HUT66231A - Pharmaceutical compositions containing interleukin-2 and process for producing them - Google Patents
Pharmaceutical compositions containing interleukin-2 and process for producing them Download PDFInfo
- Publication number
- HUT66231A HUT66231A HU9303167A HU9303167A HUT66231A HU T66231 A HUT66231 A HU T66231A HU 9303167 A HU9303167 A HU 9303167A HU 9303167 A HU9303167 A HU 9303167A HU T66231 A HUT66231 A HU T66231A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- interleukin
- priority
- pharmaceutical composition
- regeneration
- cells
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
- C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/16—Otologicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/249—Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
Description
A találmány tárgyát interleukin-2 (IL-2)-t tartalmazó, a központi idegrendszer sérült idegei regenerálásának megkönyítésére és fokozására (emlősökben) alkalmas gyógyszerkészítmények és ezek előállítási eljárása képezi.
Az alacsonyabbrendű gerincesek központi idegrendszerének (CNS) erős képessége van arra, hogy axonális sérülések után regenerálódjék, míg az emlősök központi neuronjainak csekély a regenerálódási képessége. Ez a csekély regenerálódási képesség, legalábbis részben, az érett oligodendrociták jelenlétének tulajdonítható, amelyekről kimutatták, hogy gátló hatásuk van az axonális növekedésre.
A halak látóidegeiben — amely jó képviselője a spontán regenerálódó CNS-nek. — a regenerálódásról kimutatták, hogy regenerálódást kísérő anyagok, jelenlétével társul, amelyek, amikor ezeket sérült felnőtt nyúl látóidegekre alkalmazzák, megkönnyíti azok regenerálódását /Schwartz M. és munkatársai: Science 228, 601-603 (1985), Lavie V. és munkatársai: J. Comp. Neurol. 298, 293-315 (1990), 172 987 számú európai szabadalmi leírás/. Az oligodendrocitákra citotoxikus aktivitás ezen készítményekben olyan anyagoknak tulajdonítható, amelyek a halideget valószínűleg képessé teszi arra, hogy leküzdje az oligodendrocitákkal társult gátló aktivitást /Sivron T. és munkatársai Glia 3, 267-276 (1990)/. Az in vitro citotoxicitást nem csupán a hal oligodendrocitáknál mutatták ki, hanem a patkány oligodendrocitáknál is /Sivron T. és munkatársai: fentebb idézett munka, Cohen A.
és munkatársai: Brain Rés. 537, 24-32 (1990)/. Ezek az anya• ··♦· ····
- 3 gok — közvetve vagy közvetlenül — makrofágokhoz vagy más véreredetű sejtekhez társulnak.
Az EP 415321 számú európai szabadalmi bejelentés leír egy olyan oligodendrocita citotoxikus faktort, amely jelen van alacsonyabbrendű gerincesek, pl. halak regenerálódó sérült idegeinek kondicionált tápközegében, de nincs jelen sem az alacsonyabbrendű gerincesek ép idegeinek kondicionált tápközegében, sem az emlősök sérült vagy ép idegeinek kondicionált tápközegében.
Az interleukin-2 (IL-2) olyan limfokin, amelyről ismert, hogy a T sejtekben szintetizálódik és azokból választódik ki antigénnel vagy mitogénnel történő aktiválás után IL-1 jelenlétében /Smith K.A.: Science 240, 1169-1176 (1988)/. Az IL-2 az immunrendszerben fontos citokinnak tekinthető, amely felelős több immunválasz gátlásáért vagy fokozásáért /Liang S.M. és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 165, 1312-1318 (1989)/. Ezzel ellentétben nagyon keveset tudunk az IL-2 szerepéről az agyban. Az idegrendszerben az IL-2 oligodendrocitákra való hatásaira vonatkozó néhány megfigyelés ellentmondásosnak tűnik. Az elmúlt évek néhány tanulmánya az IL-2 citokinnek gátló hatást tulajdonított oligodendrocitákra /Saneto R.P. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA .88, 9221-9225 (1986), Saneto R.P. és munkatársai: J.Neurosci. Rés. .18, 147-154 (1987)/, míg más tanulmányok az IL-2 burjánzást elősegítő hatását mutatják be oligodendrocitákra /Benveniste E.N. és Merril J.E.: Natúré 321, 610-613 (1986)/ Az IL-2-ről emlősökben kimutat*14» ···«
- 4 ták, hogy limfociták terméke (lásd: Smith K.A. fentebb idézett munkáját), és bizonyos beszámolók azt jelzik, hogy a hal limfocitáknak IL-2-szeru aktivitásuk van /Caspi R.R. és Avtalion R.R.: Dev. Comp. Immunoi. .8, 51-60 (1984)/.
