JPH05238941A - 薬剤組成物 - Google Patents

薬剤組成物

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JPH05238941A
JPH05238941A JP4090398A JP9039892A JPH05238941A JP H05238941 A JPH05238941 A JP H05238941A JP 4090398 A JP4090398 A JP 4090398A JP 9039892 A JP9039892 A JP 9039892A JP H05238941 A JPH05238941 A JP H05238941A
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antibody
interleukin
fish
optic nerve
conditioned medium
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JP4090398A
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Michal Schwartz
シュワルツ ミカル
Shoshana Eitan
エイタン ショシャナ
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Original Assignee
Yeda Research and Development Co Ltd
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 木発明は、傷害部位に投与された場合傷害さ
れた軸策の再生の誘導と促進に有効な量の、単位投与量
のインターロイキン−２またはインターロイキン−２様
物質と、薬剤として許容される担体または補形剤よりな
る薬剤組成物を与える。 【構成】 インターロイキン−２およびインターロイキ
ン−２様物質は軸策再生を促進する。傷害部位に投与さ
れた場合傷害された軸策の再生の誘導と促進に有効な量
の、単位投与量のインターロイキン−２またはインター
ロイキン−２様物質と、薬剤として許容される担体また
は補形剤よりなる薬剤組成物を傷害部位に投与すること
により、哺乳動物の傷害された中枢神経系の軸策の再生
を誘導および促進することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】
【０００１】本発明は、哺乳動物の中枢神経系の傷害さ
れた神経の再生を促進および増強するための、インター
ロイキン−２（ＩＬ−２）またはＩＬ−２様物質の使用
に関する。
【０００２】下等脊椎動物の中枢神経系（ＣＮＳ）は軸
策（ａｘｏｎ）傷害後の高い再生能力を有しているが、
哺乳動物の中枢神経系は再生能力が低い。この再生能力
の低さの原因の少なくとも一部は、軸策成長を阻害する
成熟した寡突起神経膠細胞の存在にあるとされている。
【０００３】自発的に再生するＣＮＳの代表である魚の
視神経では、再生には再生関連物質の存在をともなうこ
とが証明されており、これは傷害されたウサギ視神経に
使用された時その再生を促進する（シュワルツら（Ｓｃ
ｈｗａｒｔｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）第２２８巻、６０１−６０３頁（１９８５
年）；ラビエら（Ｌａｖｉｅ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．）、ジ
ェイ・コンプ・ニューロル（Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏ
ｌ．）第２９８巻、２９３−３１５頁（１９９０年）；
ヨーロッパ特許第１７２９８７号）。
【０００４】寡突起神経膠細胞に対する細胞毒性はこれ
らの調製物中にあるとされており、おそらくこれにより
魚の視神経は寡突起神経膠細胞に関連する阻害活性を克
服することができる（シブロンら（Ｓｉｂｒｏｎ，Ｔ．
ｅｔ ａｌ．）、グリア（Ｇｌｉａ）第３巻、２６７−
２７６頁（１９９０年））。インビトロでの細胞毒性は
魚の寡突起神経膠細胞のみでなく、ラットの寡突起神経
膠細胞にも細胞毒性であることが証明されている（シブ
ロンら（Ｓｉｂｒｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．）、前期、お
よびコーエン（Ｃｏｈｅｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、ブレ
インリサーチ（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）第５３７巻、２
４−３２頁（１９９０年））。これらの物質は直接的ま
たは間接的にマクロファージまたは他の血液由来細胞に
関連している。
【０００５】ヨーロッパ特許出願第４１５３２１号は、
下等脊椎動物（例えば魚）の再生中の傷害された視神経
の調製培地中に存在するが、下等脊椎動物の無傷の神経
の調整培地や哺乳動物の傷害された神経または無傷の神
経中には存在しない、寡突起神経膠細胞細胞毒性因子に
ついて記載している。
【０００６】インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、Ｉ
Ｌ−１の存在下で抗原または分裂促進因子（ｍｉｔｏｇ
ｅｎ）で活性化後、Ｔ細胞により合成および分泌される
ことが知られているリンフォカインである（スミス（Ｓ
ｍｉｔｈ，Ｋ．Ａ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
第２４０巻、１１６９−１１７６頁（１９８８年））。
免疫系におけるＩＬ−２は、多くの免疫応答の阻害また
は進行に関与する、重要なサイトカインであると考えら
れている（リナングら（Ｌｉｎａｎｇ）、ビオケム・ビ
オフィズ・レス・コム（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）第１６５巻、１３１２−
１３１８頁（１９８９年）。これに対して脳の中でのＩ
Ｌ−２の役割についてはほとんど知られていない。神経
系では寡突起神経膠細胞に対するＩＬ−２の作用に関連
するいくつかの観察は互いに矛盾している
【０００７】最近の研究では寡突起神経膠細胞に対する
阻害効果はＩＬ−２にあるとされているが（サネトら
（Ｓａｎｅｔｏ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．）、プロシーデ
ィングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシーズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第８８巻、９２２１−
９２２５頁（１９８６年）；サネトら（Ｓａｎｅｔｏ，
Ｒ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．）、ジェイ・ニューロサイ・レス
（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．）第１８巻、１４７
−１５４頁（１９８７年）、他の研究ではＩＬ−２の寡
突起神経膠細胞に対する増殖作用を証明している（ベン
ベニステとメリル（Ｅ．Ｎ．Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ ａ
ｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｍｅｒｒｉｌ）、ネーチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）第３２１巻、６１０−６１３頁（１９８６
年））。哺乳動物においてＩＬ−２はリンフォカインの
生成物であることが証明されており（スミス（Ｓｍｉｔ
ｈ，Ｋ．Ａ．）、前記）、いくつかの報告は魚のリンパ
球はＩＬ−２様活性を有するかも知れないと記載してい
る（カスピとアブタリオン（Ｃａｓｐｉ，Ｒ．Ｒ．ａｎ
ｄ Ａｖｔａｌｉｏｎ，Ｒ．Ｒ．）、デブ・コンプ・イ
ムノル（Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）第８
巻、５１−６０頁（１９８４年））。
【０００８】ＩＬ−２とＣＮＳ一般（特に脳）における
傷害との間に関連があることが指摘されている（ニエト
−サンペドロら（Ｎｉｅｔｏ−Ｓａｍｐｅｄｒｏ，Ｍ．
ｅｔａｌ．）、ニューロケム・レス（Ｎｅｕｒｏｃｈｅ
ｍ．Ｒｅｓ．）第１２巻、７２３−７２７頁（１９８７
年）；アラウジョら（Ａｒａｕｊｏ，Ｄ．Ｍ．ｅｔａ
ｌ．）、ブレイン・レス（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）第４
９８巻、２５７−２６６頁（１９８９年））。ニエト−
サンペドロら（Ｎｉｅｔｏ−Ｓａｍｐｅｄｒｏ，Ｍ．ｅ
ｔ ａｌ．）は傷害後の脳にＩＬ−２活性を見いだし
た。同様にリンら（Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、前記）は
ＭＰＰ＋（１−メチル−４−フェニルピリミジン）で作
りだした脳の病変中にＩＬ−２を見いだした。さらに、
傷害後のラットの海馬状隆起中にＩＬ−２結合部位の上
方制御（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）がアラウジョら
（Ａｒａｕｊｏ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．）により観察さ
れた。しかしＩＬ−２とＣＮＳの再生との間にはこれま
で何の関連も示唆されていない。
【０００９】最近の別の研究では、寡突起神経膠細胞に
よる成長妨害を避ける治療法により再生が促進されるか
も知れないことが示唆されている。例えばＴＮＦのよう
な寡突起神経膠細胞に対して細胞毒性を有する因子の適
用（ヨーロッパ特許出願４５５０９３号、およびシュワ
ルツら（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、ブレ
イン・レス（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）第５４５巻、３３
４−３３８頁（１９９１年））、または寡突起神経膠細
胞関連インヒビターに対する抗体の適用（シュネルら
（Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．）、ネーチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）第３４３巻、２６９−２７２頁（１９
９０年））がある。
【００１０】ロビンスら（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａ
ｌ．）（ジェイ・イミュノル（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）
第１３８巻（８）、２５９３−７頁（１９８７年））
は、インビトロでラットの星状細胞を刺激すると、腫瘍
壊死因子に機能が類似している細胞毒性因子の再生が起
きることを報告している。かれらはまた、ヒト組換え腫
瘍壊死因子は、ラットの寡突起神経膠細胞に対して細胞
毒性を有することも報告している。セルマジら（Ｓｅｌ
ｍａｊ ｅｔ ａｌ．）（アン・ニューロル（Ａｎｎ．
Ｎｅｒｕｒｏｌ．）第２４巻（４）、３３９−４６頁
（１９８８年））は、マウスの脊髄組織の髄鞘を有する
培養物に対する、組換えヒト腫瘍壊死因子（ｒｈＴＮ
Ｆ）の影響について報告した。かれらはｒｈＴＮＦは遅
延型の寡突起神経膠細胞壊死（ｄｅｌａｙｅｄ−ｏｎｓ
ｅｔ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｎｅｃｒｏｓｉ
ｓ）と１つの型の髄鞘拡張（ｍｙｅｌｉｎ ｄｉｌａｔ
ａｔｉｏｎ）を誘導することを見いだした。
【００１１】世界中で多くの研究努力がなされているに
もかかわらず、哺乳動物（特にヒト）でＣＮＳの再生を
起こす安全で有効な方法はまだ開発されていない。この
ような方法は、そして特に目的の再生部位に注入できる
薬剤組成物は、傷害後の両側痺痳または四肢痺痳、盲
