JPH032870B2

JPH032870B2 -

Info

Publication number: JPH032870B2
Application number: JP55153141A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Takiguchi; Michihisa Okuda; Micha Terao; Shinjiro Yamamoto
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1980-10-31
Filing date: 1980-10-31
Publication date: 1991-01-17
Also published as: JPS5777686A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新抗生物質Ｂ−41Fに関する。ストレプトミセス属のＢ−41−146菌株から単
離された一群のマクロライド系抗生物質は、特開
昭50−29742号公報にＢ−41と称され、そして
A₁，A₂，A₃，A₄，BA，B₂，B₃，C₁及びC₂の９
種が述べられた。更に４種の化合物が単離されて
すべての13種の化合物の構造が決定され、ザ・ジ
ヤーナル・オブ・アンチバイオテツクス（J.
Antibiotics）29(3)の76−14〜76−16頁及び同誌
29(6)の76−35〜76−42頁に発表された。そしてさ
らに、Ｂ−41Dが単離され特願昭54−107550号
（特開昭56−32481号）に述べられた。これらＢ−
41抗生物質はミルベマイシンと命名された。これ
ら既に単離されたＢ−41化合物の構造は次表に示
される通りである。

【表】＼

CH_３
Ｂ−41 R₁ R₂ R₃ A₁ CH₃ −OCH₃ −CH₂OH C₂H₃ −OCH₃ −CH₂OH これらＢ−41化合物は上記文献に殺虫活性及び
殺ダニ活性を有することが知られ、更に特開54−
89041号公報には駆虫活性を有することが知られ
ている。本発明者らは今回新たにストレプトミセス属に
属するＢ−41−146菌株の培養物から新抗生物質
Ｂ−41Fを見い出した。Ｂ−41Fは次の式を有す
る。抗生物質Ｂ−41Fを生産するストレプトマイセ
ス属Ｂ−41−146菌株の菌学的性質については特
開昭50−29742号に詳しく記載され、ストレプト
ミセス・Ｂ−41−146株は工業技術院微生物工業
技術研究所に国際寄託されていて、その微生物受
託番号は微工研条寄第1072号である。象知のとおり、放線菌は自然界において、また
人工的な操作（たとえば、紫外線照射、放射線照
射、化学薬品処理等）により、変異おこしやす
く、本発明のB41−146株もこの点は同様である。
本発明にいうＢ−41−146株はそのすべての変異
株を包含する。すなわち、本発明では抗生物質Ｂ
−41Fを生産し、Ｂ−41−146株及びその変異株
と明確に区別されない菌は、全てＢ−41−146株
に包含されるものである。Ｂ−41FはＢ−41−146株を適当な培地で培養
し、それから採取することによつて得られる。栄
養源としては、従来ストレプトマイセス属の菌の
培養に利用されている公知のものが使用できる。
例えば、炭素源としてグルコース、シユクロー
ス、でんぷん、グリセリン、水あめ、糖みつ、大
豆油などが使用できる。また窒素源としては、大
豆粉、小麦胚芽、肉エキス、ペプトン、酵母菌
体、コーンスチープリカー、硫酸アンモニウム、
硝酸ナトリウム等を使用しうる。このほか必要に
応じて炭酸カルシウム、食塩、塩化カリ、リン酸
塩等の無機塩類を添加するほか、菌の発育を助
け、Ｂ−41Fの生産を促進するような有機及び無
機物を適当に添加することができる。培養法としては、一般の抗生物質を生産する方
法と同じく液体培養法、とくに深部培養法が最も
適している。培養は好気的条件下で行なわれ、培
養に適当な温度は22〜30℃であるが、多くの場合
28℃付近で培養する。Ｂ−41Fの生産は振盪培
養、タンク培養ともに５〜15日で最高値に達す
る。Ｂ−41Fの検定にあたつては次の方法が用いら
れる。すなわち、培養物３mlを小試験管にとり、
アセトン10mlを添加、振盪して抽出し、遠心分離
する。ここで得られた上澄をアセトンで10mlまで
フイル・アツプする。このサンプルの10〜20μlを
TLC用板（メルク社製、Kieselgel 60F₂₅₄）上の
所定の位置に吸着せしめ、これをジオキサン：四
塩化水素（18：82）で４時間展開後、二波長クロ
マトスキヤナを用いて245mμの波長（ブランクは
380mμ）で測定し、その吸収量を標準物質のそれ
と比較し、算出する。Ｂ−41Fを培養物から採取するにあたつては活
性炭、アルミナ、シリカゲルなどの吸着剤、ダイ
ヤイオンHP−20（三菱化成社製）などの合成吸
着剤、アビセル（旭化成社製）、紙などの固定
剤、イオン交換樹脂、イオン交換ゲル過剤など
が使用されうるが、以下に示す採取方法が最も効
果的である。培養物を、けいそう土などの過助剤を用いて
別し、ここで得られたケーキをメタノール抽出
することにより、目的物はメタノール水に溶解し
てくる。これに水を加えた後、ｎ−ヘキサンで抽
出し、これを減圧下で濃縮することにより、目的
物を含有するオイル状物質が得られる。これをシ
リカゲル（ワコーゲルＣ−200）のカラムに吸着
せしめ、ｎ−ヘキサン：アセトン（95：５）で溶
出し、さらにｎ−ヘキサン：アセトン（80：20）
で溶出し、Ｂ−41Fを含有するフラクシヨンを集
める。Ｂ−41Fを含有するフラクシヨンは減圧下で濃
縮し、再びオイル状となし、少量のエタノールに
溶解后、適量の活性炭を加え、脱色する。過に
より活性炭を除去し、液を再び減圧下で濃縮す
る。これに少量のｎ−ヘキサンを加えシリカゲル
のカラムにかけて、ｎ−ヘキサン：アセトン
（80：20）で溶出し、目的物を含有するフラクシ
ヨンを集め、減圧下で濃縮し、ここで得られた残
渣を少量のメタノールに溶解し水を加えて室温に
放置するとＢ−41Fが結晶状に得られる。Ｂ−41−Ｆは次の理化学的性質を有する。１外観：無晶形粉末２マススペクトル：ｍ／e665（M⁺）（分子式
C₃₈H₅₁O₉N）３化学構造式前述のとおり４分子量：665 ５紫外吸収スペクトル：第１図に示す。極大吸収：245mμ（ε＝24.075） 253mμ（ε＝21.362）６赤外吸収スペクトル： Nujolで測定したスペクトルを第２図に示す。７ NMRスペクトル：重クロロホルム中内部基準にTMSを使用し
て測定した核磁気共鳴吸収スペクトル（100M
Hz）は第３図に示す通りである。８溶解性：ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、アセト
ン、エタノール、メタノールに易溶、水に難
溶。９薄層クロマトグラフイー：Rf値0.27 吸着剤：メルク社製Kieselgel60F₂₅₆ 展開溶媒：ジオキサン：四塩化炭素（20：80）次にＢ−41Fの製造例を示す。製造例１グルコース２％、大豆粉１％、コーンスチー
プ、リカー（コーンブロダクツ製）0.5％および
NaCl0.2％を含有する前培養培地600mlを含む２
容三角フラスコにストレプトマイセスＢ−41−
146株を１白金耳接種し、48時間27℃で培養を行
い、この２容三角フラスコ２本を30容ジヤ
ー・フアメンタに移殖した。ジヤー・フアメンタ
には、グルコース４％、大豆粉１％、コーンスタ
ーチ0.5％、スキムミルク１％、コーンスチー
プ・リカー0.2％及びNaCl0.3％を含有する培地20
を仕込み、PHを7.2〜7.5に調節し、十分に滅菌
しておいた。培養期間中は、28℃、内圧0.5Kg／
cm²に保持した。 10日間培養後、培養物20のPHを硫酸で３と
し、セライト１Kgを加えて加圧過すると、約
2.8Kgのケーキが得られた。これを15のメタノ
ールで抽出し、別し、得られたメタノール溶液
15に水５を加え、20のｎ−ヘキサンで抽出
した。得られたｎ−ヘキサン層は芒硝で脱水後、
40〜45℃水溶中で減圧下濃縮すると22ｇのオイル
が得られた。これを１のメタノールに溶かし、
水を１加えて、あらかじめ１のダイヤイオン
HP−20を水でつめてあるカラムに吸着せしめ、
１の水で水洗し、さらに60％メタノール水で洗
浄後90ないし100％メタノール水で溶出する。目
的物質を含有するフラクシヨン７を集め減圧下
濃縮すると15.4ｇのオイルが得られた。これを、
40mlのｎ−ヘキサンにとかし、あらかじめ500ｇ
のシリカゲルをｎ−ヘキサンでつめてあるカラム
に吸着せしめ、ｎ−ヘキサン：アセトン（95：
５）で展開し、さらにｎ−ヘキサン：アセトン
（80：20）で展開し、Ｂ−41Fを含有するフラク
シヨン２を得た。これらは前述と同様の条件で
濃縮し、Ｂ−41Fを含有するオイル700mgをそれ
ぞれ得た。上記のＢ−41Fを含有するオイルをエタノール
20mlにとかし、活性炭0.1ｇを加え脱色した。減
圧過して活性炭を除き、得られた溶液は減圧下
45℃で濃縮し550mgのオイルを得た。これをｎ−
ヘキサン３mlにとかし、あらかじめ20ｇのシリカ
ゲルをｎ−ヘキサンでつめてあるカラムに吸着せ
しめ、ｎ−ヘキサン：アセトン（80：20）で展開
した。その結果、Ｂ−41Fを含有するフラクシヨ
ン200mlを得た。これを減圧下、45℃で濃縮し、
ここで得られた残渣を２mlのメタノールに溶解
し、水２mlを加え、室温に放置して無晶形の粉末
Ｂ−41F90mgが得られた。製造例２シユクロース１％、ポリペプトン0.35％および
K₂HPO₄0.05％を含有する前培養培地100mlを含
む500ml容三角フラスコにストレプトマイセスＢ
−41−146株を白金耳接種し、48時間27℃で培養
を行ない、同成分の前培養培地600mlを含む２
容三角フラスコに、30ml接種し、24時間27℃で培
養した。この２容三角フラスコ５本を600容
タンクに移殖した。タンクにはグルコース２％、
大豆粉１％、コーンスターチ0.5％、スキムミル
ク１％、コーンスチープ・リカー0.2％および
NaCl0.3％を含有する培地300を仕込み、PHを
7.2〜7.5に調整し、十分に滅菌しておいた。培養
期間中は、28℃、内圧0.5Kg／cm²に保持し、さら
に１から２％の間にグルコース濃度を保つた。 12日間培養液、培養物300を硫酸でPH３とし、
セライト15Kgを加えて加圧過すると、約45Kgの
ケーキが得られた。これを200のメタノールで
抽出し、別し、得られたメタノール溶液210
に水170を加え、NaOHでPHを中性にし、400
のｎ−ヘキサンで抽出した。得られたｎ−ヘキ
サン層は芒硝で脱水後、40〜45℃水浴中で減圧下
濃縮すると600ｇのオイルが得られた。これを５
メタノールで溶かし、水５を加えて、あらか
じめ５のダイヤイオンHP−20を水でつめてあ
るカラムに吸着せしめ、５の水で水洗し、さら
