JPH0549493A - ヌクレオシド化合物の製造方法 - Google Patents
ヌクレオシド化合物の製造方法Info
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- JPH0549493A JPH0549493A JP23078591A JP23078591A JPH0549493A JP H0549493 A JPH0549493 A JP H0549493A JP 23078591 A JP23078591 A JP 23078591A JP 23078591 A JP23078591 A JP 23078591A JP H0549493 A JPH0549493 A JP H0549493A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】アデノシンまたはデオキシアデノシンからアデ
ノシンデアミナ−ゼによりイノシンまたはデオキシイノ
シンを得る。このイノシンまたはデオキシイノシンとピ
リミジン塩基とを、リン酸の存在下で、プリンヌクレオ
シドホスホリラ−ゼおよびピリミジンヌクレオシドホス
ホリラ−ゼにより塩基交換反応させてピリミジンヌクレ
オシドとヒポキサンチンを生成させる。このヒポキサン
チンをキサンチンオキシダ−ゼにより尿酸に変換させて
反応系から除去することにより、平衡を生成物側に移動
させる。 【効果】塩基交換反応を利用して、簡便に、かつ高収率
でヌクレオシド化合物を得ることが可能である。
ノシンデアミナ−ゼによりイノシンまたはデオキシイノ
シンを得る。このイノシンまたはデオキシイノシンとピ
リミジン塩基とを、リン酸の存在下で、プリンヌクレオ
シドホスホリラ−ゼおよびピリミジンヌクレオシドホス
ホリラ−ゼにより塩基交換反応させてピリミジンヌクレ
オシドとヒポキサンチンを生成させる。このヒポキサン
チンをキサンチンオキシダ−ゼにより尿酸に変換させて
反応系から除去することにより、平衡を生成物側に移動
させる。 【効果】塩基交換反応を利用して、簡便に、かつ高収率
でヌクレオシド化合物を得ることが可能である。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】この発明は、高い収率でヌクレオ
シド化合物を製造することができる方法に関する。
シド化合物を製造することができる方法に関する。
【0002】
【従来の技術】塩基の交換反応を用いてヌクレオシド化
合物を製造する方法としては、N.Hori, M.Watanabe, Y.
Yamazaki and Y.Mikami, Agric.Biol.Chem., 53, 197
(1989)に報告された方法がある。この方法は、プリンヌ
クレオシドホスホリラ−ゼとピリミジンヌクレオシドホ
スホリラ−ゼとを用い、リン酸の存在下において、チミ
ンとイノシンとを反応させて塩基の交換反応を行ない、
リボ−ス-1- リン酸を中間体として5-メチルウリジンを
製造するものである。
合物を製造する方法としては、N.Hori, M.Watanabe, Y.
Yamazaki and Y.Mikami, Agric.Biol.Chem., 53, 197
(1989)に報告された方法がある。この方法は、プリンヌ
クレオシドホスホリラ−ゼとピリミジンヌクレオシドホ
スホリラ−ゼとを用い、リン酸の存在下において、チミ
ンとイノシンとを反応させて塩基の交換反応を行ない、
リボ−ス-1- リン酸を中間体として5-メチルウリジンを
製造するものである。
【0003】上記反応は、以下の二つの反応よりなる。
【0004】
【化1】 したがって、反応全体としては、
【0005】
【化2】 となる。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】前記化2に示す塩基の
交換反応(3) の平衡定数 K1 (K1=[5-メチルウリジン][ヒポキサンチン]/[イ
ノシン][チミン])は 0.21 (40℃)であり、イノシ
ンとチミンの初期濃度が同じであれば、収率は平衡定数
に規定されるので、5-メチルウリジンの最大収率はわず
か31%となる。これは、チミン以外の他の塩基を用いた
場合も同様であり、塩基の交換反応による5-メチルウリ
ジンの収率は低い値に止まっている。
交換反応(3) の平衡定数 K1 (K1=[5-メチルウリジン][ヒポキサンチン]/[イ
ノシン][チミン])は 0.21 (40℃)であり、イノシ
ンとチミンの初期濃度が同じであれば、収率は平衡定数
に規定されるので、5-メチルウリジンの最大収率はわず
か31%となる。これは、チミン以外の他の塩基を用いた
場合も同様であり、塩基の交換反応による5-メチルウリ
ジンの収率は低い値に止まっている。
【0007】この発明は、塩基の交換反応を利用する、
収率の高いヌクレオシド化合物の製造方法を提供するこ
とを目的とする。
収率の高いヌクレオシド化合物の製造方法を提供するこ
とを目的とする。
【0008】〔課題を解決するための手段〕本発明者ら
は、上記事情に鑑み、ヌクレオシド化合物の収率をより