A 205 261 sz. magyar szabadalmi leírás eljárást ismertet humán interleukin aktivitással rendelkező polipeptideket tartalmazó gyógyszerkészítények előállítására, primer mellhártyarák kezelésére. A gyógyszerkészítmények nemglikozilezett rekombináns interleukin-2-t tartalmaznak redukált alakban és főként mezotelióma kezelésére alkalmazhatók.
A 206 048 sz. magyar szabadalmi leírás eljárást ismertet leukémia elleni gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek hatóanyagként rekombináns technikákkal előállított humán interleukin-2-t tartalmaznak. A szabadalmi leírás szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmények akut mieloid leukémia hatásos kezelésére alkalmazhatók.
Többen hangsúlyozták a kapcsolatot az IL-2 és a CNS-ben történő sérülések között általában, de különösen az agyban /Nieto-Sampedro M. és munkatársai: Neurochem. Rés. 12, 723-727 (1987), Araujo D.M. és munkatársai: Brain Rés. 498, 257-266 (1989)/. Nieto-Sampedro és munkatársai IL-2 aktivitást találtak agysérülés után. Hasonlóképpen Liang és munkatársai (fentebb idézett munkájukban) is találtak IL-2-t MPP+-vel (l-metil-4-fenil-pirimidin) kialakított agysérülésekben. Ezen kívül Araujo és munkatársai IL-2 kötőhelyek túlszabályozását figyelték meg patkány agyvelőkampóban a sérülés eredményeképpen. Az IL-2 és a CNS regenerálódás között ·
- 5 azonban kapcsolatot eddig még nem tételeztek fel. Ténylegesen egyik, előbbiekben említett hivatkozás sem írja le, vagy veti fel azt a gondolatot, hogy az IL-2 felhasználásával olyan gyógyszerkészítmény állítható elő, amely a sérülés helyére juttatva indukálja és elősegíti a sérült axonok regenerálódását. Az IL-2-nek ez az új biológiai aktivitása — nevezetesen az a képessége, hogy indukálja és elősegíti a sérült axonok regenerálódását — az alábbiakban részletesen ismertetett találmány meglepő és nemvárt jellemzőinek egyike.
További, újabb tanulmányok azt is sugallják, hogy a regenerálódás elősegíthető olyan kezeléssel, amely megakadályozza az oligodendrociták által előidézett növekedésgátló hatást; ilyen pl. valamely oligodendrocitákra citotoxikus faktor, pl. a TNF alkalmazása /455093 számú európai szabadalmi bejelentés, Schwartz M. és munkatársai: Brain Rés. 545, 334-338 (1991)/, vagy olyan antitestek alkalmazása, amelyek az oligodendrocitákkal társult inhibitorok ellen irányulnak /Schnell L. és munkatársai: Natúré 343, 269-272 (1990)/.
Robbins és munkatársai /J. Immunoi. .8, 2593-7 (1987)/ beszámoltak arról, hogy a patkány asztrociták in vitro stimulálása olyan citotoxikus faktort eredményez, amely működését tekintve hasonló a tumor nekrózis faktorhoz. Arról is beszámoltak, hogy a humán rekombináns tumor nekrózis faktornak citotoxikus aktivitása van, amely patkány oligodendrociták ellen irányul. Selmaj és munkatársai /Ann. Neurol. 24 (4) 339-346 (1988)/ beszámoltak a rekombináns humán tumor nekrózis faktor (rhTNF) vizsgálatáról egér gerincvelő szövet mielinezett tenyészeteire való hatásával kapcsolatban. Arra a megállapításra jutottak, hogy az rhTNF késleltetett beindulású oligodendrocita nekrózist és bizonyos típusú mielin tágulást indukál.
Az előbbiekben részben vázolt, a szakember számára ismert, világszerte jelentős kutatás ellenére eddig még nem fejlesztettek ki biztos és hatékony eszközt, hogy a CNS regenerálását előidézzék emlősökben, és különösen emberekben. Egy ilyen eszközre, különösen egy gyógyászati kompozícióra, amelyet be lehetnek injektálni a regenerálás kívánt helyére, nagy mértékben szükség lenne abból a célból, hogy csökkentsük a balesetek utáni kétoldali vagy teljes bénulás, vakság, siketség, sebészeti beavatkozással társult axotómia, stb. kialakulásának esélyeit.
Az alábbiakban rövidet összefoglaljuk a találmányt.
A találmány szerint arra jöttünk rá, hogy az interleukin-2 elősegíti az axonális regenerálódást.
