、pＨを７.
２（２８％アンモニア水で調整）に調節しながら２０時
間培養した。なお、グルコース濃度が、濃度上限の０.
１％（W/V）を越えないように、且つ０.０１％（W/V）
の下限を下回らないように、経時的に培養液中のグルコ
ース濃度を測定しながら、５０％（W/V）の加熱滅菌済
グルコース水溶液を無菌的に連続添加した。また、ＯＤ
₆₆₀１５前後でＭgＳＯ₄・７Ｈ₂ＯおよびＦeＳＯ₄・７Ｈ
₂Ｏをそれぞれ終濃度４００mg／lおよび１００mg／lと
なるように追添加した。培養終了後、菌体を遠心分離に
より回収し、これをグリシンを２０g／lの濃度で含有す
る５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（pＨ７.５）に、菌濃
度が培養終了時と同じになるように懸濁した。この懸濁
液を、別の３l容ジャーファーメンターに移し、３７
℃、２４時間、無通気、回転４００rpmで撹拌し、トリ
プトファナーゼを抽出した。抽出終了後、遠心分離によ
り菌体を除去した上清液（菌体抽出液）について、参考
例１と同じ方法で比活性を測定したところ、この菌体抽
出液の比活性は、２１６Ｕ／mgであった。

【００１６】実施例１ 参考例１で調製した菌体抽出液の１００mlを、３００ml
容三角フラスコに入れ、表３に示すような処理を行っ
た。続いて、これを遠心分離し、得られた上清の比活性
を参考例１と同様に測定した。なお、菌体抽出液に対し
て、硫酸アンモニウムの添加および加熱処理を全く行な
わなかったとき（無処理）の菌体抽出液中に含有される
全酵素量を１００％とし、処理後の全酵素量の相対値を
もって表示したものを回収率（％）とした。その結果を
表３に示す。

【００１７】

【表３】

【００１８】参考例１で調製した菌体抽出液中のトリプ
トファナーゼは、硫酸アンモニウム１００g／l、温度４
５〜５５℃、１５〜６０分間の加熱処理により、回収率
は８０％以上、比活性は１.２〜１.７倍に分画された。
一方、硫酸アンモニウム無添加時の加熱処理では、比活
性、回収率ともに低下した。また硫酸アンモニウムを添
加しても、加熱温度が低い（１０℃および３７℃）と、
回収率は高いものの比活性の上昇は見られなかった。以
上のことから、硫酸アンモニウムの添加と加熱とが同時
に行われることが必要であることが判る。

【００１９】実施例２ 参考例２で調製した菌体抽出液０.７５lに、硫酸アンモ
ニウムを１００g／lの濃度となるように添加し、２l容
ジャーファーメンターにて無通気、回転２００rpmで撹
拌しながら４５℃で２時間加熱処理を行った。終了後、
遠心分離で変性蛋白質を除去した上清液の比活性および
回収率を測定したところ、３６７Ｕ／mgおよび９８％で
あり、比活性は約１.７倍上昇していた。

【００２０】

【発明の効果】本発明によって、トリプトファナーゼを
生産する大腸菌の菌体から、該酵素を、簡便に、且つ高
い純度および回収率で分画することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 大腸菌の生産したトリプトファナーゼを
   分画する方法において、該菌の菌体抽出液を少なくとも
   硫酸アンモニウムの存在下、加熱処理することを特徴と
   する、トリプトファナーゼの分画法。