JPH0586960B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新抗生物質ムレイドマイシン
（Mureidomycin）ＢおよびＤ、その製造法およ
びそれを有効成分とする抗菌剤に関するものであ
る。本発明者らは、土壌から分離したストレプト
ミセス属に属するSANK60486株が、主としてグ
ラム陰性細菌特にシユウドモナス スペシーズ
（Pseudomonas sp.）に対して有効な新抗生物質
ムレイドマイシンＢおよびＤを生産することを見
出した。 本発明の抗生物質ムレイドマイシンＢおよびＤ
はその諸性状より新規抗生物質と同定された。 抗生物質ムレイドマイシンＢおよびＤはグラム
陰性細菌、特にシユウドモナス スペシーズに対
して強い抗菌力を示すことから、ヒトおよび動物
のこれらの細菌に起因する疾病の予防および治療
に用いられる。 抗菌物質ムレイドマイシンＢおよびＤを生産す
るSANK60486株の菌学的性状は次の通りであ
る。 １ 形態学的特徴 一般的に基生菌糸は寒天培地上で分岐してよく
伸長し気菌糸は単純分岐である。胞子鎖の形態は
多くのものは直〜曲線状を示す。１胞子鎖上に形
成される胞子数は多くの場合、約10〜50個または
それ以上が観察される。胞子の形は楕円状であ
り、その大きさは0.5〜0.8μm×0.7〜1.1μmであ
り、その表面は平滑状を示す。また気菌糸の車軸
分岐、菌核、胞子のうなどの特殊器管は観察され
なかつた。 ２ 各種培養基上の諸性質 各種培養基上で28℃、14日間培養後の性状は第
１表に示す通りである。色調の表示は日本色彩研
究所版“標準色票”のカラーチツプ・ナンバーを
表わす。

【表】

【表】 可溶性色素
３ 生理学的性質 SANK60486株の生理学的性質は第２表に示す
通りである。

【表】

【表】 またプリドハム・ゴトリーブ寒天培地（ISP
９）を使用して、28℃、14日間培養後に観察した
SANK 60486株の炭素源の資化性は第３表に示
す通りである。

