JPH0586959B2

JPH0586959B2 -

Info

Publication number: JPH0586959B2
Application number: JP61115639A
Authority: JP
Inventors: Tatsuo Haishi; Masatoshi Inukai; Keiko Shimizu; Fujio Isono; Yoshiaki Sakaida; Takeshi Kinoshita
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1986-05-20
Filing date: 1986-05-20
Publication date: 1993-12-14
Also published as: JPS63211295A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新抗生物質ムレイドマイシン
（Mureidomycin）ＡおよびＣ、その製造法およ
びそれを有効成分とする抗菌剤に関するものであ
る。本発明者らは、土壊から分離したストレプト
ミセス属に属するSANK60486株が、主としてグ
ラム陰性細菌特にシユウドモナススペシーズ
（Pseudomonas sp.）に対して有効な新抗生物質
ムレイドマイシンＡおよびＣを生産することを見
出した。本発明の抗生物質ムレイドマイシンＡおよびＣ
はその諸性状より新規抗生物質と同定された。抗生物質ムレイドマイシンＡおよびＣはグラム
陰性細菌、特にシユウドモナススペシーズに対
して強い抗菌力を示すことから、ヒトおよび動物
のこれらの細菌に起因する疾病の予防および治療
に用いられる。抗菌物質ムレイドマイシンＡおよびＣを生産す
るSANK60486株の菌学的性状は次の通りであ
る。１形態学的特徴一般的に基生菌糸は寒天培地上で分岐してよく
伸長し気菌糸は単純分岐である。胞子鎖の形態は
多くのものは直〜曲線状を示す。１胞子鎖上に形
成される胞子数は多くの場合、約10〜50個または
それ以上が観察される。胞子の形は楕円状であ
り、その大きさは0.5〜0.8μm×0.7〜1.1μmであ
り、その表面は平滑状を示す。また気菌糸の車軸
分岐、菌核、胞子のうなどの特殊器管は観察され
なかつた。２各種培養基上の諸性質各種培養基上で28℃、14日間培養後の性状は第
１表に示す通りである。色調の表示は日本色彩研
究所版“標準色票”のカラーチツプ・ナンバーを
表わす。

【表】

【表】可溶性色素
３生理学的性質 SANK 60486株の生理学的性質は第２表に示
す通りである。

【表】

【表】またプリドハム・ゴトリーブ寒天培地（ISP
９）を使用して、28℃、14日間培養後に観察した
SANK 60486株の炭素源の資化性は第３表に示
す通りである。