目、難聴、手術にともなう軸策切断などを緩和するのに
非常に好ましい。
【００１２】
【発明の要約】本発明によれば、インターロイキン−２
およびインターロイキン−２様物質は軸策再生を促進す
ることが明かになった。さらに魚の視神経由来の寡突起
神経膠細胞に対する細胞毒性物質はＩＬ−２様物質であ
ることも明かになった。
【００１３】従って本発明は、哺乳動物（特にヒト）の
ＣＮＳ軸策の再生の誘導や再生のための薬物の調製へ
の、ＩＬ−２およびＩＬ−２様物質の使用を与える。
【００１４】本発明の目的は、傷害部位に投与された場
合傷害された軸策の再生の誘導と促進に有効な量の、単
位投与量のインターロイキン−２またはインターロイキ
ン−２様物質と、薬剤として許容される担体または補形
剤よりなる薬剤組成物を与えることである。
【００１５】本発明の別の目的は、傷害部位に有効量の
インターロイキン−２またはインターロイキン−２様物
質を投与することよりなる、哺乳動物の傷害された中枢
神経系の軸策の再生を誘導および促進する方法を与える
ことである。
【００１６】本発明のさらに別の目的は、魚の視神経由
来の寡突起神経膠細胞細胞毒性因子、インターロイキン
−２様物質を与えることである。
【００１７】図１は、抗−ＩＬ−２抗体は調整培地（Ｃ
Ｍ）中の魚の可溶性物質の寡突起神経膠細胞に対する細
胞毒性作用を中和することを示す。
【００１８】図２は、マウス抗−ヒトＩＬ−２モノクロ
ーナル抗体を用いる魚の視神経の可溶性物質のウェスタ
ンブロット解析を示す。
【００１９】図３は、魚の視神経調整培地由来のＩＬ−
２様因子のアフィニティ精製を示す。
【００２０】図４は、ラットの脳の寡突起神経膠細胞培
養物中の組換えマウスＩＬ−２による寡突起神経膠細胞
の数の減少を示す。
【００２１】図５は、組換えマウスＩＬ−２により引き
起こされた成熟寡突起神経膠細胞（ＧａＬＣで標識され
ている）の数の減少を示す。
【００２２】図６は、横に切断されたインターロイキン
−２処理神経中で新しく成長している繊維を示す。
【００２３】
【好適な態様の詳細な説明】哺乳動物におけるＣＮＳ傷
害部位での軸策の再生は、傷害部位へＩＬ−２またはＩ
Ｌ−２様物質を投与することにより誘導および促進され
る。ＩＬ−２またはＩＬ−２様物質は治療している哺乳
動物と同じ種であることが好ましいが、これはどうして
も必要なわけではない。
【００２４】本発明においてＩＬ−２様物質とは、ＩＬ
−２に対する抗体と交差反応する物質である。ムテイン
（ｍｕｔｅｉｎｓ）や、天然のヒトＩＬ−２に比較して
アミノ酸残基が添加、欠失または置換された修飾ＩＬ−
２物質、および薬剤組成物として使用できるように物理
的性質を改良するために分子の一部や他のペプチド配列
が添加されたＩＬ−２誘導体も、それらがインビボで傷
害された哺乳動物の軸策の再生を誘導および促進する性
質を有する限り、この定義に含まれる。この機能は過度
の実験をしなくても、寡突起神経膠細胞に対する選択細
胞毒性をインビトロで試験することにより調べることが
できる。
【００２５】本発明で使用されるＩＬ−２は任意の種の
天然のＩＬ−２および任意の種の組換えＩＬ−２を含
む。ＩＬ−２は任意の従来技術、例えばロブらの方法
（Ｒ．Ｊ．Ｒｏｂｂ ｅｔ ａｌ．プロシーディングズ
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第８０巻、５９９０頁（１９８３
年））により得られる。好ましくはＩＬ−２は組換えＤ
ＮＡ法、例えばタニグチら（Ｔ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ
ｅｔ ａｌ．）の方法（ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第
３０２巻、３０５−３１０頁（１９８３年））、または
デボス（Ｄｅｖｏｓ，Ｒ．）の方法（ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ）第１１巻、４３０７−４３２３頁（１９
８３年））により得られる。組換えヒトＩＬ−２（ｒｈ
ＩＬ−２）は現在市販されている。いくつかのＩＬ−２
ムテインは米国特許第４，５１８，５８４号に記載の方
法で得られる。
【００２６】本発明で使用される好適なＩＬ−２は、実
質的に精製された型の魚の視神経由来の寡突起神経膠細
胞細胞毒性因子である。もともとＥＰ４１５３２１号に
初めて記載されたこの因子は、充分に性状解析されてお
り精製された型で得られている。
【００２７】本発明によれば、魚の視神経由来の寡突起
神経膠細胞細胞毒性因子はＩＬ−２様物質であることが
以下の事実により確認されている：（１）これは抗−Ｉ
Ｌ−２抗体のアフィニティクロマトグラフィーにより精
製された；（２）ＩＬ−２に対する抗体は再生中の魚の
視神経由来の調整培地の細胞毒性活性を中和した；
（３）ウェスタンブロット解析により魚調整培地中に２
８ｋＤａのＩＬ−２免疫反応性バンドの存在が認められ
た；そして（４）組換えマウスＩＬ−２はインビトロで
寡突起神経膠細胞に対して選択的細胞毒性を有していた
が星状細胞に対しては細胞毒性がなかった。
【００２８】組換えマウスＩＬ−２よりも魚の調整培地
中のＩＬ−２様物質の活性が高いということは、活性の
特異性は種ではなく組織により決定されることを示唆し
ている。すなわち中枢神経系由来の魚ＩＬ−２は、免疫
由来の組換えＩＬ−２とはおそらく異なり、魚の視神経
の活性分子は免疫由来のＩＬ−２の変化したものである
ことを示している。これは魚の血液のリンパ球中のＩＬ
−２免疫反応性物質は約１４ｋＤａのポリペプチドであ
り、神経中のＩＬ−２様物質のような２８ｋＤａポリペ
プチドではないという、図２に示す結果によりさらに支
持されている。
【００２９】実質的に精製された型の魚の視神経由来の
寡突起神経膠細胞細胞毒性因子は、ウェスタンブロット
解析による分子量が約２８ｋＤａのＩＬ−２様物質であ
る。これは下等脊椎動物（例えば魚）の再生中の傷害さ
れた神経の調整培地に存在するが、下等脊椎動物の無傷
の神経の調整培地や哺乳動物の傷害されたかまたは無傷
の神経の調整培地中には存在しない。これは寡突起神経
膠細胞系統には選択的に毒性を有するが、１型星状細胞
（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）や繊維芽細胞には毒性がな
い。この細胞毒性活性はＩＬ−２に対する抗体により中
和される。
【００３０】精製された魚寡突起神経膠細胞細胞毒性因
子はアフィニティ精製により得られる。破砕した再生中
の魚の視神経とインキュベートした無血清培地により調
製された該因子を含む調整培地を、ＩＬ−２に対する抗
体を含むカラムに適用し、結合した物質を適当な溶媒で
溶出し、寡突起神経膠細胞に対する細胞毒性とウェスタ
ンブロット解析により確認した２８ｋＤａの因子を含む
画分を得る。
【００３１】アフィニティ精製法では任意の抗−ＩＬ−
２抗体が使用できる。好ましくは抗−ヒトＩＬ−２抗
体、そして特に組換えヒトＩＬ−２に対するマウスモノ
クローナル抗体が、適当な樹脂（例えばポリアクリルヒ
ドラジドアガロース）に結合されて使用される。結合さ
れた物質の溶出は、例えばグリシンで実施する。
【００３２】本発明においてＩＬ−２およびＩＬ−２様
物質は、哺乳動物（特にヒト）のＣＮＳ軸策の再生を促
進するのに充分な量と純度のものが使用される。精製さ
れた寡突起神経膠細胞細胞毒性因子はＩＬ−２よりも強
力であることが証明されたため、これはＩＬ−２より少
ない量で使用される。これらは再生すべき傷害された軸
策の近傍に与えるのに適当な任意の方法で投与される。
これらは好ましくは、薬剤として許容される液体担体中
で、部位に直接注射される。
【００３３】あるいはＩＬ−２およびＩＬ−２様物質を
有する移植組織（ｉｍｐｌａｎｔ）を外科的に挿入して
もよい。このような移植組織は、スポンジのように活性
物質を吸収し移植部位で徐々に放出する任意の物質（例
えばニトロセルロース）で構成される。他の投与方法も
当業者には明かであり、それらも本発明の範囲に含まれ
る。
【００３４】特定の患者に投与されるＩＬ−２およびＩ
Ｌ−２様物質の量は、治療すべき部位、再生すべき傷害
された軸策部位そして患者の状態などの種々の因子によ
り変わる。しかし典型的には、ＩＬ−２およびＩＬ−２
様物質は１回の注射として、またはニトロセルロースや
他の吸収性担体にしみ込ませて投与される。正確な投与
量は経験的に決定される。
【００３５】ＩＬ−２およびＩＬ−２様物質は好ましく
は、治療すベき傷害の直後に投与される。すなわちこれ
は慢性の傷害よりも急性の傷害で使用することが好まし
い。変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の時期が長いほ
ど本発明による再生の促進は難しくなるであろう。
【００３６】ＩＬ−２およびＩＬ−２様物質のみの投与
で良好は結果は得られるが、治療にその効果を増強する
ような任意のタイプの治療を同時に組合せてもよい。例
えば低エネルギーレーザー（好ましくはＨｅ−Ｎｅレー
ザー、５分／日、３５ｍＷ）で傷害部位を照射すると、
傷害後の変性過程を遅延させ傷の形成を遅らせることが
できる。アッシアら（Ａｓｓｉａ ｅｔ ａｌ．）、ブ
レイン・レス（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）第４７６巻、２
０５−２１２頁（１９８８年）を参照。
【００３７】本発明により治療される種々の傷害は無数
にあり、当業者には明かである。例えば神経の疾患、圧
力または虚血によるＣＮＳ軸策の急性または亜急性の傷
害（例えば緑内障）、前方虚血性視神経傷害（ａｎｔｅ
ｒｉｏｒ ｉｓｃｈｅｍｉｃｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐ
ａｔｈｙ）、脊髄傷害、視神経への傷害または聴覚神経
への傷害などがあるが、これらに限定されるものではな
い。神経の手術または腫瘍に起因するＣＮＳニューロン
への傷害も本発明の方法により治療される。
【００３８】本発明の目的のために、ＩＬ−２およびＩ
Ｌ−２様物質は薬剤としてまたは獣医学的に許容される
担体または希釈剤とともに製剤化される。これらは水溶
液（例えば無菌水溶液）として与えられる。ＩＬ−２お
よびＩＬ−２様物質を含有する溶液または粉末は、安定
剤で安定化される。これは単位投与量の注射できる型
（溶液、懸濁液、乳液）で、好ましくは本質的に非毒性
で非治療的な薬剤として許容される担体媒体中で製剤化
される。このような担体の例としては生理食塩水、リン
ゲル液、ショ糖溶液、マンニトールおよび正常血清アル
ブミンがある。固定油やオレイン酸エチルなどの非水溶
性賦形剤も使用できる。担体媒体は、等張性、溶解度お
よび／または化学的安定性を増強する物質（例えば緩衝
液、界面活性剤そして保存剤）などの添加剤を少量含有
していてもよい。他の適応症でＩＬ−２の種々の製剤が
すでに公知である。このような製剤は、ＩＬ−２の所期
の機能が影響を受けない限り、本発明の目的のために使
用することもできる。
【００３９】本発明によれば、ＩＬ−２様物質が魚の視
神経由来の可溶性物質中に存在し、そのレベルが傷害後
上昇するという免疫化学的証拠が与えられる。この物質
は性状解析され、先に記載した寡突起神経膠細胞細胞毒
性因子であると同定されている。哺乳動物のＩＬ−２に
対する抗体は、ラットの脳の寡突起神経膠細胞に対する
その作用を中和する。さらに組換えマウスＩＬ−２はイ
ンビトロで成熟ラット寡突起神経膠細胞に対して細胞毒
性があり、インビボで傷害されたウサギの視神経の軸策
成長を促進することは証明されている。
【００４０】以下の実施例により本発明を説明する。 実施例
【００４１】実験法 ａ． 再生中の魚の視神経からの可溶性物質の調製 １日間順化させた鯉（サイプリナスカルピオ（Ｃｙｐｒ
ｉｎｕｓ ｃａｒｐｉｏ）、８００−１２００ｇ、チュ
ーバ（Ｔｈｕｖａ）、イスラエル）を０．０５％のトリ
カインメタンスルホネート（ｔｒｉｃａｉｎｅ ｍｅｔ
ｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（シグマ社（Ｓｉｇｍ
ａ）、米国ミズーリ州セントルイス市）で麻酔をかけ、
その視神経をピンセットで破砕した（３０秒間）。回り
の組織はそのままで視神経のみ傷つけるように注意し