A találmány tárgyát képezik tehát az IL-2-t tartalmazó gyógyszerek, amelyek indukálják és elősegítik a CNS axonok regenerálódását emlősökben, elsősorban emberekben.
A találmány további tárgya gyógyászati készítmény előállítása, amely interleukin-2 egységdózist tartalmaz adott esetben valamely gyógyászati hordozóval és/vagy hígítóval együtt, ahol a hatóanyag olyan mennyiségben van jelen, hogy hatékonyan indukálja és segítse elő a sérült axonok regenerálódását, amikor azt a sérülés helyére juttatjuk.
·«*·
- 7 Az alábbiakban röviden ismertetjük a leírást kísérő ábrákat.
Az 1. ábra az oligodendrocita szám csökkenését mutatja be patkány agy oligodendrocita tenyészetekben rekombináns egér IL-2-vel.
A 2. ábra az érett (Gal-C-vel jelzett) oligodendrociták számának csökkenését mutatja be, amelyet a rekombináns egér IL-2 idéz elő.
A 3. ábra az újonnan kinövő rostokat mutatja be az átvágott, majd IL-2-vel kezelt idegekben.
Az alábbiakban részletesen leírjuk a találmány előnyös kiviteli módjait.
Az axonok regenerálását emlősökben a CNS sérülésének helyén indukáljuk és IL-2-nek a sérülés helyére való bejuttatásával segítjük elő. Bár előnyös, ha az IL-2 azonos fajból való, mint a kezelendő állat, ez nem kritikus tényező.
A találmány szerint alkalmazott IL-2 fogalma magában foglalja bármely faj natív IL-2-jét vagy bármely faj rekombináns IL-2-jét. Az IL-2-t előállíthatjuk bármely, a szakember által ismert kényelmes, alkalmas technikával, pl. Robb R.J. eljárásával /Proc. Natl. Acad. Sci. USA .80, 5990 (1983)/. Ezt előnyösen előállíthatjuk rekombináns DNS technikával is, pl. azzal, amelyeket Taniguchi T. és munkatársai /Natúré 302 305-310 (1983)/, illetve Devos R. és munkatársai /Nucleic Acid Research 11, 4307-4323 (1983)/ írnak le. A rekombináns humán IL-2 (rhIL-2) jelenleg már kereskedelmi forgalomban van. Bizonyos IL-2 muteineket előállít• · ·
- 8 hatunk a 4,515,584 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás alapján.
Az IL-2-t a találmány szerinti olyan mennyiségben és tisztaságban alkalmazzuk, amely elegendő ahhoz, hogy a CNS axonok regenerálódását megkönnyítse emlősökben, elsősorban emberekben. Ezt bármely olyan módon be lehet vinni, amely alkalmas arra, hogy az anyagot a regenerálandó axon közelébe vigye. Előnyösen ezt — gyógyászatilag elfogadható folyékony hordozóban — közvetlenül injektáljuk az adott helyre .
Egy másik megoldás szerint sebészeti úton IL-2-t hordozó implantátumot vezethetünk be.
Egy ilyen implantátum állhat bármely olyan anyagból, pl. nitrocellulózból, amely az aktív anyagot szivacsként abszorbeálja és lassan kibocsátja a beültetés helyén.
Egy adott betegnek beviendő IL-2 mennyisége sokféle tényezőtől függ, pl. a kezelendő sérülés természetétől, a regenerálni kívánt sérült axonok helyétől és a beteg állapotától. Tipikusan azonban az IL-2-t egyedi injekció formájában, illetve nitrocellulózba vagy más adszorbeáló hordozóba felitatva vezetjük be. A pontos adagolást tapasztalati úton határozzuk meg.
Az IL-2-t előnyösen lehetőleg azonnal a kezelendő sérülés után vezetjük be. így az eljárás előnyösen inkább akut sérülések, mint krónikus sérülések kezelésére alkalmas. Nehezebb elősegíteni a találmány szerint a regenerálódást az esetben, ha a degenerálódás már hosszabb idő óta fennáll.
Bár az IL-2 bevezetése önmagában is jó eredményeket mutat, az ilyen kezelés kombinálható bármilyen típusú kísérő terápiával, amely ezek hatásainak fokozására irányul. így pl. a sérülési hely besugárzása kis energiájú lézerrel, előnyösen He-Ne lézerrel (5 perc/nap, 35 mW) megakadályozhatja a degenerálódás baleset utáni folyamatát és ezáltal megakadályozhatja a sebhelyképződést /Assia és munkatársai: Brain Rés. 476, 205-212 (1988)/.