【表】＋：利用する、−：利用しない
４菌体成分について SANK 60486株の細胞壁はビー・ベツカーら
の方法［B.Becker et al.、アプライドマイクロ
バイオロジー（Applied Microbiology）、12巻、
421〜423頁、1964年］に従い検討した結果、Ｌ，
Ｌ−ジアミノピメリン酸およびグリシンが検出さ
れたことから、フラビドレンスSANK 60486
（Streptomyces flavidovirens SANK 60486）
（微工研菌寄第8636号）と同定された。なお、SANK 60486株の同定は、ISP［ジ・イ
ンターナシヨナル・スプレプトミセス・プロジエ
クト（The International Streptomyces
Project）］基準、バージエーズ・マニユアル
（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology）第８版、エス・エイ・ワツクス
マン（S.A.Waksman）著［ジ・アクチノミセテ
ス（The Actinomycetes）］および放線菌に関
する最近の文献によつて行つた。以上、抗生物質ムレイドマイシンＡおよびＣの
生産菌について説明したが、放射菌の諸性質は一
定したものでなく、自然的、人工的に容易に変化
することは周知のとおりであり、本発明で使用し
うる菌株はストレプトミセス属に属する、抗生物
質ムレイドマイシンＡおよびＣを生産するすべて
の菌株を包含するものである。本発明における培養は一般放線菌における培養
方法に準じて行われ、液体培地中での振盪培養あ
るいは通気攪拌培養によるのが好ましい。培地成
分としては、たとえば炭素源としてブドウ糖、マ
ルトース、シユクロース、マンニツト、糖蜜、グ
リセリン、デキストリン、澱粉、大豆油、綿実油
などが、窒素源として大豆粉、落花生粉、綿実
粉、フアーマミン、魚粉、コーン・スチープ・リ
カー、ペプトン、肉エキス、イースト、イースト
エキス、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウム、硫酸ア
ンモニウムなどが、また、無機塩として食塩、燐
酸塩、炭酸カルシウム、微量金属塩などが必要に
応じて適宜添加される。液体培養に際してはシリ
コン油、植物油、界面活性剤等が消泡剤として適
宜使用される。培地のHzは中性付近、培養温度は20℃から37
℃、特に22℃前後が好ましい。培養の経過に伴つて生産される抗生物質ムレイ
ドマイシンＡおよびＣの力価の経時変化は、シユ
ウドモナス・エルギノーサSANK70579を被検菌
としたペーパーデイスク（東洋科学産業(株)製、直
径８mm、thik）検定法により測定される。通常72
〜96時間の培養で抗生物質ムレイドマイシンＡお
よびＣの生産量は最高値に達する。主として培養液中の液体部分に存在する抗生物
質ムレイドマイシンＡおよびＣは、培養終了後、
菌体その他の固形部分をけいそう土等を濾過助剤
とする濾過操作、あるいは遠心分離によつて除去
し、その濾液または上清中から抽出、精製するこ
とによつて得られる。抗生物質ムレイドマイシンＡおよびＣはその物
理学的性状を利用することによつて、分離、採
取、精製される。すなわち、溶媒抽出；イオン交
換、例えばダウエツクスSBR−Ｐ（ダウケミカル
社製）などの陰イオン交換樹脂、ダウエツクス
50W（ダウケミカル社製）、IRC−50、CG−50な
どの陽イオン交換樹脂；吸着剤として活性炭、ア
ンバーライトXAD−２、XAD−４、XAD−７
等（ローム・アンド・ハース社製）やダイヤイオ
ンHP10、HP20、CHP20P、HP50（三菱化成工
業(株)製）等による非イオン性吸着樹脂等の樹脂、
シリカゲル、アルミナ等による処理も適宜使用さ
れる。またアビセル（旭化成工業(株)製）などのセ
ルロース、セフアデツクスLH−20（フアルマシ
ア社製）などを用いた分配カラムクロマトグラフ
イー：セフアデツクスＧ−10、Ｇ−25、Ｇ−50、
Ｇ−100（フアスマシア社製）やトヨパール（生化
学工業社製）などを用いたゲル濾過法；また結晶
化；再結晶等の手段も有効でありこれらの手段を
単独または任意の順序で組み合わせ、また反復し
て用いて分離、採取、精製を行う。抗生物質ムレイドマイシンＡおよびＣはまた培
養条件によつては培養液中の菌体部分に存在す
る。この場合は、アルコール類、アセトン等の親
水性有機溶媒によつて抽出し、抽出液より溶媒を
除去し、次いで水溶液としたのち、培養濾液から
と同様の方法で抽出精製することができる。このようにして得られた抗生物質ムレイドマイ
シンＡおよびＣは下記のような理化学的および生
物学的性状を有する。１抗生物質ムレイドマイシンＡ。 (1) 物質の性状：両性水溶性、白色粉末。 (2) 比旋光度［α］²⁵ _D＝40.9゜（ｃ 0.69、50％
メタノール） (3) 元素分析値（％）：Ｃ、49.73；Ｈ、5.65；
Ｎ、12.08；Ｓ、3.40 (4) 分子量：840（高分解能質量分析FAB−
MASS：841.31798（QM＋）） (5) 分子式：C₃₈H₄₈N₈O₁₂S₁ (6) 酸加水分解：ウラシル、ｍ−チロシン、２−アミノ−３
−メチルアミノ酪酸 (7) 紫外線吸収スパクトル：λ_naxnm（Ｅ１％ 1cm）中性、260nm（348）；0.01 NHCl、258nm
（358）；0.01NNaOH、240nm（499）、265nm
（330sh）および295nm（78sh）第１図ＡおよびＢに示す通りである。 (8) 赤外線吸収スペクトル：ν^KBr _naxcm^-1 KBrデイスクで測定した赤外線吸収スペ
クトルは第２図に示す通りである。 (9) 核磁気共鳴スペクトル（δ：ppm）ジメチルスルフオキシド中、外部基準に
TMS（テトラメチルシラン）を使用して測定
した核磁気共鳴スペクトル（400 ＭHz）は第
３図に示す通りである（配座異性体を含む）。 (10) 溶解性：水、メタノールに可溶、アセトンに難溶、
酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼンに不
溶。 (11) 呈色反応：ニンヒドリン、硫酸、ヨード、塩化第二
鉄、バイエル反応に陽性。 (12) 薄層クロマトグラフイー： Rf値；0.36 吸着剤；シリカゲルプレート（メルク社製
Kieselgel 60 F₂₅₄）展開溶媒；ｎ−ブタノール：ｎ−プロパノ
ール：水（４：２：１） (13) 高速液体クロマトグラフイー：カラム；アクアシルSS372−Ｎ（センシユ
ウ科学社製）展開溶媒；クロロホルム：ｉ−プロパノー
ル：メタノール：水（200：100：100：40）保持時間；3.92分 (14) 抗菌力：一般グラム陽性、グラム陰性細菌に対する
抗生物質ムレイドマイシンＡの最小阻止濃度
（MIC）はミユーラーヒントン寒天培地（デ
イフコ社製）を用いた寒天培地希釈法によつ
て測定した。その結果は第４表に示すとおり
である。 (15) 毒性マウスに400mg／Kgを静脈内投与したが毒
性は認められなかつた。 (16) 構造式