た。傷害後８日目に、破砕された再生中の神経を切断し
て取り出し、無血清培地（ＤＭＥＭ）中で２５℃で１．
５時間インキュベートした（培地３００μｌにつき神経
４切片）。次に得られた培地（調整培地（ＣＭ）と定義
した）を集め、その蛋白含量をブラッドフォード定量法
（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）により測定した。５
０μｌまたは５００μｌずつ分注して−７０℃中に保存
した。
【００４２】ｂ． 魚のリンパ球で調整した培地の調製 魚を３−アミノ安息香酸エチルエステル（シグマ社（Ｓ
ｉｇｍａ））で麻酔した。眼腔の頸動脈を切断してか
ら、眼窩からの血液をヘパリン硫酸（１００Ｕ／ｍｌ；
ビーディーエィチケミカルズ（ＢＤＨ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ））を含む試験管中に集めた。この血液を等量のリ
ン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して、５分間放
置してからファイコール（Ｆｉｃｏｌｌ）またはパーコ
ール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）溶液の上に重層した。使用直前
に２９．４％のソヂウムジアトリゾエート（ｓｏｄｉｕ
ｍ ｄｉａｔｒｉｚｏａｔｅ）（シグマ社（Ｓｉｇｍ
ａ））使用溶液を７０．６％のファイコール原液と混合
して密度１．０６ｇ／ｍｌを得た。パーコール溶液を使
用した場合は、４４．６ｍｌのパーコール（ファルマシ
ア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、１０ｍｌの１００ｍＭ
クエン酸（メルク社（Ｍｅｒｃｋ））、１０ｍｌの５％
牛血清アルブミン（ＢＳＡ；シグマ社（Ｓｉｇｍ
ａ））、そして３５．４ｍｌのＰＢＳを混合してパーコ
ール原液（１．０６ｇ／ｍｌ）を作成した。この溶液１
５ｍｌを、５０ｍｌの無菌コレックス（Ｃｏｒｅｘ）
（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｇ））遠心分離管中に入れ
た。この溶液の上に、希釈した血液３０ｍｌを小さいピ
ペットで注意深く重層した。遠心分離管にふたをしてス
イング型バケット中で８００×ｇで２０℃で３０分間遠
心分離した。
【００４３】遠心分離後界面に白血球が見られ、これは
パスツールピペットで簡単に取り出すことができた。５
０ｍｌの試験管中に白血球を集めＰＢＳで２回洗浄し
た。ペニシリンとストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍ
ｌ）を含む少量のＬ−１５培地中に細胞を懸濁した後、
細胞数を数えた。細胞を希釈して２０×１０７細胞／ｍ
ｌとし、その１０ｍｌを７５ｃｍ２フラスコ（ファルコ
ン社（Ｆａｌｃｏｎ））中に入れた。フラスコを２０℃
で１時間放置し、付着しなかった細胞を取り出して２番
目のフラスコ中に入れた。これを繰り返し、１時間後付
着しなかった細胞を３番目のフラスコに入れた。１番目
と２番目のフラスコを１００ｍｌのＰＢＳで激しく撹拌
して２回洗浄した。１番目のフラスコにはマクロファー
ジが濃縮された培養物が含まれ、３番目のフラスコには
リンパ球が濃縮された培養物が含まれていた。１０ｍｌ
の培地を加えてすべてのフラスコを８時間インキュベー
トした後、上澄液を集め、２０００×ｇで５−１５分間
遠心分離した。次に上澄液をセントリコン（Ｃｅｎｔｒ
ｉｃｏｎ）またはアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）装置（アミ
コン社（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏｒｐ．））で２５−１００
倍濃縮した。そしてこの試料を４℃で保存した。
【００４４】ｃ． ラットの脳の寡突起神経膠細胞培養
物の調製と免疫蛍光染色 濃縮寡突起神経膠細胞培養物の調製のために、ラットの
新生児の脳（２日令）を切り出し［２ｍｌのライボウィ
ッツ（Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ）培地（Ｌ−１５）に２個の
脳；ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））、１ｍＭのエチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するＤＭＥＭ（Ｃａ２＋
とＭｇ２＋を含まない）中の３×１０４Ｕ／ｍｌのトリ
プシン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））で化学的に分解し
た。トリプシン溶液で３７℃で１０分間インキュベート
する前に機械的分解を行った。次に細胞を、７４Ｕ／ｍ
ｌのＤＮａｓｅ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））、５２００
Ｕ／ｍｌの大豆トリプシン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））
および３ｍｇのＢＳＡ溶液１ｍｌを含有する１５ｍｌ容
の円錐試験管中に移し、室温で１分間インキュベート
し、１０ｍｌの培地中に加えた後、ＤＭＥＭ中で３回洗
浄した。最後の洗浄後、細胞を５−１０％の胎児牛血清
（ＦＢＳ；シグマ社（Ｓｉｇｍａ）−５６℃で３０分間
熱処理されている）を含有する１０ｍｌのＤＭＥＭ中に
懸濁し、メッシュに通し、２０μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−
リジン（ピーエルエル（ＰＬＬ）、分子量１００００
０；（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））で３７℃で一晩あらか
じめ被覆しておいた８５ｍｍ２のフラスコ（ヌンク社
（Ｎｕｎｃ））中に接種した。
【００４５】細胞接種後最初の２４時間目に培地を交換
し、その後２−３日毎に１回交換した。接種後８日目に
細胞を撹拌しながら４−６時間インキュベートし、上澄
液を除去し残存する細胞を１０ｍｌの培地（ＤＭＥＭ＋
５−１０％ＦＢＳ）中でさらに数時間インキュベート
し、次に一晩撹拌した。撹拌により除去された細胞を集
めて遠心分離し、ペレットになった細胞を１−２ｍｌの
無血清培地（ボッテンシュタインら（Ｂｏｔｔｅｎｓｔ
ｅｉｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．）、プロシーディングズ
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第７６巻、５１４−５１７頁（１
９７９年））中に再懸濁した。
【００４６】こうして得られた濃縮した寡突起神経膠細
胞培養物の回収した細胞を、あらかじめＰＬＬ（２０μ
ｇ／ｍｌ）で被覆したガラスのカバースリップ（１３ｍ
ｍ；３×１０５細胞／ウェル）上に接種した。このガラ
スのカバースリップを２４ウェルのプレート（ヌンク社
（Ｎｕｎｃ））中に入れた。接種中まず細胞懸濁液５０
μｌを各カバースリップに添加し、３７℃で３０分間放
置して付着させた。次に細胞をＤＭＥＭで洗浄した後、
５００μｌの規定培地（ボッテンシュタイン（Ｂｏｔｔ
ｅｎｓｔｅｉｎ’ｓ）とサトウ（Ｓａｔｏ’ｓ）の規定
培地に対するラフの（Ｒａｆｆ’ｓ）改変培地）を加え
た。４８時間後接種した細胞を調整培地か、またはウサ
ギ抗−ヒトＩＬ−２抗体（ジェンザイム社（Ｇｅｎｚｙ
ｍｅ））または対照抗体（ウサギ抗神経繊維（ｎｅｕｒ
ｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ））で２時間プレインキュベート
した調整培地で処理した。
【００４７】成熟した寡突起神経膠細胞（すなわちガラ
クトセレブロシド（ｇａｌａｃｔｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉ
ｄｅ、ＧａｌＣ）陽性細胞）の数を以下のような免疫蛍
光法で測定した：２％ＦＢＳを含有するハンクスバラン
スト塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＨＢＳＳ）で細胞を完全に洗浄
し、熱により不活性化処理をして、５０μｌの抗−Ｇａ
ｌＣモノクローナル抗体（ＩｇＧ３、ＤＭＥＭで１：５
に希釈したハイブリドーマの上澄液、セロテック社（Ｓ
ｅｒｏｔｅｃ））とともに３７℃で３０分間インキュベ
ートした。インキュベートの最後に細胞を洗浄し、５０
μｌのフルオレセン結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ３（ＤＭ
ＥＭで１：５０に希釈）とともにインキュベートし、次
に洗浄しメタノールで−２０℃で１０分間固定した。最
後の洗浄後、細胞を２２ｍＭの１，４−ジアゾビシクロ
（２，２，２）オクテインを含有するグリセロールで被
覆した。対照として、１次抗体を省略した以外は同じ染
色方法を行ったカバースリップを使用した。カバースリ
ップをガラススライドの上に置き、マニキュア液で封入
し、４℃で保存した。全カバースリップ上の細胞を数え
た。
【００４８】ｄ． ＩＬ−２免疫反応性蛋白のウェスタ
ンブロット解析 試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動した。ゲルを２０
０ｍＡで２時間ニトロセルロース上へブロットした。５
％のミルクを含むＰＢＳでニトロセルロースを３７℃で
２時間インキュベートし、次にＰＢＳで洗浄した。
【００４９】ブロットをウサギ抗−ＩＬ−２抗体で３７
℃で２時間インキュベートした後、３回洗浄（各回０．
０５％ツイーン−２０を含有するＰＢＳを５分間）し、
最後にブロットを［１２５Ｉ］−標識ヤギ抗−ウサギ抗
体（１０６ｃｐｍ／ｍｌ）で３７℃で２時間インキュベ
ートし、０．０５％ツイーン−２０を含有するＰＢＳで
３回洗浄し、乾燥してオートラジオグラフ（放射能写
真）をとった。
【００５０】実施例１．再生中の魚の視神経で調整した
培地の寡突起神経膠細胞に対する細胞毒性は抗−ＩＬ−
２抗体で中和できる
【００５１】再生中の魚の視神経で調整した培地をＩＬ
−２に対する抗体で処理して、細胞毒性活性が消失する
か否かを調べた。ＩＬ−２に対する抗体は調整培地の細
胞毒性作用を中和することがわかった。
【００５２】組換えヒトＩＬ−２抗体に対するウサギポ
リクローナル抗体による、寡突起神経膠細胞に対する魚
の可溶性物質の細胞毒性作用の、中和作用を評価した。
結果を図１に示す。４８時間後に寡突起神経膠細胞培養
物に、調整培地（単独で、または組換えヒトＩＬ−２に
対するウサギのポリクローナル抗体であらかじめインキ
ュベートしたもの）を加え、さらに４８時間インキュベ
ートした。神経繊維（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ）
に対する抗体を対照として使用した。寡突起神経膠細胞
は免疫蛍光法により同定した。
【００５３】再生中の魚の視神経から得られた可溶性物
質の最高濃度（５μｇ蛋白）は約６０％の細胞毒性を示
し、抗−ＩＬ−２抗体による中和は見られなかった；
０．５μｇの調整培地は４２％の細胞毒性を示し、その
半分は抗体により中和された；調整培地０．２μｇのみ
を使用した場合は等量の抗体で完全な中和が見られた。
結果は、抗体のみで処理利した細胞毒性のない対照培養
物（１００％生存、細胞毒性なし）に対する細胞毒性％
で示してある。すべての実験を３回繰り返し、０．１μ
ｇの抗−ＩＬ−２抗体（ＩｇＧ）を用いて行った。１つ
の実験の結果をこの図に示す；ＣＭは調整培地を示す。
各カバースリップ中で数えられたＧａＬＣ陽性細胞の総
絶対数は種々の実験で３００から５００個の範囲にあっ
た。挿入図は１０倍量の抗−ＩＬ−２抗体（すなわち１
μｇのＩｇＧ）を用いて実施した基本的に同じ実験であ
る。
【００５４】図から明かなように組換えマウスＩＬ−２
に対する抗体は調整培地の細胞毒性を中和した。抗体の
量を一定に保った場合（０．１μｇＩｇＧ画分；１μｇ
は１ＵのＩＬ−２を中和する）、達成される中和の程度
は適用した調整培地の濃度の関数であり、完全な中和が
得られる最低の試験濃度は０．２μｇ／ｍｌ総蛋白であ