【表】 ＋：利用する、−：利用しない
４ 菌体成分について SANK 60486株の細胞壁はビー・ベツカーら
の方法［B.Becker et al.、アプライドマイクロ
バイオロジー（Applied Microbiology）、12巻、
421〜423頁、1964年］に従い検討した結果、Ｌ，
Ｌ−ジアミノピメリン酸およびグリシンが検出さ
れたことから、ストレプトマイセス・フラビドレ
ンスSANK 60486（Streptomyces flavidovirens
SANK 60486）（微工研条寄第1347号、FERM・
BP−1347））と同定された。 なお、SANK 60486株の同定は、ISP［ジ・イ
ンターナシヨナル・ストレプトミセス・プロジエ
クト（The International Streptomyces
Project）］基準、バージエーズ・マニユアル
（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology）第８版、エス・エイ・ワツクス
マン（S.A.Waksman）著［ジ・アクチノミセテ
ス（The Actinomycetes）］および放線菌に関
する最近の文献によつて行つた。 以上、抗生物質ムレイドマイシンＢおよびＤの
生産菌について説明したが、放射菌の諸性質は一
定したものでなく、自然的、人工的に容易に変化
することは周知のとおりであり、本発明で使用し
うる菌株はストレプトミセス属に属する、抗生物
質ムレイドマイシンＢおよびＤを生産するすべて
の菌株を包含するものである。 本発明における培養は一般放線菌における培養
方法に準じて行われ、液体培地中での振盪培養あ
るいは通気攪拌培養によるのが好ましい。培地成
分としては、たとえば炭素源としてブドウ糖、マ
ルトース、シユクロース、マンニツト、糖蜜、グ
リセリン、デキストリン、澱粉、大豆油、綿実油
などが、窒素源として大豆粉、落花生粉、綿実
粉、フアーマミン、魚粉、コーン・スチープ・リ
カー、ペプトン、肉エキス、イースト、イースト
エキス、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウム、硫酸ア
ンモニウムなどが、また、無機塩として食塩、燐
酸塩、炭酸カルシウム、微量金属塩などが必要に
応じて適宜添加される。液体培養に際してはシリ
コン油、植物油、界面活性剤等が消泡剤として適
宜使用される。 培地のHzは中性付近、培養温度は20℃から37
℃、特に22℃前後が好ましい。 培養の経過に伴つて生産される抗生物質ムレイ
ドマイシンＢおよびＤの力価の経時変化は、シユ
ウドモナス・エルギノーサSANK70579を被検菌
としたペーパーデイスク（東洋科学産業(株)製、直
径８mm、thik）検定法により測定される。通常72
〜96時間の培養で抗生物質ムレイドマイシンＢお
よびＤの生産量は最高値に達する。 主として培養液中の液体部分に存在する抗生物
質ムレイドマイシンＢおよびＤは、培養終了後、
菌体その他の固形部分をけいそう土等を濾過助剤
とする濾過操作、あるいは遠心分離によつて除去
し、その濾液または上清中から抽出、精製するこ
とによつて得られる。 抗生物質ムレイドマイシンＢおよびＤはその物
理学的性状を利用することによつて、分離、採
取、精製される。すなわち、溶媒抽出法；イオン
交換法、例えばダウエツクスSBR−Ｐ（ダウケミ
カル社製）などの陰イオン交換樹脂、ダウエツク
ス50W（ダウケミカル社製）、IRC−50、CG−50
などの陽イオン交換樹脂；吸着法、例えば吸着剤
として活性炭、アンバーライトXAD−２、XAD
−４、XAD−７（ローム・アンド・ハース社製）
等やダイヤイオンHP10、HP20、CHP20P、
HP50（三菱化成工業(株)製）等による非イオン性
吸着樹脂等の樹脂、シリカゲル、アルミナ等；に
よる方法も適宜使用される。またアビセル（旭化
成工業(株)製）などのセルロース、セフアデツクス
LH−20（フアルマシア社製）などを用いた分配
カラムクロマトグラフイー；セフアデツクスＧ−
10、Ｇ−25、Ｇ−50、Ｇ−100（フアスマシア社
製）やトヨパール（生化学工業社製）などを用い
たゲル濾過法；また結晶化法；再結晶法等の手段
も有効でありこれらの手段を単独または任意の順
序で組み合わせ、また反復して用いて分離、採
取、精製を行う。 抗生物質ムレイドマイシンＢおよびＤはまた培
養条件によつては培養液中の菌体部分に存在す
る。この場合は、アルコール類、アセトン等の親
水性有機溶媒によつて抽出し、抽出液より溶媒を
除去し、次いで水溶液としたのち、培養濾液から
と同様の方法で抽出精製することができる。 このようにして得られた抗生物質ムレイドマイ
シンＢおよびＤは下記のような理化学的および生
物学的性状を有する。 １ 抗生物質ムレイドマイシンＢ。 (1) 物質の性状：両性水溶性、白色粉末。 (2) 比旋光度［α］²³ _D＝−7゜（ｃ 0.35、50％メ
タノール） (3) 元素分析値（％）：Ｃ、50.67；Ｈ、6.36；
Ｎ、12.62；Ｓ、3.13（水和物として） (4) 分子量：842（高分解能質量分析FAB−
MASS：843.33289（QM＋）） (5) 分子式：C₃₈H₅₀N₈O₁₂S₁ (6) 酸加水分解： 塩酸酸性下、105℃で一夜加水分解し、ジ
ヒドロウラシル、ｍ−チロシン、２−アミノ
−３−メチルアミノ酪酸を得た。 (7) 紫外線吸収スパクトル：λ_naxnm（Ｅ１％ 1cm） 中性、255nm（194）；0.1 NHCl、255nm
（186）；0.1NNaOH、245nm（325）および
295nm（85sh） 第１図に示す通りである。 (8) 赤外線吸収スペクトル：ν^KBr _naxcm^-1 KBrデイスクで測定した赤外線吸収スペ
クトルは第２図に示す通りである。 (9) 核磁気共鳴スペクトル（δ：ppm） 重水中、外部基準にTMS（テトラメチルシ
ラン）を使用して測定した核磁気共鳴スペク
トル（270MHz）は第３図に示す通りである
（配座異性体を含む）。 (10) 溶解性： 水、メタノールに可溶、アセトンに難溶、
酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼンに不
溶。 (11) 呈色反応： ニンヒドリン、硫酸、ヨード、塩化第二
鉄、バイエル反応に陽性。 (12) 薄層クロマトグラフイー： Rf値；0.34 吸着剤；シリカゲルプレート（メルク社製
Kieselgel 60 F₂₅₄） 展開溶媒；ｎ−ブタノール：ｎ−プロパノ
ール：水（４：２：１） (13) 高速液体クロマトグラフイー： カラム；アクアシルSS372−Ｎ（センシユ
ウ科学社製） 展開溶媒；クロロホルム：ｉ−プロパノー
ル：メタノール：水（200：100：100：40） 流速；1.0ml／分 保持時間；3.94分 (14) 抗菌力： 一般グラム陽性、グラム陰性細菌に対する
抗生物質ムレイドマイシンＢの最小阻止濃度
（MIC）はミユーラーヒントン寒天培地
（Difco社製）を用いた寒天培地希釈法によ
つて測定した。その結果は第４表に示すとお
りである。 (15) 毒性 マウスに400mg／Kgを静脈内投与したが毒
性は認められなかつた。 (16) 構造式