A találmány szerinti eljárással kezelhető különböző sérülések száma nagyon nagy; ez nyilvánvaló azok számára, akik a szakterületen jártasak. A korlátozás igénye nélkül felsorolunk ezek közül néhányat: idegi trauma, a CNS axonok magas vérnyomás vagy iszkémia által előidézett akut vagy szubakut károsodásával kapcsolatos betegségek, pl. glaukóma, elülső iszkémiás optikai neuropátia, gerincvelősérülések, a szemidegek vagy a fülidegek sérülései, stb. A találmány szerinti eljárással kezelhetők a CNS idegsebészeti beavatkozás során keletkező vagy tumorok által előidézett sérülései is.
A találmány céljaira az IL-2-t kiszerelhetjük bármilyen gyógyászati vagy állatorvosilag elfogadható hordozóval vagy hígítóval. Kiszerelhetjük vizes oldatokban, pl. steril vizes oldatokban. Az IL-2-t tartalmazó oldatot vagy port stabilizálhatjuk valamely stabilizálószer segítségével. Ezek kiszerelhetek injektálható egységdózis formájában (oldat, szuszpenzió, emulzió), előnyösen gyógyászatilag elfogadható hordozó közegben, amely önmagában nem toxikus és nem gyógyhatású. Az ilyen hordozókra példák lehetnek a fiziológiás kony-
hasóoldat, Ringer-féle oldat, a glükóz oldat, a mannit, és a normál szérum albumin. Alkalmazhatunk nemvizes hordozókat is, pl. fixált olajokat és etil-oleátot. A hordozó közeg tartalmazhat kisebb mennyiségű adalékanyagot, pl. olyan anyagokat, amelyek fokozzák az izotóniás jelleget, az oldhatóságot és/vagy a kémiai stabilitást, ilyenek például a pufferek, detergensek és tartósítószerek. Az IL-2 különböző kiszerelési formái más indikációknál már ismeretesek. Az ilyen kiszereléseket a találmány céljaira olyan mértékig alkalmazhatjuk, hogy ezek ne legyenek káros hatással az IL-2 kívánt működésére.
A rekombináns IL-2-ről kimutattuk, hogy citotoxikus az érett patkány oligodendrocitákra in vitro és elősegíti a sérült nyúl látóidegek axonális növekedését in vivő.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények közül előnyösek azok, amelyek 3-8xl06 egység IL-2-t — a gazdaszervezet testtömeg-kg-jára számítva — mint egységdózist, valamint egy gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyagot és/vagy hígitóanyagot tartalmaznak. Ez utóbbiakat a leírás előző részeiben említett vizes vivőanyagok és/vagy hígító anyagok (amilyen a sóoldat, Ringer-oldat, dextróz-oldat, mannit, normál szérumalbumin), illetőleg nemvizes vívőanyagok és/vagy hígítóanyagok (amilyenek a fixált olajok és az etil-oleát) választjuk ki. Az IL-2 koncentrációja a vivőanyagban és/vagy hígítóanyagban 0,1 mg/ml - 100 mg/ml. Egy ilyen készítmény pl. 0,3 mg/ml IL-2-t tartalmaz 50 mg/ml töménységű mannit-oldatban.
• ········ · • · · · · · • · · · · · • · * · ··· · ··· ···
- 11 Az alábbi példákkal bemutatjuk és alátámasztjuk a találmányt .
Kiviteli példák
Kísérleti munkamenet
Patkányagy oligodendrocita tenyészetek előállítása és immunfluoreszcens festés. A dúsított oligodendrocita tenyészetek előállításához újszülött (2 napos) patkányok agyát kimetsszük /2 agy 2 ml Leibowitz tápközegben (L-15), Gibco/ és kémiai úton elbontjuk 3-104 egység/ml tripszinnel (Sigma)DMEM-ben (CA2+ és Mg2 +-mentes), amely 1 mmól/1 etiléndiamin-tetraecetsavat (EDTA) is tartalmaz. A tripszin oldattal 37°C hőmérsékleten, 10 percig végzett inkubálás előtt mechanikus roncsolást végzünk. A sejteket azután átvisszük 15 ml-es kúpos csövekbe, amelyek 1 ml oldatot tartalmaznak /ahol az oldat összetétele: 74 egység/ml DN-áz (Sigma), 5200 egység/ml szója tripszin (Sigma), és 3 mg BSA/, inkubáljuk 1 órán át szobahőmérsékleten, hozzáadjuk 10 ml tápközeghez, majd háromszor mossuk DMEM-ben. Az utolsó mosás után a sejteket szuszpendáljuk 5-10 % borjúszérumot (FBS, Sigma, hővel aktiválva 56°C hőmérsékleten 30 percen át) is tartalmazó DMEM-ben, szűrőn engedjük át és inokuláljuk 85 mm2-es palackokba (Nunc), amelyeket előzőleg egy éjszakán át buborékoltatással átöblítünk 37°C hőmérsékleten 20 gg/ml poli-L-lizinnel (PLL, molekulatömeg 100000, Sigma). A tápközeget először a sejt inokulálás után 24 órával cseréljük, majd ezután minden 2.-3. napon. Az inokulálás utáni
8. napon a sejteket rázatással inkubáljuk 4-6 órán át, a felülúszót eltávolítjuk, és a megmaradó sejteket tovább inkubáljuk 10 ml tápközegben (DMEM+5-10 % FBS) több órán át, amelyet rázatás követ egy éjszakán át. A sejteket, amelyek a rázatással felszabadultak, összegyűjtjük és centrifugáljuk, és a leülepedett sejteket újra szuszpendáljuk 1-2 ml szérum-mentes tápközegben /Bottenstein J. E. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 514-517 (1979)/.