った。１０倍量の抗体（１μｇのＩｇＧ画分）では、よ
り高濃度の調整培地（すなわち０．５と５μｇ／ｍｌ）
が中和された（図１、挿入図）。これらの結果から、そ
して本測定で中和に使用したＩＬ−２抗体の力価を考え
ると、１μｇの調整培地は０．５−２Ｕの生物学的に活
性なＩＬ−２様分子を含有すると推定される。
【００５５】実施例２ 魚の調整培地由来のＩＬ−２様
分子の性状解析 ＩＬ−２様分子の大きさを求めるために、可溶性物質を
含有する魚の視神経調整培地を、ヒトＩＬ−２に対する
マウスのモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロッ
トを行った。視神経調整培地（ＣＭ、４００μｇ）、魚
の血液のリンパ球（ＬＭＰ、１６μｇ）、そしてマウス
ＩＬ−２（７５μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動
した。レーン１は抗−ＩＬ−２抗体でインキュベートし
た調整培地（ＣＭ）を含有する。レーン２は第２抗体の
みで反応させた調整培地を含有する対照スロットであ
る。レーン３は抗−ＩＬ−２抗体でインキュベートした
魚リンパ球（ＬＭＰ）で調整した培地を含むスロットで
ある。各レーン（レーン２は除く）の左側の矢印は各ス
ロットのＩＬ−２免疫反応性バンドを示す。同じゲルの
上で分子量マーカーを電気泳動し、ゲル上に印をつけて
ある。
【００５６】図２は分子量２８ｋＤａの位置に、単一の
ＩＬ−２免疫反応性バンドが存在することを示す。リン
パ球はＩＬ−２を産生することが知られているため、同
じ実験条件下で同じ抗体の相互作用を魚のリンパ球と比
較した。図２に示すように約１４ｋＤａの単一のＩＬ−
２免疫反応性バンドが認められた。これらの結果は、Ｉ
Ｌ−２またはＩＬ−２抗体と交差反応する分子が、寡突
起神経膠細胞に対する細胞毒性作用に関与している可能
性を示唆している。
【００５７】実施例３． 魚調整培地からの寡突起神経
膠細胞細胞毒性因子のアフィニティ精製 以下のようにＩＬ−２アフィニティカラムを用いて細胞
毒性物質の精製を行った。
【００５８】組換えヒトＩＬ−２抗体に対するマウスモ
ノクローナル抗体を、ポリアクリルヒドラジドアガロー
ス（バイオマコール（ＢｉｏＭａｋｏｒ）、イスラエ
ル）に結合させた。ウィルチェックとミロン（Ｗｉｌｃ
ｈｅｋ ａｎｄ Ｍｉｒｏｎ）の方法（メソッズ・イン
・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）第
３４巻、７２−７６頁（１９７４年））を使用して、パ
ックした樹脂の０．１ｍｌを０．５ｍｇの抗体に結合さ
せた。精製は以下の様にして行った：抗体の結合したパ
ックした樹脂に調整培地（５０μｌ）を添加し、ここに
抗−ＩＬ−２抗体を結合させ、３７℃で２時間インキュ
ベートした。次に上澄液を集め、残りの樹脂を３回（毎
回１ｍｌのＰＢＳを使用）洗浄した。５０μｌのグリシ
ン（０．２Ｍ、ｐＨ２．７）を用いて室温で１０分間撹
拌して溶出した。溶出した物質（ＥＬＵ）を１０μｌの
トリス緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８．０）の中に集めた。ＩＬ
−２結合物質を含有する画分について、寡突起神経膠細
胞の数と従ってその細胞毒性の評価のためのＭＴＴ（３
−（４，５ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−
ジフェニルテトラゾリウムブロミド）比色法（シグマ社
（Ｓｉｇｍａ））を用いて、寡突起神経膠細胞に対する
それらの細胞毒性作用を試験した（モスマン（Ｍｏｓｍ
ａｎｎ，Ｔ．）、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・
メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．）第６５
巻、５５−６３頁（１９８３年））。
【００５９】測定は以下のようにして行った：細胞を調
整培地のみ、または抗−ＩＬ−２抗体のカラムから溶出
した結合物質（ＥＬＵ）で処理した。測定で使用した溶
出物質（ＥＬＵ）の最終希釈倍率は粗調整培地の希釈倍
率に対応した。４８時間インキュベートしてから１０μ
ｌのＭＴＴを３時間添加した；次に培地を除去しイソプ
ロパノール中の１００μｌの０．０４Ｎ ＨＣｌを加え
た。すべての結晶が溶解するまで細胞を静かに撹拌し、
６００ｎｍの対照波長に対して５５０ｎｍの吸光度を測
定した。
【００６０】ＭＴＴ比色法により評価した寡突起神経膠
細胞に対する細胞毒性は、カラムに結合してあった抗−
ＩＬ−２抗体に結合した物質の溶出により、再生中の魚
の視神経で調整した培地（実験法（ａ））から回収され
た。対照は未処理の培養物または、溶出緩衝液（バッフ
ァー）を含む培地で処理した培養物であり、カラムから
の結合物質の溶出に使用した緩衝液に起因するかも知れ
ない溶出液中の細胞毒性の可能性を排除している。この
実験は３回繰り返しており、それぞれ３重測定をしてお
り、結果は未処理培養物値（生存率１００％を意昧す
る）の平均±標準偏差（ＳＤ）で示してある。繰り返し
測定法による分析は、溶出物質（ＥＬＵ）の影響は２つ
の対応する対照培養物とは有意（Ｐ＜０．０５）に異な
っていることを示していた。
【００６１】図３に示すように、カラムから溶出したＩ
Ｌ−２結合物質は寡突起神経膠細胞に対して細胞毒性を
有していた。精製の規模が小さいため溶出液の比活性は
計算できなかった。しかし蛋白検出について知られてい
る限界を考えると、溶出液の比活性は調整培地の比活性
より少なくとも１０３倍高いことが推定できた。細胞毒
性活性を保持していることがわかった溶出液を、抗−Ｉ
Ｌ−２抗体を用いてウェスタンブロット解析をすると、
元々の２８ｋＤａの免疫反応性ポリペプチドの存在が証
明された（データは示してない）。従ってこれらの結果
はＩＬ−２免疫反応性２８ｋＤａ蛋白と細胞毒性をつな
ぐものである。
【００６２】実施例４． 組換えマウスＩＬ−２は寡突
起神経膠細胞に対して選択的毒性を有する。 細胞の接種４８時間後に、組換えマウスＩＬ−２（０−
１５０Ｕ／ｍｌ）をラットの寡突起神経膠細胞の濃縮培
養物（ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（実験法
で記載した方法で調製した）に適用した。細胞の数はＧ
ａＬＣに対する抗体を使用して評価した。そして成熟寡
突起神経膠細胞の数に対する影響を免疫蛍光法で測定
し、標識された細胞の数は蛍光顕微鏡で数えた。未処理
の細胞を対照（毒性なし）として使用した。図１に見ら
れるように、ガラクトセレブロシド（ＧａＬＣ）陽性細
胞の数に反映されているように、ＩＬ−２は成熟寡突起
神経膠細胞の数の有意な減少を引き起こした。ＩＬ−２
高濃度では、ＧａＬＣ陽性細胞の数に反映されているよ
うに、成熟寡突起神経膠細胞の数は有意に減少していた
（１５０Ｕ／ｍｌで８８．６±１５．３％細胞毒性；分
散分折（ＡＮＯＶＡ）でＰ＜０．０００５）（図４）。
成熟寡突起神経膠細胞（ＧａＬＣで標識されている）の
数に対する組換えマウスＩＬ−２（２００Ｕ／ｍｌ）の
影響を示す代表的な顕微鏡写真を図５（ｂ、ｄ）に示
す。図５は抗ＧａｌＣ抗体で染色したＩＬ−２処理細胞
（ｂ）と未処理細胞（ｄ）の蛍光顕微鏡写真である。
（ｂ）と（ｄ）の視野の位相差顕微鏡写真はそれぞれ
（ａ）と（ｃ）み見られる。残っている細胞は、突起を
有している（図５ｄ）のではなく、突起がなかった（図
５ｂ）。しかし寡突起神経膠細胞に対して細胞毒性を示
すのに必要な組換えマウスＩＬ−２の量は、調整培地で
予想された量よりはるかに高かった。従って魚由来のＩ
Ｌ−２は免疫由来の（ｉｍｍｕｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ）
ＩＬ−２の変化したものであり、従って組換えマウスＩ
Ｌ−２がラットの寡突起神経膠細胞に対して有している
親和性よりも高い親和性を、魚由来のＩＬ−２はラット
の寡突起神経膠細胞に対して有している。寡突起神経膠
細胞に対するＩＬ−２の観察された効果が非特異的細胞
毒性である可能性を排除するために、ＩＬ−２を星状細
胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）の培養物（すなわちラット
の脳の偏平細胞（ｆｌａｔ ｃｅｌｌｓ）のモノレーヤ
ー）に適用した。予想されたように細胞毒性は観察され
なかった（表１）。
【００６３】
【表１】
【００６４】実施例５． インビボでのＩＬ−２活性 軸策（ａｘｏｎ）成長に対するインビボでの促進効果に
ついて、ＩＬ−２は調整培地の代わりになり得るかにつ
いて試験するために、傷害した成体ウサギの視神経に組
換えマウスＩＬ−２を適用した。２つの実験方法を用い
て適用した。１つは横に切断した成体ウサギの視神経を
用い、ＩＬ−２はニトロセルロースに浸して適用する
（ラビエら（Ｌａｖｉｅ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．）、ジェイ
・コンプ・ニューロル（Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏ
ｌ．）第２９８巻、２９３−３１５頁（１９９０
年））。２つ目の方法では視神経を激しく破砕したもの
を用い、傷害部位から離れたところで神経に沿って数カ
所、可能性型のＩＬ−２を注射する。その後の成長の評
価には透過型電子顕微鏡と、乳頭（ｏｐｔｉｃ ｄｉｓ
ｃ）に注射した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
の前方移動（ａｎｔｅｒｏｇｒａｄｅ ｔｒａｎｓｐｏ
ｒｔ）（ラビエら（Ｌａｖｉｅ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．）、
前記）により行った。観察された成長を図６に示す。図
から明かなように、ＩＬ−２処理した、傷害されたウサ
ギの視神経２では傷害部位から離れて、豊富な髄鞘を有
さない軸策（ｎｏｎｍｙｅｌｉｎａａｔｅｄ ａｘｏｎ
ｓ）と成長円錐（ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｅ）が観察され
た。これらは新しく成長している軸策に特徴的なもので
あることが記載されている（ラビエら（Ｌａｖｉｅ，
Ｖ．ｅｔ ａｌ．）、前記）。対照の傷害されたが未処
理の動物では生きている軸策は観察されなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、抗−ＩＬ−２抗体は調整培地（ＣＭ）
中の魚の可溶性物質の寡突起神経膠細胞に対する細胞毒
性作用を中和することを示す。
【図２】図２は、マウス抗−ヒトＩＬ−２モノクローナ
ル抗体を用いる魚の視神経の可溶性物質のウェスタンブ
ロット解析を示す。
【図３】図３は、魚の視神経調整培地由来のＩＬ−２様
因子のアフィニティ精製を示す。
【図４】図４は、ラットの脳の寡突起神経膠細胞培養物
中の組換えマウスＩＬ−２による寡突起神経膠細胞の数
の減少を示す。
【図５】図５は、組換えマウスＩＬ−２により引き起こ
された成熟寡突起神経膠細胞（ＧａＬＣで標識されてい
る）の数の減少を示す。
【図６】図６は、横に切断されたインターロイキン−２
処理神経中で新しく成長している繊維を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年５月８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 薬剤組成物
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【産業上の利用分野】
【０００１】本発明は、哺乳動物の中枢神経系の傷害さ
れた神経の再生を促進および増強するための、インター
ロイキン−２（ＩＬ−２）またはＩＬ−２様物質の使用
に関する。
【０００２】下等脊椎動物の中枢神経系（ＣＮＳ）は軸
策（ａｘｏｎ）傷害後の高い再生能力を有しているが、
哺乳動物の中枢神経系は再生能力が低い。この再生能力
の低さの原因の少なくとも一部は、軸策成長を阻害する
成熟した寡突起神経膠細胞の存在にあるとされている。
【０００３】自発的に再生するＣＮＳの代表である魚の
視神経では、再生には再生関連物質の存在をともなうこ
とが証明されており、これは傷害されたウサギ視神経に
使用された時その再生を促進する（シュワルツら（Ｓｃ
ｈｗａｒｔｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ）第２２８巻、６０１−６０３頁（１９８５
年）；ラビエら（Ｌａｖｉｅ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．）、ジ
ェイ・コンプ・ニューロル（Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏ
ｌ．）第２９８巻、２９３−３１５頁（１９９０年）；
ヨーロッパ特許第１７２９８７号）。
【０００４】寡突起神経膠細胞に対する細胞毒性はこれ
らの調製物中にあるとされており、おそらくこれにより
魚の視神経は寡突起神経膠細胞に関連する阻害活性を克
服することができる（シブロンら（Ｓｉｂｒｏｎ，Ｔ．
ｅｔ ａｌ．）、グリア（Ｇｌｉａ）第３巻、２６７−
２７６頁（１９９０年））。インビトロでの細胞毒性は
魚の寡突起神経膠細胞のみでなく、ラットの寡突起神経
膠細胞にも細胞毒性であることが証明されている（シブ
ロンら（Ｓｉｂｒｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．）、前記、お
よびコーエン（Ｃｏｈｅｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、ブレ
インリサーチ（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）第５３７巻、２
４−３２頁（１９９０年））。これらの物質は直接的ま
たは間接的にマクロファージまたは他の血液由来細胞に
関連している。
【０００５】ヨーロッパ特許出願第４１５３２１号は、
下等脊椎動物（例えば魚）の再生中の傷害された視神経
の調製培地中に存在するが、下等脊推動物の無傷の神経
の調整培地や哺乳動物の傷害された神経または無傷の神
経中には存在しない、寡突起神経膠細胞細胞毒性因子に
ついて記載している。
【０００６】インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、Ｉ
Ｌ−１の存在下で抗原または分裂促進因子（ｍｉｔｏｇ
ｅｎ）で活性化後、Ｔ細胞により合成および分泌される
ことが知られているリンフォカインである（スミス（Ｓ
ｍｉｔｈ，Ｋ．Ａ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
第２４０巻、１１６９−１１７６頁（１９８８年））。
免疫系におけるＩＬ−２は、多くの免疫応答の阻害また
は進行に関与する、重要なサイトカインであると考えら
れている（リナングら（Ｌｉｎａｎｇ）、ビオケム・ビ
オフィズ・レス・コム（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）第１６５巻、１３１２−
１３１８頁（１９８９年）。これに対して脳の中でのＩ
Ｌ−２の役割についてはほとんど知られていない。神経
系では寡突起神経膠細胞に対するＩＬ−２の作用に関連
するいくつかの観察は互いに矛盾している
【０００７】最近の研究では寡突起神経膠細胞に対する
阻害効果はＩＬ−２にあるとされているが（サネトら
（Ｓａｎｅｔｏ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．）、プロシーデ
ィングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシーズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第８８巻、９２２１−
９２２５頁（１９８６年）；サネトら（Ｓａｎｅｔｏ，
Ｒ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．）、ジェイ・ニューロサイ・レス
（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．）第１８巻、１４７
−１５４頁（１９８７年）、他の研究ではＩＬ−２の寡
突起神経膠細胞に対する増殖作用を証明している（ベン
ベニステとメリル（Ｅ．Ｎ．Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ ａ
ｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｍｅｒｒｉｌ）、ネーチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）第３２１巻、６１０−６１３頁（１９８６
年））。哺乳動物においてＩＬ−２はリンフォカインの
生成物であることが証明されており（スミス（Ｓｍｉｔ
ｈ，Ｋ．Ａ．）、前記）、いくつかの報告は魚のリンパ
球はＩＬ−２様活性を有するかも知れないと記載してい
る（カスピとアブタリオン（Ｃａｓｐｉ，Ｒ．Ｒ．ａｎ
ｄ Ａｖｔａｌｉｏｎ，Ｒ．Ｒ．）、デブ・コンプ・イ
ムノル（Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）第８
巻、５１−６０頁（１９８４年））。
【０００８】ＩＬ−２とＣＮＳ一般（特に脳）における
傷害との間に関連があることが指摘されている（ニエト
−サンペドロら（Ｎｉｅｔｏ−Ｓａｍｐｅｄｒｏ，Ｍ．
ｅｔａｌ．）、ニューロケム・レス（Ｎｅｕｒｏｃｈｅ
ｍ．Ｒｅｓ．）第１２巻、７２３−７２７頁（１９８７
年）；アラウジョら（Ａｒａｕｊｏ，Ｄ．Ｍ．ｅｔａ
ｌ．）、ブレイン・レス（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）第４
９８巻、２５７−２６６頁（１９８９年））。ニエト−
サンペドロら（Ｎｉｅｔｏ−Ｓａｍｐｅｄｒｏ，Ｍ．ｅ
ｔ ａｌ．）は傷害後の脳にＩＬ−２活性を見いだし
た。同様にリンら（Ｌｉｎｇｅｔ ａｌ．、前記）はＭ
ＰＰ＋（１−メチル−４−フェニルピリミジン）で作り
だした脳の病変中にＩＬ−２を見いだした。さらに、傷
害後のラットの海馬状隆起中にＩＬ−２結合部位の上方
制御（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）がアラウジョら
（Ａｒａｕｊｏ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．）により観察さ
れた。しかしＩＬ−２とＣＮＳの再生との間にはこれま
で何の関連も示唆されていない。
【０００９】最近の別の研究では、寡突起神経膠細胞に
よる成長妨害を避ける治療法により再生が促進されるか
も知れないことが示唆されている。例えばＴＮＦのよう
な寡突起神経膠細胞に対して細胞毒性を有する因子の適
用（ヨーロッパ特許出願４５５０９３号、およびシュワ
ルツら（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、ブレ
イン・レス（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）第５４５巻、３３
４−３３８頁（１９９１年））、または寡突起神経膠細
胞関連インヒビターに対する抗体の適用（シュネルら
（Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．）、ネーチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）第３４３巻、２６９−２７２頁（１９
９０年））がある。
【００１０】ロビンスら（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａ
ｌ．）（ジェイ・イミュノル（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）
第１３８巻（８）、２５９３−７頁（１９８７年））
は、インビトロでラットの星状細胞を刺激すると、腫瘍
壊死因子に機能が類似している細胞毒性因子の再生が起
きることを報告している。かれらはまた、ヒト組換え腫
瘍壊死因子は、ラットの寡突起神経膠細胞に対して細胞
毒性を有することも報告している。セルマジら（Ｓｅｌ
ｍｊ ｅｔ ａｌ．）（アン・ニューロル（Ａｎｎ．Ｎ
ｅｒｕｒｏｌ．）第２４巻（４）、３３９−４６頁（１
９８８年））は、マウスの脊髄組織の髄鞘を有する培養
物に対する、組換えヒト腫瘍壊死因子（ｒｈＴＮＦ）の
影響について報告した。かれらはｒｈＴＮＦは遅延型の
寡突起神経膠細胞壊死（ｄｅｌａｙｅｄ−ｏｎｓｅｔ
ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｎｅｃｒｏｓｉｓ）
と１つの型の髄鞘拡張（ｍｙｅｌｉｎ ｄｉｌａｔａｔ
ｉｏｎ）を誘導することを見いだした。
【００１１】世界中で多くの研究努力がなされているに
もかかわらず、哺乳動物（特にヒト）でＣＮＳの再生を
起こす安全で有効な方法はまだ開発されていない。この
ような方法は、そして特に目的の再生部位に注入できる
薬剤組成物は、傷害後の両側痺痲または四肢痺痲、盲
目、難聴、手術にともなう軸策切断などを緩和するのに
非常に好ましい。
【００１２】
【発明の要約】本発明によれば、インターロイキン−２
およびインターロイキン−２様物質は軸策再生を促進す
ることが明かになった。さらに魚の視神経由来の寡突起
神経膠細胞に対する細胞毒性物質はＩＬ−２様物質であ
ることも明かになった。
【００１３】従って本発明は、哺乳動物（特にヒト）の
ＣＮＳ軸策の再生の誘導や再生のための薬物の調製へ
の、ＩＬ−２およびＩＬ−２様物質の使用を与える。
【００１４】本発明の目的は、傷害部位に投与された場
合傷害された軸策の再生の誘導と促進に有効な量の、単
位投与量のインターロイキン−２またはインターロイキ
ン−２様物質と、薬剤として許容される担体または補形
剤よりなる薬剤組成物を与えることである。
【００１５】本発明の別の目的は、傷害部位に有効量の
インターロイキン−２またはインターロイキン−２様物
質を投与することよりなる、哺乳動物の傷害された中枢
神経系の軸策の再生を誘導および促進する方法を与える
ことである。
【００１６】本発明のさらに別の目的は、魚の視神経由
来の寡突起神経膠細胞細胞毒性因子、インターロイキン
−２様物質を与えることである。
【００１７】図１は、抗−ＩＬ−２抗体は調整培地（Ｃ
Ｍ）中の魚の可溶性物質の寡突起神経膠紬胞に対する細
胞毒性作用を中和することを示す。
【００１８】図２は、マウス抗−ヒトＩＬ−２モノクロ
ーナル抗体を用いる魚の視神経の可溶性物質のウェスタ
ンブロット解析を示す。
【００１９】図３は、魚の視神経調整培地由来のＩＬ−
２様因子のアフィニティ精製を示す。
【００２０】図４は、ラットの脳の寡突起神経膠細胞培
養物中の組換えマウスＩＬ−２による寡突起神経膠細胞
の数の減少を示す。
【００２１】図５は、組換えマウスＩＬ−２により引き
起こされた成熟寡突起神経膠細胞（ＧａＬＣで標識され
ている）の数の減少を示す。
【００２２】図６は、横に切断されたインターロイキン
−２処理神経中で新しく成長している繊維を示す。
【００２３】
【好適な態様の詳細な説明】哺乳動物におけるＣＮＳ傷
害部位での軸策の再生は、傷害部位へＩＬ−２またはＩ
Ｌ−２様物質を投与することにより誘導および促進され
る。ＩＬ−２またはＩＬ−２様物質は治療している哺乳
動物と同じ種であることが好ましいが、これはどうして
も必要なわけではない。
【００２４】本発明においてＩＬ−２様物質とは、ＩＬ
−２に対する抗体と交差反応する物質である。ムテイン
（ｍｕｔｅｉｎｓ）や、天然のヒトＩＬ−２に比較して
アミノ酸残基が添加、欠失または置換された修飾ＩＬ−
２物質、および薬剤組成物として使用できるように物理
的性質を改良するために分子の一部や他のペプチド配列
が添加されたＩＬ−２誘導体も、それらがインビボで傷
害された哺乳動物の軸策の再生を誘導および促進する性
質を有する限り、この定義に含まれる。この機能は過度
の実験をしなくても、寡突起神経膠細胞に対する選択細
胞毒性をインビトロで試験することにより調べることが
できる。
【００２５】本発明で使用されるＩＬ−２は任意の種の
天然のＩＬ−２および任意の種の組換えＩＬ−２を含
む。ＩＬ−２は任意の従来技術、例えばロブらの方法