【化】２抗生物質ムレイドマイシンＣ。 (1) 物質の性状：両性水溶性、白色粉末。 (2) 比旋光度［α］²⁵ _D＝＋16.7゜（ｃ 0.57、50
％メタノール水） (3) 元素分析値（％）Ｃ、49.44；Ｈ、5.50；
Ｎ、12.53；Ｓ、3.09 (4) 分子量：897（高分解能質量分析FAB−
MASS：898.33687（QM＋） (5) 分子式：C₄₀H₅₁N₉O₁₃S₁ (6) 酸加水分解：ウラシル、グリシン、ｍ−チロシン、２−
アミノ−３−メチルアミノ酪酸 (7) 紫外線吸収スペクトル：λ_naxnm（Ｅ１％ 1cm）中性、258nm（292）；0.01NHCl、259nm
（312）；0.01NNaOH、240nm（444）、265nm
（276sh）および295nm（72sh）第４図ＡおよびＢに示す通りである。 (8) 赤外線吸収スペクトル：ν^KBr _naxcm^-1 KBrデイスクで測定した赤外線吸収スペ
クトルは第５図に示す通りである。 (9) 核磁気共鳴スペクトル（δ：ppm）重水中、外部基準にTMS（テトラメチルシ
ラン）を使用して測定した核磁気共鳴スペク
トル（270MHz）は第６図に示す通りである
（配座異性体を含む）。 (10) 溶解性：水、メタノールに可溶、アセトンに難溶、
酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼンに不
溶。 (11) 呈色反応：ニンヒドリン、硫酸、ヨード、塩化第二
鉄、バイエル反応に陽性。 (11) 薄層クロマトグラフイー： Rf値；0.29 吸着剤；シリカゲルプレート（メルク社製
Kieselgel 60 F₂₅₄）展開溶媒；ｎ−ブタノール：ｎ−プロパノ
ール：水（４：２：１） (13) 高速液体クロマトグラフイー：カラム；アクアシルSS372−Ｎ（センシユ
ウ科学社製）展開溶媒；クロロホルム：ｉ−プロパノー
ル：メタノール：水（200：100：100：40）保持時間；6.29分 (14) 抗菌力：一般グラム陽性、グラム陰性細菌に対する
抗生物質ムレイドマイシンＣの最小阻止濃度
（MIC）はミユーラーヒントン寒天培地（デ
イフコ社製）を用いた寒天培地希釈法によつ
て測定した。その結果は第４表に示すとおり
である。 (15) 毒性マウスに400mg／Kgを静脈内投与したが毒
性は認められなかつた。 (16) 構造式