Az így kapott dúsított oligodendrocita tenyészetek kinyert sejtjeit olyan üveg fedőlemezre inokuláljuk (13 mm, 3·105 sejt/üreg), amelyet előzőleg PLL-lel (20 Mg/ml) burkoltunk be. Az üveg fedőlemezeket egy 24 üreges lemezen (Nunc) helyezzük el. Az inokulálás során először 50 μΐ sejtszuszpenziót alkalmazunk mindegyik fedőlemezre, majd 30 percig állni hagyjuk 37°C hőmérsékleten, hogy lehetővé tegyük a megkötést. Ezután a sejteket DMEM-mel mossuk, majd 500 μΐ meghatározott tápközeget (Raff által módosított Bottenstein-Sato meghatározott tápközeg) adunk hozzá. 48 óra múlva az inokulált sejteket a kondicionált tápközeggel kezeljük, vagy 2 órán át nyúl-anti-humán-IL-2 antitestekkel (Genzyme, Inc.), vagy kontroll antitestekkel (nyúl anti-idegvégződés) előinkubált kondicionált tápközeggel kezeljük. Az érett oligodendrociták, vagyis a galaktocerebrozid (GalC) pozitív sejtek számát immunfluoreszcenciával határozzuk meg az alábbi módon; A sejteket alaposan mossuk Hank féle kiegyensúlyozott sóoldattal (HBSS), amely 2 % FBS-t is tartalmaz, hővel inaktiváljuk, és 30 percen át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten μΐ anti-GalC monoklonális antitesttel (IgG3, hibridóma felülúszó 1:5 arányban hígítva DMEM-ben, Serotec). Az inkubálás végén a sejteket mossuk és tovább inkubáljuk 50 μΐ fluoreszceinnel konjugált kecske-anti-egér IgG3-mal (1:50 DMEM-ben), majd mossuk és metanollal fixáljuk 10 percig -20°C hőmérsékleten. Az utolsó mosás után a sejteket 22 mmól 1,4-diazabiciklo[2,2,2] oktánt tartalmazó glicerinnel befedjük. Kontrollként olyan fedőlemezeket alkalmazunk, amelyeket azonos festési munkamenetnek vetünk alá azzal a kivétellel, hogy a primer antitesteket nem alkalmazzuk. A fedőlemezeket üveglemezekre helyezzük, körömlakkal lezárjuk és 4°C hőmérsékleten tároljuk. A sejteket a teljes fedőlemezen megszámoljuk.
1. példa
A rekombináns egér IL-2 szelektíven toxikus az oligodendrocitákra.