（Ｒ．Ｊ．Ｒｏｂｂ ｅｔ ａｌ．プロシーディングズ
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第８０巻、５９９０頁（１９８３
年））により得られる。好ましくはＩＬ−２は組換えＤ
ＮＡ法、例えばタニグチら（Ｔ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ
ｅｔ ａｌ．）の方法（ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第
３０２巻、３０５−３１０頁（１９８３年））、または
デボス（Ｄｅｖｏｓ，Ｒ．）の方法（ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ）第１１巻、４３０７−４３２３頁（１９
８３年））により得られる。組換えヒトＩＬ−２（ｒｈ
ＩＬ−２）は現在市販されている。いくつかのＩＬ−２
ムテインは米国特許第４，５１８，５８４号に記載の方
法で得られる。
【００２６】本発明で使用される好適なＩＬ−２は、実
質的に精製された型の魚の視神経由来の寡突起神経膠細
胞細胞毒性因子である。もともとＥＰ４１５３２１号に
初めて記載されたこの因子は、充分に性状解析されてお
り精製された型で得られている。
【００２７】本発明によれば、魚の視神経由来の寡突起
神経膠細胞細胞毒性因子はＩＬ−２様物質であることが
以下の事実により確認されている：（１）これは抗−Ｉ
Ｌ−２抗体のアフィニティクロマトグラフィーにより精
製された；（２）ＩＬ−２に対する抗体は再生中の魚の
視神経由来の調整培地の細胞毒性活性を中和した；
（３）ウェスタンブロット解析により魚調整培地中に２
８ｋＤａのＩＬ−２免疫反応性バンドの存在が認められ
た；そして（４）組換えマウスＩＬ−２はインビトロで
寡突起神経膠細胞に対して選択的細胞毒性を有していた
が星状細胞に対しては細胞毒性がなかった。
【００２８】組換えマウスＩＬ−２よりも魚の調整培地
中のＩＬ−２様物質の活性が高いということは、活性の
特異性は種ではなく組織により決定されることを示唆し
ている。すなわち中枢神経系由来の魚ＩＬ−２は、免疫
由来の組換えＩＬ−２とはおそらく異なり、魚の視神経
の活性分子は免疫由来のＩＬ−２の変化したものである
ことを示している。これは魚の血液のリンパ球中のＩＬ
−２免疫反応性物質は約１４ｋＤａのポリペプチドであ
り、神経中のＩＬ−２様物質のような２８ｋＤａポリペ
プチドではないという、図２に示す結果によりさらに支
持されている。
【００２９】実質的に精製された型の魚の視神経由来の
寡突起神経膠細胞細胞毒性因子は、ウェスタンブロット
解析による分子量が約２８ｋＤａのＩＬ−２様物質であ
る。これは下等脊椎動物（例えば魚）の再生中の傷害さ
れた神経の調整培地に存在するが、下等脊椎動物の無傷
の神経の調整培地や哺乳動物の傷害されたかまたは無傷
の神経の調整培地中には存在しない。これは寡突起神経
膠細胞系統には選択的に毒性を有するが、１型星状細胞
（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）や繊維芽細胞には毒性がな
い。この細胞毒性活性はＩＬ−２に対する抗体により中
和される。
【００３０】精製された魚寡突起神経膠細胞細胞毒性因
子はアフィニティ精製により得られる。破砕した再生中
の魚の視神経とインキュベートした無血清培地により調
製された該因子を含む調整培地を、ＩＬ−２に対する抗
体を含むカラムに適用し、結合した物質を適当な溶媒で
溶出し、寡突起神経膠細胞に対する細胞毒性とウェスタ
ンブロット解析により確認した２８ｋＤａの因子を含む
画分を得る。
【００３１】アフィニティ精製法では任意の抗−ＩＬ−
２抗体が使用できる。好ましくは抗−ヒトＩＬ−２抗
体、そして特に組換えヒトＩＬ−２に対するマウスモノ
クローナル抗体が、適当な樹脂（例えばポリアクリルヒ
ドラジドアガロース）に結合されて使用される。結合さ
れた物質の溶出は、例えばグリシンで実施する。
【００３２】本発明においてＩＬ−２およびＩＬ−２様
物質は、哺乳動物（特にヒト）のＣＮＳ軸策の再生を促
進するのに充分な量と純度のものが使用される。精製さ
れた寡突起神経膠細胞細胞毒性因子はＩＬ−２よりも強
力であることが証明されたため、これはＩＬ−２より少
ない量で使用される。これらは再生すべき傷害された軸
策の近傍に与えるのに適当な任意の方法で投与される。
これらは好ましくは、薬剤として許容される液体担体中
で、部位に直接注射される。
【００３３】あるいはＩＬ−２およびＩＬ−２様物質を
有する移植組織（ｉｍｐｌａｎｔ）を外科的に挿入して
もよい。このような移植組織は、スポンジのように活性
物質を吸収し移植部位で徐々に放出する任意の物質（例
えばニトロセルロース）で構成される。他の投与方法も
当業者には明かであり、それらも本発明の範囲に含まれ
る。
【００３４】特定の患者に投与されるＩＬ−２およびＩ
Ｌ−２様物質の量は、治療すべき部位、再生すべき傷害
された軸策部位そして患者の状態などの種々の因子によ
り変わる。しかし典型的には、ＩＬ−２およびＩＬ−２
様物質は１回の注射として、またはニトロセルロースや
他の吸収性担体にしみ込ませて投与される。正確な投与
量は経験的に決定される。
【００３５】ＩＬ−２およびＩＬ−２様物質は好ましく
は、治療すべき傷害の直後に投与される。すなわちこれ
は慢性の傷害よりも急性の傷害で使用することが好まし
い。変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の時期が長いほ
ど本発明による再生の促進は難しくなるであろう。
【００３６】ＩＬ−２およびＩＬ−２様物質のみの投与
で良好は結果は得られるが、治療にその効果を増強する
ような任意のタイプの治療を同時に組合せてもよい。例
えば低エネルギーレーザー（好ましくはＨｅ−Ｎｅレー
ザー、５分／日、３５ｍＷ）で傷害部位を照射すると、
傷害後の変性過程を遅延させ傷の形成を遅らせることが
できる。アッシアら（Ａｓｓｉａ ｅｔ ａｌ．）、ブ
レイン・レス（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）第４７６巻、２
０５−２１２頁（１９８８年）を参照。
【００３７】本発明により治療される種々の傷害は無数
にあり、当業者には明かである。例えば神経の疾患、圧
力または虚血によるＣＮＳ軸策の急性または亜急性の傷
害（例えば緑内障）、前方虚血性視神経傷害（ａｎｔｅ
ｒｉｏｒ ｉｓｃｈｅｍｉｃｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐ
ａｔｈｙ）、脊髄傷害、視神経への傷害または聴覚神経
への傷害などがあるが、これらに限定されるものではな
い。神経の手術または腫瘍に起因するＣＮＳニューロン
への傷害も本発明の方法により治療される。
【００３８】本発明の目的のために、ＩＬ−２およびＩ
Ｌ−２様物質は薬剤としてまたは獣医学的に許容される
担体または希釈剤とともに製剤化される。これらは水溶
液（例えば無菌水溶液）として与えられる。ＩＬ−２お
よびＩＬ−２様物質を含有する溶液または粉末は、安定
剤で安定化される。これは単位投与量の注射できる型
（溶液、懸濁液、乳液）で、好ましくは本質的に非毒性
で非治療的な薬剤として許容される担体媒体中で製剤化
される。このような担体の例としては生理食塩水、リン
ゲル液、ショ糖溶液、マンニトールおよビ正常血清アル
ブミンがある。固定油やオレイン酸エチルなどの非水溶
性賦形剤も使用できる。担体媒体は、等張性、溶解度お
よび／または化学的安定性を増強する物質（例えば緩衝
液、界面活性剤そして保存剤）などの添加剤を少量含有
していてもよい。他の適応症でＩＬ−２の種々の製剤が
すでに公知である。このような製剤は、ＩＬ−２の所期
の機能が影響を受けない限り、本発明の目的のために使
用することもできる。
【００３９】本発明によれば、ＩＬ−２様物質が魚の視
神経由来の可溶性物質中に存在し、そのレベルが傷害後
上昇するという免疫化学的証拠が与えられる。この物質
は性状解折され、先に記載した寡突起神経膠細胞細胞毒
性因子であると同定されている。哺乳動物のＩＬ−２に
対する抗体は、ラットの脳の寡突起神経膠細胞に対する
その作用を中和する。さらに組換えマウスＩＬ−２はイ
ンビトロで成熟ラット寡突起神経膠細胞に対して細胞毒
性があり、インビボで傷害されたウサギの視神経の軸策
成長を促進することは証明されている。
【００４０】以下の実施例により本発明を説明する。 実施例
【００４１】実験法 ａ． 再生中の魚の視神経からの可溶性物質の調製 １日間順化させた鯉（サイプリナスカルピオ（Ｃｙｐｒ
ｉｎｕｓ Ｃａｒｐｉｏ）、８００−１２００ｇ、チュ
ーバ（Ｔｈｕｖａ）、イスラエル）を０．０５％のトリ
カインメタンスルホネート（ｔｒｉｃａｉｎｅ ｍｅｔ
ｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（シグマ社（Ｓｉｇｍ
ａ）、米国ミズーリ州セントルイス市）で麻酔をかけ、
その視神経をピンセットで破砕した（３０秒間）。回り
の組織はそのままで視神経のみ傷つけるように注意し
た。傷害後８日目に、破砕された再生中の神経を切断し
て取り出し、無血清培地（ＤＭＥＭ）中で２５℃で１．
５時間インキュベートした（培地３００μｌにつき神経
４切片）。次に得られた培地（調整培地（ＣＭ）と定義
した）を集め、その蛋白含量をブラッドフォード定量法
（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）により測定した。５
０μｌまたは５００μｌずつ分注して−７０℃中に保存
した。
【００４２】ｂ． 魚のリンパ球で調整した培地の調製 魚を３−アミノ安息香酸エチルエステル（シグマ社（Ｓ
ｉｇｍａ））で麻酔した。眼腔の頸動脈を切断してか
ら、眼窩からの血液をヘパリン硫酸（１００Ｕ／ｍｌ；
ビーディーエィチケミカルズ（ＢＤＨ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ））を含む試験管中に集めた。この血液を等量のリ
ン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して、５分間放
置してからファイコール（Ｆｉｃｏｌｌ）またはパーコ
ール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）溶液の上に重層した。使用直前
に２９．４％のソヂウムジアトリゾエート（Ｓｏｄｉｕ
ｍ ｄｉａｔｒｉｚｏａｔｅ）（シグマ社（Ｓｉｇｍ
ａ））使用溶液を７０．６％のファイコール原液と混合
して密度１．０６ｇ／ｍｌを得た。パーコール溶液を使
用した場合は、４４．６ｍｌのパーコール（ファルマシ
ア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、１０ｍｌの１００ｍＭ
クエン酸（メルク社（Ｍｅｒｃｋ））、１０ｍｌの５％
牛血清アルブミン（ＢＳＡ；シグマ社（Ｓｉｇｍ
ａ））、そして３５．４ｍｌのＰＢＳを混合してパーコ
ール原液（１．０６ｇ／ｍｌ）を作成した。この溶液１
５ｍｌを、５０ｍｌの無菌コレックス（Ｃｏｒｅｘ）
（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｇ））遠心分離管中に入れ
た。この溶液の上に、希釈した血液３０ｍｌを小さいピ
ペットで注意深く重層した。遠心分離管にふたをしてス
イング型バケット中で８００×ｇで２０℃で３０分間遠
心分離した。
【００４３】遠心分離後界面に白血球が見られ、これは
パスツールピペットで簡単に取り出すことができた。５
０ｍｌの試験管中に白血球を集めＰＢＳで２回洗浄し
た。ペニシリンとストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍ
ｌ）を含む少量のＬ−１５培地中に細胞を懸濁した後、
細胞数を数えた。細胞を希釈して２０×１０７細胞／ｍ
ｌとし、その１０ｍｌを７５ｃｍ２フラスコ（ファルコ
ン社（Ｆａｌｃｏｎ））中に入れた。フラスコを２０℃
で１時間放置し、付着しなかった細胞を取り出して２番
目のフラスコ中に入れた。これを繰り返し、１時間後付
着しなかった細胞を３番目のフラスコに入れた。１番目
と２番目のフラスコを１００ｍｌのＰＢＳで激しく撹拌
して２回洗浄した。１番目のフラスコにはマクロファー
