JPS6339900A - 精製ヒト脈管形成因子、その製造方法並びにそれを含有する医薬製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は精製されたヒト脈管形成因子（ヒトＡＦ）、そ
れを構成する個々のタンパク質、それらの製造方法、並
びに該因子または該タンパク賞分含有する医薬製剤に関
するものである。

発明の背景 組織が成長し、機能する上で予め必要とされる決定的条
件は、それらに血管が適切に供給されることである。傷
の癒合や腫瘍の増殖の如き再生過程での血管の新規形成
を目的とする内皮の誘導は、いわゆる脈管形成因子によ
り開始、コントロールされる複雑な多段階工程を経る。

これらの因子類は個別に、あるいは−緒になって、毛細
管内皮を指示方向に遊走させ、増殖させ、連合構造をと
らせて血管を形成せしめるよう作用する〔アウスブラン
ク（Ｄ、　Ｈ，Ａｕ５ｐｒｕｎｋ）およびフォークマン
（Ｊ、　　Ｆｏｌｋｍａｎ）、シエイ・マイクロバスフ
・レス（Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ、　Ｒｅｓ、）　１
４巻、１９７７．５３−６５頁〕。従って、精製脈管形
成因子（ＡＦ）およびその個々のタンパク質は、炎症性
疾−’ｃｉおよび腫瘍の診断、とりわけ、内皮腫の鑑別
診断、並びにｌｌｌ！瘍、動脈硬化症、および傷の癒合
等の治療に重要である。これらは、妊娠や骨生長の如き
正常な組織の形成および再生においても一役を担ってい
る。

脈管形成因子は、サイトキン（ｃｙｔｏｋｉｎｓ）とし
て知られている一つのグループに属している。このグル
ープには、単核細胞類、マクロファージ類、内皮細胞、
あるいは腫瘍細胞等の様々な細胞により分泌され得る生
物活性な可溶性ペプチドが含まれる。その他、サイトキ
ンの例として、インターフェロン類（インターフェロン
−α、βおよびγ）、インターロイキン１および２、マ
クロファージ活性化因子（ＭＡＦ）、マクロファージ遊
走阻止因子（ＭＩＦ）、並びに、［表皮性成長因子（Ｅ
ＧＦ　）Ｊ、「線維芽細胞性成長因子（ＦＧＦ）」およ
び「血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）Ｊ等の種々の成
長因子を挙げることができる。これらのサイトキン類は
、様々な細胞タイプの間葉や上皮起源の分化および増殖
を刺激する。

種々の脈管形成因子（それらの大部分は動物起源である
）が、適当な実験条件を整えることにより新らしい血管
の形成状況を開始させることが報告されている〔アワエ
ルバッハ（Ｒ，、Ａｕｅｒｂａｃｈ）リンホカイン類（
Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ）　４巻、１９８１．６９−８
８頁〕。これらの因子は、組織抽出物（例、牛の脳、牛
の網膜）、あるいは腫瘍組織または培養されたｉ￥瘍細
胞を起源としている。

上記の脈管形成活性に関する化学的特徴や細胞性起源に
ついては殆んど知られていない。

また、どの細胞が、どのような生理学的あるいは病理学
的条件下で脈管形成活性を生成するかについても、これ
までは不明瞭であった。文献には、可能な産生体として
腫瘍細胞、リンパ細胞およびマクロファージが示されて
いる。

従って、ヒト細胞由来の脈管形成因子が有効成分である
ことは分っていたが、従来は、他のタンパク質や生物学
的な液体との混合物として記載されているにすぎず、ま
た、１例を除けば構造上の特性化もなされていない。

ストリドム（Ｄ、Ｊ　、Ｓｔｒｙｄｏｍ、）らはヒト腫
瘍細胞（ＨＴ２９）から単離された脈管形成因子〔アン
ギオゲニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）］のアミノ酸配列
を記裁している〔バイオケミストリイ（Ｂ　ｉｏｃｈｅ
ｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ）２４巻、１９８５．５４８６−５
４９４頁コ。アンギオゲニン（分子量１４．４’００、
等電点〉９．５）はウサギの眼の角膜中、並びに醇化鶏
卵の梁床膜上で生物学的に活性であるが、培養されたヒ
ト内皮細胞の増殖を刺激することはない。

発明の記述 本発明の根本的な問題点は、高純度のヒトＡＦ、その個
々のタンパク質およびそれらを単離する方法に関係して
いる。さらにまた本発明は、精製ヒトＡＦまたはその個
々のタンパク質を含有する医薬組成物を提供するもので
ある。従来は、ヒト細胞からヒトＡＦを純粋な形で製造
することは不可能であった。

本発明は以下の知見に基づくものである。即ち、ヒトＡ
Ｆは特殊な単核細胞／マクロファージによって分泌され
るのみならず、ヒトＡＦに対するモノクローナル抗体に
よって示されるように、いくつかの内皮細胞や腫瘍細胞
、とりわけ様々な腫瘍セルラインからも分泌される。ヒ
トＡＦは、ＭＩＦ、インターフェロン、Ｍ　Ａ　Ｆおよ
びＥＧＦＳＦＧＦおよびＰＤＧＦの如き成長因子とは明
確に識別され得るものである。

従って本発明は、精製ヒト脈管形成因子（ヒトＡＦ）お
よびその個々のタンパク質に関するものである。

精製ヒトＡＦの個々のタンパク質はタンパク質分析の常
法、好ましくはプレパラテイブ（′ｆＪｆＡ製用の）ゲ
ル濾過、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、陰
イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリン−セフアロー
スによるアフイニテイクロマトグラフイーまたはヒドロ
キシアパタイトによる吸着クロマトグラフィー、あるい
はこれらの方法を組み合わせることにより均質な形で単
離され得る。それらは脈管形成性を検出するための、標
準的な分析法において活性を示す。