に60％メタノール水６で洗浄後、90％メタノー
ル水ないし100％メタノールで溶出した。目的物
質を含有するフラクシヨン35を集め減圧下濃縮
すると430ｇのオイルが得られた。これを、500ml
のｎ−ヘキサンにとかし、あらかじめ3.5Kgのシ
リカゲルをｎ−ヘキサンでつめてあるカラムに吸
着せしめ、ｎ−ヘキサン：アセトン（95：５）で
展開し、さらにｎ−ヘキサン：アセトン（80：
20）で展開し、Ｂ−41Fを含有するフラクシヨン
6.5を得た。上記のＢ−41Fを含むフラクシヨンを濃縮して
18ｇのオイルを得、これをエタノール500mlにと
かし、活性炭２ｇを加え脱色した。別して活性
炭を除き、得られた溶液は減圧下45℃で濃縮し、
15ｇのオイルを得た。これをｎ−ヘキサン45mlに
とかし、あらかじめ200ｇのシリカゲルをｎ−ヘ
キサンでつめてあるカラムに吸着せしめ、ｎ−ヘ
キサン：アセトン（80：20）で展開した。その結
果、Ｂ−41Fを含有するフラクシヨン３を得
た。これを減圧下で濃縮し、ここで得られた残渣
を15mlのメタノールに溶解し、水15mlを加え、室
温に放置して無晶形の粉末Ｂ−41F1.8ｇが得られ
た。本発明のＢ−41Fは果樹、野菜及び花卉に寄生
するナミハダニ類（Tetranychus）、リンゴハダ
ニやミカンハダニ（Panonychus）及びサビダニ
等の成虫及び卵、動物に寄生するマダニ科
（Ixodidac）、ワクモ科（Dermanysside）及びヒ
ゼンダニ科（Sarcoptidae）等に対してすぐれた
殺ダニ活性を有している。更にヒツジバエ（Oestrus）、キンバエ
（Lucilia）、ウシバエ（Hypoderma）、ウマバエ
（Gautrophilus）等及びのみ、しらみ等の動物や
鳥類の外部寄生虫；ゴキブリ、家バエ等の衛生害
虫；その他アブラムシ類、鱗〓目幼虫等の各種農
園芸害虫に対して活性である。更にまた土壌中の
根こぶ線虫（Meloidogyne）、ネダニ
（Phizoglyphus）等に対しても活性である。Ｂ−41Fは単離精製して使用して得るが、その
代りに精製の任意の段階で精製を中止し、粗製物
を有効成分とすることもできる。培養物の精製か
ら得られた種々のＢ−41の各化合物を完全に分離
することなく、２種以上のＢ−41化合物を含有す
る混合物を用いるときは、5ppmの濃度で100％の
殺ダニ率が得られる程度に精製すれば十分であ
る。好適には粗製物中のＢ−41F含量は約50％程
度であつて、残りはブロスからの夾雑物を含む。Ｂ−41Fを殺ダニ剤として使用するには、活性
化合物を担体で希釈し、必要に応じて他の補助剤
を加えることにより、粉剤、粗粉剤、粒剤、微粒
剤、水和剤、乳剤、油剤等の散布剤に調製して使
用することができる。ここでいう担体とは、有効成分の植物、ダニ、
害虫等処理すべき目的物への到達性を助け、また
は有効成分の貯蔵、輸送、あるいは取り扱いを容
易にするために通常殺虫剤に混合される合成また
は天然の無機または有機物質を意味する。試験例１試験方法１ナミハダニ殺ダニ試験後記製剤例３により３％乳剤を調製し、水で
所定濃度に希釈して薬液をつくつた。この薬液
をミズホ式回転散布器（ミズホ理化学器械KK
製）でナミハダニ雌成虫の寄生したササゲ葉に
５c.c.あて散布し、風乾後25℃の定温室に放置
し、72時間後の死ダニ率を求めた。供試ナミハ
ダニ成虫数は各処理区とも60〜70頭である。２ミカンハダニ殺ダニ試験ミカンハダニ雌成虫の寄生したクワ葉を用い
る他は１）と同様。試験結果第１表および第２表に示す。

【表】

【表】次に本発明の殺ダニ剤の製剤例を示す。文中、