ジが濃縮された培養物が含まれ、３番目のフラスコには
リンパ球が濃縮された培養物が含まれていた。１０ｍｌ
の培地を加えてすべてのフラスコを８時間インキュベー
トした後、上澄液を集め、２０００×ｇで５−１５分間
遠心分離した。次に上澄液をセントリコン（Ｃｅｎｔｒ
ｉｃｏｎ）またはアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）装置（アミ
コン社（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏｒｐ．））で２５−１００
倍濃縮した。そしてこの試料を４℃で保存した。
【００４４】ｃ． ラットの脳の寡突起神経膠細胞培養
物の調製と免疫蛍光染色 濃縮寡突起神経膠細胞培養物の調製のために、ラットの
新生児の脳（２日令）を切り出し［２ｍｌのライボウィ
ッツ（Ｌｅｉｄｏｗｉｔｚ）培地（Ｌ−１５）に２個の
脳；ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））、１ｍＭのエチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するＤＭＥＭ（Ｃａ２＋
とＭｇ２＋を含まない）中の３×１０４Ｕ／ｍｌのトリ
プシン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））で化学的に分解し
た。トリプシン溶液で３７℃で１０分間インキュベート
する前に機械的分解を行った。次に細胞を、７４Ｕ／ｍ
ｌのＤＮａｓｅ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））、５２００
Ｕ／ｍｌの大豆トリプシン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））
および３ｍｇのＢＳＡ溶液１ｍｌを含有する１５ｍｌ容
の円錐試験管中に移し、室温で１分間インキュベート
し、１０ｍｌの培地中に加えた後、ＤＭＥＭ中で３回洗
浄した。最後の洗浄後、細胞を５−１０％の胎児牛血清
（ＦＢＳ；シグマ社（Ｓｉｇｍａ）−５６℃で３０分間
熱処理されている）を含有する１０ｍｌのＤＭＥＭ中に
懸濁し、メッシュに通し、２０μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−
リジン（ピーエルエル（ＰＬＬ）、分子量１００００
０；（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））で３７℃で一晩あらか
じめ被覆しておいた８５ｍｍ２のフラスコ（ヌンク社
（Ｎｕｎｃ））中に接種した。
【００４５】細胞接種後最初の２４時間目に培地を交換
し、その後２−３日毎に１回交換した。接種後８日目に
細胞を撹拌しながら４−６時間インキュベートし、上澄
液を除去し残存する細胞を１０ｍｌの培地（ＤＭＥＭ＋
５−１０％ＦＢＳ）中でさらに数時間インキュベート
し、次に一晩撹拌した。撹拌により除去された細胞を集
めて遠心分離し、ペレットになった細胞を１−２ｍｌの
無血清培地（ボッテンシュタインら（Ｂｏｔｔｅｎｓｔ
ｅｉｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．）、プロシーディングズ
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第７６巻、５１４−５１７頁（１
９７９年））中に再懸濁した。
【００４６】こうして得られた濃縮した寡突起神経膠細
胞培養物の回収した細胞を、あらかじめＰＬＬ（２０μ
ｇ／ｍｌ）で被覆したガラスのカバースリップ（１３ｍ
ｍ；３×１０５細胞／ウェル）上に接種した。このガラ
スのカバースリップを２４ウェルのプレート（ヌンク社
（Ｎｕｎｃ））中に入れた。接種中まず細胞懸濁液５０
μｌを各カバースリップに添加し、３７℃で３０分間放
置して付着させた。次に細胞をＤＭＥＭで洗浄した後、
５００μｌの規定培地（ボッテンシュタイン（Ｂｏｔｔ
ｅｎｓｔｅｉｎ’ｓ）とサトウ（Ｓａｔｏ’ｓ）の規定
培地に対するラフの（Ｒａｆｆ’ｓ）改変培地）を加え
た。４８時間後接種した細胞を調整培地か、またはウサ
ギ抗−ヒトＩＬ−２抗体（ジェンザイム社（Ｇｅｎｚｙ
ｍｅ））または対照抗体（ウサギ抗神経繊維（ｎｅｕｒ
ｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ））で２時間プレインキュベート
した調整培地で処理した。
【００４７】成熟した寡突起神経膠細胞（すなわちガラ
クトセレブロシド（ｇａｌａｃｔｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉ
ｄｅ、ＧａｌＣ）陽性細胞）の数を以下のような免疫蛍
光法で測定した：２％ＦＢＳを含有するハンクスバラン
スト塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＨＢＳＳ）で細胞を完全に洗浄
し、熱により不活性化処理をして、５０μｌの抗−Ｇａ
ｌＣモノクローナル抗体（ＩｇＧ３、ＤＭＥＭで１：５
に希釈したハイブリドーマの上澄液、セロテック社（Ｓ
ｅｒｏｔｅｃ））とともに３７℃で３０分間インキュベ
ートした。インキュベートの最後に細胞を洗浄し、５０
μｌのフルオレセン結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ３（ＤＭ
ＥＭで１：５０に希釈）とともにインキュベートし、次
に洗浄しメタノールで−２０℃で１０分間固定した。最
後の洗浄後、細胞を２２ｍＭの１，４−ジアゾビシクロ
（２，２，２）オクテインを含有するグリセロールで被
覆した。対照として、１次抗体を省略した以外は同じ染
色方法を行ったカバースリップを使用した。カバースリ
ップをガラススライドの上に置き、マニキュア液で封入
し、４℃で保存した。全カバースリップ上の細胞を数え
た。
【００４８】ｄ． ＩＬ−２免疫反応性蛋白のウェスタ
ンブロット解析 試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動した。ゲルを２０
０ｍＡで２時間ニトロセルロース上へブロットした。５
％のミルクを含むＰＢＳでニトロセルロースを３７℃で
２時間インキュベートし、次にＰＢＳで洗浄した。
【００４９】ブロットをウサギ抗−ＩＬ−２抗体で３７
℃で２時間インキュベートした後、３回洗浄（各回０．
０５％ツイーン−２０を含有するＰＢＳを５分間）し、
最後にブロットを［１２５Ｉ］−標識ヤギ抗−ウサギ抗
体（１０６ｃｐｍ／ｍｌ）で３７℃で２時間インキュベ
ートし、０．０５％ツイーン−２０を含有するＰＢＳで
３回洗浄し、乾燥してオートラジオグラフ（放射能写
真）をとった。
【００５０】実施例１．再生中の魚の視神経で調整した
培地の寡突起神経膠細胞に対する細胞毒性は抗−ＩＬ−
２抗体で中和できる
【００５１】再生中の魚の視神経で調整した培地をＩＬ
−２に対する抗体で処理して、細胞毒性活性が消失する
か否かを調べた。ＩＬ−２に対する抗体は調整培地の細
胞毒性作用を中和することがわかった。
【００５２】組換えヒトＩＬ−２抗体に対するウサギポ
リクローナル抗体による、寡突起神経膠細胞に対する魚
の可溶性物質の細胞毒性作用の、中和作用を評価した。
結果を図１に示す。４８時間後に寡突起神経膠細胞培養
物に、調整培地（単独で、または組換えヒトＩＬ−２に
対するウサギのポリクローナル抗体であらかじめインキ
ュベートしたもの）を加え、さらに４８時間インキュベ
ートした。神経繊維（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ）
に対する抗体を対照として使用した。寡突起神経膠細胞
は免疫蛍光法により同定した。
【００５３】再生中の魚の視神経から得られた可溶性物
質の最高濃度（５μｇ蛋白）は約６０％の細胞毒性を示
し、抗−ＩＬ−２抗体による中和は見られなかった；
０．５μｇの調整培地は４２％の細胞毒性を示し、その
半分は抗体により中和された；調整培地０．２μｇのみ
を使用した場合は等量の抗体で完全な中和が見られた。
結果は、抗体のみで処理利した細胞毒性のない対照培養
物（１００％生存、細胞毒性なし）に対する細胞毒性％
で示してある。すべての実験を３回繰り返し、０．１μ
ｇの抗−ＩＬ−２抗体（ＩｇＧ）を用いて行った。１つ
の実験の結果をこの図に示す；ＣＭは調整培地を示す。
各カバースリップ中で数えられたＧａＬＣ陽性細胞の総
絶対数は種々の実験で３００から５００個の範囲にあっ
た。挿入図は１０倍量の抗−ＩＬ−２抗体（すなわち１
μｇのＩｇＧ）を用いて実施した基本的に同じ実験であ
る。
【００５４】図から明かなように組換えマウスＩＬ−２
に対する抗体は調整培地の細胞毒性を中和した。抗体の
量を一定に保った場合（０．１μｇ ＩｇＧ画分；１μ
ｇは１ＵのＩＬ−２を中和する）、達成される中和の程
度は適用した調整培地の濃度の関数であり、完全な中和
が得られる最低の試験濃度は０．２μｇ／ｍｌ総蛋白で
あった。１０倍量の抗体（１μｇのＩｇＧ画分）では、
より高濃度の調整培地（すなわち０．５と５μｇ／ｍ
ｌ）が中和された（図１、挿入図）。これらの結果か
ら、そして本測定で中和に使用したＩＬ−２抗体の力価
を考えると、１μｇの調整培地は０．５−２Ｕの生物学
的に活性なＩＬ−２様分子を含有すると推定される。
【００５５】実施例２ 魚の調整培地由来のＩＬ−２様
分子の性状解析 ＩＬ−２様分子の大きさを求めるために、可溶性物質を
含有する魚の視神経調整培地を、ヒトＩＬ−２に対する
マウスのモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロッ
トを行った。視神経調整培地（ＣＭ、４００μｇ）、魚
の血液のリンパ球（ＬＭＰ、１６μｇ）、そしてマウス
ＩＬ−２（７５μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動
した。レーン１は抗−ＩＬ−２抗体でインキュベートし
た調整培地（ＣＭ）を含有する。レーン２は第２抗体の
みで反応させた調整培地を含有する対照スロットであ
る。レーン３は抗−ＩＬ−２抗体でインキュベートした
魚リンパ球（ＬＭＰ）で調整した培地を含むスロットで
ある。各レーン（レーン２は除く）の左側の矢印は各ス
ロットのＩＬ−２免疫反応性バンドを示す。同じゲルの
上で分子量マーカーを電気泳動し、ゲル上に印をつけて
ある。
【００５６】図２は分子量２８ｋＤａの位置に、単一の
ＩＬ−２免疫反応性バンドが存在することを示す。リン
パ球はＩＬ−２を産生することが知られているため、同
じ実験条件下で同じ抗体の相互作用を魚のリンバ球と比
較した。図２に示すように約１４ｋＤａの単一のＩＬ−
２免疫反応性バンドが認められた。これらの結果は、Ｉ
Ｌ−２またはＩＬ−２抗体と交差反応する分子が、寡突
起神経膠細胞に対する細胞毒性作用に関与している可能
性を示唆している。
【００５７】実施例３． 魚調整培地からの寡突起神経
膠細胞細胞毒性因子のアフィニティ精製 以下のようにＩＬ−２アフィニティカラムを用いて細胞
毒性物質の精製を行った。
【００５８】組換えヒトＩＬ−２抗体に対するマウスモ
ノクローナル抗体を、ポリアクリルヒドラジドアガロー
ス（バイオマコール（ＢｉｏＭａｋｏｒ）、イスラエ
ル）に結合させた。ウイルチェックとミロン（Ｗｉｌｃ
ｈｅｋ ａｎｄ Ｍｉｒｏｎ）の方法（メソッズ・イン
・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）第
３４巻、７２−７６頁（１９７４年））を使用して、パ
ックした樹脂の０．１ｍｌを０．５ｍｇの抗体に結合さ
せた。精製は以下の様にして行った：抗体の結合したパ
ックした樹脂に調整培地（５０μｌ）を添加し、ここに
抗−ＩＬ−２抗体を結合させ、３７℃で２時間インキュ
ベートした。次に上澄液を集め、残りの樹脂を３回（毎
回１ｍｌのＰＢＳを使用）洗浄した。５０μｌのグリシ
ン（０．２Ｍ、ｐＨ２．７）を用いて室温で１０分間撹
拌して溶出した。溶出した物質（ＥＬＵ）を１０μｌの
トリス緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８．０）の中に集めた。ＩＬ
−２結合物質を含有する画分について、寡突起神経膠細
胞の数と従ってその細胞毒性の評価のためのＭＴＴ（３