ヒトＡＦは分子量約６４，０００（６４ｋｄ）および約
６８，０００　（６８ｋ　ｄ　）、等電点約５．０〜５
．３の２個のタンパク質からなっている。

Ｄ、Ｊ、ストリドム（Ｓ　ｔ　ｒｙｄｏｍ）記載のアン
ギオゲニンは醇化鶏卵テストの結果を除き、ヒトＡＦと
その特徴点が全て異っている。

ヒトＡＦは、ヒトＡＦに対するモノクローナル抗体によ
って認識され、結合されるエピトープを有するヒト起源
のタンパク質のみを含んでいる。

ヒトＡＦは、おそらくグリコジル化の相違に起因して異
る、分子量約６４．０００および６８，０００の個々の
タンパク質を含み、場合により、更により高分子量の個
々のタンパク質またはその凝集物、さらに約２０，００
０の低分子量の解離産物を含んでいることもある。ヒト
ＡＦは、醇化鶏卵の梁床膜上での新らしい血管の形成（
脈管形成性）の測定に基づく標準的分析法において活性
を示す。該テストはステンジンが−（Ｓｔｅｎｚｉｎｇ
ｅｒ）らの方法に従う〔ヨー口・ジエイ・キャンサー・
タリノ・オン：１口（Ｅｕｒ、Ｊ　、Ｃａｎｃｅｒ　Ｃ
Ｊｉｎ、　０ｎｃｏ、ｇ、）１９巻、１９８３．６４９
−６８６頁〕。

第１図はイムノアフィニティークロマトグラフィーによ
って精製したヒトＡＦ標本を５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（１０％アクリルアミド）にかけて得た
結果を示す写真の模写図である。黒色＠（メラノーマ）
セルラインＡ３７５／２の培養上清を、支持体に結合さ
せたヒトＡＦに特異的なモノクローナル抗体と一緒にイ
ンキュベートした。特異的に結合したヒトＡＦを、メン
プラン・トラップ〔バイオトラップ（Ｂｉｏｔｒａｐ）
、シレイヒヤ−（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）およびシュル
（ＳｃｈＨｌｌ　二）　、ダッセル（Ｄａｓｓｅｌ）Ｅ
　　中で２００Ｖの電圧をかける（１０ｍＭトリスホウ
酸バッファーｐＨ８，３中１０時間）ことにより溶離し
た。タンパク質のバンドを、トリチウム・ロイシンで標
識（マーク）しておいた上清をフルオログラフィーにか
けることにより検出した。分子量の分っている標識タン
パク質の位置を左側に示した。

第２図はヒトＡＰを等電点電気泳動にかけて得た結果を
示す写真の模写図である。黒色腫セルラインＡ３７５／
２の培養上清をセルパライト（Ｓｅｒｖａｌｙｔｅ）の
市販のゲル〔セルバ（Ｓｅｒｖａ）、ハイデルベルグ〕
を用い、ｐＨグラデイエンド３〜１０により分離した。

焦点（フォーカス）処理の後、分離したタンパク質をニ
トロセルロース上に移した。ヒトＡＦに対して特異的な
モノクローナル抗体を用いるウェスタンプロット法によ
ってヒトＡＦを検出した。マーカータンパク質の位置と
の比較により等重点（ｐＩ）を求めた。

本発明はまた、精製ヒトＡＦの製造法に関するものであ
る。本発明方法は、出発物質としてヒトＡＦを含有する
溶液、好ましくはヒトＡＦ形成性ヒト細胞の培養上清ま
たは細胞エキス（抽出物）を含有する溶液を用いること
を特徴とするものである。確立された（永久的な）ヒト
黒色腫細胞が好ましい。好ましいヒト黒色腫細胞には、
例えば、Ａ−３７５／２、Ｍｅｌ　Ｓ？、’Ｍｅｌ−３
１３、ＭｅＪ−２ａおＸＦ　Ｍ　ｅ　Ｗ○等の各種メラ
ノーマセルラインがある（Ｗ、ステンジンガーら、前掲
、６４９−６５６頁）。これらの内、好適なものはメラ
ノーマセルラインＡ３７５／２である。

本発明方法においては、ヒトＡＦを含有する溶液を、ヒ
ト担体と結合しているヒトＡＦに特異的なモノクローナ
ル抗体と接触させ、非結合タンパク質、並びに他の無関
係な物質を洗い去る。この方法はイムノアフイニテイク
ロマトグラフイーとして知られている。次いで、抗体と
結合した分子量約６４ｋｄ〜６８ｋｄのヒトＡＦを溶離
し、単離する。

ヒトＡＦ含有溶液、例えば、ヒト細胞の細胞培養上清ま
たは細胞培養Ｐ液は自体既知の方法で調製される。ヒト
ＡＦ含有溶液は、細胞および／または細胞上清から、例
えば、抽出、濾過および／または遠心により得ることが
でき、さらに、所望により抗生物質および／またはタン
パク分解酵素阻害剤を加えて安定化する。この様なヒト
ＡＦ溶液は、これをそのまま、担体またはマトリックス
に結合させたヒトＡＦに特異的なモノクローナル抗体と
接触させてもよい。しかしながら、排除限界が分子量約
１，０００の膜を用いて限界濾過することにより予め精
製し、濃縮しておくことが好ましい。所望により、これ
らの工程の後、クロマトグラフィー、例えばポリオール
−ＤＥＡＥ　（セルバ、ハイデルベルグ）、分子飾、等
電点電気泳動（ＬＫＢ、スエーデン）、クロマトフオー
カシング（Ｌ　Ｋ　Ｂ、スエーデン）等の方法を、分離
用材料の製造業者の指示に従って行ってもよい。