【化】 ２ 抗生物質ムレイドマイシンＤ。 (1) 物質の性状：両性水溶性、白色粉末。 (2) 比旋光度［α］²³ _D＝−30゜（ｃ 0.52、50％
メタノール水） (3) 元素分析値（％）Ｃ、48.79；Ｈ、5.86；
Ｎ、12.42；Ｓ、3.26（水和物として） (4) 分子量：899（高分解能質量分析FAB−
MASS：900.35617（QM＋） (5) 分子式：C₄₀H₅₃N₉O₁₃S₁ (6) 酸加水分解： 塩下酸性下、105℃で一夜加水分解しジヒ
ドロウラシル、グリシン、ｍ−チロシン、２
−アミノ−３−Ｎ−メチルアミノ酪酸を得
た。 (7) 紫外線吸収スペクトル：λ_naxnm（Ｅ１％ 1cm） 中性、255nm（191）；0.1NHCl、255nm
（184）；0.1NNaOH、245nm（346）および
295nm（90sh） 第４図に示す通りである。 (8) 赤外線吸収スペクトル：ν^KBr _naxcm^-1 KBrデイスクで測定した赤外線吸収スペ
クトルは第５図に示す通りである。 (9) 核磁気共鳴スペクトル（δ：ppm） 重水中、外部基準にTMS（テトラメチルシ
ラン）を使用して測定した核磁気共鳴スペク
トル（270MHz）は第６図に示す通りである
（配座異性体を含む）。 (10) 溶解性： 水、メタノールに可溶、アセトンに難溶、
酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼンに不
溶。 (11) 呈色反応： ニンヒドリン、硫酸、ヨード、塩化第二
鉄、バイエル反応に陽性。 (11) 薄層クロマトグラフイー： Rf値；0.26 吸着剤；シリカゲルプレート（メルク社製
Kieselgel 60 F₂₅₄） 展開溶媒；ｎ−ブタノール：ｎ−プロパノ
ール：水（４：２：１） (13) 高速液体クロマトグラフイー： カラム：アクアシルSS372−Ｎ（センシユ
ウ科学社製） 展開溶媒；クロロホルム：ｉ−プロパノー
ル：メタノール：水（200：100：100：40） 流速；1.0ml／分 保持時間；7.24分 (14) 抗菌力： 一般グラム陽性、グラム陰性細菌に対する
抗生物質ムレイドマイシンＤの最小阻止濃度
（MIC）はミユーラーヒントン寒天培地
（Difco社製）を用いた寒天培地希釈法によ
つて測定した。その結果は第４表に示すとお
りである。 (15) 毒性 マウスに400mg／Kgを静脈内投与したが毒
性は認められなかつた。 (16) 構造式