高めるために鋭意研究を行なった。その結果、塩基交換
により生成されるヒポキサンチンを系から除外すること
によりヌクレオシド化合物をより高収率で得る方法を見
出した。
は、上記事情に鑑み、ヌクレオシド化合物の収率をより
高めるために鋭意研究を行なった。その結果、塩基交換
により生成されるヒポキサンチンを系から除外すること
によりヌクレオシド化合物をより高収率で得る方法を見
出した。
【0009】すなわち、この発明のヌクレオシド化合物
の製造方法は、アデノシンまたはデオキシアデノシンを
アデノシンデアミナ−ゼによりイノシンまたはデオキシ
イノシンに変換し、このイノシンまたはデオキシイノシ
ンとピリミジン塩基またはプリン塩基とを、リン酸もし
くはリン酸塩存在下の水溶液中において、前記塩基がピ
リミジン塩基の場合にはプリンヌクレオシドホスホリラ
−ゼおよびピリミジンヌクレオシドホスホリラ−ゼによ
り、また前記塩基がプリン塩基の場合にはプリンヌクレ
オシドホスホリラ−ゼにより塩基交換反応を行ない、さ
らに、この塩基交換反応により生成したヒポキサンチン
をキサンチンオキシダ−ゼにより尿酸に変換することを
特徴とする。
の製造方法は、アデノシンまたはデオキシアデノシンを
アデノシンデアミナ−ゼによりイノシンまたはデオキシ
イノシンに変換し、このイノシンまたはデオキシイノシ
ンとピリミジン塩基またはプリン塩基とを、リン酸もし
くはリン酸塩存在下の水溶液中において、前記塩基がピ
リミジン塩基の場合にはプリンヌクレオシドホスホリラ
−ゼおよびピリミジンヌクレオシドホスホリラ−ゼによ
り、また前記塩基がプリン塩基の場合にはプリンヌクレ
オシドホスホリラ−ゼにより塩基交換反応を行ない、さ
らに、この塩基交換反応により生成したヒポキサンチン
をキサンチンオキシダ−ゼにより尿酸に変換することを
特徴とする。
【0010】ここで、前記ピリミジン塩基としてはウラ
シル、シトシン、チミン、5-フルオロウラシル、5-クロ
ロウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヨ−ドウラシル、5-
エチルウラシル、5-トリフルオロメチルウラシル、5-カ
ルボキシウラシル等を、前記プリン塩基としては2-クロ
ロプリン、6-クロロプリン、2,6-ジクロロプリン、2-ア
ミノ-6- クロロプリン、2,6-ジアミノプリン、6-メルカ
プトプリン、6-メチルチオプリン、2-アミノプリン等を
それぞれ挙げることができる。
シル、シトシン、チミン、5-フルオロウラシル、5-クロ
ロウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヨ−ドウラシル、5-
エチルウラシル、5-トリフルオロメチルウラシル、5-カ
ルボキシウラシル等を、前記プリン塩基としては2-クロ
ロプリン、6-クロロプリン、2,6-ジクロロプリン、2-ア
ミノ-6- クロロプリン、2,6-ジアミノプリン、6-メルカ
プトプリン、6-メチルチオプリン、2-アミノプリン等を
それぞれ挙げることができる。
【0011】以下、この発明のヌクレオシド化合物の製
造方法を、ヌクレオシドと塩基交換反応を行なう塩基を
ピリミジン塩基として詳細に説明する。
造方法を、ヌクレオシドと塩基交換反応を行なう塩基を
ピリミジン塩基として詳細に説明する。
【0012】まず、アデノシンデアミナ−ゼにより、出
発物質であるアデノシンまたはデオキシアデノシンと H
2 O とからそれぞれイノシンまたはデオキシイノシンと
NH3 とが生成する。この反応は可逆反応ではあるが、通
常、反応系には大量の H2 Oが存在するので平衡はイノ
シンまたはデオキシイノシンの生成側に大きく傾いてい
る。すなわち、出発物質であるアデノシンまたはデオキ
シアデノシンの初期濃度と生成するイノシンの濃度とは
等しいものと考えることができる。なお、ここで得られ
るデオキシイノシンは工業的に製造されておらず入手が
困難な化合物であるが、この方法により、工業的に大量
に製造されており入手が容易なデオキシアデノシンから
簡単に生成させることができる。
発物質であるアデノシンまたはデオキシアデノシンと H
2 O とからそれぞれイノシンまたはデオキシイノシンと
NH3 とが生成する。この反応は可逆反応ではあるが、通
常、反応系には大量の H2 Oが存在するので平衡はイノ
シンまたはデオキシイノシンの生成側に大きく傾いてい
る。すなわち、出発物質であるアデノシンまたはデオキ
シアデノシンの初期濃度と生成するイノシンの濃度とは
等しいものと考えることができる。なお、ここで得られ
るデオキシイノシンは工業的に製造されておらず入手が
困難な化合物であるが、この方法により、工業的に大量
に製造されており入手が容易なデオキシアデノシンから
簡単に生成させることができる。
【0013】次いで、生成したイノシンまたはデオキシ
イノシンとリン酸もしくはリン酸塩とから、プリンヌク
レオシドホスホリラ−ゼにより、ヒポキサンチンとリボ
−ス-1- リン酸もしくはデオキシリボ−ス-1- リン酸が
生成する。
イノシンとリン酸もしくはリン酸塩とから、プリンヌク