本発明方法では、溶液中に含まれている他のタンパク質
や無関係な物質とヒトＡＦとをイムノアフイニテイクロ
マトグラフイーにより分離することができる。この目的
を達成するには、ヒトＡＦを含有している溶液を、ヒト
ＡＦに対して特異的なモノクローナル抗体を結合させた
担体と接触させる。

適当な担体には、例えば、シリケート類、交差結合した
アガロース、デキストランまたはポリアクリルアミド等
の適当に機能化された形のものがある。ヒトＡＦに対し
て特異的なモノクローナル抗体を、必要に応じて予め活
性化させた担体に自体、既知の方法により結合させる。

例えば、活性化されたエステル基（機能）を有する担体
（例、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基）をバ
ッファー水溶液に懸濁し、モノクローナル抗体の溶液と
混合する。次いで、結合しなかったモノクローナル抗体
を洗い去り、例えばエタノールアミンの如き１級アミン
で担体上の反応性の、非占有部位を遮断する。モノクロ
ーナル抗体を担っている担体を適当な水性溶媒、例えば
塩化ナトリワム溶液、あるいはりん酸緩衝化ＮａＣ１溶
液（ＰＢＳ）、Ｎ　ａ　ＨＣＯ３溶液または３−（Ｎ−
モルホリノ）−プロパノ・スルホン酸溶液の如きバッフ
ァー溶液中樽に懸濁し、ヒトＡＦ含有溶液と接触させる
。例えば、モノクローナル抗体を伴った担体をクロマト
グラフィーカラムに充填し、ヒトＡＦ含有溶液を適用し
、所望により加圧しながら担体上に通す。

非結合タンパク質やその他の不純物を水性液体、例えば
ｐＨ範囲約５〜９および／または濃度０．１−０．３Ｍ
、好ましくは０．１５ＭのＮａＣＪ溶液で洗い去る。担
体上の抗体と結合したヒトＡＦを、適当な水性溶液、好
ましくはグリシンバッファーの如きｐＨ域約ｐＨ２〜約
ｐＨ５のバッファー溶液、あるいは種々の組成物または
塩溶液のｐＨグラジェント、好ましくはＮＨ４ＳＣＮの
３〜４Ｍ溶液により溶離する。得られた、ヒトＡＦを含
有している精製溶液を必要ならば中和し、自体既知の方
法、例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘｏ）　ニ
よルクロマトグラフイー、電気透析、限外濾過および／
または減圧遠心にかけてより高純度のヒトＡＦを単離す
る。

所望により、ヒ）ＡＦをその個々のタンパク質に分離す
る。例えば、このタンパク質の混合物をクロマトグラフ
し、自体既知の方法で分子量の変化により分画すること
によって分離し、個々のタンパク質に分離する。好まし
くは、調製用ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動［：５ＤＳ−ＰＡＧＥ、ｔＪ、に、ラ
エムリ（Ｌａａｎｌ　ｉ　）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、２２７巻、１９７０．６８０頁〕により精製ヒト
ＡＦを分離する。自体既知の方法によりゲルから分子量
の均一な画分を溶離し、例えば、セファデックスＯによ
るクロマトグラフィー（好ましくはセファデックス０Ｇ
−７５またはＧ−１００）、電気泳動的濃縮および／ま
たは減圧遠心法にかけ、純粋な形で単離する。

また、ヒトＡＦはカラムクロマトグラフィーを用いる方
法によっても均一な分子量の両分に分けられ、これから
個々のタンパク質を単離することができる。陰イオン交
換カラムＣＭｏｎｏ　−Ｑ　、　ＨＲ５−５、ファルマ
シア（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）、アップサラ（Ｕｐｐｓ
ａｌａ）　］、次いでヘパリン−セフアロース（黒１７
−０４６７−０１　：ファルマシア）上アフイニテイク
ロマトグラフイー、最後にヒドロキシアパタイト〔盃１
２５−０１７５：バイオーラト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）］上
交換クロマトグラフィーを行うことからなる一連の分離
工程が好ましい。

本発明はまた、本発明方法によって精製されたヒトＡＦ
またはその個々のタンパク質を含有する医薬製剤に関す
るものである。

本発明の医薬製剤は、人間の如き温血動物に対し、経腸
投与、例えば鼻腔内、経直腸、または経口投与すること
ができるが、非経口投与が好ましい。目的とする投与経
路に応じて、本発明の医薬製剤を、例えばアンプル、薬
びん、廃剤、糖衣錠、カプセル剤として、あるいは液状
または固形の鼻腔内スプレーとして１回投与剤形に製剤
化することができる。

化合物の治療有効投与量は投与経路、並びにヒト等、温
血動物の状態、例えば体重、疾患の性質および重篤度、
および全身の健康状態に依存しており、医師により決定
される。ヒトＡＦおよびその活性は個々のタンパク質の
投与量は１日当り、０．０’０１〜１０μｇ／体重に９
とすることができる。