−（４，５ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−
ジフェニルテトラゾリウムブロミド）比色法（シグマ社
（Ｓｉｇｍａ））を用いて、寡突起神経膠細胞に対する
それらの細胞毒性作用を試験した（モスマン（Ｍｏｓｍ
ａｎｎ，Ｔ．）、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・
メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．）第６５
巻、５５−６３頁（１９８３年））。
【００５９】測定は以下のようにして行った：細胞を調
整培地のみ、または抗−ＩＬ−２抗体のカラムから溶出
した結合物質（ＥＬＵ）で処理した。測定で使用した溶
出物質（ＥＬＵ）の最終希釈倍率は粗調整培地の希釈倍
率に対応した。４８時間インキュベートしてから１０μ
ｌのＭＴＴを３時間添加した；次に培地を除去しイソプ
ロパノール中の１００μｌの０．０４ＮＨＣｌを加え
た。すべての結晶が溶解するまで細胞を静かに撹拌し、
６００ｎｍの対照波長に対して５５０ｎｍの吸光度を測
定した。
【００６０】ＭＴＴ比色法により評価した寡突起神経膠
細胞に対する細胞毒性は、カラムに結合してあった抗−
ＩＬ−２抗体に結合した物質の溶出により、再生中の魚
の視神経で調整した培地（実験法（ａ））から回収され
た。対照は未処理の培養物または、溶出緩衝液（バッフ
ァー）を含む培地で処理した培養物であり、カラムから
の結合物質の溶出に使用した緩衝液に起因するかも知れ
ない溶出液中の細胞毒性の可能性を排除している。この
実験は３回繰り返しており、それぞれ３重測定をしてお
り、結果は未処理培養物値（生存率１００％を意味す
る）の平均±標準偏差（ＳＤ）で示してある。繰り返し
測定法による分析は、溶出物質（ＥＬＵ）の影響は２つ
の対応する対照培養物とは有意（Ｐ＜０．０５）に異な
っていることを示していた。
【００６１】図３に示すように、カラムから溶出したＩ
Ｌ−２結合物質は寡突起神経膠細胞に対して細胞毒性を
有していた。精製の規模が小さいため溶出液の比活性は
計算できなかった。しかし蛋白検出について知られてい
る限界を考えると、溶出液の比活性は調整培地の比活性
より少なくとも１０３倍高いことが推定できた。細胞毒
性活性を保持していることがわかった溶出液を、抗−Ｉ
Ｌ−２抗体を用いてウェスタンブロット解析をすると、
元々の２８ｋＤａの免疫反応性ポリペプチドの存在が証
明された（データは示してない）。従ってこれらの結果
はＩＬ−２免疫反応性２８ｋＤａ蛋白と細胞毒性をつな
ぐものである。
【００６２】実施例４． 組換えマウスＩＬ−２は寡突
起神経膠細胞に対して選択的毒性を有する。 細胞の接種４８時間後に、組換えマウスＩＬ−２（０−
１５０Ｕ／ｍｌ）をラットの寡突起神経膠細胞の濃縮培
養物（ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（実験法
で記載した方法で調製した）に適用した。細胞の数はＧ
ａＬＣに対する抗体を使用して評価した。そして成熟寡
突起神経膠細胞の数に対する影響を免疫蛍光法で測定
し、標識された細胞の数は蛍光顕微鏡で数えた。未処理
の細胞を対照（毒性なし）として使用した。図１に見ら
れるように、ガラクトセレブロシド（ＧａＬＣ）陽性細
胞の数に反映されているように、ＩＬ−２は成熟寡突起
神経膠細胞の数の有意な減少を引き起こした。ＩＬ−２
高濃度では、ＧａＬＣ陽性細胞の数に反映されているよ
うに、成熟寡突起神経膠細胞の数は有意に減少していた
（１５０Ｕ／ｍｌで８８．６±１５．３％細胞毒性；分
散分析（ＡＮＯＶＡ）でＰ＜０．０００５）（図４）。
成熟寡突起神経膠細胞（ＧａＬＣで標識されている）の
数に対する組換えマウスＩＬ−２（２００Ｕ／ｍｌ）の
影響を示す代表的な顕微鏡写真を図５（ｂ、ｄ）に示
す。図５は抗ＧａｌＣ抗体で染色したＩＬ−２処理細胞
（ｂ）と未処理細胞（ｄ）の蛍光顕微鏡写真である。
（ｂ）と（ｄ）の視野の位相差顕微鏡写真はそれぞれ
（ａ）と（ｃ）み見られる。残っている細胞は、突起を
有している（図５ｄ）のではなく、突起がなかった（図
５ｂ）。しかし寡突起神経膠細胞に対して細胞毒性を示
すのに必要な組換えマウスＩＬ−２の量は、調整培地で
予想された量よりはるかに高かった。従って魚由来のＩ
Ｌ−２は免疫由来の（ｉｍｍｕｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ）
ＩＬ−２の変化したものであり、従って組換えマウスＩ
Ｌ−２がラットの寡突起神経膠細胞に対して有している
親和性よりも高い親和性を、魚由来のＩＬ−２はラット
の寡突起神経膠細胞に対して有している。寡突起神経膠
細胞に対するＩＬ−２の観察された効果が非特異的細胞
毒性である可能性を排除するために、ＩＬ−２を星状細
胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）の培養物（すなわちラット
の脳の偏平細胞（ｆｌａｔ ｃｅｌｌｓ）のモノレーヤ
ー）に適用した。予想されたように細胞毒性は観察され
なかった（表１）。
【００６３】
【表１】
【００６４】実施例５． インビボでのＩＬ−２活性 軸策（ａｘｏｎ）成長に対するインビボでの促進効果に
ついて、ＩＬ−２は調整培地の代わりになり得るかにつ
いて試験するために、傷害した成体ウサギの視神経に組
換えマウスＩＬ−２を適用した。２つの実験方法を用い
て適用した。１つは横に切断した成体ウサギの視神経を
用い、ＩＬ−２はニトロセルロースに浸して適用する
（ラビエら（Ｌａｖｉｅ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．）、ジェイ
・コンプ・ニューロル（Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏ
ｌ．）第２９８巻、２９３−３１５頁（１９９０
年））。２つ目の方法では視神経を激しく破砕したもの
を用い、傷害部位から離れたところで神経に沿って数カ
所、可能性型のＩＬ−２を注射する。その後の成長の評
価には透過型電子顕微鏡と、乳頭（ｏｐｔｉｃ ｄｉｓ
ｃ）に注射した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
の前方移動（ａｎｔｅｒｏｇｒａｄｅ ｔｒａｎｓｐｏ
ｒｔ）（ラビエら（Ｌａｖｉｅ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．）、
前記）により行った。観察された成長を図６に示す。図
から明かなように、ＩＬ−２処理した、傷害されたウサ
ギの視神経２では傷害部位から離れて、豊富な髄鞘を有
さない軸策（ｎｏｎｍｙｅｌｉｎａａｔｅｄ ａｘｏｎ
ｓ）と成長円錐（ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｅ）が観察され
た。これらは新しく成長している軸策に特徴的なもので
あることが記載されている（ラビエら（Ｌａｖｉｅ，
Ｖ．ｅｔ ａｌ．）、前記）。対照の傷害されたが未処
理の動物では生きている軸策は観察されなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、抗−ＩＬ−２抗体は調整培地（ＣＭ）
中の魚の可溶性物質の寡突起神経膠細胞に対する細胞毒
性作用を中和することを示す。
【図２】図２は、マウス抗−ヒトＩＬ−２モノクローナ
ル抗体を用いる魚の視神経の可溶性物質のウェスタンブ
ロット解析を示す。
【図３】図３は、魚の視神経調整培地由来のＩＬ−２様
因子のアフィニティ精製を示す。
【図４】図４は、ラットの脳の寡突起神経膠細胞培養物
中の組換えマウスＩＬ−２による寡突起神経膠細胞の数
の減少を示す。
【図５】図５は、組換えマウスＩＬ−２により引き起こ
された成熟寡突起神経膠細胞（ＧａＬＣで標識されてい
る）の数の減少を示す。
【図６】図６は、横に切断されたインターロイキン−２
処理神経中で新しく成長している繊維を示す。

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 傷害部位に投与された場合傷害された軸
    策の再生の誘導と促進に有効な量の、単位投与量のイン
    ターロイキン−２またはインターロイキン−２様物質
    と、薬剤として許容される担体または補形剤よりなる薬
    剤組成物。
  2. 【請求項２】 単位投与量のインターロイキン−２より
    なる請求項１に記載の薬剤組成物。
  3. 【請求項３】 ヒトインターロイキン−２よりなる請求
    項１に記載の薬剤組成物。
  4. 【請求項４】 組換えヒトインターロイキン−２よりな
    る請求項３に記載の薬剤組成物。
  5. 【請求項５】 インターロイキン−２様物質よりなる請
    求項１に記載の薬剤組成物。
  6. 【請求項６】 実質的に精製された型の魚の視神経由来
    の寡突起神経膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔ
    ｅ）細胞毒性因子よりなる、請求項５に記載の薬剤組成
    物。
  7. 【請求項７】 インターロイキン−２のムテイン（ｍｕ
    ｔｅｉｎ）よりなる請求項５に記載の薬剤組成物。
  8. 【請求項８】 以下の特徴を有する実質的に精製された
    型の魚の視神経由来の寡突起神経膠細胞細胞毒性因子： １） 水溶性である； ２） 下等脊椎動物（例えば魚）の再生中の傷害された
    神経の調整培地に存在するが、下等脊椎動物の無傷の神
    経の調整培地の中や哺乳動物の傷害されたかまたは無傷
    の神経の調整培地の中には存在しない； ３） インターロイキン−２様物質である； ４） 寡突起神経膠細胞系統には選択的に毒性を有する
    が、他の細胞（例えば１型星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔ
    ｅｓ）や繊維芽細胞）には毒性がない； ５） 寡突起神経膠細胞に対する細胞毒性はインターロ
    イキン−２に対する抗体により中和される； ６） インターロイキン−２に対する抗体を用いるアフ
    ィニティクロマトグラフィーにより、再生中の魚の視神
    経の調整培地から精製される；そして ７） ウェスタンブロット解析による分子量は約２８ｋ
    Ｄａである。
  9. 【請求項９】 魚の視神経由来の実質的に精製された寡
    突起神経膠細胞細胞毒性因子の生産方法において： ａ． 再生中の魚の視神経の調製培地を抗−ＩＬ−２抗
    体によるアフィニティクロマトグラフィーにかけ； ｂ． 結合物質を適当な溶媒で溶出して、 ｃ． 寡突起神経膠細胞に対して選択的細胞毒性を示す
    溶出された画分中の分子量約２８ｋＤａを有する精製因
    子を回収することよりなる、上記方法。
  10. 【請求項１０】 段階（ａ）において抗−ＩＬ−２抗体
    は抗−ヒトＩＬ−２抗体である、請求項９に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 段階（ａ）において抗−ＩＬ−２抗体
    は組換えヒトＩＬ−２に対するマウスモノクローナル抗
    体である、請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 段階（ｂ）において適当な溶媒はグリ
    シンである、請求項９から１１までのいずれか１項に記
    載の方法。
  13. 【請求項１３】 抗−ＩＬ−２抗体を用いるアフィニテ
    ィクロマトグラフィー精製により得られる、魚の視神経
    由来の実質的に精製された寡突起神経膠細胞細胞毒性因
    子。
  14. 【請求項１４】 抗−ヒトＩＬ−２抗体を用いるアフィ
    ニティクロマトグラフィー精製により得られる、魚の視
    神経由来の実質的に精製された寡突起神経膠細胞細胞毒
    性因子。
  15. 【請求項１５】 組換えヒトＩＬ−２に対するマウスモ
    ノクローナル抗体を用いるアフィニティクロマトグラフ
    ィー精製により得られる、魚の視神経由来の実質的に精
    製された寡突起神経膠細胞細胞毒性因子。
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