【化】

【表】

【表】 以上から、抗生物質ムレイドマイシンＢおよび
Ｄはグラム陰性細菌、特にシユウドモナス属細菌
に有効である。 以上から、抗生物質ムレイドマイシンＢおよび
Ｄは各種細菌感染症疾患を対照とする抗菌剤とし
て使用される。その投与形態としては皮下注射、
静脈内注射、筋肉注射、坐薬などによる非経口投
与法あるいは錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤な
どによる経口投与法があげられる。投与量は対象
疾患、投与経路および投与回数などによつて異な
るが、例えば成人に対して通常は１日0.1ｇ〜10
ｇを１回または数回に分けて投与するのが好まし
い。 次に実施例、製剤例をあげて本発明を具体的に
説明する。 実施例 １ スプレプトミセス・フラビドビレンス
SANK60486株をＡ培地（グルコース、３％、生
イースト、１％；大豆粉、３％；CaCO₃、0.4
％；MgSO₄・7H₂O、0.2％；ニツサン・デイス
フオームCB−442、0.01％；滅菌前PH7.2）80ml含
む500ml容三角フラスコに一白金耳接種し、
220rpmの回転振盪培養機により22℃で84時間培
養した。この培養液25mlをＡ培地500mlを含む２
容三角フラスコ４本に接種して220rpmの回転
振盪培養機により22℃、24時間培養した。この培
養液750mlをＡ培地15を含む30容ジヤーフア
ーメンター２基に接種し、22℃、回転数；
150rpm、通気量；15／分で96時間通気攪拌培
養した。この培養液30に濾過助剤としてセライ
ト545を加えて濾過すると、濾液30が得られた。
この濾液を３のアンバーライトXAD−２カラ
ムに吸着させ、15の精製水および12の15％メ
タノール水で順次洗浄した後、15の40％メタノ
ール水にて溶出した。得られた活性画分を減圧下
でメタノールを留去後、凍結乾燥すると粗粉末
17.4ｇが得られた。得られた粗粉末17ｇを３の
精製水に溶解しアンバーライトCG−50（H⁺）、
800mlのカラムを通過させ有効物質を吸着させた。
このカラムから有効物質を0.5Mのアンモニア水
で溶出した。活性画分3.5を集め、減圧下1.0
に濃縮した。濃縮液1.0を0.1Mの炭酸水素アン
モニウムで平衡化した400mlのDE−52（ワツトマ
ン社製）に通過吸着させ、0.2Mの炭酸水素アン
モニウムで溶出した。活性画分800mlを集め、ダ
イヤイオンHP20（三菱化成工業(株)社製）200mlに
吸着後50％アセトン500mlで有効物質を溶出した。
活性画分を濃縮し凍結乾燥することにより抗生物
質ムレイドマイシンＢおよびＤを含む粗粉末1.6
ｇを得た。この粗粉末1.5ｇを200mlの精製水に溶
解し0.05Mの炭酸水素アンモニウムで平衡化した
500mlのDE−52に吸着させ、0.05Mの同緩衝液で
洗浄後、0.1M同緩衝液で溶出し20mlごとに分画
した。活性画分として、フラクシヨン25から60を
集め、HP20カラムにて吸着、脱塩することによ
り脱塩し、減圧濃縮、凍結乾燥し、抗生物質ムレ
イドマイシンＢおよびＤを含む部分精製粉末5.10
mgを得た。部分精製粉末500mgを100ｇのシリカゲ
ルカラムにかけ、ｎ−ブタノール：ｎ−プロパノ
ール：水（８：４：１）より成る混合溶媒で展開
し、20mlごとに分画した。活性は２つのピークと
して現われた。フラクシヨン37から55を集め水を
加えて濃縮後、凍結乾燥することにより抗生物質
ムレイドマイシンＢを含む粗粉末74mgを得た。ま
た同様にしてフラクシヨン76から110より抗生物