Rekombináns egér IL-2-t (0-150 egység/ml) alkalmazunk patkány oligodendrociták dúsított tenyészeteiben (amelyeknek előállítását a kísérleti munkameneteknél írtuk le) 48 órával a sejtek inokulálása után. A sejtek számát a GalC elleni antitestek alkalmazásával becsüljük meg. Az ezt követően az érett oligodendrocitákra kifejtett immunfluoreszcens vizsgálattal határozzuk meg, ahol a jelzett sejtek számát fluoreszcens mikroszkóp alkalmazásával számoljuk meg. Kontrollként a nem kezelt sejteket alkalmazzunk (nincs citotoxicitás). A nagy IL-2 koncentrációknál az érett oligodend··· rociták száma, amint ez a GalC pozitív sejtek számából tükröződik, szignifikánsan csökken (88,6 ± 15,3 % citotoxicitás 150 egység/ml-nél, p < 0,0005 ANOVA-val) (1. ábra). A reprezentatív mikroszkópos képek, amelyek bemutatják a rekombináns egér IL-2 (200 egység/ml) hatásait az érett (GalC-vel jelzett) oligodendrociták számára, a 2. ábra b. és d. részében láthatók. Az IL-2-vel kezelt (b), illetve nem kezelt (d) sejtek fluoreszcens mikroszkópos képei anti-GalC antitestekkel vannak megfestve. A (b)-ben és (d)-ben bemutatott mezők megfelelő fázis-mikroszkópos képei a 2.a.-bán, illetve a
2.c.-ben láthatók. Azok a sejtek, amelyek megmaradtak, nyúlvány nélküliek (2.b. ábra), ellentétben a nyúlványokat hordozó sejtekkel (2.d. ábra). Az oligodendrocitákra való kimutatható citotoxikus hatáshoz szükséges rekombináns egér IL-2 mennyisége azonban sokkal nagyobb, mint amekkora a becsült mennyiség a kondicionált tápközegben. Ennélfogva lehetséges, hogy a halból származó IL-2 az immun-eredetű IL-2 módosult formája és így nagyobb affinitása van a patkány oligodendrocitákhoz, mint amekkora a rekombináns egér IL-2 affinitása a patkány oligodendrocitákhoz. Abból a célból, hogy kizárjuk azt a lehetőséget, hogy az IL-2 oligodendrocitákra megfigyelt hatása nem egy fajlagos citotoxicitás következménye, IL-2-t alkalmazunk asztrociták, vagyis lapos sejtek patkányagy-egyrétegei tenyészeteiben. Amint várható, citotoxicitás nem figyelhető meg.
• ·· ·
1. táblázat
5000 sejt/üreg | 10.000 | sej t/üreg | 30.000 | sej t/üreg | ||
IL-2 | CPM | % | CPM | % | CPM | % |
egység/ml | ± S D | ± S D | ± S D | ± S D | ± S D | ± S D |
0 | 28030 | 100±2 | 48776 | 101±15 | 55727 | 100±ll |
±518 | ±5954 | ±5137 | ||||
0,1 | 33632 | 120±7 | 53040 | 109±13 | 60345 | 108±8 |
±2351 | ±3639 | ±793 | ||||
1 | 31084 | 110±3 | 55740 | 115±12 | 58231 | 105±8 |
±984 | ±1436 | ±86 | ||||
10 | 33384 | 119±16 | 51745 | 107±14 | 62328 | 112±9 |
±5181 | ±5317 | ±103 | ||||
50 | 31879 | 113±9 | 53548 | 110±13 | 56601 | 102±8 |
±2957 | ±3251 | ±658 | ||||
200 | 30248 | 107±3 | 50064 | 103±ll | 57380 | 103±9 |
±1052 | ±2219 | ±2771 |
A jelölések magyarázata:
CPM: beütésszám/perc ± SD: ± standard deviáció (eltérés).
2. példa
IL-2 aktivitás in vivő
Rekombináns egér IL-2-t alkalmazunk, sérült felnőtt nyúl látóidegekre. Az alkalmazást két kísérleti paradigma alkalmazásával hajtjuk végre. Az egyik kísérleti paradigma magában foglalja az átvágott felnőtt nyúl látóidegeket és a nitrocellulózon felitatott IL-2 alkalmazását /Lavie V. és munkatársai: J. Comp. Neurol. 298. 293-315 (1990)/. A második paradigma magában foglalja a látóidegek súlyos összemorzsolását és IL-2 injektálását oldott formában több helyen az idegek mentén, a sérülések helyétől disztálisan. Az ezt követő növekedés becslése magában foglalja az elemzést transzmissziós elektronmikroszkópiával és a látókorongba injektált torma-peroxidáz (HRP) anterográd szállításának elemzésével (Lavie és munkatársai: fentebb idézett munka). A megfigyelt növekedést a 3. ábrában mutatjuk be. Amint látható, az IL-2-vel kezelt, sérült nyúl látóidegekben a sérülés helyétől disztálisan bőséges mennyiségű, nem mielinezett axon és növekedési kúp figyelhető meg. Ezeket korábban úgy írták le (Lavie és munkatársai, fentebb idézett munka), mint az újonnan növekvő axonok jellemzőit. A kontroll sérült, de nem kezelt állatokban életképes axonok nem figyelhetők meg.