単に部とあるのは全て重量部を示す。製剤例１製造例１の方法で培養し、抽出して得たＢ−
41Fの無晶形粉末10部をホワイトカーボン５部と
均一に混合し、これにタルク50部およびクレー35
部を加えて均一に混合し、衝撃式粉砕機で３回粉
砕し、再び均一に混合して粉剤を得る。製剤例２Ｂ−41Fの無晶形粉末40部をホワイトカーボン
20部と均一に混合し、これにドデシルベンゼンス
ルホン酸ソーダ５部、ポリビニルアルコール２部
及びクレー33部を加えて均一に混合し、衝撃式粉
砕機で３回粉砕し、再び均一に混合して水和剤を
得る。製剤例３Ｂ−41Fの無晶形粉末３部、ポリオキシエチレ
ンノニルフエニルエーテル７部、ドデシルベンゼ
ンスルホン酸カルシウム３部及びキシレン87部を
混合して均一に溶解させ、過して乳剤を得る。更に本発明のＢ−41Fは動物及び人間の駆虫剤
としてすぐれた殺寄生虫活性を有している。一般
に寄生虫症として説明されている病気は、蠕虫
（Helminth）として知られている寄生原虫による
動物宿主の感染による。寄生虫症は豚、羊、山
羊、牛、馬、犬、猫及び鶏のような家畜、家禽及
びペツトに流行して経済上重大な被害を与える。
蠕虫の内で線虫として説明されている寄生虫群は
種々の動物にはびこりしばしば重大な感染を引き
起す。前述した動物に感染する線虫の最も一般的
な属は、ヘモンクス属（Haemonchus）、トリコストロンギルス属
（Trichostrongylus）、オステルターギヤ属（Ostertagia）、ネマトデイルス属（Nematodirus）、クーペリア属（Cooperia）、アスカリス属（Ascaris）、プノストムーム属（Bunostomum）、エソフアゴストムーム属
（Oesphagostomum）、チヤベルチア属（Chabertia）、トリキユリス属（Trichuris）、ストロンギルス属（Strongylus）、トリコネマ属（Trichonema）、デイクチオカウルス属（Dictyocaulus）、キヤピラリア属（Capillaria）、ヘテラキス属（Heterakis）、トキソカラ属（Toxocara）、アスカリデイア属（Ascaridia）、オキシウリス属（Oxyuris）、アンキロストーマ属（Ancylostoma）、ウンシナリア属（Uncinaria）、トキサスカリス属（Toxascaris）、及びパラスカリス属（Parascaris）である。ネマトデイルス属、クーペリア属及びエソフア
ゴストムーム属のある種のものは腸管を攻撃し、
一方ヘモンクス属及びオステルターギア属のもの
は胃に寄生し、デイクチオカウルス属の寄生虫は
肺に見い出される。また、フイラリア科（Filariidae）やセタリヤ
科（Setariidae）の寄生虫は心臓及び血管、皮下
及びリンパ管組織のような体内の他の組織及び器
管に見い出される。さらにまた、種々の動物における多くの内部寄
生虫に対して広いスペクトルの活性を有し、例え
ば犬のデイロフイラリア属（Dirofilaria）、ゲツ
シ類動物のネマトスピロイデス属
（Nematospiroides）、シイフアシア属
（Syphacia）及びアスピキユラリス属
（Aspiculuris）にも活性を示す。Ｂ−41Fはまた、人間に感染する寄生虫に対し
ても有用であり、人間の消化管の最も普通の寄生
虫は、アンキロストーマ属（Ancylostoma）、ネカトール属（Necator）、アスカリス属（Ascaris）、ストロンギロイデス属（Strongyloides）、トリヒネラ属（Trichinella）、キヤピラリア属（Capillaria）、トリキユリス属（Trichuris）及びエンテロビウス属（Enterobius）である。消化管の外に血液又は他の組織及び器管に見い