【化】

【表】

【表】以上から、抗生物質ムレイドマイシンＡおよび
Ｃはグラム陰性細菌、特にシユウドモナス属細菌
に有効である。以上から、抗生物質ムレイドマイシンＡおよび
Ｃは各種細菌感染症疾患を対照とする抗菌剤とし
て使用される。その投与形態としては皮下注射、
静脈内注射、筋肉注射、坐薬などによる非経口投
与法あるいは錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤な
どによる経口投与法があげられる。投与量は対象
症患、投与経路および投与回数などによつて異な
るが、例えば成人に対して通常は１日0.1ｇ〜10
ｇを１回または数回に分けて投与するのが好まし
い。次に実施例、製剤例をあげて本発明を具体的に
説明する。実施例１スプレプトミセス・フラビドビレンス
SANK60486株をＡ培地（グルコース：３％、生
イースト：１％、大豆粉：３％、CaCO₃：0.4％、
MgSO₄・7H₂O：0.2％、ニツサン・デイスフオ
ームCB−442：0.01％、滅菌前PH7.2）80ml含む
500ml容三角フラスコに一白金耳付接種し、
220rpmの回転振盪培養機により22℃で84時間培
養した。この培養液25mlをＡ培地500mlを含む２
容三角フラスコ４本に接種して220rpmの回転
振盪培養機により22℃、24時間培養した。この培
養液750mlをＡ培地15を含む30容ジヤーフア
ーメンター２基に接種し、22℃、回転数；
150rpm、通気量15／分で96時間通気攪拌培養
した。この培養液30に濾過助剤としてセライト
545を加えて濾過すると、濾液30が得られた。
この濾液を３のアンバーライトXAD−２カラ
ムに吸着させ、15の精製水および12の15％メ
タノール水で順次洗浄した後、15の40％メタノ
ール水にて溶出した。得られた活性画分を減圧下
でメタノールを留去後、凍結乾燥すると粗粉末
17.4ｇが得られた。得られた粗粉末17ｇを３の
精製水に溶解しアンバーライトCG−50（H⁺）、
800mlのカラムを通過させ有効物質を吸着させた。
このカラムから有効物質を0.5Mのアンモニア水
で溶出した。活性画分3.5を集め、減圧下1.0
に濃縮した。濃縮液1.0を0.1Mの炭酸水素アン
モニウムで平衡化した400mlのDE−52（ワツトマ
ン社製）に通過吸着させ、0.2Mの炭酸水素アン
モニウムで溶出した。活性画分800mlを集め、ダ
イヤイオンHP20（三菱化成工業(株)社製）200mlに
吸着後50％アセトン500mlで有効物質を溶出した。
活性画分を濃縮し凍結乾燥することにより抗生物
質ムレイドマイシンＡおよびＣを含む粗粉末1.6
ｇを得た。この粗粉末1.5ｇを200mlの精製水に溶
解し0.05Mの炭酸水素アンモニウムで平衡化した
500mlのDE−52に吸着させ、0.05Mの同緩衝液で
洗浄後、0.1Mの同緩衝液で溶出し20mlごとに分
画した。活性画分としてフラクシヨン80から130
を集め、HP20カラムにて吸着、脱塩することに
より脱塩し、減圧濃縮、凍結乾燥し、抗生物質ム
レイドマイシンＡおよびＣを含む部分精製粉末
309mgを得た。部分精製粉末300mgを100ｇのシリ
カゲルカラムにかけ、ｎ−ブタノール：ｎ−プロ
パノール：水（８：４：１）より成る混合溶媒で
展開し、20mlごとに分画した。活性は２つのピー
クとして現われた。フラクシヨン13から36を集め
水を加えて濃縮後、凍結乾燥することにより抗生
物質ムレイドマイシンＡを含む粗粉末33mgを得