Claims (10)
1. Eljárás sérült axonok regenerálódásának indukcióját és elősegítését — a sérülés helyére juttatva — biztosító, interleukin 2-t tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal j ellemezve , hogy interleukin-2-t és gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy higítót összekeverünk és gyógyszerkészítménnyé alakítunk. (Elsőbbsége: 1991. 02. 27.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 3-8χ10θ egység interleukin-2/gazdaszervezet kg-testtömeg egységdózist alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán interleukin 2-t alkalmazunk. (Elsőbbsé ge: 1994. 07. 01.)
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán interleukin 2-ként rekombináns humán interleukin-2-t alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán interleukinként rekombináns humán IL-2 muteint alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1991. 02. 27.)
6. Gyógyszerkészítmény, amely sérült axonok regenerálódásának indukcióját és elősegítését — a sérülés helyére juttatva — biztosító, hatásos mennyiségű interleukin-2 egységdózist tartalmaz, amely egységdózis 3-8x10^ egység interleukin-2/gazdaszervezet kg-testtömeg, valamint tartalmaz egy gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyagot és/vagy hígítóanyagot, amilyenek a vizes vivőanyagok és/vagy hígítóanyagok, amilyen a sóoldat, Ringer-oldat, dextróz oldat, mannit, normál szérumalbumin, vagy amilyenek a nemvizes vivőanyagok és/vagy hígítók, amilyenek a fixált olajok és az etil-oleát, mimellett az interleukin-2 koncentrációja a vivőanyagban és/vagy hígítóanyagban 0,1 mg/ml - 100 mg/ml. (Elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
7. A 6. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amely humán interleukin-2-t tartalmaz. (Elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
8. A 7. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amely rekombináns humán interleukin-2-t tartalmaz. (Elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
9. A 8. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amely rekombináns humán interleukin-2-muteint tartalmaz. (Elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
10. A 6.-9. igénypontok bármelyike szerinti, sebészeti úton beültethető alakú gyógyszerkészítmény, amely az interleukin-2 egységdózisát vivőanyagban és/vagy hígítóanyagban egy hordozóanyagra, amilyen a nitrocellulóz, adszorbeálva tartalmazza. (Elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IL97365A IL97365A0 (en) | 1991-02-27 | 1991-02-27 | Pharmaceutical compositions comprising a lymphokine |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9303167D0 HU9303167D0 (en) | 1994-01-28 |
HUT66231A true HUT66231A (en) | 1994-10-28 |
Family
ID=11062144
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9200644A HUT60437A (en) | 1991-02-27 | 1992-02-26 | Process for producing pharmaceutical compositions |
HU9303167A HUT66231A (en) | 1991-02-27 | 1992-02-26 | Pharmaceutical compositions containing interleukin-2 and process for producing them |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9200644A HUT60437A (en) | 1991-02-27 | 1992-02-26 | Process for producing pharmaceutical compositions |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0501445A1 (hu) |
JP (1) | JPH05238941A (hu) |
KR (1) | KR920016106A (hu) |
AU (1) | AU647883B2 (hu) |
CA (1) | CA2061918A1 (hu) |
FI (1) | FI920845A (hu) |
HU (2) | HUT60437A (hu) |
IE (1) | IE920594A1 (hu) |
IL (1) | IL97365A0 (hu) |
MY (1) | MY131097A (hu) |
NZ (1) | NZ241719A (hu) |
TW (1) | TW208657B (hu) |
ZA (1) | ZA921416B (hu) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69331730T2 (de) * | 1992-07-30 | 2002-10-31 | Yeda Res & Dev | Aus nerven gewonnenes transglutaminase-enzym für die induktion der nervenregeneration |
US6267955B1 (en) | 1995-09-15 | 2001-07-31 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Mononuclear phagocytes and their use to promote axonal regeneration |
US5800812A (en) * | 1995-09-15 | 1998-09-01 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of use of mononuclear phagocytes to promote axonal regeneration |
US6214796B1 (en) | 1996-03-22 | 2001-04-10 | The General Hospital Corporation | Administration of polypeptide growth factors following central nervous system ischemia or trauma |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4832686A (en) * | 1986-06-24 | 1989-05-23 | Anderson Mark E | Method for administering interleukin-2 |