レオシドホスホリラ−ゼにより、ヒポキサンチンとリボ
−ス-1- リン酸もしくはデオキシリボ−ス-1- リン酸が
生成する。
【0014】次に、生成したリボ−ス-1- リン酸もしく
はデオキシリボ−ス-1- リン酸が、ピリミジンヌクレオ
シドホスホリラ−ゼにより、ピリミジン塩基と置換反応
を行なう。これにより、リボ−ス-1- リン酸とピリミジ
ン塩基との反応からピリミジンヌクレオシドが生成し、
デオキシリボ−ス-1- リン酸とピリミジン塩基との反応
からはピリミジンデオキシヌクレオシドが生成する。
はデオキシリボ−ス-1- リン酸が、ピリミジンヌクレオ
シドホスホリラ−ゼにより、ピリミジン塩基と置換反応
を行なう。これにより、リボ−ス-1- リン酸とピリミジ
ン塩基との反応からピリミジンヌクレオシドが生成し、
デオキシリボ−ス-1- リン酸とピリミジン塩基との反応
からはピリミジンデオキシヌクレオシドが生成する。
【0015】これと同時に、反応溶液中に存在するピリ
ミジンヌクレオシドホスホリラ−ゼにより、逆反応とし
て、塩基交換反応により生成したこれらのヌクレオシド
およびリン酸もしくはリン酸塩が、再びピリミジン塩基
とリボ−ス-1- リン酸もしくはデオキシリボ−ス-1- リ
ン酸とに分解し、系全体として平衡状態に至る。
ミジンヌクレオシドホスホリラ−ゼにより、逆反応とし
て、塩基交換反応により生成したこれらのヌクレオシド
およびリン酸もしくはリン酸塩が、再びピリミジン塩基
とリボ−ス-1- リン酸もしくはデオキシリボ−ス-1- リ
ン酸とに分解し、系全体として平衡状態に至る。
【0016】しかしながら、この発明の方法において
は、さらに、反応溶液中にキサンチンオキシダ−ゼが共
存している。これにより、上記イノシンまたはデオキシ
イノシンの分解により生成したヒポキサンチンは、酸素
とキサンチンオキシダ−ゼにより不可逆的に酸化されて
キサンチンを経て尿酸となる。生成した尿酸は、プリン
ヌクレオシドホスホリラ−ゼおよびピリミジンヌクレオ
シドホスホリラ−ゼの基質ではないので、塩基の交換反
応には関与せず、系から除外される。よって、化学量論
的にイノシンは全てリボ−ス-1- リン酸と尿酸とにな
り、デオキシイノシンは全てデオキシリボ−ス-1- リン
酸と尿酸とになる。
は、さらに、反応溶液中にキサンチンオキシダ−ゼが共
存している。これにより、上記イノシンまたはデオキシ
イノシンの分解により生成したヒポキサンチンは、酸素
とキサンチンオキシダ−ゼにより不可逆的に酸化されて
キサンチンを経て尿酸となる。生成した尿酸は、プリン
ヌクレオシドホスホリラ−ゼおよびピリミジンヌクレオ
シドホスホリラ−ゼの基質ではないので、塩基の交換反
応には関与せず、系から除外される。よって、化学量論
的にイノシンは全てリボ−ス-1- リン酸と尿酸とにな
り、デオキシイノシンは全てデオキシリボ−ス-1- リン
酸と尿酸とになる。
【0017】したがって、生成するヌクレオシドの生成
量は、下式の平衡定数にのみ依存する。
量は、下式の平衡定数にのみ依存する。
【0018】
【化3】 ここで、出発物質としてアデノシン、塩基としてチミン
を用いた場合を考えると、最終生成物である5-メチルウ
リジンは、上記式(2) に従って生成するので、その収量
は反応式(2) の平衡定数 (K=[リボ−ス-1- リン酸][チミン]/[5-メチル
ウリジン][リン酸])= 0.062によって規定される。
アデノシンはアデノシンデアミナ−ゼにより全量イノシ
ンに変換され、さらに、生成したイノシンはプリンヌク
レオシドホスホリラ−ゼとキサンチンオキシダ−ゼによ
り全てリボ−ス-1- リン酸と尿酸になる。したがって、
アデノシンとチミンの初期濃度が等しいとき、反応終了
時のチミンおよび5-メチルウリジンの濃度TおよびMは
下記化4に示す式(4) および(5) によって計算すること
ができる。なお、式中のアデノシンおよびリン酸の初期
濃度はAおよびPである。
を用いた場合を考えると、最終生成物である5-メチルウ
リジンは、上記式(2) に従って生成するので、その収量
は反応式(2) の平衡定数 (K=[リボ−ス-1- リン酸][チミン]/[5-メチル
ウリジン][リン酸])= 0.062によって規定される。
アデノシンはアデノシンデアミナ−ゼにより全量イノシ
ンに変換され、さらに、生成したイノシンはプリンヌク
レオシドホスホリラ−ゼとキサンチンオキシダ−ゼによ
り全てリボ−ス-1- リン酸と尿酸になる。したがって、
アデノシンとチミンの初期濃度が等しいとき、反応終了
時のチミンおよび5-メチルウリジンの濃度TおよびMは
下記化4に示す式(4) および(5) によって計算すること
ができる。なお、式中のアデノシンおよびリン酸の初期
濃度はAおよびPである。
【0019】
【化4】 ヌクレオシドと交換反応を行なう塩基がプリン塩基であ
る場合には、アデノシンまたはデオキシアデノシンから
生じたリボ−ス-1- リン酸またはデオキシリボ−ス-1-
リン酸とプリン塩基との置換反応は、プリンヌクレオシ
ドホスホリラ−ゼによって起こる。これにより、リボ−
ス-1- リン酸とプリン塩基との反応からプリンヌクレオ