た。また同様にしてフラクシヨン56から75より抗
生物質ムレイドマイシンＣを含む粗粉末66mgを得
た。実施例２実施例１で得た抗生物質ムレイドマイシンＡを
含む粗粉末のうち30mgを30％メタノールで作成し
た1000mlのトヨパールカラムに吸着させ同溶媒で
展開し、10mlずつに分画した。活性画分としてフ
ラクシヨン50から70を集め、10mlのCG−50（H⁺
型）に吸着後、0.5Mのアンモニア水にて溶出し
た。活性画分を集め濃縮後、凍結乾燥することに
より抗生物質ムレイドマイシンA24mgを得た。実施例３実施例１で得た抗生物質ムレイドマイシンＣを
含む粗粉末のうち60mgを30％メタノールで作製し
た1000mlのトヨパールカラムに吸着させ同溶媒で
展開し、10mlずつ分画した。活性画分としてフラ
クシヨン65から85を集め、10mlのCG−50（H⁺型）
に吸着後、0.5Mのアンモニア水にて溶出した。
活性画分を集め濃縮後、凍結乾燥することにより
抗生物質ムレイドマイシンC49mgを得た。次に製剤例について述べる。製剤例１経口用カプセル剤ムレイドマイシンＡ 100mg 乳糖 100 トウモロコシ澱粉 148.5 ステアリン酸マグネシウム 1.5 350mg 上記処方の粉末を混合し、30メツシユのふるい
を通した後、この粉末350mgを２号ゼラチンカプ
セルに入れ、カプセル剤とした。製造例２経口用カプセル剤ムレイドマイシンＣ 100mg 乳糖 100 トウモロコシ澱粉 148.5 ステアリン酸マグネシウム 1.5 350mg 上記処方の粉末を混合し、30メツシユのふるい
を通した後、この粉末350mgを２号ゼラチンカプ
セルに入れ、カプセル剤とした。製剤例３注射剤ムレイドマイシンA1.0ｇを１／15M燐酸緩衝
液（PH6.9）5.0mlに加えて溶解し、次いで５mlア
ンプルに封入し、常法に従つて滅菌し注射剤とし
た。製剤例４注射剤ムレイドマイシンC1.0ｇを１／15M燐酸緩衝液
（PH6.9）5.0mlに加えて溶解し、次いで５mlアン
プルに封入し、常法に従つて滅菌し注射剤とし
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗生物質ムレイドマイシンＡの紫外線
吸収スペクトルを示し、第２図は同物質の赤外線
吸収スペクトルを示し、第３図は同物質の核磁気
共鳴吸収スペクトルを示す。第４図は抗生物質ム
レイドマイシンＣの紫外線吸収スペクトルを示
し、第５図は同物質の赤外線吸収スペクトルを示
し、第６図は同物質の核磁気共鳴吸収スペクトル
を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１以下の構造式を有する抗生物質ムレイドマイ
シンＡ。【化】２以下の構造式を有する抗生物質ムレイドマイ
シンＣ。【化】３スプレプトミセス属に属する抗生物質ムレイ
ドマイシンＡおよびＣ生産菌を培養し、その培養
液より抗生物質ムレイドマイシンＡおよび抗生物
質ムレイドマイシンＣを採取することを特徴とす
る抗生物質ムレイドマイシンＡおよびＣの製造
法。４ストレプトミセス属に属する抗生物質ムレイ
ドマイシンＡおよびＣ生産菌がストレプトミセ
ス・フラビドレンスSANK60486株
（Streptomyces flavidovirens SANK 60486）
（微工研菌寄第8636号）である特許請求の範囲第
３項記載の製造法。５抗生物質ムレイドマイシンおよび／または抗
生物質ムレイドマイシンＣを有効成分とする抗菌
剤。