質ムレイドマイシンＤを含む粗粉末67.5mgを得
た。 実施例 ２ 実施例１で得た抗生物質ムレイドマイシンＢを
含む粗粉末のうち70mgを30％メタノールで作製し
た1000mlのトヨパールカラムに吸着させ同溶媒で
展開し、10mlずつに分画した。活性画分としてフ
ラクシヨン55から75を集め、10mlのCG−50（H⁺
型）に吸着後、0.5Mのアンモニア水にて溶出し
た。活性画分を集め濃縮後、凍結乾燥することに
より抗生物質ムレイドマイシンB45mgを得た。 実施例 ３ 実施例１で得た抗生物質ムレイドマイシンＤを
含む粗粉末のうち65mgを30％メタノールで作製し
た1000mlのトヨパールカラムに吸着させ同溶媒で
展開し、10mlずつ分画した。活性画分としてフラ
クシヨン65から85を集め、10mlのCG−50（H⁺型）
に吸着後、0.5Mのアンモニア水にて溶出した。
活性画分を集め濃縮後、凍結乾燥することにより
抗生物質ムレイドマイシンD40mgを得た。 次に製剤例について述べる。 製剤例 １ 経口用カプセル剤 ムレイドマイシンＢ 100mg 乳 糖 100 トウモロコシ澱粉 148.5 ステアリン酸マグネシウム 1.5 350mg 上記処方の粉末を混合し、30メツシユのふるい
を通した後、この粉末350mgを２号ゼラチンカプ
セルに入れ、カプセル剤とした。 製造例 ２ 経口用カプセル剤 ムレイドマイシンＤ 100mg 乳 糖 100 トウモロコシ澱粉 148.5 ステアリン酸マグネシウム 1.5 350mg 上記処方の粉末を混合し、30メツシユのふるい
を通した後、この粉末350mgを２号ゼラチンカプ
セルに入れ、カプセル剤とした。 製剤例 ３ 注射剤 ムレイドマイシンB1.0ｇを１／15M燐酸緩衝
液（PH6.9）5.0mlに加えて溶解し、次いで５mlア
ンプルに封入し、常法に従つて滅菌し注射剤とし
た。 製剤例 ４ 注射剤 ムレイドマイシンD1.0ｇを１／15M燐酸緩衝
液（PH6.9）5.0mlに加えて溶解し、次いで５mlア
ンプルに封入し、常法に従つて滅菌し注射剤とし
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗生物質ムレイドマイシンＢの紫外線
吸収スペクトルを示し、第２図は同物質の赤外線
吸収スペクトルを示し、第３図は同物質の核磁気
共鳴吸収スペクトルを示す。第４図は抗生物質ム
レイドマイシンＤの紫外線吸収スペクトルを示
し、第５図は同物質の赤外線吸収スペクトルを示
し、第６図は同物質の核磁気共鳴吸収スペクトル
を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 以下の構造式を有する抗生物質ムレイドマイ
   シンＢ。 【化】 ２ 以下の構造式を有する抗生物質ムレイドマイ
   シンＤ。 【化】 ３ スプレプトミセス属に属する抗生物質ムレイ
   ドマイシンＢおよびＤ生産菌を培養し、その培養
   液より抗生物質ムレイドマイシンＢおよび抗生物
   質ムレイドマイシンＤを採取することを特徴とす
   る抗生物質ムレイドマイシンＢおよびＤの製造
   法。 ４ ストレプトミセス属に属する抗生物質ムレイ
   ドマイシンＢおよびＤ生産菌がストレプトミセ
   ス・フラビドビレンスSANK60486株
   （Streptomyces flavidovirens SANK 60486）
   （微工研条寄第1347号、FERM BP−1347）であ
   る特許請求の範囲第３項記載の製造法。 ５ 抗生物質ムレイドマイシンＢおよび／または
   抗生物質ムレイドマイシンＤを有効成分とする抗
   菌剤。