シドが生成し、デオキシリボ−ス-1- リン酸とプリン塩
基との反応からはプリンデオキシヌクレオシドが生成す
る。また、この逆反応である、プリンヌクレオシドまた
はプリンデオキシヌクレオシドとリン酸またはリン酸塩
とからプリン塩基とリボ−ス-1- リン酸またはデオキシ
リボ−ス-1- リン酸が生じる反応もプリンヌクレオシド
ホスホリラ−ゼによって起こる。したがって、ヌクレオ
シドと交換反応を行なう塩基がプリン塩基である場合に
は、ピリミジンヌクレオシドホスホリラ−ゼは必要な
い。
る場合には、アデノシンまたはデオキシアデノシンから
生じたリボ−ス-1- リン酸またはデオキシリボ−ス-1-
リン酸とプリン塩基との置換反応は、プリンヌクレオシ
ドホスホリラ−ゼによって起こる。これにより、リボ−
ス-1- リン酸とプリン塩基との反応からプリンヌクレオ
シドが生成し、デオキシリボ−ス-1- リン酸とプリン塩
基との反応からはプリンデオキシヌクレオシドが生成す
る。また、この逆反応である、プリンヌクレオシドまた
はプリンデオキシヌクレオシドとリン酸またはリン酸塩
とからプリン塩基とリボ−ス-1- リン酸またはデオキシ
リボ−ス-1- リン酸が生じる反応もプリンヌクレオシド
ホスホリラ−ゼによって起こる。したがって、ヌクレオ
シドと交換反応を行なう塩基がプリン塩基である場合に
は、ピリミジンヌクレオシドホスホリラ−ゼは必要な
い。
【0020】本発明に用いられるアデノシンデアミナ−
ゼ、キサンチンオキシダ−ゼ、プリンヌクレオシドホス
ホリラ−ゼ、およびピリミジンヌクレオシドホスホリラ
−ゼは、いかなる起源のものでも構わない。この発明に
おいて用いたアデノシンデアミナ−ゼおよびキサンチン
オキシダ−ゼは、ベ−リンガ−・マンハイム山之内社製
の牛乳由来のものである。また、この発明において用い
たプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼおよびピリミジン
ヌクレオシドホスホリラ−ゼは、この2種の酵素を同時
に産生するバチルス・ステアロサ−モスフィルス JTS85
9 より調製した。
ゼ、キサンチンオキシダ−ゼ、プリンヌクレオシドホス
ホリラ−ゼ、およびピリミジンヌクレオシドホスホリラ
−ゼは、いかなる起源のものでも構わない。この発明に
おいて用いたアデノシンデアミナ−ゼおよびキサンチン
オキシダ−ゼは、ベ−リンガ−・マンハイム山之内社製
の牛乳由来のものである。また、この発明において用い
たプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼおよびピリミジン
ヌクレオシドホスホリラ−ゼは、この2種の酵素を同時
に産生するバチルス・ステアロサ−モスフィルス JTS85
9 より調製した。
【0021】この菌株は、通商産業省工業技術院微生物
工業研究所に寄託されており、その寄託番号は、微工研
菌第 9666 号(FERM P-9666 )である。
工業研究所に寄託されており、その寄託番号は、微工研
菌第 9666 号(FERM P-9666 )である。
【0022】この菌株の菌学的性質を、バ−ジェイズ・
マニュアル第2巻に準じて検討した結果を以下に示す。 1.形態 桿菌: 5.4〜6.5 μm× 0.7〜0.9 μm 楕円形の胞子形成: 2.0〜2.3 μm× 1.1×1.2μm、 1細胞に1個、位置は末端 2.培養的性質 NB培地 :62℃、2日間培養 平板上 :白色、僅かに黄色を含む 光沢あり 不透明 盛り上がらない コロニ−の形は円形波状 スラント上:白色、僅かに黄色を含む 光沢あり 不透明 盛り上がらない 生育は中程度 3.生化学的性質 (1) グラム染色 陽性 (2) 嫌気的培養 生育せず (3) 運動性 あり、周毛 (4) オキシダ−ゼ 陽性 (5) カタラ−ゼ 陽性 (6) ゼラチンの液化 液化能あり (7) リトマスミルク 凝固させる (8) OFテスト 発酵タイプ (9) V−Pテスト 陰性 (10)グルコ−スからのガスの発生 発生せず (11)グルコ−スからの酸の産生 産生した (12)アラビノ−スからの酸の産生 産生せず (13)マンニト−ルからの酸の産生 産生した (14)キシロ−ルからの酸の産生 産生せず (15)サブロ−培地での生育 スラント 生育した 液体 生育した (16) 0.001%リゾチ−ム下での生育 生育せず (17) 0.02 %アザイド下での生育 生育せず (18) 7%NaCl下での生育 生育せず ( 2%までは生育した) (19)カゼインの加水分解 分解能あり (20)デンプンの加水分解 分解能あり (21)ジヒドロキシアセトンの生成 生成せず (22)エッグヨ−ク試験 生育せず (23)クエン酸の利用 陰性 (24)インド−ルの産生 陰性 (25)ウレア−ゼ活性 陽性 (26)フェニルアラニンの脱アミノ化 陰性 (27)アルギニンデヒドロラ−ゼ活性 陽性 (28)チロシンの分解 陰性 (29)レバンの産生 陰性 (30)硝酸塩の還元 陽性 (31)硝酸ナトリウムの脱窒能 陰性 (32)硫化水素の生成 陽性 (33)無機窒素源の利用 NO3 を唯一の窒素源として 生育した NH4 を唯一の窒素源として 生育した (34)GC含量 47.3% (35)生育温度 40〜71℃で生育 最適 60〜68℃ (36) pH 範囲 pH 5.7〜8.5 最適pH 6.0〜7.0 この発明の方法において、反応液は、アデノシンまたは
デオキシアデノシン、ウラシル、チミン等の塩基、リン
酸もしくはリン酸カリウム等のリン酸塩、アデノシンデ
アミナ−ゼ、プリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ、ピリ
ミジンヌクレオシドホスホリラ−ゼ、およびキサンチン
オキシダ−ゼを含めばよい。この反応液における、アデ
ノシンまたはデオキシアデノシンの濃度は 5〜100mM、
塩基の濃度は 5〜100 mM、およびリン酸もしくはリン酸
塩の濃度は 5〜20 mM であることが好ましい。アデノシ
ンまたはデオキシアデノシンと塩基とは同一濃度とし、
アデノシンまたはデドキシアデノシンとリン酸もしくは
リン酸塩との濃度比は大きいほうがヌクレオシド化合物
の収率は増加する。反応液の pH は、 7.0〜9.0 、好ま
しくは 7.0〜8.0 である。反応温度は35℃ないし42℃、
好ましくは37℃ないし40℃である。
マニュアル第2巻に準じて検討した結果を以下に示す。 1.形態 桿菌: 5.4〜6.5 μm× 0.7〜0.9 μm 楕円形の胞子形成: 2.0〜2.3 μm× 1.1×1.2μm、 1細胞に1個、位置は末端 2.培養的性質 NB培地 :62℃、2日間培養 平板上 :白色、僅かに黄色を含む 光沢あり 不透明 盛り上がらない コロニ−の形は円形波状 スラント上:白色、僅かに黄色を含む 光沢あり 不透明 盛り上がらない 生育は中程度 3.生化学的性質 (1) グラム染色 陽性 (2) 嫌気的培養 生育せず (3) 運動性 あり、周毛 (4) オキシダ−ゼ 陽性 (5) カタラ−ゼ 陽性 (6) ゼラチンの液化 液化能あり (7) リトマスミルク 凝固させる (8) OFテスト 発酵タイプ (9) V−Pテスト 陰性 (10)グルコ−スからのガスの発生 発生せず (11)グルコ−スからの酸の産生 産生した (12)アラビノ−スからの酸の産生 産生せず (13)マンニト−ルからの酸の産生 産生した (14)キシロ−ルからの酸の産生 産生せず (15)サブロ−培地での生育 スラント 生育した 液体 生育した (16) 0.001%リゾチ−ム下での生育 生育せず (17) 0.02 %アザイド下での生育 生育せず (18) 7%NaCl下での生育 生育せず ( 2%までは生育した) (19)カゼインの加水分解 分解能あり (20)デンプンの加水分解 分解能あり (21)ジヒドロキシアセトンの生成 生成せず (22)エッグヨ−ク試験 生育せず (23)クエン酸の利用 陰性 (24)インド−ルの産生 陰性 (25)ウレア−ゼ活性 陽性 (26)フェニルアラニンの脱アミノ化 陰性 (27)アルギニンデヒドロラ−ゼ活性 陽性 (28)チロシンの分解 陰性 (29)レバンの産生 陰性 (30)硝酸塩の還元 陽性 (31)硝酸ナトリウムの脱窒能 陰性 (32)硫化水素の生成 陽性 (33)無機窒素源の利用 NO3 を唯一の窒素源として 生育した NH4 を唯一の窒素源として 生育した (34)GC含量 47.3% (35)生育温度 40〜71℃で生育 最適 60〜68℃ (36) pH 範囲 pH 5.7〜8.5 最適pH 6.0〜7.0 この発明の方法において、反応液は、アデノシンまたは
デオキシアデノシン、ウラシル、チミン等の塩基、リン
酸もしくはリン酸カリウム等のリン酸塩、アデノシンデ
アミナ−ゼ、プリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ、ピリ
ミジンヌクレオシドホスホリラ−ゼ、およびキサンチン
オキシダ−ゼを含めばよい。この反応液における、アデ
ノシンまたはデオキシアデノシンの濃度は 5〜100mM、
塩基の濃度は 5〜100 mM、およびリン酸もしくはリン酸
塩の濃度は 5〜20 mM であることが好ましい。アデノシ
ンまたはデオキシアデノシンと塩基とは同一濃度とし、
アデノシンまたはデドキシアデノシンとリン酸もしくは
リン酸塩との濃度比は大きいほうがヌクレオシド化合物
の収率は増加する。反応液の pH は、 7.0〜9.0 、好ま
しくは 7.0〜8.0 である。反応温度は35℃ないし42℃、
好ましくは37℃ないし40℃である。
【0023】反応液からの生成物の採取は、オクタデシ
ル基の逆層クロマトグラフィ−により好適に行なうこと
ができる。
ル基の逆層クロマトグラフィ−により好適に行なうこと
ができる。
【0024】
製造例1:プリンヌクレオシドホスホリラ−ゼおよびピ
リミジンヌクレオシドホスホリラ−ゼの粗酵素液の調製 まず、バチルス・ステアロサ−モフィルス JTS859 を、
以下の手順で培養した。
リミジンヌクレオシドホスホリラ−ゼの粗酵素液の調製 まず、バチルス・ステアロサ−モフィルス JTS859 を、
以下の手順で培養した。
【0025】菌の培養には、ペプトン 20 g、イ−スト
エキス 10g、グルコ−ス 3gおよび水 1リットルより
なる pH6.0の培地を用いた。この培地 2リットルに、バ
チルス・ステアロサ−モフィルス JTS859 の胞子 3.2×
107 個を添加し、撹拌翼(直径60mm、上下部各 6枚)を
有するジャ−ファ−メンタ−を用い、撹拌翼を 680rpm
で回転させつつ、通気量 1.5 vvm、培養温度 65 ℃、 p
H5.9〜6.2 で8時間培養した。
エキス 10g、グルコ−ス 3gおよび水 1リットルより
なる pH6.0の培地を用いた。この培地 2リットルに、バ
チルス・ステアロサ−モフィルス JTS859 の胞子 3.2×
107 個を添加し、撹拌翼(直径60mm、上下部各 6枚)を
有するジャ−ファ−メンタ−を用い、撹拌翼を 680rpm
で回転させつつ、通気量 1.5 vvm、培養温度 65 ℃、 p
H5.9〜6.2 で8時間培養した。
【0026】培養終了後、菌体を遠心分離( 10000×
g、 4℃、15分)により集菌した。次いで、粗酵素液を
以下のようにして調製した。
g、 4℃、15分)により集菌した。次いで、粗酵素液を
以下のようにして調製した。
【0027】得られた湿菌 160gを 500mMリン酸カリ
ウム溶液( pH7.0、以下単に「緩衝液」と記述する)に
懸濁し、ダイモミルで菌体を破壊した。次いで、緩衝液
を添加して全体を1400mlとした後、遠心分離(8300×
g、20分)を行ない、上清1300mlを得た。沈殿物はさ
らに 500mlの緩衝液に懸濁して全体を1030mlとした
後、遠心分離(8300×g、20分)を行ない、上清990m
lを得た。この上清 900mlを先の上清1300mlと合わ
せ、63℃で 1時間穏やかに撹拌した。次いで、遠心分離
(8300×g、40分)を行ない、上清2130mlを得た。
ウム溶液( pH7.0、以下単に「緩衝液」と記述する)に
懸濁し、ダイモミルで菌体を破壊した。次いで、緩衝液
を添加して全体を1400mlとした後、遠心分離(8300×
g、20分)を行ない、上清1300mlを得た。沈殿物はさ
らに 500mlの緩衝液に懸濁して全体を1030mlとした
後、遠心分離(8300×g、20分)を行ない、上清990m
lを得た。この上清 900mlを先の上清1300mlと合わ
せ、63℃で 1時間穏やかに撹拌した。次いで、遠心分離
(8300×g、40分)を行ない、上清2130mlを得た。
【0028】この上清2130mlを熱処理した後、 -10℃
に冷却したアセトン 200mlおよび緩衝液 200mlの混
合溶液を添加した。さらに、 -10℃に冷却したアセトン
1.8リットルを添加して 5〜10℃で15分間撹拌した後、
遠心分離(9000×g、 5分)を行なった。得られた上清
に -10℃のアセトン 2.5リットルを添加して15分間撹拌
し、遠心分離(9000g、 5分)を行なって沈殿物を得
た。この沈殿物を 800mlの緩衝液に懸濁させ、アセト
ン処理済み粗酵素液 850mlを得た。 実施例1 5mMのアデノシン、 5mMのチミン、 5mMのリン酸
カリウム、アデノシンデアミナ−ゼ 0.5mg、キサンチ
ンオキシダ−ゼ 2U、および粗酵素液(製造例1で得ら
れたもの) 250μlを含む 1mlの反応液 (pH7.0)を40
℃で13時間反応させ、反応液中に含まれる各成分の濃度
を測定した。その結果を下記表1および図1に示す。
に冷却したアセトン 200mlおよび緩衝液 200mlの混
合溶液を添加した。さらに、 -10℃に冷却したアセトン
1.8リットルを添加して 5〜10℃で15分間撹拌した後、
遠心分離(9000×g、 5分)を行なった。得られた上清
に -10℃のアセトン 2.5リットルを添加して15分間撹拌
し、遠心分離(9000g、 5分)を行なって沈殿物を得
た。この沈殿物を 800mlの緩衝液に懸濁させ、アセト
ン処理済み粗酵素液 850mlを得た。 実施例1 5mMのアデノシン、 5mMのチミン、 5mMのリン酸
カリウム、アデノシンデアミナ−ゼ 0.5mg、キサンチ
ンオキシダ−ゼ 2U、および粗酵素液(製造例1で得ら
れたもの) 250μlを含む 1mlの反応液 (pH7.0)を40
℃で13時間反応させ、反応液中に含まれる各成分の濃度
を測定した。その結果を下記表1および図1に示す。
【0029】また、アデノシンデアミナ−ゼおよびキサ
ンチンオキシダ−ゼを添加しないこと以外は全て上記手
順と同一の条件で反応を行ない、反応後の各成分の濃度
を測定した。その結果を下記表2および図2に示す。
ンチンオキシダ−ゼを添加しないこと以外は全て上記手
順と同一の条件で反応を行ない、反応後の各成分の濃度
を測定した。その結果を下記表2および図2に示す。
【0030】
【表1】
【0031】
【表2】 図1および図2において、縦軸はmMで表わす各成分の
濃度、横軸は反応時間を示す。また、 -▽- はアデノシ
ン、下向き黒三角はアデニン、 -○- はイノシン、 -●
- はヒポキサンチン、 -□- は5-メチルウリジン、 -■
- はチミン、上向き黒三角は尿酸、および -△- はキサ
ンチンをそれぞれ表わす。
濃度、横軸は反応時間を示す。また、 -▽- はアデノシ
ン、下向き黒三角はアデニン、 -○- はイノシン、 -●
- はヒポキサンチン、 -□- は5-メチルウリジン、 -■
- はチミン、上向き黒三角は尿酸、および -△- はキサ
ンチンをそれぞれ表わす。
【0032】図1および図2より明らかなように、アデ
ノシンデアミナ−ゼおよびキサンチンオキシダ−ゼが存
在する場合(図1)には、存在しない場合(図2)よ
り、生成物である5-メチルウリジンの含有量が非常に高
くなっている。特に、キサンチンオキシダ−ゼが存在す
る場合には、イノシン含有量の減少に従ってヒポキサン
チと共にキサンチンおよび尿酸が見られるようになり、
平衡状態では尿酸以外のイノシン、ヒポキサンチンおよ
びキサンチンの含有量がほぼ0になることが示されてい
る。これは、キサンチンオキシダ−ゼにより、全てのヒ
ポキサンチンが酸化されたことを示している。
ノシンデアミナ−ゼおよびキサンチンオキシダ−ゼが存
在する場合(図1)には、存在しない場合(図2)よ
り、生成物である5-メチルウリジンの含有量が非常に高
くなっている。特に、キサンチンオキシダ−ゼが存在す
る場合には、イノシン含有量の減少に従ってヒポキサン
チと共にキサンチンおよび尿酸が見られるようになり、
平衡状態では尿酸以外のイノシン、ヒポキサンチンおよ
びキサンチンの含有量がほぼ0になることが示されてい
る。これは、キサンチンオキシダ−ゼにより、全てのヒ
ポキサンチンが酸化されたことを示している。
【0033】具体的には、アデノシンデアミナ−ゼおよ
びキサンチンオキシダ−ゼが反応系に存在する場合に
は、 3.6mMの5-メチルウリジンが生成した。存在しな
い場合には、5-メチルウリジンの生成量は0.09mMであ
った。
びキサンチンオキシダ−ゼが反応系に存在する場合に
は、 3.6mMの5-メチルウリジンが生成した。存在しな
い場合には、5-メチルウリジンの生成量は0.09mMであ
った。
【0034】このように、アデノシンデアミナ−ゼおよ
びキサンチンオキシダ−ゼの存在下において、より高い
収率で5-メチルウリジンを得ることができた。 実施例2 1〜15mMのチミン、チミンと同じ濃度のアデノシン、
5mMのリン酸カリウム、アデノシンデアミナ−ゼ 0.5
mg、キサンチンオキシダ−ゼ 2U、および粗酵素液
(製造例1で得られたもの) 250μlを含む反応液 1m
lを40℃で反応させ、イノシンが消失したときの5-メチ
ルウリジンの生成量を測定した。その結果を図3に -○
- で示す。この収量は、破線で表わされる、前記化4に
示す式 (4)、(5) で計算した理論曲線と比べて大変よい
一致をみた。 実施例3 5mMのアデノシン、下記表3に示す 5mMの各種塩
基、 5mMのリン酸カリウム、アデノシンデアミナ−ゼ
0.20mg、キサンチンオキシダ−ゼ 0.8U、および粗酵
素液(製造例1で得られたもの) 100μlを含む 0.5m
lの反応液 (pH7.0)を40℃で10時間反応させ、反応液中
に含まれる生成ヌクレオシドの濃度を測定した。その結
果を表3に併記する。
びキサンチンオキシダ−ゼの存在下において、より高い
収率で5-メチルウリジンを得ることができた。 実施例2 1〜15mMのチミン、チミンと同じ濃度のアデノシン、
5mMのリン酸カリウム、アデノシンデアミナ−ゼ 0.5
mg、キサンチンオキシダ−ゼ 2U、および粗酵素液
(製造例1で得られたもの) 250μlを含む反応液 1m
lを40℃で反応させ、イノシンが消失したときの5-メチ
ルウリジンの生成量を測定した。その結果を図3に -○
- で示す。この収量は、破線で表わされる、前記化4に
示す式 (4)、(5) で計算した理論曲線と比べて大変よい
一致をみた。 実施例3 5mMのアデノシン、下記表3に示す 5mMの各種塩
基、 5mMのリン酸カリウム、アデノシンデアミナ−ゼ
0.20mg、キサンチンオキシダ−ゼ 0.8U、および粗酵
素液(製造例1で得られたもの) 100μlを含む 0.5m
lの反応液 (pH7.0)を40℃で10時間反応させ、反応液中
に含まれる生成ヌクレオシドの濃度を測定した。その結
果を表3に併記する。
【0035】
【表3】 実施例4 アデノシンの代わりに 5mMの 2'-デオキシアデノシン
を用いること以外は実施例3と同様の操作を行ない、反
応液中に含まれる生成ヌクレオシドの濃度を測定した。
その結果を表4に示す。
を用いること以外は実施例3と同様の操作を行ない、反
応液中に含まれる生成ヌクレオシドの濃度を測定した。
その結果を表4に示す。
【0036】
【表4】
【0037】
【発明の効果】以上のように、この発明のヌクレオシド
化合物の製造方法は、塩基交換反応を利用して、簡便
に、かつ高収率でヌクレオシド化合物を得ることが可能
である。
化合物の製造方法は、塩基交換反応を利用して、簡便
に、かつ高収率でヌクレオシド化合物を得ることが可能
である。
【図1】この発明の実施例1における反応液中の各成分