本発明の医薬製剤には通常の、無機、有機、固型または
液体状の薬学的に許容し得る担体または希駅剤を可能な
らば賦形剤と一緒に含有させることができる。好ましい
有効物質の溶液または懸濁液は、等張性の水溶液または
懸濁液を用いて調製され、さらに、使用の前に溶屑させ
る凍結乾燥製剤の形を採用してもよい。医薬製剤は、滅
菌され、そして／または保存剤、安定化剤、界面活性剤
、乳化剤、可溶化剤、増粘剤、侵透圧調節用の塩類およ
び／またはバッファー、並びに、ヒト血清アルブミンの
如き他のタンパク質類またはヒト血漿製剤を含有してい
てもよい。

以下に実施例を挙げ本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１　粗ヒトＡＦの生産 ヒトＡＦを生産するために、ヒト黒色腫セルラインＡ−
３７５／２を：エールの塩類（Ｅａｒｌｅ’５ｓａｌｔ
ｓ）　Ｃギブコ（Ｇｉｂｃｏ）］、１５％ウシ胎児血清
〔）ぐイオクロム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）ベルリン（Ｂｅ
ｒ　ｌ　ｉｎ）〕を添加した最少必須培地（ＭＥＭ）　
１００ａｔ！中、培養皿〔ナンクロン（Ｎｕｎｃｌｏｎ
）Ｔ　６００　、カタログ厘１６６．５０８〕当り細胞
密度約４×１０６でインキュベートした。細胞を３７℃
で２４時間インキュベートした後、血清不含のＭＥＭ−
Ｅａｒｌｅ’ｓ各１００ｍｅで３回洗浄し、ペニシリン
−ストレプトマイシン、グルタミン、非−必須アミノ酸
、ピルビン酸ナトリウムおよびＨＥＰＥＳをそれぞれ濃
度１％の割合で添加したＭＥＭ−Ｅａｒｌｅ’ｓを用い
、３７℃で更に７２時間インキュベートした。７２時間
後に上清を除き、−８０℃で冷凍−解凍を繰り返すこと
により細胞を抽出した。抽出液と上清を合わせ、２５０
×１で３０分間遠心した。

実施例２　ヒトＡＦの同定（ＣＡＭテスト）８日令の群
化鶏卵の平坦な末端にドリルで穴をあけ、強固なフィル
ムで被覆した。さらに１〜２日経過後、鶏卵の尖った末
端にｌＸＩＣ１ｍの窓をドリルで開口した。滅菌したプ
ラスチック製のピンセットで殻を除き、窓の外側端部を
シリコン油でコートした。滅菌したカバーグラスで窓を
気密状（こシールした。さら（こ２日後（１０日口重、
グラスファイバーのフィルタープレート上に直径０．５
ｃｍ　（６０μｉｌｊ’レート）でスポットした被検物
質を梁床膜（ＣＡＭ）上に置いた。保湿培養器（３７℃
）中で３−４日間インキュベートした後、カバーグラス
を除き、４％ホルムアルデヒド溶液中に３０分間浸漬し
て醇化鶏卵を殺し、フィルタープレートと一緒にＣＡＭ
を摘出し、４％ホルムアルデヒド溶液と共にぺｌ−ＩＪ
皿に入れた。プレートの下または周囲に新らしい毛細管
の輪が存在すれば陽性反応である。

実施例３　ハイブリ・、ドーマ細胞およびヒトＡＦに特
異的なモノクローナル抗体の製造 ３．１　　ヒトＡＦの単離 実施例１の方法に従い、Ａ−３７５／２セルラインの血
清不含培養上清がら単離した物質１５０ゴを、ＣＸ−１
０液浸フイルター〔ミリボア（Ｍｉ　ｌ　ｌ　１ｐｏｒ
ｅ）カタログＡＰ　Ｔ　Ｂ　　Ｃ１ＩＫ２５’：ｌを用
い１　ｍｌに濃縮した。この濃縮物をＨＰＬＣにがけ、
ＴＳＫ−１２５シーブカラム（バイオ−ラッド、ムニツ
ヒ）テ分画シタ。一部ヲニトロセルロース上にスポット
した後、モノクローナル抗体によりヒトＡＦ含有両分を
同定した。陽性の両分をプールし、再び２ｍｌに濃縮し
た。これらの製品は約４０μ九勺のタンパク質を含有し
ていた。この物質を、実施例３．２に示す如く赤血球と
の結合（カップリング）に用いた。

３．２　　ヒトーＡ’Ｆ含有タンパク質画分とヒツジ赤
血球（ＳＲＢＣ）とのコンジュゲーション充填されたヒ
ツジ赤血球〔パックドヒツジ赤血球細胞台（ＳＲＢＣ）
、ベーリングベルク（Ｂｅｈ−ｒｉｎｇｗｅｒｋｅ）’
］　２．５ｒｎｌをりん酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）２０
ａ／中に懸濁した。この５ＲＢＣ懸濁液１００μｌをＰ
ＢＳ中グルタルアルデヒド溶液９００μｅと一緒に室温
で５分間インキュベートし、グルタルアルデヒドの終濃
度を０．０５％とした。

この様にして前処理した５ＲＢＣを水冷蒸留水で２回洗
浄し、２０００Ｘ７で遠心分離した後、実施例３．１で
調製したヒトＡＦ含有画分３００μでと一緒に２０℃で
１時間インキュベートした。この１懸濁液を、実施例３
．３における免疫化に用いた。

３．３　　免疫化 実施例３．２で調製した、ヒ）ＡＦと結合した５ＲＢＣ
懸濁液各０．５　ｒｒｔｌを、完全フロイントのアジュ
バント０．５　ｍｌと一緒にＢＡＬＢ／ｃマウスに、０
．７および１０日口重３回注射することにより免疫した
。４分の１に分け、注射量の半量を腹腔内投与（ｉ、ｐ
、）Ｌ、残る半量を皮下投与（ｓ、ｃ、）した。１３お
よび１４日口重こアジュバントを含まないコンジュゲー
ト懸濁液０．５　ｍｅづつを腹腔内注入することでブー
スター注射した。第１８日月に処置マウスの）半量を摘
出した。

３．４　　細胞融合 ケーラー（Ｇ、に；ｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｃ
，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）の方法（ケーラーおよびミルスタ
イン、ネイチャー、２５６巻、１９７５．４９５−４９
７頁）に従い、約１０８の胛リンパ則胞と約３．３Ｘ１
０　　のマウス黒色腫細胞Ｐ３−Ｘ６３’−Ａ、Ｆ８．
６５３［カーネイら（Ｊ、Ｆ、　Ｋｅａｒｎｅｙ）、ジ
エイ・イムノロ（Ｊ　、Ｉｒｒｍｕｎｏｌ、）１２３巻
、１９７９．１５４ｇ−１５５０頁〕とを、以下の溶液
、即ちダルベツコの改良イーグル培地中の３５％ポリエ
チレンクリコール４０００（メルク、ダルムスタット）
と９．７％ジメチル・スルホキシド溶液との混合物１．
５　ｍｌに入れて混合した。融合後、細胞をフアシヨン
（Ｆａｌｃｏｎ）　３０４０製９６ウエルプレートの６
００個のウエルニフレートシ、リトルフィールドのＨＡ
Ｔ培地（Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ’ｓ　ＨＡＴ　ｍｅｄ
ｉｕｍ）（Ｊ、Ｗ、リトルフィールド、サイエンス、１
４５巻、１９６４．７０９−÷７１０頁）中で、供給細
胞としての骨髄マクロファージ〔ノイマン（Ｎｅｕｍａ
ｎ）トンーク（Ｓｏｒｇ）、ヨー口・ジエイ・イムノロ
（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｒｒｒｎｕｎｏｌ）　１０巻１９８０
．８３４−８４０頁〕をウェル当り約１０　個加えて培
養した。

ＨＡ　Ｔ中で１０日間培養した後、ＲＰＭ１１６４０Ｈ
Ｔ培地中でさらに培養した。

３．５　　抗体特異性に関するハイブリドーマ細胞の検
査 ３、５．１　　ガンマグロブリン同定 ハイブリドーマ細胞の培養上清を、第２の抗体としてペ
ルオキシダーゼと結合しており、マウスのガンマグロブ
リンで認識され、結合されるウサギ由来の抗体を用いて
行うＥＬ　Ｉ　ＳＡ法にかけた〔スターら（５ｕｔｅｒ
）　、ジエイ・イムノロ・メン（Ｊ、　ｒｒｒｍｕｎｏ
Ｌ　、　Ｍｅｔｈ、）３９巻、１９８０．４０７−４１
１頁〕。

３、５．２　　所望の分子量域のタンパク質に対する特
異性 シンジエネイックなマウスの赤血球（ウェル当り、Ｐ　
Ｂ　Ｓ　１００　ｔｔｌ！　中１ｃ赤血球約Ｉ　Ｘ　１
０６個（７）割合）杏ポリーＬ−リジン（２５η／ＩＩ
Ｌｌ）で被覆した９６ウエルのプレート〔ダイナチク（
Ｄｙｎａｔ　−ｅｃｈ）マイクロタイター〕に適用し、
４℃で一夜インキユベートした。結合しなかった赤血球
を。

Ｐ　１３５で数回洗浄して除いた。実施例３．２でその
概要を述べた様に、この様にして結合した赤血球をグル
タルアルデヒドで固定化し、洗浄した後、ヒトＡＦ含有
画分と一緒にインキュベートした。

非 数回洗浄し１合タンパク質を除き、プレートラ０．１％
Ｎ　２３　Ｎ　３含有ＰＢＳ中に保存した。プレートを
ハイブリドーマ細胞由来の培養上清と一緒にインキュベ
ートした後、アルカリホスファターゼと結合した第２抗
体であるウサギの抗マウスイムノグロブリンと一緒にイ
ンキュベートし、２−アミノ−２−エチル−１，３−プ
ロパンジオールバッファー〔セルバ（Ｓｅｒｖａ）Ｅ　
中ノル−ニトロフェニルホスフェートで展開した（スタ
ーら、ジエイ・イムノａ−メン、３９巻、１９８０．４
０７−４１１３Ｎ）。遊離されたｐ−二トロフェノール
を４０５　ｎｍにおける光度測定により同定した。この
ＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験の結果、実施例３．２のヒ）ＡＦを
含有する分子量画分の赤血球結合タンパク質と結合する
、モノクローナル抗体が認められた。

３、５．３　　ヒトＡＦに対する特異性実施例３．５．
２で同定されたクローンの培養上清から得たガンマグロ
ブリンを５０％飽和硫酸アンモニウムで析出させ、この
沈殿をＰＢＳ中にとり、業者の指示に従ってＡｆｆｉ　
−Ｇｅｌ　１０　　（バイオ−ラド）と結合させた。こ
の様にして固定化したガンマグロブリンを、ヒトＡＦを
含有する上清と一緒に４℃で一夜インキユベートし、次
いで、ＩＥＣ遠心機により、２０００Ｘ７．４℃で１０
分間遠心した。次いで、実施例２に従い、ＣＡＭテスト
によって上清溶液を残存ヒトＡＦについて調べた。

