JPH0560471B2

JPH0560471B2 -

Info

Publication number: JPH0560471B2
Application number: JP29664085A
Authority: JP
Inventors: Michihisa Ono; Seigo Iwato
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1985-12-27
Filing date: 1985-12-27
Publication date: 1993-09-02
Also published as: JPS62155281A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は新抗生物質ミルベマイシン化合物およ
びその製法に関する。

ストレプトミセス属のＢ−41−146菌株から単
離された一群のマクロライド系抗生物質は、特開
昭50−29742号公報にＢ−41と称され、そして
A1，A2，A3，A4，B1，B2，B3，C1，及びC2
の９種が述べられた。更に４種の化合物が単離さ
れてすべての13種の化合物の構造が決定され、
ザ．ジヤーナル．オブ．アンチバイオテツクス
（J.Antibiotics）29(3)の76−14 76−16頁及び同誌
29(6)の76−35 76−42頁に発表された。そしてさ
らに、Ｂ−41D，Ｅ，Ｆが単離され特願昭54−
107550号及び特開昭57−77686号に述べられた。
これらＢ−41抗生物質はミルベマイシンと命名さ
れた。これらＢ−41化合物は上記文献に殺虫活性
及び殺ダニ活性を有することが知られ、更に特開
54−89041号公報には駆虫活性を有することが知
られている。

本発明者等は、上記Ｂ−41−146菌株の培養物
から、新たに下記式で表わされる一連のミルベマ
イシン化合物を見出した。

上記式中、＝Ｙは＝Ｏまたは−OHを示し、Ｘ
はＹが＝Ｏのときメチル基を示し、Ｙが−OHの
ときメチル基またはヒドロキシメチル基を示す。

上記式において、＝Ｙが−OHを示し、Ｘがヒ
ドロキシメチル基を示す化合物をミルベマイシン
β4と、＝Ｙが−OHを示しＸがメチル基を示す化
合物をミルベマイシンβ5と、そして＝Ｙが＝Ｏ
を示し、Ｘがメチル基を示す化合物をミルベマイ
シンβ6とそれぞれ称する。

抗生物質ミルベマイシンβ4，β5およびβ6を生
産するストレプトミセス属Ｂ−41−146株の菌学
的性質については特開昭50−29742号に詳しく記
載され、ストレプトミセスＢ−41−146株は工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されていて、
その微生物受託番号は微工研条寄第1072号
（FERM BP−1072）である。

衆知のとおり、放線菌は自然界において、また
人工的な操作（たとえば、紫外線照射、放射線照
射、化学薬品処理等）により、変異をおこしやす
く、本発明のＢ−41−146株もこの点は同じであ
る。本発明にいうＢ−41−146株はそのすべての
変異株を包含する。すなわち、本発明では抗生物
質ミルベマイシンβ4，β5およびβ6を生産し、Ｂ
−41−146株およびその変異株と明確に区別され
ない菌は、全てＢ−41−146株に包含されるもの
である。

ミルベマイシンβ4，β5およびβ6はＢ−41−146
株を適当な培地で培養し、それから採取すること
によつて得られる。栄養源としては、従来ストレ
プトミセス属の菌の培養に利用されている公知の
ものが使用できる。例えば、炭素源としてはグル
コース、シユクロース、でんぷん、グリセリン、
水あめ、糖みつ、大豆油などが使用できる。また
窒素源としては、大豆粉、小麦はいが、肉エキ
ス、ペプトン、酵母菌体、コーンスチープリカ
ー、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等を使用
しうる。このほか必要に応じて炭酸カルシウム、
食塩、塩化カリ、リン酸塩等の無機塩類を添加す
るほか、菌の発育を助け、ミルベマイシンβ4，
β5およびβ6の生産を促進するような有機及び無
機物を適当に添加することができる。