の濃度の経時変化を示すグラフ。
の濃度の経時変化を示すグラフ。
【図2】アデノシンデアミナ−ゼおよびキサンチンオキ
シダ−ゼを添加しないこと以外は図1に示すグラフと同
じ条件における反応液中の各成分の濃度の経時変化を示
すグラフ。
シダ−ゼを添加しないこと以外は図1に示すグラフと同
じ条件における反応液中の各成分の濃度の経時変化を示
すグラフ。
【図3】実施例2におけるチミン濃度と5-メチルウリジ
ン生成量との関係を示すグラフ。
ン生成量との関係を示すグラフ。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C07H 19/16 7822−4C
Claims (2)
- 【請求項1】 アデノシンまたはデオキシアデノシンを
アデノシンデアミナ−ゼによりイノシンまたはデオキシ
イノシンに変換し、得られたイノシンまたはデオキシイ
ノシンとピリミジン塩基とを、リン酸またはリン酸塩存
在下の水溶液中において、プリンヌクレオシドホスホリ
ラ−ゼおよびピリミジンヌクレオシドホスホリラ−ゼに
より塩基交換反応させ、さらに、この塩基交換反応によ
り生成したヒポキサンチンをキサンチンオキシダ−ゼに
より尿酸に変換させることを特徴とするヌクレオシド化
合物の製造方法。 - 【請求項2】 アデノシンまたはデオキシアデノシンを
アデノシンデアミナ−ゼによりイノシンまたはデオキシ
イノシンに変換し、得られたイノシンまたはデオキシイ
ノシンとプリン塩基とを、リン酸またはリン酸塩存在下
の水溶液中において、プリンヌクレオシドホスホリラ−
ゼにより塩基交換反応させ、さらに、この塩基交換反応
により生成したヒポキサンチンをキサンチンオキシダ−
ゼにより尿酸に変換させることを特徴とするヌクレオシ
ド化合物の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3230785A JP2534807B2 (ja) | 1991-08-19 | 1991-08-19 | ヌクレオシド化合物の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3230785A JP2534807B2 (ja) | 1991-08-19 | 1991-08-19 | ヌクレオシド化合物の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0549493A true JPH0549493A (ja) | 1993-03-02 |
JP2534807B2 JP2534807B2 (ja) | 1996-09-18 |
Family
ID=16913235
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3230785A Expired - Fee Related JP2534807B2 (ja) | 1991-08-19 | 1991-08-19 | ヌクレオシド化合物の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2534807B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6316228B1 (en) * | 1996-10-21 | 2001-11-13 | The University Of Iowa Research Foundation | Efficient synthesis of nucleosides |
WO2002031176A1 (fr) * | 2000-10-12 | 2002-04-18 | Mitsui Chemicals, Inc. | Procédé permettant la production de nucléosides |
-
1991
- 1991-08-19 JP JP3230785A patent/JP2534807B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6316228B1 (en) * | 1996-10-21 | 2001-11-13 | The University Of Iowa Research Foundation | Efficient synthesis of nucleosides |
WO2002031176A1 (fr) * | 2000-10-12 | 2002-04-18 | Mitsui Chemicals, Inc. | Procédé permettant la production de nucléosides |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2534807B2 (ja) | 1996-09-18 |
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Legal Events
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