この様にして３つの陽性の細胞クローンが得られた。そ
の内の１つを５Ｆ４と命名した。

３、５．４　　モノクローナル抗体の単離と精製ＢＡＬ
Ｂ／ｃ？ウスをブリスタンｏ（Ｐｒｉｓｔａｎ）〔カー
ＪＬｔ　−０ス（Ｃａｒｔ　Ｒｏｔｈ）、カールスルー
エ（ｆ（ａｒｌｓｒｕｈｅ）１０．４　ｍｌの腹腔内投
与で前処置した。

１週間後、約２〜５×１０６のクローンしたハイブリド
ーマ細胞を腹腔内に注入した。各マウスから腹水を繰返
してとり、−８０℃で凍結した。

採取した液体を解凍し、４℃において３ｏｏｏｏＸｙで
３０分間遠心した。脂肪を吸引し、残存する破片不含の
上清に０℃で撹拌下、飽和覚酸アンモニウムを濃度が５
０％になるまで滴下した。この様にして析出した粗イム
ノグロブリン画分を業者の指示に従い、ＤＥＡＥ　　Ａ
ｆｆｉ−ゲルブルー（Ｇｅｌ　Ｂｌｕｅ）（バイオラド
）を用い、０．１　ｍｏｌ　）リスＨＣｅ（ｐＨ８，２
）で溶離してクロマトグラフし、活性成分を一緒にし、
アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ＸＭ５０フイルター（アミコ
ン）で濃縮した。

実施例４　抗体カラムの調製 業者の指示に従い、Ａｆｆｉｃｏ−’ｆル１０（バイオ
−ラド）を冷蒸留水とカップリング・バッファー（ＰＢ
Ｓ、０．１５　Ｍ、　　ｐＨ７，２）で洗浄した。

ゲルの、カップリングバッファー中５０％ｉ！Ｊ３液（
１ｍｌ　）をプラスチック・チューブに入れ、同量の精
製抗体溶液（モノクローナル抗体２０　ｒｑ　）と混合
し、室温で４時間回転させた。次いで、ゲルをカップリ
ングバッファーで洗浄した。活性のある遊離の部位をブ
ロックするためにゲル１　ｍｌに対し、ＩＭ−］−］タ
ノールアミ７−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）０．１　ｍｌ！
を加え、室温で２時間処理した後、ゲル１ｍｌについて
１０　ｍＭのすｌ−ＩＪウムアジドを含有するＰＢＳで
洗浄し、そのまま４℃に保った。カップリングの程度は
２８０　ｎｍにおける吸光度測定で求め、ゲル１尻ｅ当
りのモノクローナル抗体は合計１２〜３０■であった。

実施例５　ヒトＡＦタンパク質の単離と精製５．１　　
ヒトＡＦの製造 実施例１の方法に従ってＡ−３７５／２セルラインの培
養上清を調製した。血清不含の培養上清的１２１を、メ
ンプランの分子量排除限界が〉１０゜０００　であるペ
リコン（Ｐｅ　Ｌ　１ｃｏｎ）　　カセット・システム
（ミリポア）を用いて約１６０ａｌに濃縮し、０、ＯＩ
ＭＰＢＳ　　に対して透析した。

５．２　　イムノアフイニテイ・クロマトグラフィー濃
縮した粗ヒ）ＡＦ２０ｍｇを、ゲル１　ｒｎｅにつき抗
体１２ηの割合で結合させたゲル４ｍＪの入った抗体カ
ラム（実施例４）に、４℃、流速１０ｒｎｅ／時間で繰
返しポンプ注入した。０．１％オクチルグリコジッド添
加Ｐ　Ｂ　Ｓ　］、　ＯＯｍｅで非持異的に結合してい
るタンパク質や付随する他の物質を洗い去り、最後に、
０．１モルＮａＣ１水溶液１０ｍｅを用い、流速１５ａ
ｅ／時間でカラムから溶離した。特異的に結合している
ヒトＡＦタンパク質を、０．１ｍｏｌグリシン塩酸塩／
　０．１　ｍｏｌ　ＮａＣｊ？（ｐＨ２，６）の水溶液
で溶離した。溶出液を２８０　ｎｍにおける吸収の自動
測定により追跡した〔ユニコード（Ｕｎｉ−ｃｏｒｄ）
Ｓ、　ＬＫＢインスツルメンツ〕。タンパク質含有画分
を一緒にして１モルトリス溶液を加えて中和し、実施例
２の如くにして生物活性を測定した。この物質は脈管形
成性を示した。

５．３　　ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）によるヒトＡＦタンパク質の分析 透析による濃縮物（実施例５．１）の１部（約２％）を
ラエムリ（Ｕ、に、　Ｌａｅｍｌ　ｉ）の方法（ネイチ
ャー、２２７巻、１９７０．６８０−６８５頁）に従い
、１２．５％ポリアクリルアミド・フラットゲルを用い
て電気泳動させた。クマツシー（Ｃｏｍ−ａｓｓｉｅ）
ブリリアント・ブルー〔フル力（Ｆｌｕｋａ）〕染色ま
たはメリル（Ｃ８Ｒ，Ｍｅｒｒｉ　ｌ　）らの銀染色法
〔アナリティカル・バイオヶミストリイ（Ａｎｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　１１０巻、１９８１．２０１−２
０７頁〕により染色してタンパク質バンドを観察した。

抗体カラムから溶出した物質は分子量約６４゜０００（
６４ｋｄ）および約６８，０００　（６８ｋｄ）のタン
パク質を含有していた。

もう一方のバッチで、実施例５．１の透析濃縮物の一部
（約２％）を上記ラエムリの方法に従い、１５％ポリア
クリルアミド・フラットゲルにより電気泳動させた後、
トウビンら（Ｔｏｗｂｉｎ）　［：プロシーデインダス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
スイズ（Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔ　、Ａｃａｄ　。

Ｓｃｉ、）７６巻、１９７９．４３５０−４３５４頁〕
の指示およびトランス−プロット（Ｔｒａｎｓ　−Ｂｌ
ｏｔ”装置に関するバイオ−ラッド社の１９８３使用規
定に従い、メンプラン〔バイオトラップ（Ｂｉｏ−ｔｒ
ａｐ）シレイヒヤー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）およびジ
ュール（Ｓｃｈｕｌｌ）　］上；こ電気溶離し、ヒトＡ
Ｆタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用い、間
接的な免疫ペルオキシダーゼ法で染色した。プロット上
に、分子量約６４，０００　（６４ｋ　ｄ　）おヨヒ約
６８，０００（６８ｋｄ）の２本のバンドを認めた。

５．４　　ＨＰＬＣゲル濾過法によるヒトＡＦタンパ実
ｍ、、５．２で単離した物質をＴＳＫ１２５モレキュラ
ーシーフ（バイオ−ラッド）で分離した。使用した溶離
剤はＰＢＳ、ｐＨ７，２であり、流速は０、５　ｒｒｔ
　７分であった。０Ｄ２８ｏにおいて、この物質は）８
０，０００と約６０，０００−７０，０００の２つのピ
ークを示した。両方の分子量域の画分をプールし、５０
　ｍＭ重炭酸アンモニヮムに対して透析した後凍結乾燥
し、乾燥後、２回蒸留した水中にとり、再び凍結乾燥し
た。これら各調製物の１部をＣＡＭテスト（実施例２）
にかけ、ヒトＡＦについて１回調べた。

５．５　　イオン交換ＨＰＬＣおよびイムノアフ・イニ
テイクロマトグラフイーによるヒトＡＦタンパク質のプ
レパラティブ分離および単離 実施例２の如くにして得た物７８１０　ｒｎｌを室温下
、モノ（Ｍｏｎｏ）　　Ｑ陰イオン交換カラム（ＨＲ５
１５１，ぢ１７０５４６−０１：ファルマシア）に充填
し、線状塩グラデイエンドで溶離した。移動相（Ａ）は
、Ｏ，ＯＩＭ　　ＰＢＳ、ｐＨ７，２であり、移動相（
Ｂ）はＩ　Ｍ　ＮａＣｇ−）−０，１Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　
、　ｐＨ７，２であった。各両分の１部をニトロセルロ
ース上にスポットし、トウビンらの方法（実施例５．３
参照）に従い、ヒトＡＦに特異的なモノクローナル抗体
で染色した。０．４Ｍ　ＮａＣ１域における陽性画分を
プールし、ミリポア・イマーシブル（Ｍｉ　ｌ　１　ｉ
ｐｏｒｅＩｒｒｍｅｒｓｉｂｌｅ）　ＣＸ　１０　　限
外濾過機を用いて１　ｒ！Ｉｅに濃縮し、０．１ＭＰＢ
Ｓに対して透析し、実施例２の方法に従って生物学的活
性を調べた。この物質は脈管形成性であった。

次の工程で、この物質をヘパリン−セフアロースＣＬ−
６Ｂ　（泥１７−０４６７−０１　、ファルマシア）に
よるアフイニテイクロマトグラフイーにかけた。この方
法は、該物質を０．ＯＩＭＰＢＳに対して透析し、予め
移動相（０，０１Ｍ　）　’）ス＋０、１　Ｍ　ＮａＣ
１：　ｐＨ７，０）で平衡化しておいたヘパリン・カラ
ム（４０ｍｌゲル床）にかけることからなる。次いで移
動相Ｂ（０，０１Ｍトリス、２．２Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ
７，２）による線状グラデイエントチ溶離した。フラク
ションをニトロセルロース上にスポットし、ヒトＡＦタ
ンパク質に特異的なモノクローナル抗体で検出した。ヒ
トＡＦに対して特異的なモノクローナル抗体をヒトＡＦ
タンパク質に加えた。サブストラル（基質、５ｕｂｓｔ
ｒａｌ）バッファー溶液（ジアミノベンジジン５０’ｎ
９／ＰＢＳ１００ｍｇ＋Ｈ２Ｏ２４０μｌ）を加えるこ
とにより、マウスのイムノグロブリンに対して惹起され
たペルオキシダーゼ−標識抗血清（ヒツジ）で、抗原（
ヒトＡＦ　）と結合したモノクローナル抗体を検出した
。色の強度はニトロセルロース上にスポットされた抗原
（ヒトＡＦ）の量と比例する。

陽性画分をプールし、０．１５ＭＰＢＳに対して透析し
た後、実施例２の方法に従って生物活性を調べた。Ｑ、
５ＭＮａＣ１の位置で溶離したこの物質は脈管形成性で
あった。

第３番目の工程では、この物質をヒドロキシアパタイト
（瓜！２５−０１７５；バイオラッド）で精製した。１
／１０濃縮バツフアー（移動相Ａ、０．０１　ＭＮａ２
ｐ０４＋０．０１　ＭＣａ（Ｊ’２　、ｐＨ６，８）に
対して透析した後、載物・實を移動相Ａで平衡化された
ヒドロキシアパタイト・カラム（ゲル床４、８　ｍｌ）
に充填し、移動相Ｂ　（０，５Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４，０
，０１ｍＭＣａ（Ｊ’２　、ｐＨ６，８）の線状グラデ
イエンドで溶離した。両分の一部をニトロセルロース上
にスポットし、ヒトＡＦタンパク質に特異的なモノクロ
ーナル抗体で染色した。０．５ＭＮａＣｌで溶離した陽
性画分をプールし、０．１５ＭＰＢＳに対して透析した
後、実施例２の方法に従って生物学的な活性を調べた。

この物質も脈管形成性であった。

この物質を、ＰＢＳを移動相としてモレキュラーシーブ
・カラム（ＴＳＫ−１２５）で分離すると、分子量６０
，０００と７０，０００の間にホモジーニアス（均一）
なピークが認められた。該物質を実施例５．３のラエム
リの方法に従い、１５％ポリアクリルアミドフラットゲ
ル上で分離した後、ニトロセルロース上に郡し、ヒトＡ
Ｆに特異的なモノクローナル抗体で染色すると、分子全
域６４゜０００と６８，０００に２本のバンド、さらに
２０゜０００に１本のバンドが認められた。

５．６　　ヒトＡＦの等電点の測定 実施例５．１においてヒトＡＦ含有培養上清から得たタ
ンパク質５０μｍを５０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液に
対して透析し、凍結乾燥して皿回蒸留水１００μｌにと
り、市販のゲル〔プレコート（Ｐｒｅｃｏｔｅ）、セル
バ（Ｓｅｒｖａ）’］上、ｐＨ３−１０において等電点
電気泳動させた。ゲルをニトロセルロース上にプロット
させ、トウービンラ（Ｔｏｗ−ｂｉｎ）の方法（実施例
５．３参照）に従い、ヒトＡＦに特異的なモノクローナ
ル抗体で染色した。

ｐＨ５，０−５，３の領域に単一のバンドが認められた
。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトＡＦ含有タンパク質をポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけ、フルオログラフィーで検出するこ
とにより得られた泳動パターンの写真の模写図である。 第２図はヒトＡＦ含有タンパク質を等電点電気泳動にか
け、ウェスタンプロット法で検出することにより得られ
た泳動パターンの写真の模写図である。 特許出願人　ロバファルム・アクチェン・ゲゼルシャフ
ト代　理　人　弁理士　青　山　　　葆例１名）図」の
半開内容に変更なし） ＦＩＧ、　　１ ＦＩＧ、　　２ １　事件の表示 昭和６２年特許願第　　４１２５２　　　号ｔ１７製ヒ
）・脈管形成因子、その製造方法並びにそれを含有ｒろ
医薬製剤 補正をする者 事件との関係　特許出願人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、精製ヒト脈管形成因子、即ちヒトＡＦおよびその個
   々のタンパク質。 ２、ヒト起源のタンパク質のみを含有していること、並
   びにヒトＡＦに対する抗体によつて認識され、結合され
   るエピトープを含有していることを特徴とし、新しい毛
   細血管の形成を測定することからなる標準分析法におい
   て活性を示す第１項記載の精製ヒトＡＦ。 ３、分子量範囲が約６４，０００（６４ｋｄ）および６
   ８，０００（６８ｋｄ）の少なくとも２個の分子からな
   り、解離により、生物学的に活性な分子量約２０，００
   ０のタンパク質に分解され得ることを特徴とする第１項
   記載の精製ヒトＡＦ。 ４、分子量約６４，０００および６８，０００の分子の
   等電点が約５．０〜５．３であることを特徴とする第３
   項記載の精製ヒトＡＦ。 ５、ヘパリン−セフアロースに親和性を有し、塩濃度約
   ０．５ＭＮａＣｌで単離され得ることを特徴とする第３
   項または第４項記載の精製ヒトＡＦ。 ６、精製ヒトＡＦの製造方法であつて、ヒトＡＦ含有溶
   液を、担体と結合しているヒトＡＦに特異的なモノクロ
   ーナル抗体と接触させ、非結合タンパク質および他の無
   関係な物質を除去し、抗体と結合したヒトＡＦであつて
   、分子量約６４，０００（６４ｋｄ）〜６８，０００（
   ６８ｋｄ）のヒトＡＦを分離し、単離することからなる
   方法。 ７、ヒトＡＦ含有溶液が確立された（永久的）ヒト黒色
   腫細胞の細胞培養上清または細胞抽出物であることを特
   徴とする第６項記載の方法。 ８、イムノアフイニテイクロマトグラフイーに適用する
   前にヒトＡＦ含有溶液を限外濾過して濃縮しておくこと
   を特徴とする第６項記載の方法。 ９、精製ヒトＡＦを、調製用のドデシル硫酸ナトリウム
   −ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量約６４
   ，０００（６４ｋｄ）と６８，０００（６８ｋｄ）の個
   々のタンパク質に分離する工程を含む第６項記載の方法
   。 １０、調製用のゲル濾過、ＨＰＬＣ（高速液体クロマト
   グラフィー）、陰イオン交換クロマトグラフィー、ヘパ
   リン−セフアロースによるアフイニテイクロマトグラフ
   イー、ヒドロキシアパタイトによる吸着クロマトグラフ
   ィー、またはこれらの方法の併用により精製ヒトＡＦを
   個々のタンパク質に分離する工程を含む第６項記載の方
   法。 １１、脈管系疾患、あるいは血管の供給不十分または損
   傷に起因する疾患の治療のための医薬であつて、第１項
   に記載の精製ヒトＡＦまたはその個々のタンパク質と担
   体とを含有する医薬製剤。 １２、第６項〜第１０項記載の方法で製造された精製ヒ
   トＡＦまたはその個々のタンパク質を含有する第１１項
   記載の医薬製剤。