培養法としては、一般の抗生物質を生産する方
法と同じく液体培養法、とくに深部培養法が最も
適している。培養は好気的条件下で行なわれ、培
養に適当な温度は22−30℃であるが、多くの場合
28℃付近で培養する。ミルベマイシンβ4，β5お
よびβ6の生産は振とう培養、タンク培養ともに
５−15日で最高値に達する。

ミルベマイシンβ4，β5およびβ6の検定にあた
つては次の方法が用いられる。すなわち、培養物
１mlを小試験管にとり、80％メタノール水９mlを
添加、振とうして抽出し、遠心分離する。高速液
体クロマトグラフイーはNOVA−PAKC18逆相
カラム（Waters，0.39×15cm）、ポンプ（日立
model635A）およびサンプルインジエクター
（Waters，model U6K）を用い、上記試料を5μ
注入し、アセトニトリル−水（75：25）の溶媒
系を流速1.6ml／minで行つた。ミルベマイシン
β4，β5およびβ6は紫外線検出器（240nm）でモ
ニターし、データー処理装置（島津製作所
Chromatopac Ｃ−R1A）を用いて定量した。

ミルベマイシンβ4，β5およびβ6を培養物から
採取するにあたつては活性炭、アルミナ、シリカ
ゲルなどの吸着剤、ダイヤイオンHP−20（三菱
化成社製）など合成吸着剤、アビセル（旭化成社
製）、ろ紙などの固定剤、イオン交換樹脂、イオ
ン交換ゲルろ過剤などが使用されうるが、以下に
示す採取方法が最も効果的である。

培養物を、けいそう土などのろ過助剤を用いて
ろ過し、ここでえられたケーキをメタノール抽出
することにより、目的物はメタノール水に溶解し
てくる。これに水を加えた後、ｎ−ヘキサンで抽
出し、これを減圧下で濃縮することにより、ミル
ベマイシンβ5およびβ6を含有するオイル状物質
がえられる。次にメタノール水を濃縮後、酢酸エ
チルで抽出し、これを減圧下で濃縮することによ
りミルベマイシンβ4を含有するオイル状物質が
えられる。

ミルベマイシンβ5およびβ6を含有するオイル
状物質をローバーカラムSi60（メルク社製、サイ
ズＢ）のカラムに吸着せしめ、ｎ−ヘキサン：酢
酸エチル（８：２）で溶出し、ミルベマイシン
β5とβ6をそれぞれ含有するフラクシヨンを集め
る。ミルベマイシンβ5とβ6をそれぞれ含有する
フラクシヨンは減圧下で濃縮し再びオイル状とな
し、少量のメタノールを加えて、ローパーカラム
RP−８（メルク社製、サイズＢ）に吸着させ、ア
セトニトリル：水（85：15）で溶出し、ミルベマ
イシンβ5およびβ6をそれぞれ含有するフラクシ
ヨンを集め、減圧下でアセトニトリルを除去した
後酢酸エチルで抽出する。これら抽出液を減圧下
で濃縮し、得られた残渣をｎ−ヘキサン：酢酸エ
チル（８：２）に溶解し、室温に放置するとミル
ベマイシンβ5およびβ6が結晶状にえられる。

ミルベマイシンβ4を含有するオイル状物質を
ローバーカラムSi60（メルク社製、サイズＢ）の
カラムに吸着せしめ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル
（４：６）で溶出し、ミルベマイシンβ4を含有す
るフラクシヨンを集める。ミルベマイシンβ4を
含有するフラクシヨンは減圧下で濃縮し、再びオ
イル状となし、少量のメタノールを加えてローバ
ーカラムRP−８（メルク社製、サイズＢ）に吸着
させ、アセトニトリル：水（８：２）で溶出し、
ミルベマイシンβ4を含有するフラクシヨンを集
め減圧下でアセトニトリルを除去した後、酢酸エ
チルで抽出する。抽出液を減圧下で濃縮し得られ
た残渣をｎ−ヘキサン：酢酸エチル（４：６）に
溶解し室温に放置するとミルベマイシンβ4が結
晶状に得られる。

ミルベマイシンβ4は次の理化学的性質を有す
る。

１外観：針状結晶２マススペクトル：ｍ／e544（M⁺）分子式
（C₃₂H₄₈O₇）３化学構造式：前述の通り４分子量：544 ５紫外線吸収スペクトル：λ^EtOH _naxnm（ε）241
（27900）６赤外線吸収スペクトル：ν^KBr _naxcm^-13430，1710 ７核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルムに溶
解し、内部標準にTMSを使用して、90MHzで
測定した（δ：ppm）。

0.79（3H，ｄ，Ｊ＝６） 0.94（3H，ｔ，Ｊ＝6.2） 1.02（3H，ｄ，Ｊ＝６） 1.60（3H，ｓ） 1.83（3H，ｓ） 2.40（1H，ｍ） 3.06〜4.34（多くのピークがみられる） 5.35（1H，ｍ） 5.60（1H，ｍ） 6.10〜6.46（多くのピークがみられる）８溶解性：酢酸エチル、アセトン、エタノー
ル、メタノールに易溶、水に難溶。

９薄層クロマトグラフイー：Rf値0.13 吸着剤；メルク社製Kieselgel60F₂₅₄ 展開溶媒；ジオキサン：四塩化炭素（20：80）ミルベマイシンβ5は次の理化学的性質を有す
る。

１外観：無晶形粉末２マススペクトル：ｍ／e528（M⁺）（分子式C₃₂
H₄₈O₆）３化学構造式：前述の通り。

４分子量：528 ５紫外線吸収スペクトル：λ^EtOH _naxnm（δ）241
（26600）６赤外線吸収スペクトル：ν^KBr _naxcm^-13480，1715 ７核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルムに溶
解し、内部標準にTMSを使用して、90MHzで
測定した（δ：ppm）。

0.82（3H，ｄ，Ｊ＝６） 0.95（3H，ｔ，Ｊ＝6.2） 1.03（3H，ｄ，Ｊ＝６） 1.60（3H，ｓ） 1.74（3H，ｓ） 1.83（3H，ｓ） 4.46（1H，ｍ） 4.87（1H，ｍ） 5.20〜5.60（多くのピークがみられる） 5.90〜6.03（多くのピークがみられる）８溶解性：ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、エタノ
ール、メタノールに易溶、水に難溶。

９薄層クロマトグラフイー：Rf値0.4 吸着剤；メルク社製Kieselgel60F₂₅₄ 展開溶媒；ジオキサン：四塩化炭素（20：80）ミルベマイシンβ6は次の理化学的性質を有す
る。

１外観：針状結晶２マススペクトル：ｍ／e526（M⁺）（分子式C₃₂
H₄₆O₆）３化学構造式：前述の通り。

４分子量：526 ５紫外線吸収スペクトル：λ^EtOH _naxnm（ε）236
（31800）６赤外線吸収スペクトル：ν^KBr _naxcm^-13480，
1718，1680 ７核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルムに溶
解し、内部標準にTMSを使用して、90MHzで
測定した（δ：ppm）。

0.83（3H，ｄ，Ｊ＝６） 0.95（3H，ｔ，Ｊ＝6.2） 1.03（3H，ｄ，Ｊ＝６） 1.63（3H，ｓ） 1.76（3H，ｓ） 1.86（3H，ｓ） 2.27（1H，ｄ，Ｊ＝17） 2.73（1H，ｄ，Ｊ＝17） 5.25〜5.62（多くのピークがみられる） 5.90〜6.40（多くのピークがみられる）８溶解性：ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、アセト
ン，エタノール、メタノールに易溶、水に難
溶。

９薄層クロマトグラフイー：Rf値0.61 吸着剤；メルク社製Kieselgel60F₂₅₄ 展開溶媒；ジオキサン：四塩化炭素（20：80）次にβ4，β5およびβ6の製造例を示す。

製造例１シユクロース１％、ポリペプトン0.35％および
K₂HPO₄0.05％を含有する前培養培地100mlを含
む500ml容三角フラスコにストレプトマイセスＢ
−41−146株を一白金耳接種し、48時間28℃にて
ロータリーシエーカーで培養した。この培養液２
mlを40mlの生産培地（シユクロース８％、大豆粉
１％、スキムミルク１％、イーストエキス0.1％、
肉エキス0.1％，CaCO₃0.3％，K₂HPO₄0.03％，
MgSO₄・7H₂O0.1％，FeSO₄・7H₂O0.005％）を
含む500ml容三角フラスコに植菌した。前培養培
地および生産培地は滅菌前にPH7.2に調整し、オ
ートクレープで120℃20分間滅菌したものを用い
た。ロータリーシエーカー（210rpm，７cm）で
28℃にて12日間培養した。

12日間培養後、培養物５のPHを硫酸で３と
し、セライト300ｇを加えてろ過すると、約530ｇ
のケーキがえられた。これを４のメタノールで
抽出し、ろ別し、得られたメタノール溶液４に
水3.5を加え、８のｎ−ヘキサンで抽出した。
得られたｎ−ヘキサン層は無水硫酸ナトリウムで
脱水後、40−45℃水浴中で減圧下濃縮すると９ｇ
のオイルがえられた。これを、20mlのｎ−ヘキサ
ンに溶かし、あらかじめ300ｇのシリカゲルをｎ
−ヘキサンでつめてあるカラムに吸着させ、ｎ−
ヘキサン：アセトン（80；20）で展開した。この
結果、ミルベマイシンβ5およびβ6を含有するフ
ラクシヨン800mlを得た。これを前述と同様の条
件で濃縮し、580mgのオイルを得た。これをｎ−
ヘキサン10mlにとかし、ローバーカラムSi60（メ
ルク社製、サイズＢ）のカラムに吸着させ、ｎ−
ヘキサン：酢酸エチル（８：２）で溶出し、ミル
ベマイシンβ5とβ6をそれぞれ含有するフラクシ
ヨンを集めた。ミルベマイシンβ5とβ6を含有す
るそれぞれのフラクシヨンは、減圧下で濃縮し再
びオイル状となし、小量のメタノールを加えて、
ローバーカラムRP−８（メルク社製、サイズＢ）
にそれぞれ吸着させ、アセトニトリル：水（85：
15）で溶出し、目的物を含有するそれぞれのフラ
クシヨンを集め、減圧下でアセトニトリルを除去
した後酢酸エチルで抽出した。これら抽出液を減
圧下で濃縮し、得られた残渣をｎ−ヘキサン：酢
酸エチル（８：２）に溶解し、室温に放置すると
ミルベマイシンβ5は無晶形粉末として130mg、β6
は結晶として300mg得られた。

前述のｎ−ヘキサンで抽出したあとのメタノー
ルを含む水層を減圧下でメタノール除去し、酢酸
エチルで抽出した。得られた酢酸エチル層は無水
硫酸ナトリウムで脱水後40−45℃水浴中で減圧下
濃縮すると3.5ｇのオイルが得られた。これを30
mlのメタノールに溶かし、ローバーカラムRP−
８（メルク社製、サイズＢ）のカラムに吸着させ、
アセトニトリル：水（８：２）で溶出しミルベマ
イシンβ4を含有するフラクシヨンを集め、減圧
下でアセトニトリルを除去した後酢酸エチルで抽
出した。酢酸エチル抽出液を減圧下で濃縮し、得
られた残渣を酢酸エチルに溶解し、ローバーカラ
ムSi60のカラムに吸着させ、酢酸エチル：ｎ−ヘ
キサン（６：４）で溶出しミルベマイシンβ4を
含有するフラクシヨンを集めた。これを減圧下で
濃縮後酢酸エチル：ｎ−ヘキサンに溶解して室温
に放置するとミルベマイシンβ4 110mgが結晶状
に得られた。

本発明のミルベマイシンβ4，β5およびβ6は果
樹、野菜及び花卉に寄生するナミハダニ類
（Tetranychus）、リンゴハダニやミカンハダニ
（Panonychus）及びサビダニ等の成虫及び卵、
動物に寄生するマダニ科（Ixodidac）、ワクモ科
（Dermanysside）及びヒゼンダニ科（Sarcopt−
idae）等に対してすぐれた殺ダニ活性を有してい
る。

更にヒツジバエ（Oestrus）、キンバエ（Lu−
cilia）、ウシバエ（Hypoderma）、ウマバエ
（Gautrophilus）等及びのみ、しらみ等の動物や
鳥類の外部寄生虫；ゴキブリ、家バエ等の衛生害
虫；その他アブラムシ類、鱗翅目幼虫等の各種農
園芸害虫に対して活性である。更にまた土壌中の
根こぶ線虫（Meloidogyne）、ネダニ（Ph−
izoglyphus）等に対しても活性である。

ミルベマイシンβ4，β5およびβ6を殺ダニ剤と
して使用するには、活性化合物を担体で希釈し、
必要に応じて他の補助剤を加えることにより、粉
剤、粗粉剤、粒剤、微粒剤、水和剤、乳剤、油剤
等の散布剤に調製して使用することができる。

更に本発明のミルベマイシンβ4，β5およびβ6
は動物及び人間の駆虫剤としてすぐれた殺寄生虫
活性を有している。一般に寄生虫症として説明さ
れている病気は、蠕虫（Helminth）として知ら
れている寄生原虫による動物宿主の感染による。
寄生虫症は豚、羊、山羊、牛、馬、犬、猫及び鶏
のような家畜、家禽及びペツトに流行して経済上
重大な被害を与える。蠕虫の内で線虫として説明
されている寄生虫群は種々の動物にはびこりしば
しば重大な感染を引き起す。前述した動物に感染
する線虫の最も一般的な属は、ヘモンクス属
（Haemonchus）、トリコストロンギルス属
（Trichostrongylus）、オステルターギヤ属
（Ostertagia）、ネマトデイルス属
（Nematodirus）、クーペリア属（Cooperia）、ア
スカリス属（Ascaris）、ブノストムーム属
（Bunostomum）、エソフアゴストムーム属
（Oesophagostomum）、チヤベルチア属
（Chabertia）、トリキユリス属（Trichuris）、ス
トロンギルス属（Strongylus）、トリコネマ属
（Trichonema）、デイクチオカウルス属
（Dictyocaulus）、キヤピラリア属（Capillaria）、
ヘテラキス属（Heterakis）、トキソカラ属
（Toxocara）、アスカリデイア属（Ascaridia）、
オキシウリス属（Oxyuris）、アンキロストーマ
属（Ancylostoma）、ウンシナリア属
（Uncinaria）、トキサスカリス属（Toxascaris）
及びパラスカリス属（Parascaris）である。

ネマトデイルス属、クーペリア属及びエソフア
ゴストムーム属のある種のものは腸管を攻撃し、
一方ヘモンクス属及びオステルターギア属のもの
は胃に発生し、デイクチオカウルス属の寄生虫は
肺に見い出される。

また、フイラリア科（Filariidae）やセタリア
科（Setariidae）の寄生虫は心臓及び血管、皮下
及びリンパ管組織のような体内の他の組織及び器
管に見い出される。

さらにまた、種々の動物における多くの内部寄
生虫に対して広いスペクトルの活性を有し、例え
ば犬のデイロフイラリア属（Dirofilaia）、ケツ
シ類動物のネマトスピロイデス属（Nematos−
piroides）、シイフアシア属（Syphacia）及びア
スピキユラリス属（Aspiculuris）にも活性を示
す。

ミルベマイシンβ4，β5およびβ6はまた、人間
に感染する寄生虫に対しても有用であり、人間の
消化管の最も普通の寄生虫は、アンキロストーマ
属（Ancylostoma）、ネカトール属（Necator）、
アスカリス属（Ascaris）、ストロンギロイデス
属（Strongyloides）、トリヒネラ属
（Trichinella）、キヤピラリア属（Capillaria）、
トリキユリス属（Trichuris）及びエンテロピウ
ス属（Enterobius）である。

消化管の外に血液又は他の組織及び器管に見い
出される他の医学的に重要な寄生虫は、フイラリ
ア科のブツヘレリア属（Wuchereria）、ブルージ
ア属（Brugia）、オンコセルカ属（Onchoce−
rca）及びロア糸状虫属（Loa）並びに蛇状線虫
科（Dracunculidae）のドラクンクルス属（Dra
−cunculus）の寄生虫の外に、腸管内寄生虫の特
別な腸管外寄生状態におけるストロンギロイデス
属及びトリヒネラ属である。

ミルベマイシンβ4，β5およびβ6を動物及び人
における駆虫剤として使用する場合は、液体飲料
として経口的に投与することができる。飲料は普
通ベントナイトのような懸濁剤及び湿潤剤又はそ
の他の賦形剤と共に適当な非毒性の溶剤又は水で
の溶液、懸濁液又は分散液である。一般に飲料は
また消泡剤を含有する。飲料処方は一般に活性化
合物を約0.01〜0.5重量％、好適には0.01〜0.1重
量％を含有する。

ミルベマイシンβ4，β5およびβ6を動物飼料に
よつて投与する場合は、それを飼料に均質に分散
させるか、トツプドレツシングとして使用される
か又はペレツトの形態として使用される。普通望
ましい抗寄生虫効果を達成するためには、最終飼
料中に活性化合物を0.0001〜0.02％を含有してい
る。

また、ミルベマイシンβ4，β5およびβ6を液体担
体賦形剤に溶解又は分散させたものは、前胃内、
筋肉内、気管内又は皮下に注射によつて非経口的
に動物に投与することができる。非経口投与のた
めに、活性化合物は好適には落花生油、棉実油の
ような適当な植物油と混合する。このような処方
は、一般に活性化合物を0.05〜50重量％含有す
る。

ミルベマイシンβ4，β5およびβ6はまた、ジメ
チルスルホキシド又は炭化水素溶剤のような適当
な担体と混合することによつて局所的に投与し得
る。この製剤はスプレー又は直接的注加によつて
動物の外部表面に直接適用される。

最善の結果を得るための活性化合物の最適使用
量は、治療される動物の種類及び寄生虫感染の型
及び程度によつてきまるが、一般に動物体重１Kg
当り約０，01〜100mg、好適には0.5〜50.0mgを経
口投与することによつて得られる。このような使
用量は一度に又は分割した使用量で１〜５日のよ
うな比較的短時間にわたつて与えられる。

Claims

【特許請求の範囲】１次の化学式で表わされるミルベマイシン化合
物：（式中、＝Ｙは＝Ｏまたは−OHを示し、Ｘは
Ｙが＝Ｏのときメチル基を示し、Ｙが−OHのと
きメチル基またはヒドロキシメチル基を示す）。２ストレプトミセス属に属し、下記式のミルベ
マイシン化合物を生産する菌を好気的に培養し、
その培養物から生産物を単離することを特徴とす
る当該ミルベマイシン化合物の製造法：（式中、＝Ｙは＝Ｏまたは−OHを示し、Ｘは
Ｙが＝Ｏのときメチル基を示し、Ｙが−OHのと
きメチル基またはヒドロキシメチル基を示す）。