出される他の医学的に重要な寄生虫は、フイラリ
ア科のブツヘレリア属（Wuchereria）、ブルージ
ア属（Brugia）、オンコセルカ属（Onchocerca）
及びロア糸状虫属（Loa）並びに蛇状線虫科
（Dracunculidae）のドラクンクルス属
（Dracunculus）の寄生虫の外に、腸管内寄生虫
の特別な腸管外寄生状態におけるストロンギロイ
デス属及びトリヒネラ属である。Ｂ−41Fを動物及び人における駆虫剤として使
用する場合は、液体飲料として経口的に投与する
ことができる。飲料は普通ベントナイトのような
懸濁剤及び湿潤剤又はその他の賦形剤と共に適当
な非毒性の溶剤又は水での溶液、懸濁液又は分散
液である。一般に飲料はまた消泡剤を含有する。
飲料処方は一般に活性化合物を約0.01〜0.5重量
％、好適には0.01〜0.1重量％を含有する。Ｂ−41Fを乾燥した固体の単位使用形態で経口
投与することが望ましい場合は、普通所望量の活
性化合物を含有するカプセル、丸薬又は錠剤を使
用する。これらの使用形態は、活性成分を適当な
細かく粉砕された希釈剤、充填剤、崩解剤及び／
又は結合剤、例えばデンプン、乳糖、タルク、ス
テアリン酸マグネシウム、植物性ゴムなどと均質
に混和することによつて製造される。このような
単位使用処方は、治療される宿主動物の種類、感
染の程度及び寄生虫の種類及び宿主の体重によつ
て駆虫剤の重量及び含量に関して広く変化させる
ことができる。Ｂ−41Fを動物飼料によつて投与する場合は、
それを飼料に均質に分散させるか、トツプドレツ
シングとして使用されるか又はペレツトの形態と
して使用される。普通望ましい抗寄生虫効果を達
成するためには、最終飼料中に活性化合物を
0.0001〜0.02％を含有している。また、Ｂ−41Fを液状担体賦形剤に溶解又は分
散させたものは、前胃内、筋肉内、気管内又は皮
下に注射によつて非経口的に動物に投与すること
ができる。非経口投与のために、活性化合物は好
適には落花性油、棉実油のような適当な植物油と
混合する。このような処方は、一般に活性化合物
を0.05〜50重量％含有する。Ｂ−41Fはまた、ジメチルスルホキシド又は炭
化水素溶剤のような適当な担体と混合することに
よつて局所的に投与し得る。この製剤はスプレー
又は直接的注加によつて動物の外部表面に直接適
用される。最善の結果を得るための活性化合物の最適使用
量は、治療される動物の種類及び寄生虫感染の型
及び程度によつてきまるが、一般に動物体重１Kg
当り約0.01〜10mg、好適には0.1〜50.0mgを経口投
与することによつて得られる。このような使用量
は一度に又は分割した使用量で１〜５日のような
比較的短時間にわたつて与えられる。試験例２培養し、フ化した野性ラツトの毛様線虫
（Nippostrongylus brasiliensis）の懸濁液0.4ml
に、Ｂ−41Fの各種濃度液0.1mlを加え、24時間後
の虫体の運動量を顕微鏡下に調査し、殺虫濃度の
MIC値を求めたところ、0.63μg／mlであつた。対
照の公知化合物であるＢ−41のC₁及びC₂のMIC
値は、それぞれ1.25μg／ml及び2.50μg／mlであつ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図はＢ−41Fの紫外吸収スペクトル、第２
図は同物質の赤外吸収スペクトル、第３図は同物
質の核磁気共鳴吸収スペクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】１次の化学式を有する抗生物質Ｂ−41F。