IL91459A0 (en) * | 1989-08-28 | 1990-04-29 | Yeda Res & Dev | Oligodendrocyte inhibitory factor |
-
1991
- 1991-02-27 IL IL97365A patent/IL97365A0/xx unknown
-
1992
- 1992-02-25 NZ NZ241719A patent/NZ241719A/en unknown
- 1992-02-25 IE IE059492A patent/IE920594A1/en not_active Application Discontinuation
- 1992-02-26 EP EP92103260A patent/EP0501445A1/en not_active Withdrawn
- 1992-02-26 FI FI920845A patent/FI920845A/fi not_active Application Discontinuation
- 1992-02-26 AU AU11267/92A patent/AU647883B2/en not_active Ceased
- 1992-02-26 ZA ZA921416A patent/ZA921416B/xx unknown
- 1992-02-26 CA CA002061918A patent/CA2061918A1/en not_active Abandoned
- 1992-02-26 HU HU9200644A patent/HUT60437A/hu unknown
- 1992-02-26 HU HU9303167A patent/HUT66231A/hu unknown
- 1992-02-27 JP JP4090398A patent/JPH05238941A/ja active Pending
- 1992-02-27 KR KR1019920003089A patent/KR920016106A/ko not_active Application Discontinuation
- 1992-02-27 MY MYPI92000322A patent/MY131097A/en unknown
- 1992-04-13 TW TW081102862A patent/TW208657B/zh active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ZA921416B (en) | 1993-01-27 |
IE920594A1 (en) | 1992-09-09 |
AU1126792A (en) | 1992-09-03 |
HUT60437A (en) | 1992-09-28 |
JPH05238941A (ja) | 1993-09-17 |
MY131097A (en) | 2007-07-31 |
CA2061918A1 (en) | 1992-08-28 |
HU9200644D0 (en) | 1992-05-28 |
AU647883B2 (en) | 1994-03-31 |
NZ241719A (en) | 1994-12-22 |
FI920845A (fi) | 1992-08-28 |
EP0501445A1 (en) | 1992-09-02 |
HU9303167D0 (en) | 1994-01-28 |
FI920845A0 (fi) | 1992-02-26 |
TW208657B (hu) | 1993-07-01 |
KR920016106A (ko) | 1992-09-24 |
IL97365A0 (en) | 1992-05-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69910362T2 (de) | Anwendung der mesenchymalen stammzellen als immunsuppressiva | |
US5580555A (en) | Regeneration of injured central nervous system axons | |
Lu et al. | Glial cell line‐derived neurotrophic factor prevents death, but not reductions in tyrosine hydroxylase, of injured nigrostriatal neurons in adult rats | |
JP4028598B2 (ja) | 神経膠細胞系由来神経栄養因子(gdnf)タンパク質産物を使用する感覚神経性聴力損失及び前庭障害の予防及び治療方法 | |
KR100328752B1 (ko) | 인간골형태발생단백질을사용한신경재생법 | |
AU704515B2 (en) | Novel protein and process for producing the same | |
KR19990071540A (ko) | 광수용체 손상 또는 변성 치룡용 제약학적 조성물 | |
Igarashi et al. | Expression of receptors for glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and neurturin in the inner blood-retinal barrier of rats | |
CA2170979A1 (en) | Increase in hematopoietic progenitor cells in peripheral blood by transforming growth factor beta | |
EP1137421A1 (en) | Uses of fibroblasts or supernatants from fibroblasts for the suppression of immune responses in transplantation | |
Cohen et al. | Oligodendrocyte cytotoxic factor associated with fish optic nerve regeneration: implications for mammalian CNS regeneration | |
AU2002225864B2 (en) | Methods of improving central nervous system functioning | |
JPH05509096A (ja) | 骨髄間質細胞及び始原細胞の刺激 | |
DE69815840T2 (de) | Verwendung von tall-104 zellen in kombination mit adriamyzin oder cisplatin zur behandlung von malignen tumoren | |
HUT66231A (en) | Pharmaceutical compositions containing interleukin-2 and process for producing them | |
Silagi et al. | Successful immunotherapy of mouse melanoma and sarcoma with recombinant interleukin-2 and cyclophosphamide | |
EP0531425B1 (en) | Combination of IGF-I and TGF-beta for bone regeneration | |
AU9617998A (en) | Immunological compositions and methods of use to transiently alter mammalian central nervous system myelin to promote neuronal regeneration | |
EP1059931B1 (de) | Verwendung von cd137 zur förderung der proliferation peripherer monocyten | |
Li et al. | Neuroprotective effect of bone marrow stromal cell combination with atorvastatin in rat model of spinal cord injury | |
EP0415321B1 (en) | Oligodendrocyte cytotoxic factor | |
JPH101439A (ja) | 神経変性疾患治療剤 | |
EP0839048A1 (en) | Method of treating epilepsy with brain derived neurotrophic factor | |
Silani et al. | ALS cerebrospinal fluid enhances human foetal astroglial cell proliferation in vitro | |
JPH06511393A (ja) | 酵素的に産生された2量体il−2とその調製のための神経由来のトランスグルタミナーゼ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |